Термостабильная ДНК-полимераза Archaeoglobus fulgidus и её свойства тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Чалов, Сергей Евгеньевич

• Чалов, Сергей Евгеньевич
• кандидат химических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат химических наук Чалов, Сергей Евгеньевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА! ТЕРМОСТАБИЛЬНЫЕ ДНК-ПОЛИМЕР АЗЫ: СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ, СВОЙСТВА И ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Обзор литературы.

1Л. Классификация ДНК-полимераз.

1.2. Ферментативные активности ДНК-полимераз.

1.2Л. Механизм 5'-3'-полимеразной активности.

1.2.2. 3'-5'-экзонуклеазная активность.

1.2.3. 5'-3'-экзонуклеазная активность.1В

1.3. Процессивность ДНК-полимераз.

1.4. Структурная организация и гомология ДНК-полимераз семейства В.

1.4.1. Структура ДНК-полимераз семейства В.

1.4.1.1. М^-концевой домен.

1.4.1.2. Полимеразный домен.

1.4.1.3. Домены "пальцы".

1.4.1.4. 3'-5'-экзонуклеазный домен.

1.4.1.5. Совместное перемещение доменов.

1.5. Термостабильные ДНК-полимеразы.

1.5.1. Термостабильные ДНК-полимеразы семейства А.

1.5.2. Термостабильные ДНК-полимеразы из архебактерий семейства В.

1.6. Практическое использование термостабильных ДНК-полимераз в биотехнологии.

ГЛАВА 2. ТЕРМОСТАБИЛЬНАЯ ДНК-ПОЛИМЕРАЗА ARCHAEOGLOBUSFULGIDUS

VC16 И ЕЕ СВОЙСТВА. Обсуждение результатов.

2.1. Клонирование гена (номер AF0497, GenBank (США)) из генома

A. fulgidus.

2.2. Свойства рекомбинантной Afu-uon.

2.2.1. Изучение 3'-5'-экзонуклеазной и полимеразной активностей Afu-uon.

2.2.2. Мутагенез с заменой в белке Afn-non. аминокислотного остатка Glul70.

2.2.3. Термостабильность и температурный оптимум 4/и(ехо")-пол.

2.2.4. Влияние рН среды на ДНК-полимеразную активность 4/^(ехо")-пол.

2.2.5. Влияние одновалентных и двухвалентных катионов на полимеразные свойства 4/и(ехо')-пол.

2.2.6. Процессивность4/м(ехо")-гюл.

2.2.7. Амплификация ДНК4/и(ехо")-пол.,4/и-пол.

2.3. Структурно-функциональные исследования Afu-uon.

2.3.1. Выбор участка для проведения мутагенеза гена afu-пол.

2.3.2. Планирование и общая схема проведения мутагенеза.

2.3.3. Подготовка исходных компонентов для проведения мутагенеза.

2.3.4. Мутагенез в белке Afu(txo')-non. для получения конструкции с уникальными сайтами рестрикции EcoRV и Vha464l.

2.3.5 Мутагенез с заменой в белке А/и(ехо')-пол. аминокислотного остатка Lys493.

2.3.6. Мутагенез с заменой в белке4/и(ехо")-пол. аминокислотного остатка Asn497.

2.3.7. Мутагенез с заменой в белке Afu(exo~)-non. аминокислотного остатка Thr496.

2.3.8. Изучение мутантных форм 4А(ехо")"пол.

2.4. Получение и изучение свойств химерного белка (T-Afu-non.).

2.4.1. Конструирование химерного белка T-Afu-поя.

2.4.2. Изучение свойств химерного белка Т-А/и-пол.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. Материалы и методы исследования.

3.1 Бактериальные штаммы и плазмиды.

3.2. Химические реагенты и ферменты.

3.3. Приборы и аппараты.

3.4 Общие методики.

3.4.1. Трансформация клетокЕ. coli Ml5.

3.4.2. Амплификация гена afu-пол.

3.4.3. Идентификация Afu-uon. в штамме Е. coli Ml5.

3.4.4. Выделение рекомбинантной Afu-пол.

3.4.5 Измерение активности Afu-пол.

3.4.6. Исследование физико-химических характеристик 4/м(ехо~)-пол.

3.4.7. Исследование термостабильности белков.

3.4.8. Измерение 3'-5'-экзонуклеазной активности.

3.4.9. Тестирование 5'-3'-эндонуклеазной активности.

3.4.10. Амплификация ДНК с использованием Г-Д/м-пол., Afu-non., Afu(exo')-non.

3 .4.11. Синтез фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).

3.4.12. Ферментативные реакции.

3.4.13. Конструирование и отбор целевых мутантных плазмид, несущих точечные замены аминокислотных остатков в белке Afu-non.

3.4.14. Выделение и очистка плазмидной ДНК.

3.4.15. Препаративное выделение фрагментов ДНК из агарозного геля и олигонуклеотидов из ПААГ.

3.4.16. Секвенирование ДНК.

3.4.17 Компьютерные программы для анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Термостабильная ДНК-полимераза Archaeoglobus fulgidus и её свойства»

ДНК-полимеразы входят в большую группу ферментов, катализирующих биосинтез ДНК. И хотя эти ферменты известны давно, их исследования интенсивно продолжаются, что определяется значимостью их биологических функций и широким практическим применением.

