Тетрагидротиамин, его фосфорилированные производные и действие их на активность тиаминзависимых ферментов в тканях животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Забродская, Светлана Викторовна

• Забродская, Светлана Викторовна
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Забродская, Светлана Викторовна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизм каталитического действия витамина Bj

1.2. Влияние различных АТР:фосфотрансфераз и фосфатаз на метаболизм витамина Bj и его фосфорилированных производных

1.3. Транспорт биологически активной формы витамина Bj.

1.4. Структурные аналоги витамина Bj в исследовании тиаминзависимых ферментативных систем.

ГЛАВА 2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Обоснование методов получения и идентификации фосфорилированных производных тетрагидротиамина.

2.2. Обоснование методов изучения антивитаминной активности тетрагидротиамина и его фосфорилированных производных

2.3. Другие методы исследования

ГЛАВА 3. ПОЛУЧЕНИЕ, ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ, ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТЕТРАГИДРОТИАМИНА И

ЕГО ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ.

ГЛАВА 4. ТИАМИНЗАВИСИМЫЕ ФОРМЫ, УРОВЕНЬ СВОБОДНОЙ И КОФЕРМЕНТНОЙ ФОРМ ВИТАМИНА Bj ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ АНТИВИТАМИННЫХ СВОЙСТВ ТЕТРА-ГИДРОТИАМИНА И ЕГО ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

4.1. Зависимость от дозы и длительности действия

4.2. Влияние способа введения исследуемых препаратов

4.3. Последействие высоких доз тетрагидротиа-мина, его О-монофосфорного и 0-дифосфорного эфиров при подкожном введении

4.4. Антикоферментное действие тетрагидротиа-миндифосфата на пируватдегидрогеназный комплекс из митохондрий коры надпочечников быка.

4.5. Тетрагидротиаминтрифосфат - новый антивитамин витамина Bj

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Тетрагидротиамин, его фосфорилированные производные и действие их на активность тиаминзависимых ферментов в тканях животных»

Современные методы исследования экспериментальной витаминологии, химиотерапии невозможно представить без использования структурных аналогов природных физиологически активных соеди -нений.

Значительную группу подобных соединений представляют собой антивитамины. В клинике успешно применяются метатрексат, дику-марол, сульфаниламиды и другие высокоэффективные терапевтические препараты, созданные на антивитаминной основе (Островский, 1983).

Антивитаминные производные витамина Bj ампрол и хлоротиа-мин используются в ветеринарии для лечения кокцидиозных состояний у домашних животных (Труфанов, 1972).

Другие производные тиамина окситиамин и пиритиамин применяются в экспериментальной витаминологии для моделирования Bj-авитаминозных состояний (Островский, 1979).

Структурные изменения молекулы витамина Bj придают ей специфические антивитаминные свойства, позволяющие использовать их для направленного изучения тиаминзависимых ферментативных систем. Поиск подобного рода соединений актуален в плане дальнейшего развития представлений о механизмах тиаминового катализа, строении и функциях тиаминовых ферментов, изыскания новых возможных путей регуляции обмена веществ с участием витамина Bj в организме животных и человека.

Особенно остро в настоящее время стоит вопрос исследования Bj -к патологических состояний у людей. Ряд "болезней цивилизации" - неврозы, тучность, ожирение, ранний атероскле -роз, гипертония, ишемическая болезнь сердца, алкоголизм, расстройство функций органов пищеварения сопровождается Bj-ави-таминозным фоном.

Тиаминовый катализ главным образом определяется функциональным состоянием тиазоловой части молекулы витамина Bj (Островский, 1975). Гидрирование тиамина по 2, 3 и Ч, 5-двой -ным связям тиазолового кольца, естественно, приводит к каталитически неактивному производному витамина Bj-тетрагидротиа-мину (Пюльман Б., Пюльман А., 1965). Синтез тт осуществлен в 1957 году ( Bonvicino , Hennessy ). В опытах с меченым по сере тт (0,5 мг/кг) на крысах показано интенсивное выведение данного аналога витамина Bj в мочу через 0,5 часа после подкожного введения (Островский, Доста, 1967). Сочетанная подкожная инъекция животным меченого Bj и 10-кратного количества немеченного тт приводила к накоплению радиоактивной метки через I час в печени и почках (Островский, Доста, Садовник, 1970). Полученные результаты свидетельствовали об отсутствии связывания тт , его влияния на механизмы физиологического транспорта и эксреции витамина Bj в организме животных. Величина активностей И)Р -зависимых ферментов, уровень кофермент-ной формы витамина в тканях животных в обоих случаях не определялись.

