Участие ассоциированного с фосфатазой лимфоцитарного фосфопротеина (LPAP) в процессах активации Т-клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.03, кандидат наук Круглова Наталья Андреевна

• Круглова Наталья Андреевна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Круглова Наталья Андреевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антигенспецифическая активация Т-клеток

1.1.1 Внутриклеточный сигнальный каскад, запускаемый при активации Т-клеток через TCR

1.1.2 Основные методы исследования Т-клеточного сигнального каскада

1.1.3 Регуляторный модуль Т-клеточного сигнального каскада

1.1.4 Серин-треониновые киназы в Т-клеточном сигналинге

1.2 Значение фосфорилирования белков

1.2.1 Подходы к изучению фосфорилирования

1.2.2 Методы детекции фосфорилированных белков

1.2.3 Методы обогащения образца фосфорилированными белками и пептидами

1.2.4 Идентификация сайтов фосфорилирования

1.2.5 Количественный анализ фосфорилирования

1.2.6 Связывание киназ с сайтами фосфорилирования

1.2.7 Определение последствий фосфорилирования

1.3 Кинетика сигнальных путей

1.3.1 Кинетика Т-клеточного сигнального каскада

1.3.2 Данные о кинетике Т-клеточного сигнального каскада, полученные с помощью Вестерн-блоттинга с фосфоспецифическими антителами

1.3.3 Данные о кинетике Т-клеточного сигнального каскада, полученные с помощью масс-спектрометрического анализа фосфопротеома

1.4 Белок LPAP

1.4.1 Общие сведения о белке

1.4.2 Экспрессия LPAP/CD45-AP

1.4.3 Экспрессия LPAP/CD45-AP в CD45+/+ и CD45-/- клетках

1.4.4 Протеоформы белка LPAP

1.4.5 Фосфорилирование белка LPAP

1.4.6 Взаимодействие LPAP/CD45-AP с другими белками

1.4.7 Ген РТРЯСЛР

1.4.8 Изучение функции LPAP методом «loss-of-function»

1.4.9 Дополнительные сведения о белке LPAP

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Растворы и реагенты

2.2 Клеточные линии и первичные клетки

2.2.1 Клеточные линии

2.2.2 Первичные клетки

2.2.3 Выделение периферических мононуклеарных клеток крови

2.3 Создание нокаутных клеточных линий

2.3.1 Создание клеточных линий СЕМ и Jurkat с нокаутом по LPAP или CD45 с помощью CRISPR/Cas9 методом double-nicking

2.3.2 Создание клеточных линий СЕМ и Jurkat с нокаутом по LPAP методом SORTS

2.4 Получение клеточных линий J531 LPAP wt, KIO LPAP wt и K562 LPAP с помощью лентивирусной трансдукции

2.5 Получение моноклональных фосфоспецифических антител против LPAP

2.6 Иммуноферментный анализ (ИФА)

2.7 Проточная цитометрия

2.8 Активация клеток

2.9 Ингибиторный анализ

2.10 Мечение белков флуоресцентным красителем

2.11 Сшивка белков in situ

2.12 Иммунопреципитация

2.13 Дефосфорилирование белков in vitro

2.14 In vitro киназный тест

2.15 Деградация белков в присутствии циклогексимида

2.16 Подготовка образцов для прямого Вестерн-блоттинга

2.17 Электрофоретические методы

2.17.1 SDS-Электрофорез

2.17.2 Голубой нативный электрофорез (Blue-Native PAGE)

2.17.3 Фосфо-аффинный электрофорез с реагентом Phos-tag

2.17.4 Двумерный электрофорез

2.18 Вестерн-блоттинг

2.19 Масс-спектрометрический анализ

2.19.1 Пробоподготовка для идентификация белковых полос

2.19.2 Пробоподготовка для идентификации активационного сайта фосфорилирования

2.19.3 Масс-спектрометрический анализ

2.20 Статистическая обработка данных

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Фосфорилирование LPAP в условиях активации клеток

3.1.1 Паттерн фосфорилирования LPAP в условиях активации клеток

3.1.2 Идентификация активационного сайта фосфорилирования LPAP

3.1.3 Характеристика протеоформ белка LPAP в различных клеточных линиях в норме и в условиях активации

