Тирозин-фенол-лиаза из Citrobacter Freundii: вклад кофермент-связывающих остатков активного центра ASP214, SER254 и ARG100 в катализ тема диссертации и автореферата по ВАК 02.00.15, кандидат химических наук Паписова, Анастасия Ивановна

Диссертация и автореферат на тему «Тирозин-фенол-лиаза из Citrobacter Freundii: вклад кофермент-связывающих остатков активного центра ASP214, SER254 и ARG100 в катализ». disserCat — научная электронная библиотека.
Автореферат
Диссертация
Артикул: 244397
Год: 
2004
Автор научной работы: 
Паписова, Анастасия Ивановна
Ученая cтепень: 
кандидат химических наук
Место защиты диссертации: 
Москва
Код cпециальности ВАК: 
02.00.15
Специальность: 
Катализ
Количество cтраниц: 
128

Оглавление диссертации кандидат химических наук Паписова, Анастасия Ивановна

Актуальность проблемы.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Пиридоксаль-5'-фосфат как кофермент.

Глава 2. Классификация пиридоксаль-Р-зависимых ферментов.

2.1 Классификация пиридоксаль-Р-зависимых ферментов на а, р и у семейства.

2.2 Классификация на основе сравнения пространственных структур.

2.3 Классификация по типу укладки полипептидной цепи.

Глава 3. Исследование аминокислотных остатков активного центра, ответственных за связывание и функционирование пиридоксаль-Р методом сайт-направленного мутагенеза.

3.1 Остатки активного центра, взаимодействующие с альдегидной группой пиридоксаль-Р.

3.2 Остатки активного центра, взаимодействующие с N(1) атомом азота пиридоксаль-Р.

3.3 Остатки активного центра, взаимодействующие с З'-гидроксильной группой кофермента.

3.4 Остатки активного центра, взаимодействующие с фосфатной группой кофермента.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 4. Объекты и методы исследования.

4.1 Материалы.

4.2 Методы исследования.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 5. Исследование мутантных ферментов ТФЛ, содержащих замену остатка Asp214.

Глава 6. Характеристика мутантных ферментов ТФЛ, содержащих замену остатка Ser254.

Глава 7. Характеристика мутантного фермента ТФЛ, содержащего в активном центре замену ArglOOThr.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) На тему "Тирозин-фенол-лиаза из Citrobacter Freundii: вклад кофермент-связывающих остатков активного центра ASP214, SER254 и ARG100 в катализ"

Актуальность проблемы.

Ферменты, которые используют пиридоксаль-5'-фосфат в качестве кофермента, катализируют самые разнообразные реакции метаболизма аминокислот, протекающие в клетке: трансаминирование, а,Р- и а,у-элиминирование, (3- и у-замещение, декарбоксилирование, альдольное расщепление, рацемизацию. Ни один из известных коферментов не участвует в катализе столь разнообразных реакций, имеющих физиологическое значение. Реакционная и субстратная специфичность конкретного пиридоксаль-Р-зависимого фермента определяется его белковой частью. В последние годы особое внимание уделяется изучению структурных основ механизма действия этих ферментов с целью вьиснения взаимосвязи структура- функция. Для исследования данного вопроса применяются самые различные методы: рентгеноструктурный анализ, сайт-направленный мутагенез, ЯМР, изучение взаимодействия белковой части фермента с аналогами кофермента и субстратов и т.д. Физиологическая важность пиридоксаль-Р-зависимых ферментов предполагает большую практическую ценность результатов исследований закономерностей их действия для биотехнологии и медицины.

Научная новизна и практическая значимость работы.

На основании рентгеноструктурных данных о пространственной структуре тирозин - фенол-лиазы проводилось изучение кофермент-связывающих остатков активного центра фермента методом сайт-направленного мутагенеза. Установлена роль консервативных остатков Asp214, Ser254 и ArglOO в механизме действия фермента и связывании пиридоксаль-Р. Следует отметить, что исследование остатка Ser, имеющего структурно консервативное расположение в активных центрах многих пиридоксаль-Р-зависимых ферментов, ранее не изучалось. Показано, что исследованные точечные нарушения кофермент-связывающего центра сильно сказывается как на связывании пиридоксаль-Р с белковой частью фермента, так и на взаимодействии с субстратами. Полученные данные имеют большое значение для понимания участия кофермент-связывающих остатков активного центра в механизме реакции (5-элиминирования, катализируемой тирозин — фенол-лиазой.