В последние годы наблюдается растущий интерес исследователей к свойствам термостабильных ДНК-полимераз, которые стали ключевыми инструментами в таких методах как полимеразная цепная реакция [1] и "дидезокси" метод секвенирования ДНК [2], на которых в значительной мере базируется современная молекулярная биология и биотехнология. Кроме этого, эти ферменты остаются интересными объектами для изучения процессов репликации ДНК, так как они обеспечивают высокую точность синтеза ДНК при экстремально высоких температурах.

В настоящее время выделены и хорошо изучены ДНК-полимеразы из многих термофильных микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим группам: Bacilus, Thermus. Наиболее детально исследованы полимеразы Taq из Thermits aquaticus YT1 и Tth из Thermus thermophilus HB8. Однако невысокая процессивность и точность копирования ДНК ограничивает возможность их применения в биотехнологии. В связи с этим представляется актуальным обнаружение новых термостабильных ферментов, клонирование их генов, изучение свойств, проведение "белкового дизайна" с целью получения рекомбинантных форм ферментов, обладающих измененными свойствами, расширяющими спектр их применения. Кроме того, представляет интерес изучение ДНК-полимераз как компонентов репликационной системы архебактерий, являющихся объектами, удобными для моделирования основных механизмов, действующих в бактериях и эукариотах.

В настоящее время хорошо изучены ДНК-полимеразы из архебактерий P. furiosus, Ы. jannachii, P. sp.GB-D, Т. litoralis, Т. fumicolans. К этому классу бактерий также относится и A. fulgidus [3]. На основе полного секвенирования геномов микроорганизмов М. jannachii, A. fulgidus определен ряд генов, кодирующих ферменты, обеспечивающие синтез ДНК при достаточно высоких температурах [4], [5]. Однако до настоящего времени не была выделена и соответствующим образом изучена ДНК-полимераза из микроорганизма A. fulgidus, не была исследована возможность ее практического использования. Это и явилось причиной выбора этого фермента в качестве объекта исследования в данной работе.

Цель данной работы состоит в исследовании структурной организации, свойств рекомбинантной ДНК-полимеразы из термостабильного микроорганизма Archaeoglobus fulgidus и изучении возможности практического использования этого фермента.

В ходе работы решались следующие задачи:

• Выделение и изучение термостабильной Л/у-пол.

• Анализ первичной структуры Afu-nosi. на основе гомологий с ферментами родственного класса.

• Мутагенез гена, получение мутантных форм фермента.

• Исследование основных характеристик и энзиматических свойств мутантных формЛ/м-пол.

• Создание химерного белка из Afu-пол. и Taq-uon.

• Оценка возможности практического использования фермента и химерного белка в ПЦР.

Работа содержит обзор литературы, посвященной изучению структурной организации, свойств ДНК-полимераз, включая термостабильные, их практического применения.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Чалов, Сергей Евгеньевич

выводы

1. Впервые проведено выделение рекомбинантного белка Afu-пол. Показано, что фермент относится к ДНК-полимеразам семейства В, обладает полимеразной и 3'-5'-экзонуклеазной активностями.

2. Методом сайт-направленного мутагенеза показано, что замена остатка Glu 170 в мотиве 168DXE170 приводит к полной инактивации 3'-5'-экзонуклеазной активности; замены остатков Lys493, Thr496, Asn497 в мотиве K493X2T496N497SXY500G приводят к уменьшению и выключению полимеразной активности фермента. Таким образом, установлено, что аминокислотные остатки Glu 170, Lys493, Thr496, Asn497 принимают непосредственное участие в формировании активных центров полимеразного и 3'-5'-экзонуклеазного доменов Afu-пол.

3. Исследованы основные физико-химические характеристики и энзиматические свойства Afu-пол., 4/«(ехо")-пол. Показано, что Afu{Qxo~)-uon. обладает максимальной полимеразной активностью при значении рН 6,8 - 7,5; концентрации ионов Mg2+ - 8 мМ; отсутствии ионов КГ и NK,+ в реакционной смеси.

4. С целью получения мультифункционального фермента с новыми свойствами был создан гибридный ген, кодирующий химерный белок, состоящий из N-концевого 5'-3'-экзонуклеазного домена Taq-пол., сформированного 288 аминокислотными остатками (аминокислоты 1-304 в Taq-пол.), и полноразмерной Afu-пол. Показано, что фермент обладает 5'-3'-эндонуклеазной и более высокой 3'-5'-экзонуклеазной активностью, сохраняет полимеразную активность, но отличается более низким уровнем термостабильности по сравнению с исходными белками.

5. Найдены оптимальные условия для практического использования Afu-пол., 4/м(ехо>пол. и химерного белка в полимеразной цепной реакции.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Чалов, Сергей Евгеньевич, 2002 год

1. Braithwaite DK, Ito J. // Compilation, alignment, and phylogenetic relationships of DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1993 Feb 25;21(4):787-802.

2. Li Y, Korolev S, Waksman G. // Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for ucleotide incorporation. EMBO J. 1998 Dec 15; 17(24):7514-25.

3. Hopfner KP, Eichinger A, Engh RA, Laue F, Ankenbauer W, Huber R, Angerer B. // Crystal structure of a thermostable type В DNA polymerase from Thermococcus gorgonarius. Proc Natl Acad Sci USA. 1999 Mar 30;96(7):3600-5.

