Транскрипционная регуляция кластеров семенник-специфичных генов Stellate y Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Оленкина, Оксана Михайловна

• Оленкина, Оксана Михайловна
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Оленкина, Оксана Михайловна

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1 Актуальность проблемы

1.2 Цели и задачи работы

1.3 Научная новизна работы

1.4 Практическая значимость

1.5 Апробация работы

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 РОЛЬ ГЕНОВ STELLATE В СПЕРМАТОГЕНЕЗЕ DROSOPHILA MELANOGASTER

2.1.1 Система генов crystal-Stellate

2.1.2 Эволюция системы генов crystal-Stellate

2.1.3 Гены Stellate — основная мишень piPHK-зависимого сайленсинга в терминальных тканях самцов Drosophila melanogaster

2.1.4 Белок Stellate, партнёры и посттрансляционные модификации

2.2 ТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ У ЭУКАРИОТ

2.2.1 Области контроля транскрипции. Белки регуляторы транскрипции

2

2.2.2 Способы инициации транскрипции

2.2.3 Основные регуляторные элементы корового промотора

2.2.3.1 ТАТА-бокс

2.2.3.2 TFIIB recognition element (ВRE). BREu и BREd

2.2.3.3. Mnuifuamop (Inr)

2.2.3.4 Downstream Promoter Element (DPE)

2.2.3.5 Motif ten element (MTE)

2.2.3.6 Трехчастная организация послестартового корового промотора DCP (downstream core promoter)

2.2.3.7 Downstream core element (DCE)

2.2.3.8 Элементы, функционирующие независимо от ТАТА-бокса или инициатора (ХСРЕ1, ХСРЕ2, MED-1)

2.2.3.9 ТСТмотив (полипиримидиновый инициатор)

2.2.3.10 CpG островки

2.2.4 Проксимальные промоторные элементы

Е-бокс (enhancer box). Суперсемейство транскрипционных факторов bHLH

2.2.5 Дистальные регуляторные элементы

2.2.6 Модели транскрипционной регуляции с помощью регуляторных элементов минимального промотора

2.2.7 Семенник-специфичные промоторы Drosophila

2.2.8 Особенности транскрипции генов при сперматогенезе у Drosophila

Заключение

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Биоинформатические методы

3.1.1 Поиск участков связывания транскрипционных факторов

3.1.2 Оценка дивергенции промоторов

3.2 Биологические материалы

3.3 Линии Drosophila и генетические скрещивания

Мобилизация Р-элементов Stel34-lacZ и Ste 13 4-E2M-lacZ

3.4 Стандартные молекулярно-биологические методы

3.5 Создание трансгенных конструкций Stel34-E123M-lacZ и SteMJ-E^'-lacZ

3.6 Трансформация эмбрионов Drosophila

3.6.1 Подготовка и тренировка стада

3.6.2 Сбор эмбрионов и инъекции

3.6.3 Сбор эмбрионов после инъекций

3.7 Анализ активности ß-галактозидазы в семенниках трансгснных мух

3.8 Выделение ядерных экстрактов

3.9 Гель-шифт

3.9.1 Зонды

3.9.2 Получение двуцепочечных зондов

3.9.3 Кинирование и очистка зондов

3.9.4 Гель-шифт и супер-шифт

3.10 Детекция транскриптов dUSF

3.11 Получение антител к белку dUSF

3.11.1 Создание конструкцийpQE30 -ßJSF иpQE30 -tUSF

3.11.2 Экспрессия конструкцийpQE30 -fUSF иpQE30 -tUSF и очисткарекомбинантных белков

3.11.3 Илшунизация мышейрекомбинантными белками 6His-ßJSF и 6His-tUSF и получение антисывороток

3.12 Иммуноферментиый сорбционный анализ (ELISA)

3.13 Электрофорез в денатурирующих условиях в ДСН-ПААГ и Вестерн-блот-анализ

3.14 Иммунофлуоресцентное окрашивание препаратов целых семенников и конфокальная микроскопия

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Идентификация ^мс-регуляторных участков в промоторе генов Stellate

4.2 Идентификация фактора, связывающего E-боксы в промоторе гетерохроматиновых генов Stellate

4.3 Оценка значимости *<ис-регуляторных элементов в составе промотора

гетерохроматиновых генов Stellate in vivo

4

4.4 Детальное картирование промотора гетерохроматиновых генов Stellate

4.5 Дивергенция в промоторной области генов ßNACtes

4.6 Репрессия активности трансгенов в Х-хромосоме

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ВЫВОДЫ

7. СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

8. БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Транскрипционная регуляция кластеров семенник-специфичных генов Stellate y Drosophila melanogaster»

1. Общая характеристика работы

1.1 Актуальность проблемы

Расположение генов в геноме эукариот носит неслучайный характер. Для генов, обладающих сходными профилями экспрессии и/или координированной экспрессией, характерно образование кластеров (Hurst et al., 2004). По данным геномного анализа с применением ДНК-микрочипов, свыше 20% генов Drosophila melanogaster образуют коэкспрессирующиеся кластеры, состоящие в среднем из 10-30 генов (Spellman and Rubin, 2002; Boutanaev et al., 2002). Кластеры дуплицированных генов приводят к увеличению сложности организмов и вносят существенный вклад в эволюцию видов. Тандемно организованные семенник-специфичные гены Stellate представляют собой уникальное явление и являются частью генетической системы Ste-Su(Ste), необходимой для поддержания фертильности самцов у Drosophila melanogaster.

Гены Stellate формируют два кластера в Х-хромосоме, один находится в эухроматине (участок 12Е1-2 карты политенной Х-хромосомы), другой в гетерохроматине (участок Ь26 митотической прометафазной карты Х-хромосомы) (Hardy et al., 1984; Livak 1984; Palumbo et al., 1994; Tulin et al., 1997). Различные линии D. melanogaster несут разное число повторов Stellate, от 15-50 до 150-400 копий (Palumbo et al., 1994). Кодируемый ими белковый продукт гомологичен регуляторной Р-субъединице протеинкиназы СК2, СК20 (Livak 1990; Bozzetti et al., 1995). В Y-хромосоме расположены высокогомологичные генам Stellate повторы Sn(Ste) {Suppressor of Stellate), также известные как локус crystal (Hardy et al., 1984). Повторы Su(Ste) несут нарушенные ОРС и не транслируются, но транскрибируются в обоих направлениях (Balakireva et al., 1992; Aravin et al., 2001). В норме экспрессия генов Stellate в семенниках подавлена посттранскрипционно с помощью коротких piPHK, образующихся при процессинге антисмысловых транскриптов Su(Ste) (Aravin et al., 2001; Vagin et al., 2006). Полная или частичная потеря повторов Sa(Ste) приводит к гипсрэкспрессии генов Stellate, к нарушениям мейоза и частичной или полной стерильности самцов. При этом белок Stellate формирует большое количество игловидных или звездчатых кристаллов в сперматоцитах (Hardy et al., 1984; Palumbo et al., 1994; Bozzetti et al., 1995).

Растворимая форма белка Stellate, обнаруженная в ядрах сперматоцитов самцов с делецией повторов Su(Ste), взаимодействует с каталитической а-субъединицей протеинкиназы СК2, СК2а, и вызывает модуляцию фосфорилирования ряда мишеней СК2 в ядре (Egorova et al.,

7

2009). Кроме того, белок Stellate подвергается посттрансляционному триметилированию по остатку лизина К92, структурно мимикрируя триметилирование гистоиа НЗ по остатку К9 (Egorova et al., 2009). Не исключено, что именно триметилированная форма Stellate играет ключевую роль в аберрантном мейотическом процессе за счёт изменения фосфорилирования ядерных хромодоменных белков, участвующих в когезии и/или расхождении гомологичных хромосом и сестринских хроматид в мейозе.

Повторы Stellate эволюционно фиксированы и сохраняют высокую гомогенность в геноме D. melanogaster (Tulin et al., 1997; Kogan et al., 2000). Гены Stellate представляют собой основную мишень piPIIK-сайленсинга в семенниках D. melanogaster (Aravin et al., 2001; Nagao et al., 2010). Т.о. для поддержания фертильности самцов и воспроизводства вида необходима интактная система генов Ste-Su(Ste) и корректная работа piPHK-зависимой машины сайленсинга.

Остаются неизвестными как эволюционный смысл возникновения Ste-Su(Ste) системы, так и точный механизм вызываемого гиперэкспрессией Stellate патогенеза. У других близкородственных видов Drosophila подобной системы не обнаружено. Возникновение, эволюция и регуляция Ste-Su(Ste) системы остается предметом интенсивных исследований (Kalmykova et al, 1997; 2002; Usakin et al., 2005; Nishida et al., 2007; Nagao et al., 2010; Kogan et al., 2012). Однако до настоящего времени о транскрипционной регуляции экспрессии генов Stellate было известно немного.

В ходе данной работы было проведено функциональное картирование промотора генов Stellate, в результате которого в составе минимального промоторного участка были обнаружены три i/г/с-регуляторных элемента, известных как Е-боксы (CANNTG). Один и тот же фактор из ядерного экстракта семенников (dUSF, транскрипционный фактор из семейства bHLH, basic Helix-Loop-IIelix) взаимодействовал со всеми тремя Е-боксами in vitro. С помощью репортерного анализа была показана необходимость Е-боксов для семенник-специфической транскрипции с использованием данного промотора in vivo. Полученные данные позволили охарактеризовать новый тип семенник-специфического промотора, определяющего смысловую транскрипцию не только повторов Ste-Sa(Ste), но и другого семейства семенник-специфичных генов.

1.2 Цели и задачи работы

Целью настоящей работы являлся анализ семенник-специфичного промотора генов семейства Stellate. Для этого были поставлены следующие задачи:

• картировать г/г/с-регуляторные участки в последовательности промотора генов Stellate;

• идентифицировать тканеспецифичный транскрипционный фактор, взаимодействующий с г/г/с-регуляторными участками в промоторе генов Stellate;

• доказать функциональную значимость найденных z/ис-регуляторных участков для транскрипции in vivo с помощью репортерных конструкций;

• провести сравнительный анализ промоторов семейств генов Ste-Su(Ste) и fíNACtes;

• сравнить активность репортерных конструкций под промотором генов Stellate, встроенных в аутосомы и в Х-хромосому.

1.3 Научная новизна работы

В работе представлен анализ семенник-специфичного промотора генов семейства Stellate. Впервые обнаружены в промоторной области три близко расположенных цис-регуляторных участка, известных как E-боксы, с которыми взаимодействует один транскрипционный фактор - dUSF семейства bHLH (basic Helix-Loop-Helix). Для dUSF впервые показана его тканеспецифичная экспрессия у D. melanogaster.

С использованием избирательно мутагенизированных репортерных конструкций показано, что для эффективной семенник-специфичной транскрипции с промотора Stellate in vivo необходимы ненарушенные E-боксы, причем наиболее важным регуляторным элементом является Е-бокс 2. Сравнительный анализ последовательностей промоторов генов Stellate, Sit(Ste) и [iNACtes позволил установить, какие из E-боксов являются общими для всех генных семейств. Был также обнаружен потенциальный сайт связывания неизвестного транскрипционного фактора в промоторной области двух генов семейства fiNACtes, несущих делецию Е-бокса 2 в промоторе. Поскольку мы не обнаружили E-боксов в составе известных семенник-специфичных промоторов, то промотор Stellate может рассматриваться как новый тип промотора, ответственный за семенник-специфичную транскрипцию.

С помощью анализа экспрессии репортерных конструкций P{Ste703-lacZ} и P{6Stellate-Ste703-lacZ}, встроенных в различные хромосомы, мы впервые показали, что активность эндогенного промотора семенник-специфичных генов Х-хромосомы определяется контекстом хроматина Х-хромосомы в терминальных клетках самцов и является сниженной вдвое по сравнению с таковой в аутосомах. Это позволяет говорить о двух уровнях репрессии генов Stellate, один из которых реализуется на уровне хроматина, приводя к частичному подавлению их транскрипции, а другой основан на посттранскрипционном piPHK-сайленсинге, обеспечивающем полную репрессию этих генов.