3.1.4 Характеристика протеоформ белка LPAP в первичных клетках

3.1.5 Поиск стимулов, влияющих на фосфорилирование LPAP

3.1.6 Кинетика фосфорилирования LPAP

3.1.7 Влияние фосфорилирования на стабильность белка LPAP

3.1.8 Поиск киназ и фосфатаз, участвующих в фосфорилировании LPAP

3.1.9 Фосфорилирование LPAP по индивидуальным сайтам не зависит друг от друга

3.2 Поиск белков-партнеров LPAP

3.3.1 Поиск белков-партнеров LPAP с помощью метода FIPA

3.3.2 Коиммунопреципитация/масс-спектрометрия без поперечного сшивания

3.3.3 Коиммунопреципитация/масс-спектрометрия с предварительной поперечной сшивкой взаимодействующих белков

3.3.4 Комплексы LPAP, проявляемые с помощью голубого нативного электрофореза

3.3 Изучение роли взаимодействия LPAP с фосфатазой CD45

3.3.1 Уровень экспрессии белка LPAP падает в отсутствие CD45

3.3.2 Фосфорилирование LPAP в клетках с нокаутом CD45

3.3.3 Уровень белка CD45 падает при нокаутировании LPAP

3.3.4 Экспрессия CD45 коррелирует с уровнем белка LPAP в клетках Jurkat

4. Обсуждение

5. Выводы

6. Список литературы

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПК - Антигенпрезентирующая клетка БСА - Бычий сывороточный альбумин ИФА - иммуноферментный анализ

2D-DIGE - Two-Dimensional-Difference Gel Electrophoresis

2D-PAGE - Two-Dimensional-Polyacrylamide Gel Electrophoresis

AQUA - Absolute Quantification

ATP - Adenosine Triphosphate

BSA - Bovine Serum Albumin

Cas - CRISPR-Associated Protein

CD45-AP - CD45-Associated Protein

CRISPRS - Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats DAG - diacylglycerol

ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FCS - Fetal Calf Serum

FITC - Fluorescein Isothyocyanate

FRET - Förster Resonance Energy Transfer

gRNA (sgRNA) - guide (single guide) RNA

GTP - Guanosine triphosphate

HDX-MS - Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry IMAC - Immobilized Metal Affinity Chromatography IP3 - Inositol-1,4,5-Triphosphate

ITAMs - Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motifs iTRAQ - Isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation KD - knock down Kd - константа диссоциации KO - knock out

Lck - Lymphocyte-Specific Protein Tyrosine Kinase

LPAP - Lymphocyte Phosphatase-Associated Phosphoprotein

LSM-1 - Lymphocyte Specific Molecule-1

MBP - Myelin Basic Protein

MHC - Major Histocompatibility Complex

MS/MS - Tandem Mass Spectrometry

NMR - Nuclear Magnetic Resonance

PBS - Phosphate Buffered Saline

PBu2 - Phorbol-12,13 -Dibutyrate

PHA - Phytohemagglutinin

pI - изоэлектрическая точка

PKC - Protein Kinase C

pMCC - Moth Cytochrome C Peptide

PTPRCAP - Protein Tyrosine Phosphatase Receptor Type C-Associated Protein RasGEFs - Ras Guanine nucleotide Exchange Factors RasGRPs - Ras Guanyl nucleotide-Releasing Proteins

RPMI - Roswell Park Memorial Institute Medium (среда для культивирования клеток)

RT-PCR - Real-Time Polymerase Chain Reaction

SCX - Strong Cation Exchange Chromatography

SILAC - Stable Isotope Labeling By/With Amino Acids In Cell Culture

TCR - T Cell Receptor

TiO2 - Titanium Dioxide

TIRF - Total Internal Reflection Fluorescence

TMTs - Tandem Mass Tags

WB - Western Blot

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Участие ассоциированного с фосфатазой лимфоцитарного фосфопротеина (LPAP) в процессах активации Т-клеток»

Актуальность темы исследования

При активации лимфоцитов через антиген-специфический рецептор развивается внутриклеточный каскад реакций, в котором участвуют киназы и фосфатазы, а также адаптерные белки, лишенные каталитической активности, но необходимые для работы ферментов и сборки макромолекулярных комплексов. Трансмембранный белок лимфоцитов LPAP (Lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein) претендует на роль такого адаптерного белка.