4. Innis MA, Myambo KB, Gelfand DH, Brow MA. // DNA sequencing with Thermus aquaticus DNA polymerase and direct sequencing of polymerase chain reaction-amplified DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec;85(24):9436-40.

5. Wyman C, Botchan M. // DNA replication. A familiar ring to DNA polymerase processivity. Curr Biol. 1995 Apr l;5(4):334-7.

6. Vlasov VA, Dymshits GM, Lavrik 01. // Structural and functional dynamics of DNA and RNA polymerases. Mol Biol (Mosk). 1998 Jan-Feb;32(l):5-18.

7. Johnson KA. // Conformational coupling in DNA polymerase fidelity. Annu Rev Biochem. 1993;62:685-713.

8. Hori K, Mark DF, Richardson CC. // Deoxyribonucleic acid polymerase of bacteriophage T 7. Purification and properties of the phage-encoded subunit, the gene 5 protein. J Biol Chem.1979 Nov 25;254(22): 11591-7.

9. Jung GH, Leavitt MC, Schultz M, Ito J. // Site-specific mutagenesis of PRD1 DNA polymerase: mutations in highly conserved regions of the family В DNA polymerase. Biochem Biophys Res Commun. 1990 Aug 16;170(3):1294-300.

10. Esteban J A, Soengas MS, Salas M, Blanco L. // 3'~>5' exonuclease active site of phi 29 DNA polymerase. Evidence favoring a metal ion-assisted reaction mechanism. J Biol Chem. 1994 Dec 16;269(50):31946-54.

11. Frey MW, Nossal NG, Capson TL, Benkovic SJ. // Construction and characterization of a bacteriophage T4 DNA polymerase deficient in 3'->5' exonuclease activity. Proc Natl Acad SciU S A. 1993 Apr l;90(7):2579-83.

12. Romberg, A., and Baker, T. A. (1992). // "DNA Replication." Freeman, New York

13. Yang B, Gathy KN, Coleman MS. // Mutational analysis of residues in the nucleotide binding domain of human terminal deoxynucleotidyl transferase. J Biol Chem. 1994 Apr 22;269(16): 11859-68.

14. Zhu W, Ito J. //Family A and family В DNA polymerases are structurally related: evolutionary implications. Nucleic Acids Res. 1994 Dec 11;22(24):5177-83.

15. Basu S, Basu A, ModakMJ.//Pyridoxal 5'-phosphate mediated inactivation of Escherichia coli DNA polymerase I: identification of lysine-635 as an essential residue for the processive mode of DNA synthesis. Biochemistry. 1988 Sep 6;27(18):6710-6.

16. Romberg A. // DNA replication. San Francisco: W.H. Freeman and Co., 1980. P. 1-726; Kornberg A Supplement to DNA replication. San Francisco: W.H. Freeman and Co.,1982. P. 1203.

17. Краевский А. А., Куханова M.K. Итоги науки и техники. Серия Молекулярная биология. 1986. Т. 22. С. 3-164.

18. Beese LS, Friedman JM, Steitz ТА. // Crystal structures of the Klenow fragment of DNA polymerase I complexed with deoxynucleoside triphosphate and pyrophosphate. Biochemistry.1993 Dec 28,32(51): 14095-101.

19. Polesky AH, Dahlberg ME, Benkovic SJ, Grindley ND, Joyce CM. // Side chains involved in catalysis of the polymerase reaction of DNA polymerase I from Escherichia coli. JBiol Chem. 1992 Apr 25;267(12):8417-28.

20. Pandey VN, Kaushik N, Sanzgiri RP, Patil MS, Modak MJ, Barik S. // Site directed mutagenesis of DNA polymerase I (Klenow) from Escherichia coli.The significance of Arg682 in catalysis. Eur JBiochem. 1993 May 15;214(l):59-65.

21. Blanco L, Bernad A, Blasco MA, Salas M. // A general structure for DNA-dependent DNA polymerases. Gene. 1991 Apr;100:27-38.

22. Morrison A, Bell JB, Kunkel ТА, Sugino A. // Eukaryotic DNA polymerase amino acid sequence required for 3'—5' exonuclease activity. ProcNatl Acad Sci USA. 1991 Nov l;88(21):9473-7.

23. Beese LS, Steitz ТА. // Structural basis for the 3-5' exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism. EMBO J. 1991 Jan;10(l):25-33.

24. Derbyshire. V., Pinsonneault. J. K., and Joyce, С. M. // (1995). In "Methods in Enzymology" (J. L. Campbell, ed.), Vol. 262, pp. 363-388. Academic Press. San Diego)

25. Derbyshire V, Freemont PS, Sanderson MR, Beese L, Friedman JM, Joyce CM, Steitz ТА. // Genetic and crystallographic studies of the 3',5'-exonucleolytic site of DNA polymerase I. Science. 1988 Apr 8;240(4849): 199-201.

26. Derbyshire V, Pinsonneault JK, Joyce CM. // Structure-function analysis of 3'->5'-exonuclease of DNA polymerases. Methods Enzymol. 1995;262:363-85.