1.4 Практическая значимость

Нарушения слаженного механизма работы генетической системы Ste-Su(Ste) приводит к значительным дефектам сперматогенеза, воспроизводства и поддержания вида. И если о посттранскрипционном сайленсинге генов Stellate с помощью piPHK в настоящий момент известно довольно много, то о регуляции транскрипции генов Stellate данных чрезвычайно мало. В работе охарактеризован новый тип тканеспецифичного промотора, выявлены цис-регуляторные участки и идентифицирован взаимодействующий с ними фактор. Результаты данной работы расширяют наши знания о механизмах тканеспецифичной экспрессии генов, о транскрипционной регуляции разных генных семейств, обладающих одинаковым промотором и о влиянии Х-хромосомного контекста на экспрессию Х-сцепленных генов на премейотических стадиях сперматогенеза.

1.5 Апробация работы

Работа апробирована на лабораторном семинаре в Отделе молекулярной генетики клетки (ОМГК) ИМГ РАН и на научном коллоквиуме Лаборатории молекулярных механизмов биологической адаптации ИМБ РАН.

Данные, полученные в работе, были представлены на следующих научных симпозиумах

и конференциях: Eighteenth IGB meeting "Epigenetic Bases of Genome Reprogramming" (Capri,

Italy, 8-11 October, 2005), 48th Annual Drosophila Research Conference (Philadelphia, USA, March

7-11, 2007), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and

genetics, dedicated to 120th anniversary of N.I. Vavilov (Kiev, Ukraine, 20-22 September, 2007), на

IV Международной научной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов»

(Алушта, Украина, 22-26 сентября, 2008 г.), на Международный научной конференции по

биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня

10

рождения академика Ю.А. Овчинникова (Москва, Россия, 28 сентября - 1 октября, 2009 г.), на XXV Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», посвященной 30-летию Научно-образовательного центра ИБХ РАН (Москва, Россия, 11-15 февраля, 2013 г).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 2 статьи в международных реферируемых журналах, статья в сборнике трудов международной конференции и глава в серийном издании «Drosophila Melanogaster: Life Cycle, Genetics and Development».

Структура и объем диссертации

Материал диссертации изложен на 147 страницах машинописного текста, содержит 39 рисунков. Список цитированной литературы состоит из 262 работ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Оленкина, Оксана Михайловна

5. Обсуждение

Анализ иромоторных областей, определяющих семенник-специфичную транскрипцию

генов, свидетельствует об относительно малом их размере в сравнении с промоторами генов,

активных в соматических тканях (White-Cooper, 2010, таблица 6). В данной работе

функционально охарактеризован минимальный проксимальный промотор, отвечающий за

семенник-специфичную транскрипцию генов Stellate.

Ранее бьшо показано, что для обеспечения высокоуровневой экспрессии репортерного

гена Р-галактозидазы lacZ в семенниках самцов с/У Y достаточно 134-нуклеотидного фрагмента

5'- области гена Stellate (Aravin et al., 2001). Фрагмент гетерохроматиновых генов Stellate

размером 134 п.н. содержит проксимальную область промотора размером 101 п.н. в 5'-области

перед стартом транскрипции (TSS) и 33 п.н. 5'-транскрибируемой области, включающую

стартовый кодон AGT, слитый с ОРС lacZ. Этот промотор не содержит канонических TATA -

или СААТ-боксов, характерных для многих эукариотических промоторов, однако содержит

последовательности Inr и DPE (рисунок 15; Kutach and Kadonaga, 2000).

С помощью метода гель-шифт мы картировали три г/г/с-регуляторных мотива, Е-бокса,

расположенные в пределах этого промотора (в положениях от -87 до -82, от -47 до -42 и от +18

до +23 п.н.) (рисунок 15, рисунок 16, рисунок 18). Мы также идентифицировали

транскрипционный фактор dUSF в ядерном экстракте семенников, который узнает Е-боксы в

составе промоторной области (рисунок 17, рисунок 20, рисунок 21, рисунок 22).

dUSF принадлежит к большому надсемейству транскрипционных факторов bHLH и

ранее был описан только in silico как ортолог белка USF млекопитающих (Ledent et al., 2002;

Moore et al., 2000). Белку USF позвоночных присуща повсеместная экспрессия (Henrion et al.,

1995; Viollet et al., 1996). Мы детектировали транскрипты dusf в семенниках, а также в головах и

каркасах самцов и яичниках (рисунок 25), что согласуется с данными FlyAthlas (Chintapalli et

al., 2010.9.17) и RNAseq (Graveley et al., 2011.4.13).

Однако белок dUSF был обнаружен только в белковом экстракте семенников (рисунок

28). Надо отметить, что использование Вестерн-блот гибридизации дает достаточно

приблизительную оценку экспрессии в тканях, и возможно, существуют небольшие популяции

клеток, экспрессирующие dUSF, однако ниже порога детекции этого метода. Существует

вероятность того, что dUSF задействован в регуляции важных функций в организме, поскольку

самцы с делецией, затрагивающей в том числе ген dUSF, а также с доминантной мутацией

dUSF4, вызванной заменой остатка тирозина на аспарагин (Y248N), не жизнеспособны.

Мутантный фенотип dUSFi восстанавливается при скрещивании с линией, несущей

118

транслокацшо участка Х-хромосомы размером 88 т.п.н. с геном dUSF в хромосому III (Yamamoto et al., 2013). Для dUSF характерна высокая гомология (до 92% идентичности) с USF1 и USF2 человека только в основном ДНК-связывающем домене (Moore et al., 2000). Как и USF белки млекопитающих, dUSF с наивысшей аффинностью узнает тот же консенсусный

вариант Е-бокса - CACGTG, названный нами Е-бокс 2 (рисунок 17 и рисунок 22).

2+

Наблюдаемые зависимости ДНК-связывающей активности от присутствия ионов Mg и окислительно-восстановительного состояния среды (рисунок 21 , рисунок 23, рисунок 24), также были ранее описаны для USF млекопитающих (Bendall and Molloy, 1994; Marmillot and Scovell, 1998; Pognonec et al., 1992).

Последовательности E-боксов по-видимому сверхпредставлены в промоторах генов Stellate, поскольку случайное возникновение одного E-бокса можно ожидать лишь на каждые 500 п.н. (Wasserman and Sandelin, 2004), наличие трех E-боксов в пределах 134 п.н. вряд ли можно рассматривать как случайное. Е-бокс 1 и Е-бокс-3 отличаются от консенсуса одним нуклеотидом (рисунок 18), что отражает некоторую «пластичность» в связывании dUSF с промотором генов Stellate. Следует отметить, что связывание dUSF с Е-боксом 2 происходит с наибольшей аффинностью, тогда как связывание с Е-боксом 3 приблизительно на треть менее эффективно, а с Е-боксом 1 — на порядок (рисунок 17).

Мы оценили функциональную роль E-боксов in vivo с помощью избирательного мутагенеза E-боксов в трансгенных конструкциях с репортерным геном lacZ. При нарушении в репортерной конструкции всех трех E-боксов активность репортерного гена практически полностью подавляется по сравнению с конструкцией с ненарушенными E-боксами (рисунок 31 А, рисунок 32). Поэтому мы заключили, что E-боксы являются необходимыми цис-регуляторными участками для осуществления семенник-специфичной транскрипции трансгенов, встроенных в различные участки генома.

Мутагенез Е-боксов 2 и 3 показал, что достаточно одного из них для поддержания транскрипционной активности промотора, при этом сохранение палиндромного Е-бокса 2 предпочтительнее (рисунок 31Б, рисунок 33), поскольку его разрушение заметно снижает экспрессию lacZ, тогда как разрушение Е-бокса 3 не оказывает заметного влияния на активность репортера (рисунок 31 Б). Также результаты анализа трансгенных конструкций не свидетельствуют в пользу синергического воздействия E-боксов, расположенных в непосредственной близости друг от друга, на транскрипцию репортерного гена.

Наши результаты свидетельствуют в пользу того, что dUSF является транскрипционным фактором, ответственным за семенник-специфичную экспрессию генов Ste-Su(Ste). Кроме того обогащение dUSF в предмейотических сперматоцитах, для которых характерна активная транскрипция генов, указывает на возможную роль dUSF в регуляции других генов в процессе

119

сперматогенеза (рисунок 30). Однако мы не можем исключить наличия и участия в транскрипции генов Stellate других белков семейства bHLH, поскольку последовательность CACGTG узнают белки двух групп семейства HLH - В и С, объединяющих 19 белков (Atchley and Fitch, 1997; Ledent et al., 2002). Однако по данным базы FlyAtlas (http://flyatlas.org) большинство из них демонстрируют низкий или практически не детектируемый уровень экспрессии в семенниках. Транскрипты только пяти генов из групп В и С семейства bHLH, включая dusf, были найдены в EST-библиотеках из семенников (Таблица 7).

Анализ кластеров генов Ste-Su(Ste) и /INACtes продемонстрировал, что все копии генов имеют общую высокогомологичную область около 180 п.н. в 5'НТО, тогда как гомология между кодирующими областями отсутствует (Usakin et al., 2005). Повторы Stellate поддерживаются в геноме отбором и последовательности их обладают высокой гомогенностью за счет интенсивной гомогенизации в процессе эволюции (Kogan et al., 2000). Для сравнения промоторов генов Ste-Su(Ste) и PNACtes мы выравнивали их последовательности и сравнивали положение найденных Е-боксов (рисунок 34, рисунок 36; также выравнивание приведено в работе Usakin et al., 2005). Следует отметить, что внутрилокусная дивергенция в промоторных областях Stellate несколько выше, чем дивергенция в их кодирующих областях. Так дивергенция внутри локуса для промоторных областей составляет 1.1-4.5%, тогда как для кодирующих областей - 0.2-2.5% (Tulin et al., 1997; Kogan et al., 2000; McKee and Satter, 1996).

Тем не менее, все гены Stellate как из гетерохроматинового, так и из эухроматинового кластеров, содержат три консервативных Е-бокса (рисунок 34, рисунок 36). Промоторы гетерохроматиновых генов Stellate демонстрируют наибольшее сходство с промоторами генов PNACtes, за исключением сильно дивергировавших З'-копий тандемов pNACtes2 и PNACtes4, однако Е-бокс 3 в промоторах гетерохроматиновых генов Stellate находится за пределами области гомологии генов Ste-Su(Ste) и PNACtes (рисунок 34, рисунок 36). Промоторы эухроматиновых генов Stellate также демонстрируют высокую гомологию с последовательностями промоторов гетерохроматиновых генов Stellate, но отличаются наличием делеции 16 п.н. между Е-боксом 1 и Е-боксом 2 (рисунок 34, рисунок 36).

Присутствие консервативных г/г/с-регуляторных элементов закономерно ведет нас к предположению о сопряженной регуляции экспрессии генов Stellate из обоих кластеров в сперматоцитах. И действительно, существует прямая корреляция между суммарным числом копий генов Stellate в обоих кластерах и степенью стерильности и мейотическими нарушениями у самцов cry7 (Palumbo et al., 1994). Показано, что популяция белка Stellate действительно представлена продуктами обоих генных кластеров Stellate (Egorova et al., 2009). Таким образом, общий промотор может обеспечивать семенник-специфичную транскрипцию даже в гетерохроматиновом контексте.