Список сокращений

ТФЛ - тирозин - фенол-лиаза

DTT - дитиотрейтол

АТФ - аденозин-5'-трифосфат

PLP, пиридоксаль-Р - пиридоксаль-5 '-фосфат

Пиридоксамин-Р - пиридоксамин-5 '-фосфат

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

КД - круговой дихроизм

СоА - кофермент А

NADH - никотинамидадениндинуклеотид

LB-среда - среда Лурье-Бертрана

BSA - бычий сывороточный альбумин

PS - протаминсульфат

SDS - додецилсульфат натрия

SOPC - 8-(о-нитрофенил)-Ь-цистеин

СоА - кофермент А

НК - нуклеиновые кислоты

Введение

Тирозин - фенол-лиаза (ЕС 4.1.99.2) - это пиридоксаль-5'-фосфат (пиридоксаль-Р) зависимый фермент, катализирующий реакцию Р-элиминирования L-Tyr с образованием фенола, пирувата и иона аммония [1] (схема 1) схема 1.

В качестве субстратов в данной реакции in vitro могут также выступать другие природные и синтетические аминокислоты: L-Ser, L-Cys, S-Memn-Cys, Р-С1-Ala (1), Б-бензил-Сув, 8-(о-нитрофенил)-Ь-Суз [2]. Кроме того, тирозин-фенол лиаза катализирует реакции р-замещения [3,4], рацемизацию ЦО)-аланина [5,6], а также реакцию побочного трансаминирования L-Tyr, L-Ser и конкурентных ингибиторов фермента L-Ala, L-Phe и L-m-Tyr [7].

Молекула фермента состоит из четырех идентичных субъединиц, молекулярный вес каждой субъединицы составляет около 51 кДа. Молекула ТФЛ связывает 4 молекулы кофермента на тетрамер. В каждой субъединице е-аминогруппа Lys257 активного центра образует альдиминную связь («внутренний» альдимин) с альдегидной группой кофермента [8].

Механизм реакции p-элиминирования был предложен в работе [9]. На первой стадии любой реакции с участием пиридоксаль-Р-зависимых ферментов (схема 2) происходит взаимодействие «внутреннего» альдимина (I) и аминогруппы субстрата с освобождением е-аминогруппы лизина и образованием альдиминной связи («внешнего» альдимина II) между коферментом и аминогруппой субстрата. Далее образуется хиноидное промежуточное соединение (ШЬ) посредством отрыва С-а-протона субстрата основной каталитической группой. На следующей стадии происходит таутомеризация фенольного фрагмента в циклогексадиеноновый (111с) с последующим элиминированием фенола (IV). В активном центре тирозин - фенол-лиазы внутренний альдимин холофермента образован остатком Lys257. Наиболее вероятно, что основанием В1, отрывающим С-а-протон (II), является е-аминогруппа Lys257 [10]. Общий кислотный катализ на стадиях IIIb-»IIIc-»IV осуществляется гидроксильной группой остатка Туг71, которая переносит протон в СГ-положение фенольного фрагмента [И]. Остаток Arg381 способствует отрыву протона от гидроксильной группы фенола, выполняя, таким образом, роль основной группы [10], а остаток Thrl24, находящийся на расстоянии водородной связи от фенольной группы субстрата, скорее всего, служит для сохранения выгодной ориентации фенольного кольца для успешного протекания реакции р-элиминирования [12].

В 1994 г. была решена трехмерная структура холофермента ТФЛ из Citrobacter intermedins с разрешением 2.7 А [13], позволившая выявить аминокислотные остатки активного центра, которые играют важную роль в связывании кофермента. Некоторые из них представлены на рисунке 1.

В целях детального выяснения роли остатков Asp214 (взаимодействует с атомом N(1) пиридинового кольца пиридоксаль-Р), Ser254 (взаимодействует с одним из атомов кислорода фосфатной группы пиридоксаль-Р) и ArglOO (образует две водородные связи с фосфатной группой кофермента) [8] в связывании кофермента и механизме каталитического превращения, осуществляемого тирозин -фенол-лиазой, в данной работе были изучены свойства их мутантных форм: Asp214Ala, Asp214Asn, Ser254Ala, Ser254Cys и ArglOOThr.

PLP

Рисунок 1. Схема расположения некоторых ключевых остатков кофермент-связывающего центра тирозин - фенол-лиазы относительно пиридоксаль-Р.