27. Echols H, Goodman MF. // Fidelity mechanisms in DNA replication. Annu Rev Biochem. 1991;60:477-511.

28. Kunkel ТА. // DNA replication fidelity. J Biol Chem. 1992 Sep 15;267(26): 18251-4.

29. Derbyshire V, Grindley ND, Joyce CM.// The 3-5' exonuclease of DNA polymerase I of Escherichia coli: contribution of each amino acid at the active site to the reaction. EMBO1. J. 1991 Jan;10(l): 17-24.

30. Beese LS, Derbyshire V, Steitz ТА. // Structure of DNA polymerase I Klenow fragment bound to duplex DNA. Science. 1993 Apr 16;260(5106):352-5.

31. Freemont PS, Friedman JM, Beese LS, Sanderson MR, Steitz ТА. // Cocrystal structure of an editing complex of Klenow fragment with DNA. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Dec;85(23):8924-8.

32. Joyce CM, Steitz ТА.// Function and structure relationships in DNA polymerases. Annu RevBiochem. 1994;63:777-822.

33. Cowart M, Gibson KJ, Allen DJ, Benkovic SJ. // Substrate structural requirements for the exonuclease and polymerase activities of procaryotic and phage DNA polymerases. Biochemistry. 1989 Mar 7;28(5): 1975-83.

34. Arnold E, Jacobo-Molina A, Nanni RG, Williams RL, Lu X, Ding J, Clark AD Jr, Zhang A, Ferris AL, Clark P, et al. // Structure of HIV-1 reverse transcriptase/DNA complex at 7 A resolution showing active site locations. Nature. 1992 May 7;357(6373):85-9.

35. Lyamichev V, Brow MA, Dahlberg JE. // Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. Science. 1993 May 7;260(5109):778-83.

36. Lundquist RC, Olivera BM. // Transient generation of displaced single-stranded DNA during nick translation. Cell. 1982 Nov;31(l):53-60.

37. Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand DH. // Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5'—3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA. 1991 Aug 15;88(16):7276-80.

38. Gutman PD, Minton KW.// Conserved sites in the 5'-3'exonuclease domain of

39. Escherichia coli DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 1993 Sep ll;21(18):4406-7.

40. Kim Y, Eom SH, Wang J, Lee DS, Suh SW, Steitz ТА. // Crystal structure of Thermus aquaticus DNA polymerase. Nature. 1995 Aug 17;376(6541):612-6.

41. Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых кислот / под. ред. акад. Спирина А. С. Москва: Высшая школа 1990, С. 46.

42. Gibbs JS, Chiou НС, Bastow KF, Cheng YC, Coen DM. // Identification of amino acids in herpes simplex virus DNA polymerase involved in substrate and drug recognition. Proc Natl Acad Sci USA. 1988 Sep;85(18):6672-6.

43. Larder BA, Kemp SD, Darby G. // Related functional domains in virus DNA polymerases. EMBO J. 1987 Jan;6(l): 169-75.

44. Knopf CW. // The herpes simplex virus type 1 DNA polymerase gene: site of phosphonoacetic acid resistance mutation in strain Angelotti is highly conserved. J Gen Virol. 1987 May;68 ( Pt 5): 1429-33.

45. Bernad A, Zaballos A, Salas M, Blanco L. // Structural and functional relationships between prokaryotic and eukaryotic DNA polymerases. EMBO J. 1987 Dec 20;6(13):4219-25.

46. Delarue M, Poch 0, Tordo N, Moras D, Argos P. //An attempt to unify the structure of polymerases. Protein Eng. 1990 May;3(6):461-7.

47. Poch O, Sauvaget I, Delarue M, Tordo N. // Identification of four conserved motifs among the RNA-dependent polymerase encoding elements. EMBO J. 1989 Dec 1;8(12):3867-74.

48. Bernad A, Blanco L, Salas M. // Site-directed mutagenesis of the YCDTDS amino acid motif ofthe phi 29 DNA polymerase. Gene. 1990 Sep 28;94(1):45-51.

49. Polesky AH, Steitz ТА, Grindley ND, Joyce CM. // Identification of residues critical for the polymerase activity of the Klenow fragment of DNA polymerase I from Escherichia coli. J Biol Chem. 1990 Aug 25,265(24): 14579-91.

50. Reha-Krantz LJ, Nonay RL. // Motif A of bacteriophage T4 DNA polymerase: role in primer extension and DNA replication fide lity. Isolation of new antimutator and mutator DNA polymerases. J Biol Chem. 1994 Feb 25;269(8):5635-43.

51. Copeland WC, Wang TS. // Mutational analysis of the human DNA polymerase alpha. The most conserved region in alpha-like DNA polymerases is involved in metal-specific catalysis.

52. J Biol Chem. 1993 May 25;268(15):11028-40.

53. Osumi-Davis PA, de Aguilera MC, Woody RW, Woody AY. // Asp537, Asp812 are essential and Lys631, His811 are catalytically significant in bacteriophage T7 RNA polymerase activity. J MolBiol. 1992 Jul 5;226(l):37-45.

54. Bonner G, Patra D, Lafer EM, SousaR. // Mutations in T7 RNA polymerase that support the proposal for a common polymerase active site structure. EMBO J. 1992 0<Л;11(10):3767-75.

55. Polesky AH, Dahlberg ME, Benkovic SJ, Grindley ND, Joyce CM. // Side chains involved in catalysis of the polymerase reaction of DNA polymerase I from Escherichia coli. J Biol Chem. 1992 Apr 25;267(12):8417-28.