Расположенные в Y-хромосоме повторы Su(Ste) демонстрируют высокую гомологию с генами Stellate , однако ОРС их нарушены, а промоторные области несут инсерцию транспозона hoppel (рисунок 2, рисунок 34, рисунок 36), кроме того за пределами кодирующей области есть специфичная для Su(Sle) последовательность, т.н. Y-специфичная область (рисунок 2; Balakireva et al., 1992; Livak, 1984). Предполагается, что инсерция транспозона hoppel стала ключевым событием, приведшим к возникновению репрессорной функции повторов Su(Ste). Инсерция hoppel, несущего фланкирующие инвертированные повторы, обеспечивает антисмысловую транскрипцию повторов Su(Ste) (Aravin et al., 2001), что в дальнейшем приводит к формированию piPHK Su(Ste), посредством которых осуществляется piPHK-зависимое посттранскрипционное подавление генов Stellate (Aravin et al., 2001; Nagao et al., 2010).

Мы обнаружили, что в повторах Su(Ste) Е-бокс 1 сохранился неизменным, тогда как Е-бокс 3 полностью разрушен (рисунок 34, рисунок 36). Для Е-бокса 2 в повторах Su(Ste) характерно существование нескольких вариантов, за счет единичного нуклеотидного полиморфизма. В большинстве копий обнаруживается совершенный Е-бокс CACGTG, также представлены вырожденные варианты CAAGTG и CGCGTG (рисунок 34, рисунок 36). На основании этих данных мы предполагаем, что смысловая транскрипция разных копий Su(Ste) может.осуществляться с разной эффективностью.

Предполагается, что предшественник генов Stellate и Sa(Ste) возник в результате «захвата» аутосомным геном pCK2tes промотора генов fiNACtes (Kalmykova et al., 1997; Usakin et al., 2005). Вероятно, такое событие произошло только в геноме Drosophila melanogaster, поскольку в геномах других близкородственных видов повторов Stellate не обнаружено. Как можно предположить, возникшие гены Stellate должны также «приобрести» транскрипционный фактор dUSF, который активирует транскрипцию с «захваченного» промотора. Амплификация числа копий генов Stellate с 15 до 500 на геном и наличие около 80 копий повторов Su(Ste) (Balakireva et al., 1992; Palumbo et al., 1994) может привести к предположительной конкуренции за транскрипционный фактор среди его мишеней.

Мы установили, что для промоторов генов fiNACtes характерна значительная внутрикластерная дивергенция, достигающая 8.3% между копиями в одном тандеме. Мы показали, что Е-бокс 1 и Е-бокс 2 являются консервативными только в pNACtes3 и pNACtes6, а также в одиночном гене fiNACtesl, тогда как в дивергировавших копиях fiNACtes2 и PNACtes4 Е-боксы отсутствуют (рисунок 34, рисунок 36). Мы также обнаружили, что делеция области Е-бокса 2 в PNACtes2 и pNACtes4 приводит к появлению АТ-богатой последовательности (рисунок 38), которая может служить сайтом связывания для белков, содержащих домен А-Т hook (Metcalf and Wassarman, 2006).

С помощью гель-шпфта было показано, что этот сайт специфически взаимодействует с неизвестным белковым фактором из ядерного экстракта семенников (рисунок 38). Мы предполагаем, что наблюдаемые вариации в организации z/7/с-регуляторных последовательностей промоторов могут быть результатом положительного отбора, способствовавшего фиксации данных мутаций. Принимая во внимание возможность конкуренции за транскрипционный фактор между генами семейств Ste-Su(Ste) и ßNACtes, несущими Е-боксы в промоторных областях, возникновение сайта для нового транскрипционного фактора может иметь положительное значение для поддержания уровня экспрессии белков, кодируемых ßNACtes (Kondrashov et al., 2002).

У эукариот сперматогенез характеризуется экстраординарно высокой активностью транскрипции, наблюдаемой на стадии роста первичных сперматоцитов (White-Cooper, 2010). Характерный временной профиль экспрессии генов в семенниках обеспечивается глобальным ремоделингом хроматина, специфическими компонентами базальной транскрипционной машины, тканеспецифическими транскрипционными факторами и различными промоторными элементами (Hiller et al., 2004; Kimmins et al., 2004; White-Cooper, 2010).

В нашей работе мы детально охарактеризовали новый тип семенник-специфичного промотора и определили ДНК-связывающий транскрипционный фактор, обеспечивающий регуляцию этого промотора в семенниках. Ряд исследованных на настоящий момент генов (Janus В, gdl, ß-tubidin, dhod, sdic, don juan, don juan like и ocnus), которые экспрессируются только во время сперматогенеза Drosophila, также обладают очень короткими промоторными областями (таблица 6; Blumer et al., 2002; Ilempel et al., 2006; Hense et al., 2007; Michiels et al., 1989; Ranz et al., 2003; Santel et al., 2000; Schulz et al., 1990; Yang et al., 1995; Yanicostas et al., 1989). Проанализировав их промоторные области, мы не нашли в них Е-боксов, за исключением одного вырожденного Е-бокса в области перед стартом транскрипции в гене ocnus (Hense et al., 2007).

В промоторнои области хорошо изученного гена ß-tubulin был обнаружен 14-нуклеотидный мотив, который оказался критичным для обеспечения семенник-специфичной экспрессии гена ß2tubulin (Michiels et al., 1989; Santel et al., 2000). Некоторая гомология с этим элементом была обнаружена в промоторе гетерохроматиновых генов Stellate, где он частично перекрывается с Е-боксом 3, однако его нарушение не оказывало влияния на уровень экспрессии репортерной конструкции (Aravin et al., 2004), что позволяет предположить ограниченную роль этого мотива в обеспечении экспрессии других семенник-специфичных генов, в том числе Stellate. Поскольку мы не обнаружили Е-боксов в составе промоторов семенник-специфичных генов с известным размером промоторов и других семенник-специфичных промоторных элементов в промоторах генов Stellate, то рассматриваем промотор

122

Stellate как новый тип промотора, компетентного для семенник-специфичной транскрипции как в эухроматиновом, так и в гетерохроматиновом контексте.

Мы сравнили уровни экспрессии трансгенного промотора Stellate в эухроматиновом контексте аутосом и Х-хромосомы, и установили, что уровень экспрессии репортеров Ste703~ lacZ и 6Stellate-Ste703-lacZ, расположенных в Х-хромосоме, как минимум вдвое ниже по сравнению с теми же трансгенами, находящимися в аутосомах (рисунок 39). Ранее аналогичные данные были получены в отношении экспрессии трансгенов в Х-хромосоме и аутосомах под промоторами аутосомных семенник-специфичных генов (Hoyle et al., 1995; Hense et al., 2007; Kemkemer et al., 2011; Meilkejohn et al., 2011). Впоследствии наши данные были подтверждены независимым исследованием, в котором для обеспечения транскрипции репортерного гена были использованы промоторы Х-хромосомиых семенник-экспрессирующихся генов CG10920, CG12681 и CG1314 (Kemkemer et al., 2013). Разница в экспрессии между аутосомными и Х-хромосомными линиями составляла от 2 до 7 раз (Kemkemer et al., 2013).

Вопрос о влиянии Х-хромосомного контекста на экспрессию генов в терминальных клетках широко обсуждается (líense et al., 2007; Kemkemer et al., 2011; Meilkejohn et al., 201; Bertrán et al., 2002; Vibranovski et al., 2009).

В соматических клетках Drosophila экспрессия единственной X хромосомы самцов вдвое выше, чем каждой из двух X хромосом самок. Это явление, получившее название «дозовая компенсация», обеспечивается привлечением к X хромосоме самца комплекса белков MSL (male specific lethal) и ацетилированием гистона Н4 по положению К16 (ацетил II4K16) (Gelbart and Kuroda, 2009; Avner and Heard, 2001; Lucchesi et al., 2005). Дозовая компенсация не распространяется на терминальные клетки самцов, где хроматин X хромосомы лишен ряда белков комплекса MSL и обогащения позитивной модификацией ацетил114К16 (Rastelli and Kuroda, 1998; Meiklejohn et al., 2011).

Таким образом, мы впервые показали, что активность трансгенного промотора семенник-специфичных генов Х-хромосомы в терминальных клетках определяется контекстом хроматина Х-хромосомы и снижена приблизительно вдвое, по сравнению с экспрессией трансгенов, локализованных в аутосомах.

Можно предположить, что на премейотической стадии сперматогенеза, в первичных сперматоцитах, наблюдается специфическая перестройка хроматина Х-хромосомы, проявляющаяся в подавлении экспрессии генов. Это показывает существование двух уровней репрессии генов Stellate, один из которых реализуется на уровне хроматина, приводя к частичному подавлению их транскрипции, а другой основан на посттранскрипционном piPIIK-сайленсинге, обеспечивающем полную репрессию этих генов.

В заключение, в данной работе мы значительно расширили наши знания относительно тканеспецифичной транскрипционной регуляции кластеров генов эукариот. Улучшение понимания механизмов регуляции генов является необходимым для геномики. Мы представили биохимические доказательства, результаты in vivo анализа экспрессии репортерных конструкций и данные сравнительной геномики, свидетельствующие, что генные семейства Ste-Su(Ste) и [íNACíes используют консервативные г/ис-регуляторные элементы E-боксы в своих промоторах. Также наше исследование описывает новый тип семенник-специфичного промотора и транскрипционный фактор dUSF, экспрессирующийся в семенниках Drosophila melanogaster. Мы также нашли интересный случай функциональной дивергенции цис-регуляторных элементов генов fiNACtes, практически не детектируемой на основании знания их последовательностей. А также показали зависимость экспрессии трансгенного промотора семенник-специфичных генов Х-хромосомы в терминальных клетках от контекста хроматина Х-хромосомы.

6. Выводы

1. В составе промоторов семенник-специфичных генов Stellate у Drosophila melanogaster обнаружены три консервативных г/иорегуляторных участка, Е-боксы (CANNTG). Наличие в промоторе генов Stellate двух Е-боксов из трех необходимо и достаточно для семенник-специфичной экспрессии репортерного гена.

2. Транскрипционный фактор dUSF из семейства bHLH экспрессируется в сперматоцитах Drosophila melanogaster и специфично взаимодействует с Е-боксами в составе промотора генов Stellate.

3. Экспрессия трех генов семейства fiNACtes в семенниках определяется Е-бокс-содержащим промотором, гомологичным промотору Stellate. Полученные данные позволили охарактеризовать новый тип семенник-специфичного промотора.

4. Выявлена фиксированная потеря Е-боксов в результате делеции и точечной мутации без изменения остальной последовательности промотора в отдельных копиях семенник-специфичных генов pNACtes.

5. В терминальных клетках самцов активность промотора семенник-специфичных генов Stellate в трансгенных конструкциях, расположенных на Х-хромосоме, снижена вдвое по сравнению с его активностью в аутосомах, т.е. определяется контекстом хроматина X-хромосомы в сперматоцитах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Оленкина, Оксана Михайловна, 2015 год

7. Список цитируемой литературы

1. Аравии, А.А., Наумова, Н.М., Тулин, А.В., Кленов, М.С., and Гвоздев, В.А. (2000). Исследование взаимодействия паралогичных тандемных повторов Stellate и Suppressor of Stellate в геноме Drosophila melanogaster. Генетика 36, 581-584.

2. Егорова, К.С., Оленкина, О.М., and Оленина, Л.В. (2010). Метилирование негистоновых белков по остаткам лизина как способ регуляции их стабильности и функциональности. Биохимия 75, 613-628.

3. Усакин, Л.А., В.А., Г., and Коган, Г.Л. (2009). Анализ молекулярной изменчивости специфичных для семенника генов 6emaNACtes у Drosophila melanogaster. Молекулярная биология 43, 400-406.

4. Abravaya, К., Myers, М.Р., Murphy, S.P., and Morimoto, R.I. (1992). The human heat shock protein hsp70 interacts with HSF, the transcription factor that regulates heat shock gene expression. Genes & development 6, 1153-1164.