Позднее была найдена причина индифферентности тт к распределению в различных тканях животного - препарат не взаимодействовал с атр :тиаминпирофосфотрансферазой (КФ 2.7.6.2.), (Воскобоев, Черникевич, Островский, 1976). Это исключало возможность связывания данного соединения в виде антикофермент-ного аналога.

В свою очередь исключались и эффекты тг на путях неспецифического связывания витамина Bj за счет тиол-дисульфидных превращений (Островский, Доста, Садовник и др., 1970).

Тем не менее, О-дифосфорный эфир тт на очищенных из дрожжей апоферментных белках пируватдекарбоксилазе (КФ 4.1 Л Л.), ( Wittorf , Gubler , 1971) и транскетолазе (КФ 2.2.I.I.) ( Heinrich , Steffen , Janser a.oth. » 1972, Heinrich, Schmidt , Noack , 1974) зарекомендовал себя как конкурентный ингибитор с аномально высоким сродством по сравнению с otdp , ртdp и 0—дифосфорными эфирами других различных производных витамина Bj.

Антивитаминные свойства ttdp , его метаболитов — ттмр > нефосфорилированного тт , более фосфорилированного производного 0-трифосфорного эфира тт , в условиях целостного организма с определением активности основных тиаминзависииых ферментных систем и уровня коферментной формы витамина Bj в тканях животных до сих пор не исследовались.

Целью настоящего исследования было сравнительное изучение антивитаминной активности тт и его фосфорилированных производных.

В связи с вышеизложенным задачами настоящей работы были:

- препаративное получение, доказательство структуры 0-фосфор-ных эфиров тт, характеристика основных физико-химических и фармакологических свойств тт,ттмр,ttdp,tttp.

- изучение антивитаминных свойств тт,ттмр,ттбр,тттр в условиях работы на животных через антикоферментную активность исследуемых соединений по отношению к тиаминзависимым ферментам - транскетолазе, пируватдегидрогеназе, -кетоглутарат-дегидрогеназе и уровню свободной и коферментной формы витамина в тканях.

В результате изучения влияния тт и его фосфорилированных производных на активность Bj-зависимых ферментов решена одна из актуальных задач современной биологической химии -изыскание химических соединений, обладающих Bj-антивитамин-ной активностью по отношению к тиаминовым ферментам в тканях животных, и тиаминзависимым ферментативным препаратам из животных тканей.

Научно-практическое значение полученных результатов состоит в следующем:

- 0-фосфорные эфиры тт впервые получены в препаративных количествах и охарактеризованы как индивидуальные химические соединения, определены их основные физико-химические и фар -макологические параметры;

- показана неперспективность использования тт,ттмр и ttdp в качестве антивитаминов тиамина при работе на животных в области экспериментальных Bj-витаминологических исследований (изучение транскетолазы, пируватдегидрогеназы, -ке-тоглутаратдегидрогеназы, уровня свободной и коферментной форм тиамина в тканях);

- впервые определена антивитаминная активность 0-дифос-форного эфира тт на тиаминзависимом ферменте животного происхождения - пируватдегидрогеназном комплексе, выделенном из митохондрий надпочечных желез крупного рогатого скота; TTDP рекомендуется к использованию в исследовании тиаминзависимых ферментативных препаратов животного происхождения;

- О-трифосфорный эфир тт охарактеризован как новый антагонист витамина Bj (Авторское свидетельство СССР № 792893), обладающий рядом преимуществ по сравнению с известными антивитаминами тиамина - окситиамином и пиритиамином; препарат рекомендуется для специфических исследований тиаминзависимых ферментных систем в условиях работы на животных, тт и его фосфорилированные производные широко используются в институте биохимии им.А.В.Палладина АН УССР при изучении механизмов регуляции активности пируватдегидрогеназного комплекса и механизмов взаимодействия производных тиамина с возбудимыми мембранами животных клеток, в экспериментальной практике Отдела регуляции обмена веществ АН БССР г.Гродно при исследовании высокоочиценных дегидрогеназных систем 2-оксо-кислот надпочечных желез крупного рогатого скота, уровня коферментной формы витамина Bj, уровня эндогенного эталона, при изучении обмена липидов у белых крыс.