LPAP был впервые описан как партнер фосфатазы CD45, играющей важную роль в активации лимфоцитов. LPAP не имеет гомологов в протеоме человека и его функция до сих пор неизвестна. В литературе имеются лишь косвенные данные о его роли в активации Т-клеток и в развитии В-клеток. Однако тесная связь LPAP с фосфатазой CD45 и его множественное фосфорилирование позволяют предположить, что этот белок - один из участников активационного каскада. Молекула CD45 способна регулировать киназу Lck, необходимую для запуска активационного каскада после стимуляции TCR. Взаимодействуя с CD45, LPAP может влиять на передачу сигнала от антигенспецифического рецептора.

Ранее было обнаружено, что белок LPAP в Т-клетках существует в виде как минимум пяти протеоформ, четыре из которых являются фосфоформами. Были идентифицированы три сайта фосфорилирования LPAP, Ser-99, Ser-153 и Ser-172, и проведено отнесение этих сайтов индивидуальным фосфоформам белка. Однако участие LPAP в сигнальных путях лимфоцитов все еще остается неизученным. Не установлено, какие клеточные стимулы способны изменять статус фосфорилирования LPAP, какова кинетика этого изменения и какие киназы ответственны за эти события. Молекулярные партнеры LPAP, кроме фосфатазы CD45, также неизвестны. Наконец, требует более детального исследования функциональная связь между LPAP и CD45. Ответы на все эти вопросы могут помочь приблизиться к пониманию функции LPAP и открыть новые детали активации лимфоцитов.

Цель работы - исследовать участие белка LPAP в процессах активации лимфоцитов. Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи: 1) Исследовать фосфорилирование LPAP в условиях активации лимфоцитов:

a) Охарактеризовать паттерн фосфорилирования LPAP в активированных Т, В-, NK-клеточных линиях и первичных лимфоцитах;

b) Выявить клеточные стимулы, под действием которых изменяется статус фосфорилирования LPAP, а также описать кинетику фосфорилирования белка LPAP в ответ на стимуляцию клеток Jurkat;

c) С помощью ингибиторного анализа определить киназы, участвующие в фосфорилировании LPAP в клетках Jurkat;

2) С помощью коиммунопреципитации/масс-спектрометрии (co-IP/MS) и нативного голубого электрофореза (Blue Native PAGE) провести поиск белков, взаимодействующих с LPAP в Т-клетках CEM и Jurkat.

3) Исследовать функциональную связь взаимодействия между LPAP и CD45:

a) Определить уровень экспрессии LPAP и CD45 в отсутствие белка-партнера;

b) Оценить экспрессию CD45 в клетках Jurkat с различным уровнем белка LPAP.

Научная новизна работы

В работе впервые предпринята попытка установить связь между фосфорилированием белка LPAP и процессами активации лимфоцитов. Впервые проанализировано фосфорилирование белка LPAP при активации различных типов клеток, включая первичные клетки. Изучена кинетика фосфорилирования LPAP и идентифицирован новый сайт Ser-163, претерпевающий фосфорилирование только в условиях активации лимфоцитов. Впервые с помощью ингибиторного анализа и in vitro киназного теста показано, что ERK1/2 способна фосфорилировать LPAP по Ser-163. Иными словами, обнаружен новый субстрат многофункциональной киназы ERK1/2.

Впервые проведен систематический поиск белков-партнеров LPAP. Выдвинуто предположение о том, что единственным функциональным партнером LPAP может быть фосфатаза CD45.

Для изучения роли LPAP методом «loss-of-function» впервые получена поликлональная популяция клеток Jurkat, нокаутных по этому белку, а также панель клеточных линий с различным уровнем LPAP. Впервые показана корреляция между уровнями белка LPAP и белка CD45 в клетках Jurkat. Выдвинута гипотеза о том, что функция LPAP может состоять в регуляции уровня CD45 в клетке.