5. Ackerman, P., Glover, C.V., and Osheroff, N. (1985). Phosphorylation of DNA topoisomerase II by casein kinase II: modulation of eukaryotic topoisomerase II activity in vitro. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 82, 3164-3168.

6. Allison, L.A. (2007). Fundamental Molecular Biology, 1st edn (Wiley-Blackwell).

7. Andrews, J., Bouñard, G.G., Cheadle, C., Lu, J., Becker, K.G., and Oliver, B. (2000). Gene discovery using computational and microarray analysis of transcription in the Drosophila melanogaster testis. Genome research 10, 2030-2043.

8. Anish, R., Hossain, M.B., Jacobson, R.H., and Takada, S. (2009). Characterization of transcription from TATA-less promoters: identification of a new core promoter element XCPE2 and analysis of factor requirements. PloS one 4, e5103.

9. Aravin, A., Gaidatzis, D., Pfeñer, S., Lagos-Quintana, M., Landgraf, P., Iovino, N., Morris, P., Brownstein, M.J., Kuramochi-Miyagawa, S., Nakano, Т., et al. (2006). A novel class of small RNAs bind to MILI protein in mouse testes. Nature 442, 203-207.

10. Aravin, A.A., Klenov, M.S., Vagin, V.V., Bantignies, F., Cavalli, G., and Gvozdev, V.A. (2004). Dissection of a natural RNA silencing process in the Drosophila melanogaster germ line. Molecular and cellular biology 24, 6742-6750.

11. Aravin, A.A., Naumova, N.M., Tulin, A.V., Vagin, V.V., Rozovsky, Y.M., and Gvozdev, V.A. (2001). Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements inthe£). melanogaster germline. Current biology: CB 11, 1017-1027.

12. Arkov, A.L., and Ramos, A. (2010). Building RNA-protein granules: insight from the germline. Trends in cell biology 20, 482-490.

13. Atchley, W.R., and Fitch, W.M. (1997). A natural classification of the basic helix-loop-helix class of transcription factors. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 5172-5176.

14. Atchley, W.R., Terhalle, W., and Dress, A. (1999). Positional dependence, cliques, and predictive motifs in the bHLH protein domain. Journal of molecular evolution 48, 501-516.

15. Avner, P., and Pleard, E. (2001). X-chromosome inactivation: counting, choice and initiation. Nature reviews. Genetics 2, 59-67.

16. Balakireva, M.D., Shevelyov, Y., Nurminsky, D.I., Livak, K.J., and Gvozdev, V.A. (1992). Structural organization and diversification of Y-linked sequences comprising Su(Ste) genes in Drosophila melanogaster. Nucleic acids research 20, 3731-3736.

17. Basehoar, A.D., Zanton, S.J., and Pugh, B.F. (2004). Identification and distinct regulation of yeast TATA box-containing genes. Cell 116, 699-709.

18. Batista, P.J., Ruby, J.G., Claycomb, J.M., Chiang, R., Fahlgren, N., Kasschau, K.D., Chaves, D.A., Gu, W., Vasale, J.J., Duan, S„ et al (2008). PRG-1 and 21U-RNAs interact to form the piRNA complex required for fertility in C. elegans. Molecular cell 31, 67-78.

19. Beall, E.L., Lewis, P.W., Bell, M., Rocha, M., Jones, D.L., and Botchan, M.R. (2007). Discovery of tMAC: a Drosophila testis-specific meiotic arrest complex paralogous to Myb-Muv B. Genes & development 21, 904-919.

20. Beaver, L.M., Gvakharia, B.O., Vollintine, T.S., Hege, D.M., Stanewsky, R., and Giebultowicz, J.M. (2002). Loss of circadian clock function decreases reproductive fitness in males of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99, 2134-2139.

21. Bendall, A.J., and Molloy, P.L. (1994). Base preferences for DNA binding by the bHLII-Zip protein USF: effects of MgC12 on specificity and comparison with binding of Myc family members. Nucleic acids research 22, 2801-2810.

22. Betran, E., Thornton, K., and Long, M. (2002). Retroposed new genes out of the X in Drosophila. Genome research 12, 1854-1859.

23. Bibby, A.C., and Litchfield, D.W. (2005). The multiple personalities of the regulatory subunit of protein kinase CK2: CK2 dependent and CK2 independent roles reveal a secret identity for CK2beta. International journal of biological sciences 1, 67-79.

24. Bird, A. (1999). DNA methylation de novo. Science 286, 2287-2288.

25. Bird, A.P. (1986). CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature 321, 209-213.

26. Blumer, N., Schreiter, K., I-Iempel, L., Santel, A., Hollmann, M., Schafer, M.A., and Renkawitz-Pohl, R. (2002). A new translational repression element and unusual transcriptional control regulate expression of don juan during Drosophila spermatogenesis. Mechanisms of development 110, 97-112.

27. Boutanaev, A.M., Kalmykova, A.I., Shevelyov, Y.Y., and Nurminsky, D.I. (2002). Large clusters of co-expressed genes in the Drosophila genome. Nature 420, 666-669.

28. Bozzetti, M.P., Massari, S., Finelli, P., Meggio, F., Pinna, L.A., Boldyreff, B., Issinger, O.G., Palumbo, G., Ciriaco, C., Bonaccorsi, S., et al. (1995). The Ste locus, a component of the parasitic cry-Ste system of Drosophila melanogaster, encodes a protein that forms crystals in primary spermatocytes and mimics properties of the beta subunit of casein kinase 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 92, 6067-6071.

29. Breathnach, R., and Chambon, P. (1981). Organization and expression of eucaryotic split genes coding for proteins. Annual review of biochemistry 50, 349-383.

30. Brennecke, J., Aravin, A.A., Stark, A., Dus, M., Kellis, M., Sachidanandam, R., and Hannon, G.J. (2007). Discrete small RNA-generating loci as master regulators of transposon activity in Drosophila. Cell 128, 1089-1103.

31. Burke, T.W., and Kadonaga, J.T. (1996). Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters. Genes & development 10, 711-724.

32. Burke, T.W., and Kadonaga, J.T. (1997). The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila. Genes & development 11, 3020-3031.

33. Butler, J.E., and Kadonaga, J.T. (2001). Enhancer-promoter specificity mediated by DPE or TATA core promoter motifs. Genes & development 15, 2515-2519.

34. Butler, J.E., and Kadonaga, J.T. (2002). The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression. Genes & development 16, 2583-2592.

35. Carcamo, J., Buckbinder, L., and Reinberg, D. (1991). The initiator directs the assembly of a transcription factor IID-dependent transcription complex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88, 8052-8056.

36. Caminci, P., Kasukawa, T., Katayama, S., Gough, J., Frith, M.C., Maeda, N., Oyama, R., Ravasi, T., Lenhard, B., Wells, C., et al. (2005). The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science 309, 1559-1563.

37. Carninci, P., Sandelin, A., Lenhard, B., Katayama, S., Shimokawa, K., Ponjavic, J., Semple, C.A., Taylor, M.S., Engstrom, P.G., Frith, M.C., et al. (2006). Genome-wide analysis of mammalian promoter architecture and evolution. Nat Genet 38, 626-635.

128

38. Carretero-Paulet, L., Galstyan, A., Roig-Villanova, I., Martinez-Garcia, J.F., BilbaoCastro, J.R., and Robertson, D.L. (2010). Genome-wide classification and evolutionary analysis of the bHLII family of transcription factors in Arabidopsis, poplar, rice, moss, and algae. Plant physiology 153, 1398-1412.

39. Chalkley, G.E., and Verrijzer, C.P. (1999). DNA binding site selection by RNA polymerase II TAFs: a TAF(II)250-TAF(II)150 complex recognizes the initiator. The EMBO journal 18, 4835-4845.

40. Charlesworth, B. (2001). Genome analysis: More Drosophila Y chromosome genes. Current biology: CB 11, R182-184.

41. Chen, Q.K., Hertz, G.Z., and Stormo, G.D. (1997). PromFD 1.0: a computer program that predicts eukaryotic pol II promoters using strings and IMD matrices. Computer applications in the biosciences: CABIOS 13, 29-35.

42. Chen, X., Hiller, M., Sancak, Y., and Fuller, M.T. (2005). Tissue-specific TAFs counteract Polycomb to turn on terminal differentiation. Science 310, 869-872.

43. Chen, Z., and Manley, J.L. (2003). Core promoter elements and TAFs contribute to the diversity of transcriptional activation in vertebrates. Molecular and cellular biology 23, 7350-7362.

44. Chintapalli, V.R., Wang, J., and Dow, J.A. (2007). Using FlyAtlas to identify better Drosophila melanogaster models of human disease. Nature Genetics 39, 715-720.

45. Chintapalli, V.R., Wang, J., Herzyk, P., and Dow, J.A.T. (2010.9.17). FlyAtlas: survey of adult and larval expression. FlyAtlas (http://www.flyatlas.org/). Personal communication to FlyBase: FBrf0211869.

46. Chung, S., and Perry, R.P. (1991). Cell-free transcription of a mouse ribosomal-protein-encoding gene: the effects of promoter mutations. Gene 100, 173-180.

47. Church, G.M., Ephrussi, A., Gilbert, W., and Tonegawa, S. (1985). Cell-type-specific contacts to immunoglobulin enhancers in nuclei. Nature 313, 798-801.

48. Conant, G.C., and Wolfe, K.H. (2008). Turning a hobby into a job: how duplicated genes find new functions. Nature reviews. Genetics 9, 938-950.

49. Corden, J., Wasylyk, B., Buchwalder, A., Sassone-Corsi, P., Kedinger, C., and Chambon, P. (1980). Promoter sequences of eukaryotic protein-coding genes. Science 209, 1406-1414.

50. Das, P.P., Bagijn, M.P., Goldstein, L.D., Woolford, J.R., Lehrbach, N.J., Sapetschnig, A., Buhecha, H.R., Gilchrist, M.J., Howe, K.L., Stark, R„ et al. (2008). Piwi and piRNAs act upstream of an endogenous siRNA pathway to suppress Tc3 transposon mobility in the Caenorhabditis elegans germline. Molecular cell 31, 79-90.

51. Deng, W., and Roberts, S.G. (2005). A core promoter element downstream of the TATA box that is recognized by TFIIB. Genes & development 19, 2418-2423.

129

52. Deng, W., and Roberts, S.G. (2006). Core promoter elements recognized by transcription factor IIB. Biochemical Society transactions 34, 1051-1053.

53. Di Cara, F., Morra, R., Cavaliere, D., Sorrentino, A., De Simone, A., Polito, C.L., and Digilio, A.F. (2006). Structure and expression of a novel gene family showing male germline specific expression in Drosophila melanogaster. Insect molecular biology 15, 813-822.

54. Doggett, K., Jiang, J., Aleti, G., and White-Cooper, H. (2011). Wake-up-call, a lin-52 paralogue, and Always early, a lin-9 homologue physically interact, but have opposing functions in regulating testis-specific gene expression. Developmental biology 355, 381-393.

55. Egorova, K.S., Olenkina, O.M., Kibanov, M.V., Kalmykova, A.I., Gvozdev, V.A., and Olenina, L.V. (2009). Genetically Derepressed Nucleoplasm^ Stellate Protein in Spermatocytes of D. melanogaster interacts with the catalytic subunit of protein kinase 2 and carries histone-like lysine-methylated mark. Journal of molecular biology 389, 895-906.

56. Eissenberg, J.C., Ge, Y.W., and Hartnett, T. (1994). Increased phosphorylation of HP1, a heterochromatin-associated protein of Drosophila, is correlated with heterochromatin assembly. The Journal of biological chemistry 269, 21315-21321.

57. Ephrussi, A., Church, G.M., Tonegawa, S., and Gilbert, W. (1985). B lineage—specific interactions of an immunoglobulin enhancer with cellular factors in vivo. Science 227, 134-140.