NHArg381

NHArg381

I I

-HOThrl24 bi:h

CH^ ^COO"

- пируват

- ИОН аммония

H внутренний альдимин, Я.=420 нм

NHArg381 внешний альдимин, Х=420 нм

Lys257NH

00

Н аминоакрилат кето-хиноидныи интермедиат хиноидныи интермедиат, к=500 нм

Схема 2. Механизм реакции р-элиминирования L-тирозина.

Обзор литературы

Заключение диссертации по теме "Катализ", Паписова, Анастасия Ивановна

Выводы

Мутантные формы тирозин - фенол-лиазы, содержащие замены Asp214Ala, Asp214Asn, Ser254Ala, Ser254Cys и ArglOOThr, получены в гомогенном виде. Исследованы кинетические и спектральные характеристики мутантных ферментов.

Показано, что ионной формой внутреннего альдимина холофермента дикого типа в присутствии катиона-активатора К+ является катионная форма. Установлено, что замена катиона К+ на Na+ приводит к понижению величины рКа внутреннего альдимина.

Замена остатка аспарагиновой кислоты 214 на аспарагин или аланин приводит к понижению величины рКа N1 атома азота кофермента и, как следствие, к торможению ферментативной реакции в основном на стадии отрыва С-а-протона из внешнего адьдимина.

Водородная связь между гидроксильной группой серина 254 и фосфатной группой пиридоксаль-Р необходима для обеспечения оптимальной конформации активного центра тирозин - фенол-лиазы на ключевых стадиях реакции p-элиминирования - стадии отрыва С-а-протона и стадии элиминирования ароматического фрагмента. Водородные связи, образуемые боковой группой и атомом азота основной цепи остатка аргинина 100 с атомами кислорода фосфатной группы кофермента, вносят вклад в поддержание реакционноспособных конформаций внутреннего и внешнего альдиминов тирозин - фенол-лиазы и хиноидного интермедиата.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Паписова, Анастасия Ивановна, 2004 год

1. Birkhauser Verlag, Basel/Switzerland. 14 15 Мецлер Д. Биохимия. М., «Мир», 1

2. Браунштейн, А. Е., Шемякин, М.М. (1953). Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми энзимами. Биохимия, т. 18, с. 393-411. 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Metzler D.E., Ikawa М., Snell, Е.Е. (1954). А general mechanism for vitamin Вбcatalysed reactions. J. Am. Chem. Soc, v. 76, p. 648-

3. Christen P., Metzler D.E. (1985) in Transaminases, John Wiley Sons. New York. Futuki Т., Kagamiyama H., Soda K., Wada H. (1990) in Compounds as Cofactor, Pergamon Press, Oxford. Marino G., Sannia G., Bossa F. (1994) in Biochemistry of Vitamin B6 and PPQ, Birkhauser Verlag Basel, Switzerland. Hayashi H., Wada H., Yoshimura Т., Esaki N., Soda K. (1990) Recent topics in pyridoxal 5-phosphate enzyme studies. Annu. Rev. Biochem. 59, 87-

4. John R.A. (1995) Pyridoxal phosphate-dependent enzymes Biochem. Biophys. Acta 1248, 81-

5. Dietrich J. (1992) Tyrosine aminotransferase: a transaminase among others? Cell. Mol. Biol. 38,95-

6. Hayashi H. "Pyridoxal enzymes: mechanistic diversity and uniformity" (1995 J. Biochem. 118,463-

7. Jansonius J.N. (1998) Structure, evolution and action of vitamin B6-dependent enzymes. Curr. Opin. Struct. Biol, 8, 759-769. 109

8. Parsot С (1987) A common origin for enzymes involved in the terminal step of the threonine and tryptophan biosynthetic pathways. Proc. Nat.I Acad Sci. USA 84, 5207-5210. Ill

9. Adams M.J., Ford G.C., Koekoek R., Lentz P.J., McPherson A, Rossmann M.G., Smiley I.E., Schevitz R.W., Wonacott A.J. (1970) Structure of lactate dehydrogenase at 2.8 A resolution. Nature, 227, 1098-1103. 67 Okamoto A., Higuchi Т., Hirotsu K., Kuramitsu S., Kagamiyama H. (1994) X-ray crystallographic study of pyridoxal 5-phosphate-type aspartate aminotransferases from Escherichia coli in open and closed form. JBiochem (Tokyo), 116,95-107. 113