Положения, выносимые на защиту:

- получение, идентификация 0-фосфорных эфиров тт , основные физико-химические и фармакологические параметры тт,ттмр, TTDP,TTTP;

- отсутствие выраженных антивитаминных свойств у тт ,ттмр, TTDP при различных экспериментальных условиях на животных;

- антивитаминное действие ttdp на пируватдегидрогеназ-ный комплекс, выделенный из митохондрий коры надпочечников крупного.рогатого скота;

- антивитаминные свойства тттр , квалифицирующие 0-три-фосфорный эфир тт как новое химическое соединение, обладающее Bj-антивитаминной активностью.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Забродская, Светлана Викторовна

Результаты исследования влияния тетрагидротиамина и его фосфорилированных производных на тиаминзависимые ферментные системы животного организма представляют интерес для студентов Гродненского медицинского института при изучении Bj-пато-логических состояний и широко используются в курсе лекций по медицинской физике и биологической химии.

Заведующий кафедрой медицинской физики Гродненского медицинского института кандидат биологических наук I ( Кузнецов Б. К.

Заведующий кафедрой биологической химии Гродненского медицинского института доцент Лукашик Н.К.

Руководитель патентного подразделения Гродненского медицинского института кандидат медицинских наук ^ ; Королев П.М, Младший научный сотрудник Отдела' регуляции обмена веществ АН БССР axaJL Забродская С.В, - C^R'gGb Г. ГС. ?5ве„.

V»'j^>;-:eECKcro гсскедг.клктута

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящее время у биохимиков, фармакологов и клиницистов заметно возрос интерес к биохимически активным веществам, в том числе, - к витаминам, их антагонистам. Эти соединения (природные, их синтетические аналоги) перспективны как в теоретическом плане при изучении процессов обмена веществ живого организма, так и в плане использования их для нужд народного хозяйства нашей страны.

Дифосфат тетрагидротиамина - антикоферментный аналог тиаминдифосфата, - известен более прочным связыванием по сравнению с нативным аналогом очищенным из дрожжей тиаминза-висимым апоферментным белкам- пируватдекарбоксилазой и тран-скетолазой.

В опытах на животных тетрагидротиаминдифосфат и другие фосфорилированные производные тетрагидротиамина до настоящего времени не исследовались.

Монофосфат, дифосфат и трифосфат тетрагидротиамина получены в препаративных количествах, идентифицированы как индивидуальные вещества.

Изучены физико-химические, фармакологические свойства и влияние полученных соединений на активность основных тиаминзависимых ферментов в тканях животных (транскетолаза, пируватдегидрогеназа и oC-кетоглутаратдегидрогеназа), уровень свободного и общего тиамина в ткани печени.

Незначительная и сходная биологическая активность 0-моно-фосфорного, О-дифосфорного эфира тетрагидротиамина и тетрагидротиамина, постоянный уровень общего тиамина в печени при достоверном изменении содержания свободного тиамина в той же ткани животных отражают объективные процессы, протекающие в животном организме под влиянием исследуемых соединений.

На наш взгляд суть данных процессов заключается в дефос-форилировании 0-фосфорных эфиров тетрагидротиамина и последующем влиянии вводимых соединений (в виде тетрагидротиамина) на физиологические механизмы транспорта витамина Bj.

Таким образом, отсутствие у тетрагидротиамина, тетрагид-ротиаминмонофосфата и тетрагидротиаминдифосфата выраженных антивитаминных свойств, реализуемых через антикрферментную по отношению к тиаминдифосфату активность, показало неперспективность использования указанных соединений в качестве антивитаминов тиамина при работе на животных.