58. Evans, R., Fairley, J.A., and Roberts, S.G. (2001). Activator-mediated disruption of sequence-specific DNA contacts by the general transcription factor TFIIB. Genes & development 15, 2945-2949.

59. Falkner, F.G., and Zachau, II.G. (1984). Correct transcription of an immunoglobulin kappa gene requires an upstream fragment containing conserved sequence elements. Nature 310, 7174.

60. Fay, D.S., and Yochem, J. (2007). The SynMuv genes of Caenorhabditis elegans in vulval development and beyond. Developmental biology 306, 1-9.

61. Findley, S.D., Tamanaha, M., Clegg, N.J., and Ruohola-Baker, II. (2003). Maelstrom, a Drosophila spindle-class gene, encodes a protein that colocalizes with Vasa and RDEl/AGOl homolog, Aubergine, in nuage. Development 130, 859-871.

62. Fischle, W., Tseng, B.S., Dormann, H.L., Ueberheide, B.M., Garcia, B.A., Shabanowitz, J., Hunt, D.F., Funabiki, II., and Allis, C.D. (2005). Regulation of HP 1-chromatin binding by histone 113 methylation and phosphorylation. Nature 438, 1116-1122.

63. FitzGerald, P.C., Sturgill, D., Shyakhtenko, A., Oliver, B., and Vinson, C. (2006). Comparative genomics of Drosophila and human core promoters. Genome biology 7, R53.

64. FlyBase (2005). Assessment of transgenic construct insertion sites. FlyBase analysis: FBriO 184339.

65. Fried, M., and Crothers, D.M. (1981). Equilibria and kinetics of lac repressor-operator interactions by polyacrylamide gel electrophoresis. Nucleic acids research 9, 6505-6525.

66. Frith, M.C., Valen, E., Krogh, A., Hayashizaki, Y., Carninci, P., and Sandelin, A. (2008). A code for transcription initiation in mammalian genomes. Genome research 18, 1-12.

67. Gannon, F., O'Hare, K., Perrin, F., LePennec, J.P., Benoist, C., Cochet, M., Breathnach, R., Royal, A., Garapin, A., Cami, B., et al. (1979). Organisation and sequences at the 5' end of a cloned complete ovalbumin gene. Nature 278, 428-434.

68. Gardiner-Garden, M., and Frommer, M. (1987). CpG islands in vertebrate genomes. Journal of molecular biology 196, 261-282.

69. Garner, M.M., and Revzin, A. (1981). A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic acids research 9, 3047-3060.

70. Gelbart, M.E., and Kuroda, M.I. (2009). Drosophila dosage compensation: a complex voyage to the X chromosome. Development 136, 1399-1410.

71. Gershenzon, N.I., and Ioshikhes, I.P. (2005). Synergy of human Pol II core promoter elements revealed by statistical sequence analysis. Bioinformatics 21, 1295-1300.

72. Gershenzon, N.I., Trifonov, E.N., and Ioshikhes, I.P. (2006). The features of Drosophila core promoters revealed by statistical analysis. BMC genomics 7, 161.

73. Ghildiyal, M., and Zamore, P.D. (2009). Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature reviews. Genetics 10, 94-108.

74. Giesen, K., Hummel, T., Stollewerk, A., Harrison, S., Travers, A., and Klambt, C. (1997). Glial development in the Drosophila CNS requires concomitant activation of glial and repression of neuronal differentiation genes. Development 124, 2307-2316.

75. Girard, A., Sachidanandam, R., Hannon, G.J., and Carmell, M.A. (2006). A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins. Nature 442, 199-202.

76. Goldberg, M.L. (1979). Sequence Analysis of Drosophila Histone Genes (Stanford University).

77. Graveley, B.R., May, G., Brooks, A.N., Carlson, J.W., Cherbas, L., Davis, C.A., Duff, M., Eads, B., Landolin, J., Sandler, J., Wan, K.IL, Andrews, J., Brenner, S.E., Cherbas, P., Gingeras, T.R., Hoskins, R., Kaufman, T., Celniker, S.E. (2011.4.13). The D. melanogaster transcriptome: modENCODE RNA-Seq data for dissected tissues http://www.modencode.org/CeIniker.shtml. Personal communication to FlyBase: FBrfD213503

78. Grivna, S.T., Beyret, E., Wang, Z., and Lin, H. (2006). A novel class of small RNAs in mouse spermatogenic cells. Genes & development 20, 1709-1714.

79. Gunawardane, L.S., Saito, K., Nishida, K.M., Miyoshi, K., Kawamura, Y., Nagami, T., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2007). A slicer-mediated mechanism for repeat-associated siRNA 5' end formation in Drosophila. Science 315, 1587-1590.

80. I-Iahn, S. (2004). Structure and mechanism of the RNA polymerase II transcription machinery. Nature structural & molecular biology 11, 394-403.

81. Hamilton, T.L., Stoneley, M., Spriggs, K.A., and Bushell, M. (2006). TOPs and their regulation. Biochemical Society transactions 34, 12-16.

82. Hardy, R.W., Lindsley, D.L., Livak, K.J., Lewis, B., Siversten, A.L., Joslyn, G.L., Edwards, J., and Bonaccorsi, S. (1984). Cytogenetic analysis of a segment of the Y chromosome of Drosophila melanogaster. Genetics 107, 591-610.

83. Hariharan, N., and Perry, R.P. (1990). Functional dissection of a mouse ribosomal protein promoter: significance of the polypyrimidine initiator and an element in the TATA-box region. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 87, 1526-1530.

84. Iiellman, L.M., and Fried, M.G. (2007). Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nature protocols 2, 1849-1861.

85. Hempel, L.U., Rathke, C., Raja, S.J., and Renkawitz-Pohl, R. (2006). In Drosophila, don juan and don juan like encode proteins of the spermatid nucleus and the flagellum and both are regulated at the transcriptional level by the TAF 1180 cannonball while translational repression is achieved by distinct elements. Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists 235, 1053-1064.

86. I-Ienrion, A.A., Martinez, A., Mattei, M.G., Kahn, A., and Raymondjean, M. (1995). Structure, sequence, and chromosomal location of the gene for USF2 transcription factors in mouse. Genomics 25, 36-43.

87. Hense, W., Baines, J.F., and Parsch, J. (2007). X chromosome inactivation during Drosophila spermatogenesis. PLoS biology 5, e273.

88. Hernandez, N. (1993). TBP, a universal eukaryotic transcription factor? Genes & development 7, 1291-1308.

89. Hiller, M., Chen, X., Pringle, M.J., Suchorolski, M., Sancak, Y., Viswanathan, S., Bolival, B., Lin, T.Y., Marino, S., and Fuller, M.T. (2004). Testis-specific TAF homologs collaborate to control a tissue-specific transcription program. Development 131, 5297-5308.

90. Hiller, M.A., Lin, T.Y., Wood, C., and Fuller, M.T. (2001). Developmental regulation of transcription by a tissue-specific TAF homolog. Genes & development 15, 1021-1030.

91. Holden, N.S., and Tacon, C.E. (2011). Principles and problems of the electrophoretic mobility shift assay. Journal of pharmacological and toxicological methods 63, 7-14.

92. Hoskins, R.A., Landolin, J.M., Brown, J.B., Sandler, J.E., Takahashi, II., Lassmann, T., Yu, C., Booth, B.W., Zhang, D., Wan, K.H., et al. (2011). Genome-wide analysis of promoter architecture m Drosophila melanogaster. Genome research 21, 182-192.

93. Iiouwing, S., Berezikov, E., and Ketting, R.F. (2008). Zili is required for germ cell differentiation and meiosis in zebrafish. The EMBO journal 27, 2702-2711.

94. Hoyle, H.D., Iiutchens, J.A., Turner, F.R., and Raff, E.C. (1995). Regulation of beta-tubulin function and expression in Drosophila spermatogenesis. Developmental genetics 16, 148-170.

95. Hsu, J.Y., Juven-Gershon, T., Marr, M.T., 2nd, Wright, K.J., Tjian, R., and Kadonaga, J.T. (2008). TBP, Motl, and NC2 establish a regulatory circuit that controls DPE-dependent versus TATA-dependent transcription. Genes & development 22, 2353-2358.

96. Huang, D., Jokela, M., Tuusa, J., Skog, S., Poikonen, K., and Syvaoja, J.E. (2001). E2F mediates induction of the Spl-controlled promoter of the human DNA polymerase epsilon B-subunit gene POLE2. Nucleic acids research 29, 2810-2821.

97. Ince, T.A., and Scotto, K.W. (1995). A conserved downstream element defines a new class of RNA polymerase II promoters. The Journal of biological chemistry 270, 30249-30252.

98. Ince, T.A., and Scotto, K.W. (1995). Differential utilization of multiple transcription start points accompanies the overexpression of the P-glycoprotein-encoding gene in Chinese hamster lung cells. Gene 156, 287-290.

99. Inoue, A., Hyle, J., Lechner, M.S., and Lahti, J.M. (2008). Perturbation of IIP1 localization and chromatin binding ability causes defects in sister-chromatid cohesion. Mutation research 657, 48-55.

100. Javahery, R., Khachi, A., Lo, K., Zenzie-Gregory, B., and Smale, S.T. (1994). DNA sequence requirements for transcriptional initiator activity in mammalian cells. Molecular and cellular biology 14, 116-127.

101. Jayaramaiah Raja, S., and Renkawitz-Pohl, R. (2005). Replacement by Drosophila melanogaster protamines and Mst77F of histones during chromatin condensation in late spermatids and role of sesame in the removal of these proteins from the male pronucleus. Molecular and cellular biology 25, 6165-6177.

102. Juven-Gershon, T., Hsu, J.Y., and Kadonaga, J.T. (2006). Perspectives on the RNA polymerase II core promoter. Biochemical Society transactions 34, 1047-1050.

103. Juven-Gershon, T., Hsu, J.Y., and Kadonaga, J.T. (2008a). Caudal, a key developmental regulator, is a DPE-specific transcriptional factor. Genes & development 22, 2823-2830.

104. Juven-Gershon, T., Hsu, J.Y., Theisen, J.W., and Kadonaga, J.T. (2008b). The RNA polymerase II core promoter - the gateway to transcription. Current opinion in cell biology 20, 253259.

105. Juven-Gershon, T., and Kadonaga, J.T. (2010). Regulation of gene expression via the core promoter and the basal transcriptional machinery. Developmental biology 339, 225-229.

106. Kadonaga, J.T. (2012). Perspectives on the RNA polymerase II core promoter. Wiley interdisciplinary reviews. Developmental biology 1, 40-51.

107. Kalmykova, A.I., Nurminsky, D.I., Ryzhov, D.V., and Shevelyov, Y.Y. (2005). Regulated chromatin domain comprising cluster of co-expressed genes in Drosophila melanogaster. Nucleic acids research 33, 1435-1444.

108. Kalmykova, A.I., Shevelyov, Y.Y, Dobritsa, A.A., and Gvozdev, V.A. (1997). Acquisition and amplification of a testis-expressed autosomal gene, SSL, by the Drosophila Y chromosome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 94, 6297-6302.

109. Kalmykova, A.I., Shevelyov, Y.Y., Polesskaya, O.O., Dobritsa, A.A., Evstafieva, A.G., Boldyreff, B., Issinger, O.G., and Gvozdev, V.A. (2002). CK2(beta)tes gene encodes a testis-specific isoform of the regulatory subunit of casein kinase 2 in Drosophila melanogaster. European journal of biochemistry / FEBS 269, 1418-1427.

110. Karandikar, U., Anderson, S., Mason, N., Trott, R.L., Bishop, C.P., and Bidwai, A.P. (2003). The Drosophila SSL gene is expressed in larvae, pupae, and adults, exhibits sexual dimorphism, and mimics. properties of the beta subunit of casein kinase II. Biochemical and biophysical research communications 301, 941-947.