10. Ziak M., Jaussi R., Gehring H., Christen P. (1990) Aspartate aminotransferase with the pyridoxal-5-phosphate-binding lysine residue replaced by histidine retains partial catalytic competence. Eur. J. Biochem., 187,329-333. 87 Malashkevich V.N., Jager J., Ziak M., Sauder U., Gehring H., Christen P., Jansonius J.N. (1995) Structural basis for the catalytic activity of aspartate aminotransferase K258H lacking the pyridoxal 5-phosphate-binding lysine residue. Biochemistry, 34,405-414. 115

11. Biochemistry, 37, 1065310659. 137 Sun S., Toney M.D. (1999) Evidence for a two-base mechanism involving tyrosine-265 from arginine-219 mutants of alanine racemase. Biochemistry, 38, 4058-4065. 138 Furbish F.S., Fonda M., Metzler D.E. (1969) Reaction of apoaspartate aminotransferase with analogs of pyridoxal phosphate. Biochemistry, 8, 51695180. 139 140 Fonda M.L., Auerbach S.B. (1976) The interaction of pyridoxal phosphate with aspartate apoaminotransferase. Biochim. Biophys. Acta., 422,38-

12. Smith D.L., Almo S.C, Toney M.D., Ringe D. (1989) 2.8-A-resolution crystal structure of an active-site mutant of aspartate aminotransferase from Escherichia coli. Biochemistry, 28, 8161-8167. 156 Tunnicliff G. (1980) Essential arginine residues at the pyridoxal phosphate binding site of brain gamma-aminobutyrate aminotransferase. Biochem. Biophys. Res. Commun., 97, 1024-1030. 122

13. Tanizawa K., Miles E.W. (1983) L-serine binds to arginine-148 of the beta 2 subunit of Escherichia coli tryptophan synthase. Biochemistry. 22, 3594-3

14. Kazarinoff M.N., Snell E.E. (1976) D-Serine dehydratase from Escherichia coli. Essential arginine residue at the pyridoxal 5-phosphate binding site. J. Biol. Chem.. 251, 6179-61S2.. 164 Schnackerz K.D., Feldmann K., Hull W.E. (1979) Phosphorus-31 nuclear magnetic resonance study of D-serine dehydratase: pryridoxal phosphate binding site. Biochemistry. 18, 1536-1539. 165 166 Schnackerz K.D., Feldmann K. (1980) Biochem. Biophys. Res. Commun.. 95, 1832-1

15. Swindells M.B. (1993) Classification of doubly wound nucleotide binding topologies using automated loop searches. Protein Sci., 2, 2146-2

16. Muro Т., Nakatani H., Hiromi K., Kumagai H., Yamada H. (1978) Elementary processes in the interaction of tyrosine phenol lyase with inhibitors and substrate J. Biochem. (Tokyo), 84, 633-640. 185 186 187 188 189 Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T

18. Peterson E.A., Sober H.A. (1954) Preparation of crystalline phosphorylated derivatives of vitamin B6. J. Amer. Chem. Soc. 16, 169-

19. Scatchard G. (1950) Ann. N. Y. Acad. Sci. 51,

20. Siano D.B., Metzler D.E. (1969) Band shapes of the electronic spectra of complex mo\QCM\QS.J.Chem.Phys., 51, 1856-1

21. Metzler D.E., Harris СМ., Johnson R.J., Siano, D.B. (1973) Spectra of 3hydroxypyridines. Band-shape analysis and evaluation of tautomeric equilibria Biochemistry, 12,5377-5392. 190 Metzler СМ., Metzler D.E. (1987) Quantitative description of absorption spectra of a pyridoxal phosphate-dependent enzyme using lognormal distribution curves Anal. Biochem., 166,313-327. 191 192 193 Morino Y., Snell E.E (1970) Tryptophanase {Escherichia coli B). Methods Enzymol. 17A, 439-

22. Березин И.В., Клесов A.A., (1976) Практический курс химической и ферментативной кинетики.. Изд. Московского университета, Москва. Faleev N.G., Ruvinov S.B., Demidkina T.V„ Myagkih I.V., Gololobov M.Yu., Bachmutov V.I., Belikov V.M. (1988) Tyrosine phenol-lyase from Citrobacter 125

23. Wiley-Interscience, NY, USA. 205 Фалеев Н.Г., Рувинов СБ., Демидкина Т.Н., Мягких И.О., Гололобов М.Ю. (1988) Взаимодействие тирозин фенол-лиазы из Citrobacter intermedius с аминокислотами 206 и их производными: факторы определяющие эффективность связывания. Молек. Биол., 22,249-

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания.
В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.

Автореферат
200 руб.
Диссертация
500 руб.
Артикул: 244397