56. Larder BA, Purifoy DJ, Powell KL, Darby G. // Site-specific mutagenesis of AIDS virus reverse transcriptase. Nature. 1987 Jun 25-Jul l;327(6124):716-7.

57. Date T, Yamamoto S, Tanihara K, Nishimoto Y, Matsukage A. // Aspartic acid residues at positions 190 and 192 of rat DNA polymerase beta are involved in primer binding. Biochemistry. 1991 May 28;30(21):5286-92.

58. Ollis DL, Brick P, Hamlin R, Xuong NG, Steitz ТА. // Structure of large fragment of Escherichia coli DNA polymerase I complexed with dTMP. Nature. 1985 Feb 28-Mar 6;313(6005):762-6.

59. Sawaya MR, Pelletier H, Kumar A, Wilson SH, Kraut J. // Crystal structure of rat DNA polymerase beta: evidence for a common polymerase mechanism. Science. 1994 Jun 24;264(5167): 1930-5.

60. RodgersDW, Gamblin SJ, Harris BA, Ray S, Culp JS, Hellmig B, Woolf DJ, Debouck C, Harrison SC. // The structure of unliganded reverse transcriptase from the human immunodeficiency virus type 1. ProcNatl Acad Sci USA. 1995 Feb 14;92(4): 1222-6.

61. Sousa R, Chung YJ, Rose JP, Wang ВС. // Crystal structure of bacteriophage T7 RNA polymerase at 3.3 A resolution. Nature. 1993 Aug 12;364(6438):593-9.

62. Doublie S, Sawaya MR, Ellenberger T. // An open and closed case for all polymerases. Structure Fold Des. 1999 Feb 15;7(2):R31-5.

63. Carroll SS, Cowart M, Benkovic SJ. // A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 1991 Jan 22;30(3):804-13.

64. Wang J, Sattar AK, Wang CC, Karam JD, Konigsberg WH, Steitz ТА. // Crystal structure of a pol alpha family replication DNA polymerase from bacteriophage RB69. Cell. 1997 Jun 27;89(7): 1087-99.

65. Tuerk C, Eddy S, Parma D, Gold L. // Autogenous translational operator recognized by bacteriophage T4 DNA polymerase. J Mol Biol. 1990 Jun 20;213(4):749-61.

66. Edgell DR, Doolittle WF. //Archaea and the origin(s) of DNA replication proteins. Cell. 1997 Jun 27;89(7):995-8.

67. Doublie S, Tabor S, Long AM, Richardson CC, Ellenberger T. // Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution. Nature. 1998 Jan 15;391(6664):251-8.

68. Copeland WC, Lam NK, Wang TS. // Fidelity studies of the human DNA polymerase alpha. The most conserved region among alpha-like DNA polymerases is responsible for metal-induced infidelity in DNA synthesis. J Biol Chem. 1993 May 25;268( 15): 11041-9.

69. Blanco L, Bernad A, Salas M. // Evidence favouring the hypothesis of a conserved 3-5' exonuclease active site in DNA-dependent DNA polymerases. Gene. 1992 Mar 1;112(1): 139-44.

70. Reha-Krantz LJ, Nonay RL.// Genetic and biochemical studies of bacteriophage T4 DNA polymerase 3'->5'-exonuclease activity. J Biol Chem. 1993 Dec 25;268(36):27100-8.

71. Abdus Sattar AK, Lin TC, Jones C, Konigsberg WH. // Functional consequences and exonuclease kinetic parameters of point mutations in bacteriophage T4 DNA polymerase.

72. Biochemistry. 1996 Dec 24;35(51): 16621-9.

73. Chien A, Edgar DB, Trela JM. // Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. JBacteriol. 1976 Sep;127(3): 1550-7.

74. Kaledin AS, Sliusarenko AG, Gorodetskii SI. // Isolation and properties of DNA polymerase from extreme thermophylic bacteria Thermus aquaticus YT-1. Biokhimiia. 1980 Apr;45(4):644-51. Russian.

75. Lawyer FC, Stoffel S, Saiki RK, Myambo K, Drummond R, Gelfand DH. // Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 1989 Apr 15;264(ll):6427-37.

76. Longley MJ, Bennett SE, Mosbaugh DW. // Characterization of the 5' to 3' exonuclease associated with Thermus aquaticus DNA polymerase. Nucleic Acids Res. 1990 Dec 25;18(24):7317-22.

77. Abramson R, Stoffel S, Gelfand DH. // Extension rate and procecivity of Thermus aquaticus DNA polymerase. FASEB 1990 J4 A2293.

78. Knittel T, Picard D.// PCR with degenerate primers containing deoxyinosine fails with Pfu DNA polymerase. PCR Methods Appl. 1993 May;2(4):346-7.

79. Slupphaug G, Alseth I, Eftedal I, Volden G, Krokan HE. // Low incorporation of dUMP by some thermostable DNA polymerases may limit their use in PCR amplifications. Anal Biochem. 1993 May 15,211(1): 164-9.

80. Barnes WM. // The fidelity of Taq polymerase catalyzing PCR is improved by an N-terminal deletion. Gene. 1992 Mar 1;112(1):29-35.