111. Katzenberger, R.J., Rach, E.A., Anderson, A.K., Ohler, U., and Wassarman, D.A. (2012). The Drosophila Translational Control Element (TCE) is required for high-level transcription of many genes that are specifically expressed in testes. PloS one 7, e45009.

112. Kemkemer, C., Catalan, A., and Parsch, J. (2014). 'Escaping' the X chromosome leads to increased gene expression in the male germline of Drosophila melanogaster. Heredity 112, 149-155.

113. Kemkemer, C., Hense, W., and Parsch, J. (2011). Fine-scale analysis of X chromosome inactivation in the male germ line of Drosophila melanogaster. Molecular biology and evolution 28, 1561-1563.

114. Kempe, E., Muhs, B., and Schafer, M. (1993). Gene regulation in Drosophila spermatogenesis: analysis of protein binding at the translational control element TCE. Developmental genetics 14, 449-459.

115. Kibanov, M.V., Egorova, K.S., Ryazansky, S.S., Sokolova, O.A., Kotov, A.A., Olenkina, O.M., Stolyarenko, A.D., Gvozdev, V.A., and Olenina, L.V. (2011). A novel organelle, the piNG-body, in the nuage of Drosophila male germ cells is associated with piRNA-mediated gene silencing. Molecular biology of the cell 22, 3410-3419.

116. Kibanov, M.V., Kotov, A.A., and Olenina, L.V. (2013). Multicolor fluorescence imaging of whole-mount Drosophila testes for studying spermatogenesis. Analytical biochemistry 436, 55-64.

117. Kim, T.H., Barrera, L.O., Zheng, M., Qu, C., Singer, M.A., Richmond, T.A., Wu, Y., Green, R.D., and Ren, B. (2005). A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature 436, 876-880.

118. Kim, Y.J., Bjorklund, S., Li, Y., Sayre, M.H., and Kornberg, R.D. (1994). A multiprotein mediator of transcriptional activation and its interaction with the C-terminal repeat domain of RNA polymerase II. Cell 77, 599-608.

119. Kimmins, S., Kotaja, N., Davidson, I., and Sassone-Corsi, R (2004). Testis-specific transcription mechanisms promoting male germ-cell differentiation. Reproduction 128, 5-12.

120. Kirino, Y., Kim, N., de Planell-Saguer, M., Khandros, E., Chiorean, S., Klein, P.S., Rigoutsos, I., Jongens, T.A., and Mourelatos, Z. (2009). Arginine methylation of Piwi proteins catalysed by dPRMT5 is required for Ago3 and Aub stability. Nature cell biology 11, 652-658.

121. Kirino, Y., Vourekas, A., Sayed, N., de Lima Alves, P., Thomson, T., Lasko, P., Rappsilber, J., Jongens, T.A., and Mourelatos, Z. (2010). Arginine methylation of Aubergine mediates Tudor binding and germ plasm localization. RNA 16, 70-78.

122. Klymenko, T., Papp, B., Fischle, W., Kocher, T., Schelder, M., Fritsch, C., Wild, B., Wilm, M., and Muller, J. (2006). A Polycomb group protein complex with sequence-specific DNA-binding and selective methyl-lysine-binding activities. Genes & development 20, 1110-1122.

123. Kogan, G.L., Epstein, V.N., Aravin, A.A., and Gvozdev, V.A. (2000). Molecular evolution of two paralogous tandemly repeated heterochromatic gene clusters linked to the X and Y chromosomes of Drosophila melanogaster. Molecular biology and evolution 17, 697-702.

124. Kokubo, T„ Gong, D.W., Wootton, J.C., Horikoshi, M., Roeder, R.G., and Nakatani, Y. (1994). Molecular cloning of Drosophila TFIID subunits. Nature 367, 484-487.

125. Kondrashov, F.A., Rogozin, I.B., Wolf, Y.I., and Koonin, E.V. (2002). Selection in the evolution of gene duplications. Genome biology 3, RESEARCH0008.

126. Kotelnikov, R.N., Klenov, M.S., Rozovsky, Y.M., Olenina, L.Y., Kibanov, M.V., and Gvozdev, V.A. (2009). Peculiarities of piRNA-mediated post-transcriptional silencing of Stellate repeats in testes of Drosophila melanogaster. Nucleic acids research 37, 3254-3263.

127. Kouzarides, T. (2007). Chromatin modifications and their function. Cell 128, 693-705.

128. Kuhn, R., Schafer, U., and Schafer, M. (1988). Cis-acting regions sufficient for spermatocyte-specific transcriptional and spermatid-specific translational control of the Drosophila melanogaster gene mst(3)gl-9. The EMBO journal 7, 447-454.

129. Kutach, A.K., and Kadonaga, J.T. (2000). The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters. Molecular and cellular biology 20, 4754-4764.

130. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

131. Lagrange, T., Kapanidis, A.N., Tang, II., Reinberg, D., and Ebright, R.H. (1998). New core promoter element in RNA polymerase II-dependent transcription: sequence-specific DNA binding by transcription factor IIB. Genes & development 12, 34-44.

132. Lau, N.C., Seto, A.G., Kim, J., Kuramochi-Miyagawa, S., Nakano, T., Bartel, D.P., and Kingston, R.E. (2006). Characterization of the piRNA complex from rat testes. Science 313, 363-367.

133. Le Thomas, A., Rogers, A.K., Webster, A., Marinov, G.K., Liao, S.E., Perkins, E.M., Hur, J.K., Aravin, A.A., and Toth, K.F. (2013). Piwi induces piRNA-guided transcriptional silencing and establishment of a repressive chromatin state. Genes & development 27, 390-399.

134. Lechner, M.S., Schultz, D.C., Negorev, D., Maul, G.G., and Rauscher, P.J., 3rd (2005). The mammalian heterochromatin protein 1 binds diverse nuclear proteins through a common motif that targets the chromoshadow domain. Biochemical and biophysical research communications 331, 929-937.

135. Ledent, V., Paquet, O., and Vervoort, M. (2002). Phylogenetic analysis of the human basic helix-loop-helix proteins. Genome biology 3, RESEARCH0030.

136. Ledent, V., and Vervoort, M. (2001). The basic helix-loop-helix protein family: comparative genomics and phylogenetic analysis. Genome research 11, 754-770.

137. Lee, D.H., Gershenzon, N., Gupta, M., Ioshikhes, I.P., Reinberg, D., and Lewis, B.A. (2005). Functional characterization of core promoter elements: the downstream core element is recognized by TAF1. Molecular and cellular biology 25, 9674-9686.

138. Lewis, B.A., Kim, T.K., and Orkin, S.H. (2000). A downstream element in the human beta-globin promoter: evidence of extended sequence-specific transcription factor IID contacts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97,1112-1111.

139. Li, C., Vagin, V.V., Lee, S., Xu, J., Ma, S., Xi, H., Seitz, H., Horwich, M.D., Syrzycka, M., Honda, B.M., et al. (2009). Collapse of germline piRNAs in the absence of Argonaute3 reveals somatic piRNAs in flies. Cell 137, 509-521.

140. Lifschytz, E., and Hareven, D. (1977). Gene expression and the control of spermatid morphogenesis in Drosophila melanogaster. Developmental biology 58, 276-294.

141. Lifton, R.P., Goldberg, M.L., Karp, R.W., and Hogness, D.S. (1978). The organization of the histone genes in Drosophila melanogaster. functional and evolutionary implications. Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology 42 Pt 2, 1047-1051.

136

142. Lim, A.K., and Kai, T. (2007). Unique germ-line organelle, nuage, functions to repress selfish genetic elements in Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 104, 6714-6719.

143. Lim, A.K., Tao, L., and Kai, T. (2009). piRNAs mediate posttranscriptional retroelement silencing and localization to pi-bodies in the Drosophila germline. The Journal of cell biology 186, 333-342.

144. Lim, C.Y., Santoso, B., Boulay, T., Dong, E„ Ohler, U., and Kadonaga, J.T. (2004). The MTE, a new core promoter element for transcription by RNA polymerase II. Genes & development 18, 1606-1617.

145. Lin, T.Y., Viswanathan, S., Wood, C., Wilson, P.G., Wolf, N., and Fuller, M.T. (1996). Coordinate developmental control of the meiotic cell cycle and spermatid differentiation in Drosophila males. Development 122,1331-1341.

146. Lindsley, D.L., and Zimm, G.G. (1992). The genome of Drosophila melanogaster (San Diego: Academic Press).

147. Livak, K.J. (1984). Organization and mapping of a sequence on the Drosophila melanogaster X and Y chromosomes that is transcribed during spermatogenesis. Genetics 107, 611634.

148. Livak, K.J. (1990). Detailed structure of the Drosophila melanogaster Stellate genes and their transcripts. Genetics 124, 303-316.

149. Lu, B.Y., Ma, J., and Eissenberg, J.C. (1998). Developmental regulation of heterochromatin-mediated gene silencing in Drosophila. Development 125, 2223-2234.

150. Lucchesi, J.C., Kelly, W.G., and Panning, B. (2005). Chromatin remodeling in dosage compensation. Annual review of genetics 39, 615-651.

151. Lyckegaard, E.M., and Clark, A.G. (1989). Ribosomal DNA and Stellate gene copy number variation on the Y chromosome of Drosophila melanogaster. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 86, 1944-1948.

152. Ma, P.C., Rould, M.A., Weintraub, II., and Pabo, C.O. (1994). Crystal structure of MyoD bHLH domain-DNA complex: perspectives on DNA recognition and implications for transcriptional activation. Cell 77, 451-459.

153. Macleod, D., Charlton, J., Mullins, J., and Bird, A.P. (1994). Spl sites in the mouse aprt gene promoter are required to prevent methylation of the CpG island. Genes & development 8, 22822292.

154. Malone, C.D., Brennecke, J., Dus, M., Stark, A., McCombie, W.R., Sachidanandam, R., and Hannon, G.J. (2009). Specialized piRNA pathways act in germline and somatic tissues of the Drosophila ovary. Cell 137, 522-535.

155. Marmillot, P., and Scovell, W. (1998). Enhancement of transcription factor, USF, binding to the adenovirus major late promoter: effect of dithiothreitol and high mobility group protein-1. Biochimica et biophysica acta 1395, 228-236.

156. Maston, G.A., Evans, S.K., and Green, M.R. (2006). Transcriptional regulatory elements in the human genome. Annual review of genomics and human genetics 7, 29-59.

157. McKee, B.D., and Satter, M.T. (1996). Structure of the Y chromosomal Su(Ste) locus in Drosophila melanogaster and evidence for localized recombination among repeats. Genetics 142, 149161.

158. Meiklejohn, C.D., Landeen, E.L., Cook, J.M., Kingan, S.B., and Presgraves, D.C. (2011). Sex chromosome-specific regulation in the Drosophila male germline but little evidence for chromosomal dosage compensation or meiotic inactivation. PLoS biology 9, el001126.

159. Metcalf, C.E., and Wassarman, D.A. (2007). Nucleolar colocalization of TAF1 and testis-specific TAFs during Drosophila spermatogenesis. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists 236, 2836-2843.

160. Meyer, GF., Hess, O., and Beermann, W. (1961). [Phase specific function structure in spermatocyte nuclei of Drosophila melanogaster and their dependence of Y chromosomes]. Chromosoma 12, 676-716.

161. Michiels, F., Gasch, A., Kaltschmidt, B., and Renkawitz-Pohl, R. (1989). A 14 bp promoter element directs the testis specificity of the Drosophila beta 2 tubulin gene. The EMBO journal 8, 1559-1565.

162. Molina, C., and Grotewold, E. (2005). Genome wide analysis of Arabidopsis core promoters. BMC genomics 6, 25.

163. Moore, A.W., Barbel, S., Jan, L.Y., and Jan, Y.N. (2000). A genomewide survey of basic helix-loop-helix factors in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 10436-10441.