Теоретическая и практическая значимость работы

Проведенные исследования свидетельствуют в пользу того, что белок LPAP способен регулировать уровень фосфатазы CD45. Установлено, что в отсутствие LPAP уровень CD45 составляет 30% от уровня дикого типа, а при восстановлении экспрессии LPAP, уровень CD45 возрастает пропорциональным образом. Существование корреляции между LPAP и CD45 подтверждается рядом независимых подходов на серии клонов и поликлональных популяций Jurkat, с использованием нокаутирования по технологии CRIPRS/Cas9 и с помощью технологии РНК-интерференции, а также на панели различных лимфоидных клеточных линий. Таким образом, результаты работы позволяют сформулировать гипотезу о том, что функция LPAP состоит в регуляции уровня CD45 в клетке. Это исследование представляет ценность, поскольку позволяет приблизиться к пониманию функции белка LPAP в клетке. Полученные результаты могут лечь в основу дальнейших исследований, направленных на изучение регуляции CD45 и активационного сигнального каскада лимфоцитов в целом.

Результатом работы, важным с практической точки зрения, стали полученные инструменты для дальнейшего изучения роли LPAP в лимфоцитах. Во-первых, это моноклональные антитела к «активационному» сайту фосфорилирования LPAP - Бег-163. С их помощью статус фосфорилирования LPAP можно изучать при активации не только клеточных линий, но и первичных клеток. Данные о том, что этот сайт способен фосфорилироваться киназой ЕЯК1/2, позволяют предположить, что он представляет собой регуляторный элемент сигнального каскада лимфоцитов. Во-вторых, важным инструментом стала панель клеточных линий, нокаутных по LPAP, и линий с различным уровнем этого белка, среди которых есть как клональные, так и поликлональные культуры. Эти линии могут быть использованы для изучения того, на каком этапе жизненного цикла белка LPAP способен регулировать уровень CD45. Они будут служить удобной родительской линией для получения культур с различными мутантными формами LPAP.

Методология и методы исследования

Статус фосфорилирования LPAP оценивали в клетках Jurkat, СЕМ, НЦТ78, Raji, KG1a, YT, а также в первичных клетках - РВМС и тимоцитах. Для этого клетки инкубировали в присутствии форболмиристатацетата (РМА), активатора РКС, или антител против антигенспецифических рецепторов Т- и В-клеток.

Для анализа фосфорилирования использовали набор электрофоретических методов: двумерный электрофорез, фосфо-аффинный электрофорез, Вестерн блоттинг с проявкой фосфоспецифическими антителами, а также электрофорез в высокопроцентном геле, в котором некоторые фосфоформы LPAP имеют измененную электрофоретическую подвижность.

В условиях активации клеток была выявлена дополнительная фосфоформа LPAP. На основании данных фосфо-аффинного электрофореза было предсказано, что она фосфорилирована по новому сайту, отличному от ранее идентифицированных Ser-99, Ser-153 и Ser-172. Для определения этого «активационного» сайта использовали два независимых метода: масс-спектрометрию и сайт-направленный мутагенез с анализом протеоформ белка LPAP, мутантного по предполагаемым сайтам фосфорилирования.

Для проверки гипотезы о существовании иерархического фосфорилирования LPAP использовали клетки с 4 мутантными формами белка LPAP, S172D, S99A/S153A/S172A, S163A, stop184, в которых с помощью фосфоспецифических антител оценивали фосфорилирование по сайтам S99 и S163, S163, S99 и S172, S163, соответственно.

Чтобы определить место фосфорилирования Ser-163 в сигнальной сети клетки использовали несколько подходов. Во-первых, анализировали статус фосфорилирования LPAP в ответ на активацию клеток под действием различных стимулов. Во-вторых, оценивали кинетику (де)фосфорилирования при активации клеток. В-третьих, использовали ингибиторный анализ с целью определить киназу, ответственную за фосфорилирование LPAP по Ser-163. Для независимого подтверждения результатов ингибиторного анализа применяли in vitro киназный тест.

Для определения того, влияет ли фосфорилирование по Ser-153 на стабильность белка LPAP, сравнивали скорость деградации LPAP дикого типа и LPAP S153A при инкубации клеток с циклогексимидом.

Поиск белков-партнеров LPAP вели с помощью нескольких методов. Для обнаружения прочных комплексов использовали иммунопреципитационный анализ с флуоресцентной меткой (FIPA) и ко-иммунопреципитацию с последующим масс-спектрометрическим анализом (co-IP/MS). Для детекции слабых взаимодействий образцы перед co-IP/MS предварительно стабилизировали с помощью кросс-линкеров.