81. Ruttimann C, Cotoras M, Zaldivar J, Vicuna R. // DNA polymerases from the extremely thermophilic bacterium Thermus thermophilus HB-8. Eur J Biochem. 1985 May 15;149(l):41-6.

82. Carballeira N, Nazabal M, Brito J, Garcia O. // Purification of a thermostable DNA polymerase from Thermus thermophilus HB8, useful in the polymerase chain reaction.

83. Biotechniques. 1990 Sep;9(3):276-81.

84. Bechtereva ТА, Pavlov YI, Kramorov VI, Migunova B, Kiselev 01. // DNA sequencing with thermostable Tet DNA polymerase from Thermus thermophilus. Nucleic Acids Res. 1989 Dec 25;17(24): 10507.

85. Kaledin AS, Sliusarenko AG, Gorodetskii SI. // Isolation and properties of DNA-polymerase from the extreme thermophilic bacterium Thermus flavus. Biokhimiia. 1981 Sep;46(9): 1576-84. Russian.

86. Kaledin AS, Sliusarenko AG, Gorodetskii SI. // Isolation and properties of DNA polymerase from the extreme thermophilic bacterium Thermus ruber. Biokhimiia. 1982 Nov;47(l 1): 178591. Russian.

87. Park JH, Kim JS, Kwon ST, Lee DS. // Purification and characterization of Thermus caldophilus GK24 DNA polymerase. Eur JBiochem. 1993 May 15;214(l):135-40.

88. Day DJ, Saul DJ, Reeves RA, Bergquist PL. A solid-phase assay for thermophilic DNA polymerases. Anal Biochem. 1993 May 15;211(1): 174-6.

89. Mattila P, Korpela J, Tenkanen T, Pitkanen K. // Fidelity of DNA synthesis by the Thermococcus litoralis DNA polymerase—an extremely heat stable enzyme with proofreading activity. Nucleic Acids Res. 1991 Sep 25;19(18):4967-73.

90. Мол. Биол.клетки Б.Альберте, Д.Брей, М.Рэфф изд. Москва, Мир, 1994.

91. DeLong EF, Wu KY, Prezelin BB, Jovine RV. // High abundance of Archaea in Antarctic marine picoplankton. Nature. 1994 Oct 20;371(6499).695-7.

92. Barns SM, Delwiche CF, Palmer JD, Pace NR. // Perspectives on archaeal diversity, thermophily and monophyly from environmental rRNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA. 1996 Aug 20;93(17):9188-93.

93. Rees DC, Adams MW. // Hyperthermophiles: taking the heat and loving it. Structure. 1995 Mar 15;3(3):251-4.

94. Edgell DR, Klenk HP, Doolittle WF. // Gene duplications in evolution of archaeal family В DNA polymerases. J Bacterid. 1997 Apr; 179(8):2632-40.

95. MathurEJ, Adams MW, Callen WN, Cline JM. // The DNA polymerase gene from the hyperthermophilic marine archaebacterium, Pyrococcus furiosus, shows sequence homology with alpha-like DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1991 Dec 25;19(24):6952.

96. Uemori T, Ishino Y, Toh H, Asada K, Kato I. // Organization and nucleotide sequence of the DNA polymerase gene from the archaeon Pyrococcus furiosus. Nucleic Acids Res. 1993 Jan 25;21(2):259-65.

97. Lundberg KS, Shoemaker DD, Adams MW, Short JM, Sorge J A, Mathur EJ. // High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. Gene. 1991 Dec l;108(l):l-6.

98. Jannasch, J., W., Wirsen, С. O., Molyneaux, S. J., and Langworthy,T-A. // (1992). Appl. Environ. Microbiol. 58, 3472-3481.

99. Ishino Y, Komori K, Cann DC, Koga Y. // A novel DNA polymerase family found in Archaea. J Bacteriol. 1998 Apr; 180(8):2232-6.

100. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. // Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;23 0(4732): 1350-4.

101. Keohavong P, Kat AG, Cariello NF, Thilly WG. // DNA amplification in vitro using T4 DNA polymerase. DNA. 1988 Jan-Feb;7(l):63-70.

102. Keohavong P, Wang CC, Cha RS, Thilly WG. // Enzymatic amplification and characterization of large DNA fragments from genomic DNA. Gene. 1988 Nov 15;71(1):211-6.

103. Tabor S, Richardson CC.// DNA sequence analysis with a modified bacteriophage T7 DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA. 1987 Jul;84(14):4767-71.

104. Barnes WM. // PCR amplification of u p to 35-kb DNA with high fidelity and high yield from lambda bacteriophage templates. Proc Natl Acad Sci USA. 1994 Mar15;91(6):2216-20.

105. Cheng S, Chang SY, Gravitt P, Respess R. // Long PCR. Nature. 1994 Jun 23;369(6482):684-5.

106. Cohen J. // 'Long PCR' leaps into larger DNA sequences. Science. 1994 Mar 18;263(5153):1564-5.

107. Mariame B. // Cycle sequencing protocol using deep VentR (exo-) DNA polymerase and reduced dNTP and alpha-35S.dATP concentrations. Biotechniques. 1996 Jul;21(l): 18-9.

108. Tabor S, Richardson CC. II A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides. Proc Natl Acad Sci USA. 1995 Jul 3;92(14):6339-43.

109. Laemmli UK.// Cleavage of structural p roteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970 Aug 15;227(259):680-5.