164. Murre, C., McCaw, P.S., and Baltimore, D. (1989). A new DNA binding and dimerization motif in immunoglobulin enhancer binding, daughterless, MyoD, and myc proteins. Cell 56, 777-783.

165. Murre, C., McCaw, P.S., Vaessin, H., Caudy, M., Jan, L.Y., Jan, Y.N., Cabrera, C.V., Buskin, J.N., Hauschka, S.D., Lassar, A.B., et al. (1989). Interactions between heterologous helix-loop-helix proteins generate complexes that bind specifically to a common DNA sequence. Cell 58, 537-544.

166. Nagao, A., Mituyama, T., Huang, H., Chen, D., Siomi, M.C., and Siomi, H. (2010). Biogenesis pathways of piRNAs loaded onto AG03 in the Drosophila testis. RNA 16, 2503-2515.

167. Ni, T., Corcoran, D.L., Rach, E.A., Song, S., Spana, E.P., Gao, Y., Ohler, U., and Zhu, J. (2010). A paired-end sequencing strategy to map the complex landscape of transcription initiation. Nature methods 7, 521-527.

168. Nielsen, M.G., Gadagkar, S.R., and Gutzwiller, L. (2010). Tubulin evolution in insects: gene duplication and subfunctionalization provide specialized isoforms in a functionally constrained gene family. BMC evolutionary biology 10, 113.

169. Nishida, K.M., Okada, T.N., Kawamura, T., Mituyama, T., Kawamura, Y., Inagaki, S., Huang, H., Chen, D., Kodama, T., Siomi, H., et al. (2009). Functional involvement of Tudor and dPRMT5 in the piRNA processing pathway in Drosophila germlines. The EMBO journal 28, 38203831.

170. Nishida, K.M., Saito, K., Mori, T., Kawamura, Y., Nagami-Okada, T., Inagaki, S., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2007). Gene silencing mechanisms mediated by Aubergine piRNA complexes in Drosophila male gonad. Rna 13, 1911-1922.

171. Nolan, K., Lacoste, J., and Parsons, J.T. (1999). Regulated expression of focal adhesion kinase-related nonkinase, the autonomously expressed C-terminal domain of focal adhesion kinase. Molecular and cellular biology 19, 6120-6129.

172. Nurminsky, D.I., Nurminskaya, M.V., De Aguiar, D., and Iiartl, D.L. (1998). Selective sweep of a newly evolved sperm-specific gene in Drosophila. Nature 396, 572-575.

173. Ohler, U., Liao, G.C., Niemann, H., and Rubin, GM. (2002). Computational analysis of core promoters in the Drosophila genome. Genome biology 3, RESEARCH0087.

174. Ohler, U., and Wassarman, D.A. (2010). Promoting developmental transcription. Development 137, 15-26.

175. Ohno, S. (1970). Evolution by gene duplication (London, New York,: Allen & Unwin; Springer-Verlag).

176. Oshima, S., Nakamura, T., Namiki, S., Okada, E., Tsuchiya, K., Okamoto, R., Yamazaki, M., Yokota, T., Aida, M., Yamaguchi, Y., et al. (2004). Interferon regulatory factor 1 (IRF-1) and IRF-2 distinctively up-regulate gene expression and production of interleukin-7 in human intestinal epithelial cells. Molecular and cellular biology 24, 6298-6310.

177. Osouda, S., Nakamura, Y., de Saint Phalle, B., McConnell, M., Horigome, T., Sugiyama, S., Fisher, P.A., and Furukawa, K. (2005). Null mutants of Drosophila B-type lamin Dm(0) show aberrant tissue differentiation rather than obvious nuclear shape distortion or specific defects during cell proliferation. Developmental biology 284, 219-232.

178. Palumbo, G., Bonaccorsi, S., Robbins, L.G., and Pimpinelli, S. (1994). Genetic analysis of Stellate elements of Drosophila melanogaster. Genetics 138, 1181-1197.

179. Panagiotidis, C.A., Artandi, S., Calame, K., and Silverstein, SJ. (1995). Polyamines alter sequence-specific DNA-protein interactions. Nucleic acids research 23, 1800-1809.

180. Parisi, M., Nuttall, R., Edwards, P., Minor, J., Naiman, D., Lu, J., Doctolero, M., Vainer, M., Chan, C., Malley, J., et al. (2004). A survey of ovary-, testis-, and soma-biased gene expression in Drosophila melanogaster adults. Genome biology 5, R40.

181. Parry, T.J., Theisen, J.W., Hsu, J.Y., Wang, Y.L., Corcoran, D.L., Eustice, M., Ohler, U., and Kadonaga, J.T. (2010). The TCT motif, a key component of an RNA polymerase II transcription system for the translational machinery. Genes & development 24, 2013-2018.

182. Patil, VS., and Kai, T. (2010). Repression of retroelements in Drosophila germline via piRNA pathway by the Tudor domain protein Tejas. Current biology : CB 20, 724-730.

183. Pinna, L.A. (2002). Protein kinase CK2: a challenge to canons. Journal of cell science 115, 3873-3878.

184. Pognonec, P., Kato, H., and Roeder, R.G. (1992). The helix-loop-helix/leucine repeat transcription factor USF can be functionally regulated in a redox-dependent manner. The Journal of biological chemistry 267, 24563-24567.

185. Ponce, R., and Hartl, D.L. (2006). The evolution of the novel Sdic gene cluster in Drosophila melanogaster. Genq 376, 174-183.

186. Ponjavic, J., Lenhard, B., Kai, C., Kawai, J., Carninci, P., Ilayashizaki, Y., and Sandelin, A. (2006). Transcriptional and structural impact of TATA-initiation site spacing in mammalian core promoters. Genome biology 7, R78.

187. Proudfoot, N.J. (1979). Eukaryotic promoters? Nature 279, 376.

188. Purnell, B.A., Emanuel, P.A., and Gilmour, D.S. (1994). TFIID sequence recognition of the initiator and sequences farther downstream in Drosophila class II genes. Genes & development 8, 830-842.

189. Qureshi, S.A., and Jackson, S.P. (1998). Sequence-specific DNA binding by the S. shibatae TFIIB homolog, TFB, and its effect on promoter strength. Molecular cell 1, 389-400.

190. Rach, E.A., Winter, D.R., Benjamin, A.M., Corcoran, D.L., Ni, T., Zhu, J., and Ohler, U. (2011). Transcription initiation patterns indicate divergent strategies for gene regulation at the chromatin level. PLoS genetics 7, el 001274.

191. Ranz, J.M., Ponce, A.R., Hartl, D.L., and Nurminsky, D. (2003). Origin and evolution of a new gene expressed in the Drosophila sperm axoneme. Genetica 118, 233-244.

192. Rastelli, L., and Kuroda, M.I. (1998). An analysis of maleless and histone H4 acetylation in Drosophila melanogaster spermatogenesis. Mechanisms of development 71, 107-117.

193. Rathert, P., Dhayalan, A., Murakami, M., Zhang, X., Tamas, R., Jurkowska, R., Komatsu, Y., Shinkai, Y., Cheng, X., and Jeltsch, A. (2008). Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature chemical biology 4, 344-346.

194. Reddi, P.P., Urekar, C.J., Abhyankar, M.M., and Ranpura, S.A. (2007). Role of an insulator in testis-specific gene transcription. Annals of the New York Academy of Sciences 1120, 95103.

195. Reeve, J.N. (2003). Archaeal chromatin and transcription. Molecular microbiology 48, 587-598.

196. Robertson, H.M., Preston, C.R., Phillis, R.W., Johnson-Schlitz, D.M., Benz, W.K., and Engels, W.R. (1988). A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster. Genetics 118,461-470.

197. Robinson, K.A., and Lopes, J.M. (2000). SURVEY AND SUMMARY: Saccharomyces cerevisiae basic helix-loop-helix proteins regulate diverse biological processes. Nucleic acids research 28, 1499-1505.

198. Roy, A.L. (2007). Signal-induced functions of the transcription factor TFII-I. Biochimica et biophysica acta 1769, 613-621.

199. Roy, A.L. (2012). Biochemistry and biology of the inducible multifunctional transcription factor TFII-I: 10 years later. Gene 492, 32-41.

200. Roy, A.L., Du, H., Gregor, P.D., Novina, C.D., Martinez, E., and Roeder, R.G. (1997). Cloning of an inr- and E-box-binding protein, TFII-I, that interacts physically and functionally with USF1. The EMBO journal 16, 7091-7104.

201. Roy, A.L., Meisterernst, M., Pognonec, P., and Roeder, R.G. (1991). Cooperative interaction of an initiator-binding transcription initiation factor and the helix-loop-helix activator USF. Nature 354, 245-248.

202. Rubin, G.M., Yandell, M.D., Wortman, J.R., Gabor Miklos, G.L., Nelson, C.R., Hariharan, I.K., Fortini, M.E., Li, P.W., Apweiler, R., Fleischmann, W., et al. (2000). Comparative genomics of the eukaryotes. Science 287, 2204-2215.

203. Saito, K., Nishida, K.M., Mori, T., Kawamura, Y., Miyoshi, K., Nagami, T., Siomi, H., and Siomi, M.C. (2006). Specific association of Piwi with rasiRNAs derived from retrotransposon and heterochromatic regions in the Drosophila genome. Genes & development 20, 2214-2222.

204. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd edn (Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory).

205. Sandelin, A., Carninci, P., Lenhard, B., Ponjavic, J., Hayashizaki, Y., and Hume, D.A. (2007). Mammalian RNA polymerase II core promoters: insights from genome-wide studies. Nature reviews. Genetics 8, 424-436.

206. Santel, A., Kaufmann, J., Hyland, R., and Renkawitz-Pohl, R. (2000). The initiator element of the Drosophila beta2 tubulin gene core promoter contributes to gene expression in vivo but is not required for male germ-cell specific expression. Nucleic acids research 28, 1439-1446.

207. Sarge, K.D., Murphy, S.P., and Morimoto, R.I. (1993). Activation of heat shock gene transcription by heat shock factor 1 involves oligomerization, acquisition of DNA-binding activity, and nuclear localization and can occur in the absence of stress. Molecular and cellular biology 13, 13921407.

208. Sassone-Corsi, P., Corden, J., Kedinger, C., and Chambon, P. (1981). Promotion of specific in vitro transcription by excised "TATA" box sequences inserted in a foreign nucleotide environment. Nucleic acids research 9, 3941-3958.

209. Schafer, M., Kuhn, R., Bosse, F., and Schafer, U. (1990). A conserved element in the leader mediates post-meiotic translation as well as cytoplasmic polyadenylation of a Drosophila spermatocyte mRNA. The EMBO journal 9, 4519-4525.

210. Schotta, G., Ebert, A., Krauss, V., Fischer, A., Hoffmann, J., Rea, S., Jenuwein, T., Dorn, R., and Reuter, G. (2002). Central role of Drosophila SU(VAR)3-9 in histone H3-K9 methylation and heterochromatic gene silencing. The EMBO journal 21, 1121-1131.

211. Schug, J. (2008). Using TESS to predict transcription factor binding sites in DNA sequence. Current protocols in bioinformatics Chapter 2: Unit 2.6.

212. Schug, J., and Overton, G.C. (1997). Modeling transcription factor binding sites with Gibbs Sampling and Minimum Description Length encoding. Proceedings / ... International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology; ISMB. International Conference on Intelligent Systems for Molecular Biology 5, 268-271.

213. Schulz, R.A., Miksch, J.L., Xie, X.L., Cornish, J.A., and Galewsky, S. (1990). Expression of the Drosophila gonadal gene: alternative promoters control the germ-line expression of monocistronic and bicistronic gene transcripts. Development 108, 613-622.