Только трифосфат тетрагидротиамина, являясь новым химическим соединением, представляет собой высокоактивное соединение, обладающее рядом преимуществ по сравнению с известными антивитаминами тиамина - Авторское свидетельство № 792893 (СССР). Препарат эффективен в малых дозах (10 мг/кг), угнетает активность пируватдегидрогеназы в печени через 3 часа после подкожного введения на 58$, активность пируватдегидрогеназы в сердце - на 40%,

Тетрагидротиаминтрифосфат сравнительно мало токсичен, в организме животных не накапливается, обладает сильным антивитаминным эффектом лишь в короткие сроки опыта, не оказывая антивитаминного действия на транскетолазу и ol -кетоглутарат-дегидрогеназу в тканях животного.

Механизм антивитаминного действия тетрагидротиаминтри-фосфата основан на дефосфорилировании последнего при прохождении различного рода биомембран. Образующийся при этом, дифосфат тетрагидротиамина, обладает сильным антикофермент-ным действием. Результаты исследований с данным соединением на очищенном пируватдегидрогеназном комплексе из митохондрий коры надпочечников крупного рогатого скота подтверждают высокую антивитаминную активность тетрагидротиаминдифосфата, обнаруженную в 1971 году на дрожжевой пируватдекарбоксилазе.

Процесс дефосфорилирования трифосфата тетрагидротиамина является частным случаем общей ситуации/ поскольку транспорт нуклеотидов через биомембраны также происходит путем временного отщепления концевого гамма-фосфата.

Короткие сроки антивитаминного действия тетрагидротиамин-трифосфата свидетельствуют о дальнейшем гидролизе образующегося " de novo и тетрагидротиаминдифосфата до монофосфата тетрагидротиамина и тетрагидротиамина.

Избирательность действия тетрагидротиаминтрифосфата на тиаминзависимые ферменты животных тканей определяется свойствами самих ферментных систем.

Полученные с тетрагидротиаминтрифосфатом результаты позволяют рекомендовать новый антиметаболит тиамина как специфический агент для витаминологических исследований, в случае быстрого эффективного торможения активности пируватдегидрогеназы без повреждения других тиаминовых ферментов.

Тетрагидротиамин и его фосфорилированные производные широко применяются в экспериментальной практике Отдела регуляции обмена веществ АН БССР г.Гродно:при исследовании высоко-очищенных дегидрогеназных систем 2-оксокислот надпочечных желез крупного рогатого скота (акт внедрения от 18.01.1983г.), при исследовании уровня коферментной формы витамина Bj в тканях белых крыс (акт внедрения от 19.01.1983 г.), при изучении уровня эндогенного эталона у белых крыс (акт внедрения от 20.01.1983 г.), при изучении обмена липидов у белых крыс (акт внедрения от 19.05.1983 г.), 0-фосфорные эфиры тетрагидротиамина и нефосфорилированный тетрагидротиамин нашли применение в Киевском институте биохимии им.А.В.Палладина АН УССР при изучении механизмов регуляции активности пируватдегидрогеназного комплекса и механизмов взаимодействия производных тиамина с возбудимыми мембранами животных клеток (акт внедрения от 20.03.1984 г.).

Теоретические положения исследования антивитаминных свойств тетрагидротиамина, моно-, ди- и трифосфата тетрагидротиамина используются в курсе лекций по биологической химии и медицинской физике для студентов Гродненского медицинского института при изучении Bj-патологических состояний, различных видов обмена веществ (акт внедрения от II.05.1983 г.).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Забродская, Светлана Викторовна, 1984 год

1. В о с к о б о е в А.И., Ч е р н и к е в и ч Й.П., О с т р о в с к и й Ю.М. Фосфорилирование некоторых аналогов Bj дрожжевой тиаминпирофосфокиназой. - Биохимия. 1976, т.41, вып.Ю, C.I784-I787.

2. Г а л и ц к и й Э, А., О с т р о в с к и й Ю.М. К расшифровке молекулярных механизмов влияния тиамина на аденозинтрифоофатазную активность митохондрий печени крыс. -« В кн.: Митохондрии. Ферментативные процессы и их регуляция. М., 1968, с.52-54. 3. Г е р а с и м о в и ч А.И., М а т в е е в а Я.Н. Математическая статистика. - Минск: Вышейш.школа, 1978, -200 е., ил.