110. Dang C, Jayasena SD. // Oligonucleotide inhibitors of Taq DNA polymerase facilitate detection of low copy number targets by PCR. J Mol Biol. 1996 Nov 29;264(2):268-78.

111. Pisani FM, De Martino C, Rossi M.// A DNA polymerase from the archaeon Sulfolobus solfataricus shows sequence similarity to family В DNA polymerases. Nucleic Acids Res. 1992 Jun ll;20(ll):2711-6.

112. Pisani FM, Rossi M.// Evidence that an archaeal alpha-like DNA polymerase has amodular organization of its associated catalytic activities. J Biol Chem. 1994 Mar 18;269(11):7887-92.

113. Konisky J, Paule SM, Carinato ME, Kansy JW. // The DNA polymerase gene from the methanogenic archaeon Methanococcus voltae.J Bacteriol. 1994 Oct; 176(20):6402-3.

114. Klimczak LJ, Grummt F, Burger KJ. (1986) Biochemistry 25, 4850-4855.

115. Klimczak LJ, Grummt F, Burger KJ.// Purification and characterization of DNA polymerase from the archaebacterium Sulfolobus acidocaldarius. Nucleic Acids Res. 1985 Jul 25;13(14):5269-82.

116. Scharf, S.G. (1990) Cloning with PCR, Academic Press, San Diego,California.

117. New England Biolabs catalog 1998/1999

118. Yeh MF, Trela JM. // Purification and characterization of a repressible alkaline phosphatase from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 1976 May 25;251(10):3134-9.

119. Catterall JF, Welker NE.// Isolation and properties of a thermostable restriction endonuclease (ENDO R-Bst 1503). J Bacteriol. 1977 Feb;129(2): 1110-20.

120. Wedler FC, Kenney RM, Ashour AE, Carfi J. // Two regulatory isozymes of glutamine synthetase from Bacillus caldolyticus, an extreme thermophile. Biochem Biophys Res Commun. 1978 Mar 15;81(1): 122-6.

121. Chien A, Edgar DB, Trela JM. // Deoxyribonucleic acid polymerase from the extreme thermophile Thermus aquaticus. J Bacteriol. 1976 Sep;127(3): 1550-7.

122. Kaledin AS, Sliusarenko AG, Gorodetskii SI. // Isolation and properties of DNA polymerase from extreme thermophylic bacteria Thermus aquaticus YT-1 Biokhimiia. 1980 Apr; 45 (4): 644-51. Russian.

123. Fabry M, Sumegi J, Venetianer P. // urification and properties of the RNA polymerase of an extremely thermophilic bacterium: Thermus aquaticus T2. Biochim Biophys Acta, 1976 Jul ;435(3):228-35.

124. Perler FB, Kumar S, Kong H. // Thermostable DNA polymerases. Adv Protein Chem. 96;48: 377-435.

125. Harald, H. (1998) J. Biotechnology, 64, 39-52.

126. Takagi M, Nishioka M, Kakihara H, Kitabayashi M, Inoue H, Kawakami В, Oka M, Imanaka T. // Characterization of DNA polymerase from Pyrococcus sp. strain KOD1 and its application to PCR. Appl Environ Microbiol. 1997 Nov;63(l 1):4504-10.

127. Delarue M, Poch 0, Tordo N, Moras D, Argos P.// An attempt to unify the structure of polymerases. Protein Eng. 1990 May;3(6):461-7.

128. Beese LS, Friedman JM, Steitz ТА. // Crystal structures of the Klenow fragment of DNA polymerase I complexed with deoxynucleoside triphosphate and pyrophosphate. Biochemistry. 1993 Dec 28;32(51): 14095-101.

129. Li Y, Korolev S, Waksman G. // Crystal structures of open and closed forms of binary and ternary complexes of the large fragment of Thermus aquaticus DNA polymerase I: structural basis for nucleotide incorporation. EMBO J. 1998 Dec 15;17(24):7514-25.

130. Doublie S, Tabor S, Long AM, Richardson CC, Ellenberger T. // Crystal structure of a bacteriophage T7 DNA replication complex at 2.2 A resolution. Nature. 1998 Jan 15;391(6664):251-8.

131. Polesky AH, Steitz ТА, Grindley ND, Joyce CM. // Identification of residues critical for the polymerase activity of the Klenow fragment of DNA polymerase I from Escherichiacoli. J Biol Chem. 1990 Aug 25;265(24): 14579-91.

132. Catalano CE, Allen DJ, Benkovic SJ.// Interaction of Escherichia coli DNA polymerase I with azidoDNA and fluorescent DNA probes: identification of protein-DNA contacts. Biochemistry. 1990 Apr 17;29(15):3612-21.

133. Jung GH, Leavitt MC, Schultz M, Ito J. // Site-specific mutagenesis ofPRDl DNA polymerase: mutations in highly conserved regions of the family В DNA polymerase. Biochem Biophys Res Commun. 1990 Aug 16; 170(3): 1294-300.

134. Blasco MA, Lazaro JM, Bernad A, Blanco L, Salas M. // Phi 29 DNA polymerase active site. Mutants in conserved residues Tyr254 and Tyr390 are affected in dNTP binding. J Biol Chem. 1992 Sep 25;267(27): 19427-34.