214. Sen, R., and Baltimore, D. (1986). Multiple nuclear factors interact with the immunoglobulin enhancer sequences. Cell 46, 705-716.

215. Shevelyov, Y.Y. (1992). Copies of a Stellate gene variant are located in the X heterochromatin of Drosophila melanogaster and are probably expressed. Genetics 132, 1033-1037.

216. Shevelyov, Y.Y., Lavrov, S.A., Mikhaylova, L.M., Nurminsky, I.D., Kulathinal, R.J., Egorova, K.S., Rozovsky, Y.M., and Nurminsky, D.I. (2009). The B-type lamin is required for somatic repression of testis-specific gene clusters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 3282-3287.

217. Shimada, A., Dohke, K., Sadaie, M., Shinmyozu, K., Nakayama, J., Urano, T., and Murakami, Y. (2009). Phosphorylation of Swi6/HPl regulates transcriptional gene silencing at heterochromatin. Genes & development 23, 18-23.

218. Shimizu, T., Toumoto, A., Ihara, K., Shimizu, M., Kyogoku, Y., Ogawa, N., Oshima, Y., and Hakoshima, T. (1997). Crystal structure of PII04 bHLH domain-DNA complex: flanking base recognition. The EMBO journal 16, 4689-4697.

219. Simionato, E., Ledent, V., Richards, G., Thomas-Chollier, M., Kerner, P., Coornaert, D., Degnan, B.M., and Vervoort, M. (2007). Origin and diversification of the basic helix-loop-helix gene family in metazoans: insights from comparative genomics. BMC evolutionary biology 7, 33.

220. Skinner, M.K., Rawls, A., Wilson-Rawls, J., and Roalson, E.H. (2010). Basic helix-loop-helix transcription factor gene family phylogenetics and nomenclature. Differentiation; research in biological diversity 80,1-8.

221. Smale, S.T., and Baltimore, D. (1989). The "initiator" as a transcription control element. Cell 57, 103-113.

222. Snee, M.J., and Macdonald, P.M. (2004). Live imaging of nuage and polar granules: evidence against a precursor-product relationship and a novel role for Oskar in stabilization of polar granule components. Journal of cell science 117, 2109-2120.

223. Spellman, P.T., and Rubin, G.M. (2002). Evidence for large domains of similarly expressed genes in the Drosophila genome. Journal of biology 1, 5.

224. Stabell, M., Eskeland, R., Bjorkmo, M., Larsson, J., Aalen, R.B., Imhof, A., and Lambertsson, A. (2006). The Drosophila G9a gene encodes a multi-catalytic histone methyltransferase required for normal development. Nuclcic acids research 34, 4609-4621.

225. Stevens, J.D., Roalson, E.II., and Skinner, M.K. (2008). Phylogenetic and expression analysis of the basic helix-loop-helix transcription factor gene family: genomic approach to cellular differentiation. Differentiation; research in biological diversity 76, 1006-1022.

226. Suzuki, Y., Tsunoda, T., Sese, J., Taira, H., Mizushima-Sugano, J., Hata, H., Ota, T., Isogai, T., Tanaka, T., Nakamura, Y., et al. (2001). Identification and characterization of the potential promoter regions of 1031 kinds of human genes. Genome research 11, 677-684.

227. Takemoto, A., Kimura, K., Yanagisawa, J., Yokoyama, S., and Hanaoka, F. (2006). Negative regulation of condensin I by CK2-mediated phosphorylation. The EMBO journal 25, 53395348.

228. Theisen, J.W., Lim, C.Y., and Kadonaga, J.T. (2010). Three key subregions contribute to the function of the downstream RNA polymerase II core promoter. Molecular and cellular biology 30, 3471-3479.

229. Thibault, S.T., Singer, M.A., Miyazaki, W.Y., Milash, B., Dompe, N.A., Singh, C.M., Buehholz, R., Demsky, M., Fawcett, R., Francis-Lang, H.L., et al. (2004). A complementary transposon tool kit for Drosophila melanogaster using P and piggyBac. Nature Genetics 36, 283-287.

230. Thomas, M.C., and Chiang, C.M. (2006). The general transcription machinery and general cofactors. Critical reviews in biochemistry and molecular biology 41, 105-178.

231. Thummel, C.S., Boulet, A.M., and Lipshitz, H.D. (1988). Vectors for Drosophila P-element-mediated transformation and tissue culture transfection. Gene 74, 445-456.

232. Tokusumi, Y., Ma, Y., Song, X., Jacobson, R.H., and Takada, S. (2007). The new core promoter element XCPE1 (X Core Promoter Element 1) directs activator-, mediator-, and TATA-binding protein-dependent but TFIID-independent RNA polymerase II transcription from TATA-less promoters. Molecular and cellular biology 27, 1844-1858.

233. Tsai, F.T., and Sigler, P.B. (2000). Structural basis of preinitiation complex assembly on human pol II promoters. The EMBO journal 19, 25-36.

234. Tulin, A.V., Kogan, G.L., Filipp, D., Balakireva, M.D., and Gvozdev, V.A. (1997). Heterochromatic Stellate gene cluster in Drosophila melanogaster: structure and molecular evolution. Genetics 146, 253-262.

235. Usakin, L.A., Kogan, G.L., Kalmykova, A.I., and Gvozdev, V.A. (2005). An alien promoter capture as a primary step of the evolution of testes-expressed repeats in the Drosophila melanogaster genome. Molecular biology and evolution 22, 1555-1560.

236. Vagin, V.V., Sigova, A., Li, C., Seitz, H., Gvozdev, V., and Zamore, P.D. (2006). A distinct small RNA pathway silences selfish genetic elements in the germline. Science 313, 320-324.

237. van Heeringen, S.J., Akhtar, W., Jacobi, U.G., Akkers, R.C., Suzuki, Y., and Veenstra, G.J. (2011). Nucleotide composition-linked divergence of vertebrate core promoter architecture. Genome research 21,410-421.

238. Vibranovski, M.D., Lopes, II.F., Karr, T.L., and Long, M. (2009). Stage-specific expression profiling of Drosophila spermatogenesis suggests that meiotic sex chromosome inactivation drives genomic relocation of testis-expressed genes. PLoS genetics 5, el000731.

239. Vilar, J.M., and Saiz, L. (2005). DNA looping in gene regulation: from the assembly of macromolecular complexes to the control of transcriptional noise. Current opinion in genetics & development 15, 136-144.

240. Viollet, B., Lefrancois-Martinez, A.M., Iienrion, A., Kahn, A., Raymondjean, M., and Martinez, A. (1996). Immunochemical characterization and transacting properties of upstream stimulatory factor isoforms. The Journal of biological chemistry 271, 1405-1415.

241. Wang, Y.L., Duttke, S.H., Chen, K., Johnston, J., Kassavetis, G.A., Zeitlinger, J., and Kadonaga, J.T. (2014). TRF2, but not TBP, mediates the transcription of ribosomal protein genes. Genes & development 28, 1550-1555.

242. Wasserman, W.W., Palumbo, M., Thompson, W., Fickett, J.W., and Lawrence, C.E. (2000). Human-mouse genome comparisons to locate regulatory sites. Nature Genetics 26, 225-228.

243. Wasserman, W.W., and Sandelin, A. (2004). Applied bioinformatics for the identification of regulatory elements. Nature reviews. Genetics 5, 276-287.

244. Wasylyk, B., Derbyshire, R., Guy, A., Molko, D., Roget, A., Teoule, R., and Chambon, P. (1980). Specific in vitro transcription of conalbumin gene is drastically decreased by single-point mutation in T-A-T-A box homology sequence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 77, 7024-7028.

245. Weake, V.M., and Workman, J.L. (2010). Inducible gene expression: diverse regulatory mechanisms. Nature reviews. Genetics 11, 426-437.

246. White-Cooper, H. (2010). Molecular mechanisms of gene regulation during Drosophila spermatogenesis. Reproduction 139, 11-21.

247. White-Cooper, II., and Davidson, I. (2011). Unique aspects of transcription regulation in male germ cells. Cold Spring Harbor perspectives in biology 3.

248. White-Cooper, H., Leroy, D., MacQueen, A., and Fuller, M.T. (2000). Transcription of meiotic cell cycle and terminal differentiation genes depends on a conserved chromatin associated protein, whose nuclear localisation is regulated. Development 127, 5463-5473.

249. White-Cooper, H., Schafer, M.A., Alphey, L.S., and Fuller, M.T. (1998). Transcriptional and post-transcriptional control mechanisms coordinate the onset of spermatid differentiation with meiosis I in Drosophila. Development 125, 125-134.

250. Wilczynska, A., Minshall, N., Armisen, J., Miska, E.A., and Standart, N. (2009). Two Piwi proteins, Xiwi and Xili, are expressed in the Xenopus female germline. RNA 15, 337-345.

251. Willy, P.J., Kobayashi, R., and Kadonaga, J.T. (2000). A basal transcription factor that activates or represses transcription. Science 290, 982-985.

252. Wingender, E., Chen, X., Fricke, E., Geffers, R., Ilehl, R., Liebich, I., Krull, M., Matys, V., Michael, II., Ohnhauser, R., et al. (2001). The TRANSFAC system on gene expression regulation. Nucleic acids research 29, 281-283.

253. Wingender, E., Dietze, P., Karas, H., and Knuppel, R. (1996). TRANSFAC: a database on transcription factors and their DNA binding sites. Nucleic acids research 24, 238-241.

254. Xie, X., Kokubo, T., Cohen, S.L., Mirza, U.A., Hoffmann, A., Chait, B.T., Roeder, R.G., Nakatani, Y., and Burley, S.K. (1996). Structural similarity between TAFs and the heterotetrameric core of the histone octamer. Nature 380, 316-322.

255. Yamamoto, S., Jaiswal, M., Sandoval, H., Bayat, V., Zhang, K., Xiong, B., Charng, W.L., Haelterman, N.A., Jiang, L., Li, Y., et al. (2013). X chromosome lethals from the Bellen lab. Personal communication to FlyBase: FBrfD223478.

256. Yang, C., Bolotin, E., Jiang, T., Sladek, F.M., and Martinez, E. (2007). Prevalence of the initiator over the TATA box in human and yeast genes and identification of DNA motifs enriched in human TATA-less core promoters. Gene 389, 52-65.

257. Yang, J., Porter, L., and Rawls, J. (1995). Expression of the dihydroorotate dehydrogenase gene, dhod, during spermatogenesis in Drosophila melanogaster. Molecular & general genetics: MGG 246, 334-341.

258. Yanicostas, C., and Lepesant, J.A. (1990). Transcriptional and translational cis-regulatory sequences of the spermatocyte-specific Drosophila janusB gene are located in the 3' exonic region of the overlapping janusA gene. Molecular & general genetics : MGG 224, 450-458.

259. Yanicostas, C., Vincent, A., and Lepesant, J.A. (1989). Transcriptional and posttranscriptional regulation contributes to the sex-regulated expression of two sequence-related genes at the janus locus of Drosophila melanogaster. Molecular and cellular biology 9, 2526-2535.

260. Yoon, J., Lee, K.S., Park, J.S., Yu, K., Paik, S.G., and Kang, Y.K. (2008). dSETDBl and SU(VAR)3-9 sequentially function during germline-stem cell differentiation in Drosophila melanogaster. PloS one 3, e2234.

261. Zhao, T., and Eissenberg, J.C. (1999). Phosphorylation of heterochromatin protein 1 by casein kinase II is required for efficient heterochromatin binding in Drosophila. The Journal of biological chemistry 274, 15095-15100.

262. Zhao, T., Heyduk, T., and Eissenberg, J.C. (2001). Phosphorylation site mutations in heterochromatin protein 1 (HP1) reduce or eliminate silencing activity. The Journal of biological chemistry 276, 9512-9518.