4. Г р е б е н с к а я Н.И. Тиаминдифосфатаза (тиаминпиро- фосфатаза), (К$ 3.6.1.6.) - В кн.: Кокарбоксилаза и другие тиаминфосфаты /Под ред.Ю.М.Островского - Минск, 1974, с.89-104.

5. Г р и н е в и ч В.П. Тиол-дисульфидные взаимодействия ТДС с некоторыми серусодержащими биологически активными соединениями. В кн.: Матер.2 Гродн.симп.по тиамину /Под ред.Ю.М.Островского - Гродно, 1972, с.31.

6. Д и к с о н М., У э б б 3. Ферменты: Пер.с англ. - М.: Мир, I982-II20 е. , ил.Гл.6. Специфичность действия ферментов, с,330-382. Гл.8, Ингибирование и активация ферментов, с.481-530.

7. Изучение взаимоотношений между тиамином, пантогеновой и парааминобензойной кислотами /Ю.М.О с т р о в с к и й , А.Г.М о й с е е н о к , В.И.Г о р е н ш т е й н и др. -В кн.: Украинский биохимический журнал. Киев, 1970, № Ч, C.508-5I6.

8. К ар п о в Л.М., Р о з а н о в А.Я. Динамика включе- н и я S "^^ ^ Bj и его фосфорных эфиров в клетки печени белых крыс разного возраста. - Вопр.мед.химии, 1977, т.23, №1, с.69-73.

9. Кинетические свойства о4-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса из грудной мышцы голубя /С.Е.С е в е р и н, В.С.Г о м а з к о в а , 0.3.К р а с о в с к а я и др. -В кн.: Биохимия, М., 1978, т.43, вып.12, с.2241-2248.

10. К о л т у н о в а В.И., Б е р е з о в с к и й В.М. Нуклеотиды, коферменты, фосфорные эфиры. 15. Изучение реакции фоофорилирования тиамина и его фосфорных эфиров. • Хим.фарм.журн., 1967, № 2, с.10-13.

11. К о ч е т о в Г.А. Структура и функция транскетолазы. - В кн.: Структура и функция ферментов /Под ред.С,Е.Северина - М., 1972, вып.1, C.III - I45.

12. К о ч е т о в Г.А. Тиаминовые ферменты. - М.: Наука, 1978, - 234 с , ил.

13. К р е ш к о в А.П. Степень электролитической диссоциации. •-В кн.: Основы аналитической химии, М., 1976, с.45.

14. К у з н е ц о в Б.К., О с т р о в с к и й Ю.М. Изучение действия ультразвука на очищенную дрожжевую пиру-ватдекарбоксилазу. - Изв.АН БССР. Сер.биол.н., 1975, № 3, с.37-38.

15. Л е б е д е в а А.И., Н о в о ж и л о в а И.В. Микрометод определения азота в органических соединениях. -Журн.анал.хим. 1967, т.22, вып.б, с.914-918.

16. Л е у с Н.$. Интенсивность обмена фосфорных эфиров тиамина в субклеточных структурах печени. - В кн.: Витамины /Под ред. Р.В.Чаговца - Киев, 1974, вып.7, с. 87-93.

17. Л у к и н A.M., Ч е р н ы ш е в а Т.Е. Объемное определение сульфатов с хлорофосфоназо-3.-Завод.лабор., 1968, Т.34, № 9, с.1054-1056.

18. Л у ч к о B.C., Ч е р н и к е в и ч И.П., В о с к о б о е в А.И. Высокоочищенная ТДФ-киназа из пивных дрожжей. - В кн.: б конф.биох.прибалт.республ., БССР и Ленингр. Тез.докл. (г.Рига, 12-15 октября I98I г . ) . Рига, I98I, с.266.

19. М е л е н т ь е в а Г.А. Пиримидино-тиазоловые витамины группы В. - В кн.: Фармацевтическая химия. М., 1976, т.2, с.б75-686.

20. Н а к а н и с и К. Инфракрасные спектры и строение органических соединений: Пер.с японс- М., Мир, 1965-185 с , ил.