135. Jung GH, Leavitt MC, Schultz M, Ito J. // Site-specific mutagenesis of PRD1 DNA polymerase: mutations in highly conserved regions of the family В DNA polymerase. Biochem Biophys Res Commun. 1990 Aug 16;170(3):1294-300.

136. Blanco L, Bernad A, Blasco MA, Salas M . // A general structure for DNA-dependent DNA polymerases. Gene. 1991 Apr; 100:27-3 8.

137. Dong Q, Copeland WC, Wang TS. // Mutational studies of human DNA polymerase alpha. Identification of residues critical for deoxynucleotide binding and misinsertion fidelity of DNA synthesis. J Biol Chem. 1993 Nov 15;268(32):24163-74.

138. Zhu W, Leavitt MC, Jung G, Ito J. // Mutagenesis of a highly conserved lysine 340 of the PRD1 DNA polymerase. Biochim Biophys Acta. 1994 Oct 18;1219(2):260-6.

139. Dong Q, Wang TS. // Mutational studies of human DNA polymerase alpha. Lysine 950 in the third most conserved region of alpha-like DNA polymerases is involved in binding the deoxynucleoside triphosphate. J Biol Chem. 1995 Sep 15;270(37):21563-70.

140. Wang J, Sattar AK, Wang CC, Karam JD, Konigsberg WH, Steitz ТА. // Crystal structure of a pol alpha family replication DNA polymerase from bacteriophage RB69. Cell. 1997 Jun 27;89(7): 1087-99.

141. Corpet F. // Multiple sequence alignment with hierarchical clustering. Nucleic Acids Res. 1988 Nov 25; 16(22): 10881-90.

142. Higgins DG, Sharp PM. // CLUSTAL: a package for performing multiple sequence alignment on a microcomputer. Gene. 1988 Dec 15;73(l):237-44.

143. Higgins DG, Sharp PM. // Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer. Comput Appl Biosci. 1989 Apr;5(2):151-3.

144. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA, Arnheim N. // Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science. 1985 Dec 20;230(4732): 1350-4.

145. Mullis KB, Faloona FA. // Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-catalyzed chain reaction. Methods Enzymol. 1987;155:335-50.

146. Vallette F, Mege E, Reiss A, Adesnik M. // Construction of mutant and chimeric genes using the polymerase chain reaction. Nucleic Acids Res. 1989 Jan 25; 17(2):723-33.

147. Higuchi R, Krummel B, Saiki RK.// A general method of in vitro preparation and specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucleic Acids Res. 1988 Aug 11;16(15):7351-67.

148. Yon J, Fried M. // Precise gene fusion by PCR. Nucleic Acids Res. 1989 Jun 26;17(12):4895.

149. Horton RM, Hunt HD, Ho SN, Pullen JK, Pease LR. // Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 1989 Apr 15;77(1):61-8.

150. Ho SN, Hunt HD, Horton RM, Pullen JK, Pease LR. // Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. Gene. 1989 Apr 15,77(1):51-9.

151. Niu XD, Stoops JK, Reed LJ. // Overexpression and mutagenesis of the catalytic domain of dihydrolipoamide acetyltransferase from Saccharomyces cerevisiae. Biochemistry. 1990 Sep 9(37): 8614-9.

152. Yang G, Lin T, Karam J, Konigsberg WH. // Steady-state kinetic characterization of RB69 DNA polymerase mutants that affect dNTP incorporation. Biochemistry. 1999 Jun 22;3 8(25): 8094-101.

153. Jung GH, Leavitt MC, Schultz M, Ito J. // Site-specific mutagenesis of PRD1 DNA polymerase: mutations in highly conserved regions of the family В DNA polymerase. Biochem Biophys Res Commun. 1990 Aug 16;170(3): 1294-300.

154. KaushikN, Pandey VN, ModakMJ.// Significance of the O-helix residues of Escherichia coli DNA polymerase I in DNA synthesis: dynamics of the dNTP binding pocket. Biochemistry. 1996 Jun 4;35(22):7256-66.

155. Dong Q, Copeland WC, Wang TS. // Mutational studies of human DNA polymerase alpha. Identification of residues critical for deoxynucleotide binding and misinsertion fidelity of DNA synthesis. J Biol Chem. 1993 Nov 15;268(32):24163-74.

156. Saturno J, Lazaro JM, Esteban FJ, Blanco L, Salas M. // o29 DNA polymerase residue Lys383, invariant at motif В of DNA-dependent polymerases, is involved in dNTP binding. J Mol Biol. 1997 Jun 13;269(3):313-25.

157. Nixon. A.N. Ostermeier.M. and Benkovie.S.J. // Hybrid enzymes: manipulating enzyme design. Trends Biotechnol. 1998 Jun; 16(6):258-64.

158. Kim Y, Eom SH, Wang J, Lee DS, Suh SW, Steitz ТА. // Crystal structure of Thermus aquaticus DNA polymerase. Nature. 1995 Aug 17;376(6541):612-6.

159. Michael R. Slater et all. Patent PRMG-01175 Thermophilic DNA polymerase from Thermotoga Neapoletana 1995.

160. Beguin P. // Hybrid enzymes. Curr Opin Biotechnol. 1999 Aug; 10(4):336-40.

161. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. // (1989) Molecular cloning, Cold Spring Harbor, N.Y.