21. Новые антогонисты витамина Bj нейротропного действия /Ю.М.О с т р о в с к и й , Т.И.З и м а т к и н а , Д.А. О п а р и н и др. - В кн.: Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. М., 1982, т.33, с.28-29.

22. Нуклеотиды, коферменты, фосфорные эфиры. Синтез кокар- боксилазы /В.М.Б е р е з о в с к и й , В.И.К о л т у н о-в а, И.Д.П е к е л ь и др. - В кн.: Журнал общей химии, М., 1963, т.33, ВЫП.1, с.49-55.

23. О коферментной регуляции активности тиаминдифосфатсодершащих ферментов /А.А.Р ы б и н а , Ю . М . П а р х о м е н -к о, Р.Б.П о л ь щ а к и др. - В кн.: Витамины /Под ред.Р.В.Чаговца - Киев, 1976, вып.9, с.47-48.

24. Определение активности транскетолазы и Bj ДФ-эффекта как показателя обеспеченности тиамином /В.Б.С п и р и -ч е в, Н.В.Б л а ж е в и ч, В.А.Й с а е в а и др. -В кн.: Вопросы питания. М., 1973, № б, с.б-11,

25. Определение фосфора по фосфорномолибденовой сини /А.К. Б а б R о, А.Т.П и л и п е н к о , И.В.П я т н и ц к и й и др. -!• в кн.: Физико-химические методы анализа. М., 1968, C.I48-I5I.

26. О с т р о в с к и й Ю.М., Д о с т а Г.А. Значение одновременного присутствия четвертичного азота тиазолового и аминогруппы пиримидинового компонентов тиамина для связывания тиамина тканями. - Биохимия, 1967, т.32, вып. 3, с.570-577.

27. О с т р о в с к и й Ю.М., Д о с т а Г.А., С а д о в н и к М.Н. О механизмах, обеспечивающих полифункциональность тиамина. - В кн.: Витамины /Под ред.Р.В.Чагов-ца "• Киев, 1970, вып.5, с.46-63.

28. П а н т е л е е в а Н.С. О молекулярных механизмах энергетических превращений в функциональных системах различной природы. - Вест.Ленингр.ун-та. Сер.биол. I98I, вып.4, № 21, с.23-29.

29. П а р х о м е н к о Ю.М., Р ы б и н а А.А., П о л ь- щ а к Р.Б. Разделение фосфорных эфиров тиамина на ка-тионобменном сефадексе. - Укр.(^ох1м, журн., 1976, т.48, с.384-387.

30. П ю л ь м а н Б., П ю л ь м а н А. Реакции, катализируемые тиаминпирофосфатом. - В кн.: Квантовая биохимия. М., 1965, C.5I7-533.

31. Р а й X м а н Л.М;, М а ш к о в с к и й Ю.Ш. Конфор- мационные переходы вК'^ .На"'"- зависимой АТФ-зе. - Биохимия, 1975, т.40, вып.1, с. 150-157.

32. Р о з а н о в А.Я. Метаболизм фосфорных эфиров тиами- на - S в 2ШВ0ТН0М организме. - Биохимия, I960, вып.б, C.99I-I000.

33. Р о з а н о в А.Я. Определение тиаминтрифоофата в тканях животных. - Биохимия, 1966, т.31, вып.З, с.386-389.

34. С т е п а н о в а Л.Н., Р о з а н о в А.Я. Распреде- ление и секреция меченого S •^ -^ -тиамина в пищеварительной системе крыс разного возраста. - Вопр.мед,химии, 1980, Т.26. № 5, с.663-668.

35. С т р у м и л о А., С е н к е в и ч СБ. , В и н о г р а д о в В.В. Очистка пируватдегидрогеназного комплекса из митохондрий коры надпочечников. - Биохимия, 1980, т.45, вып.5, с.883-889.

44. О X е n d е г D», Q u a y S. Binding proteins and membrane transport. - Ann. N.Y. Academ. of Sciences, 1975» vol. 264, p. 358-372.

48. Yusa T. The study on thiamine triphosphate.- In : Abstracts of papers presented at the seminar on thiamine. Tokyo ,1969,vol. 15, p. 324 - 325.