Для изучения взаимосвязи между экспрессией LPAP и CD45 с помощью технологии CRISPR/Cas9 были получены нокаутные по LPAP или по CD45 клетки. В случае белка LPAP использовали также метод SORTS, позволяющий получать

поликлональные популяции нокаутов по внутриклеточному белку. Оценку уровня CD45 в зависимости от уровня LPAP проводили на клетках Jurkat LPAP КО, стабильно трансдуцированных конструкциями с геном LPAP WT.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В активированных Т-клеточных линиях 1игка1 и СЕМ, а также в мононуклеарах периферической крови присутствует новая протеоформа белка ЬРЛР, связанная с его фосфорилированием по Ser-163.

2. При активации клеток 1игка1 происходит дефосфорилирование ЬРЛР по Бег-99 и Бег-172 и фосфорилирование по Бег-163.

3. Киназа ЕКК фосфорилирует ЬРЛР по Бег-163.

4. Единственным надежно подтвержденным партнером LPAP является фосфатаза СБ45.

5. Экспрессия CD45 и LPAP в клетках 1игка1 взаимосвязана: при снижении уровня LPAP или CD45 экспрессия белка-партнера падает.

Личный вклад автора

Результаты работы получены автором или при его участии. Вклад автора состоит в планировании и проведении экспериментов, обработке и анализе результатов, подготовке публикаций и докладов, написании текста диссертации.

Достоверность результатов

Результаты диссертационной работы получены на сертифицированном откалиброванном оборудовании. Проведено необходимое количество повторностей. Использованы корректные методики и расчеты. Для сравнения авторских данных с ранее опубликованными данными по исследуемой тематике привлекаются независимые источники. Выводы работы обоснованы и соответствуют полученным результатам.

Апробация результатов и публикации

Результаты диссертационной работы были представлены на конференциях и научных школах: XV научная конференция молодых ученых «Иммунология сегодня: традиции и инновации» (ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Россия, 22 апреля 2016), Biomembranes 2016 (Долгопрудный, Россия, 26-30 сентября 2016), V

Съезд Биохимиков России (Сочи, Россия, 4-8 октября 2016), XVI Научный форум имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, Россия, 5-8 июня 2017), 42nd FEBS Congress «From Molecules to Cells and Back», (Иерусалим, Израиль, 10-14 сентября 2017), EMBO Conference «Lymphocyte Antigen Receptor Signalling» (Сиена, Италия, 25-29 августа 2018), 10th EFIS/EJI South East European Immunology School (SEEIS2018) (Ереван, Армения, 19-22 октября 2018),

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ: 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, а также 8 тезисов.

Статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в Web of Science:

1. Filatov A., Kruglova N., Meshkova T., Mazurov D. Lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein proteoforms analyzed using monoclonal antibodies // Clin. Transl. Immunol. 2015. Vol. 4, № 10. P. e44. Импакт-фактор (WoS) - 7.271.

2. Kruglova N.A., Meshkova T.D., Kopylov A.T., Mazurov D.V., Filatov A.V. Constitutive and activation-dependent phosphorylation of lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein (LPAP). // PLoS One. 2017. Vol. 12, № 8. P. e0182468. Импакт-фактор (WoS) - 2.776.

3. Цой Т.В., Круглова Н.А., Филатов А.В. Фосфатазо-ассоциированный фосфопротеин является субстратом протеинкиназы CK2 // Биохимия. 2018. Том. 83, № 11. с. 1698-1707. Импакт-фактор (WoS) - 1.886.

4. Круглова Н.А., Копылов А.Т., Филатов А.В. Поиск молекулярных партнеров ассоциированного с фосфатазой фосфопротеина (LPAP), участвующих в активации лимфоцитов человека // Молекулярная биология. 2019. Том. 53, № 5, с.838-848. Импакт-фактор (WoS) - 0.977.

Тезисы конференций:

1. Natalia Kruglova, Tatiana Tsoy, Maria Byazrova 10th EFIS/EJI South East European Immunology School (SEEIS2018), Armenia, Yerevan, 19-22 October 2018. Опубликованы в сборнике тезисов, р 25.

2. Natalia Kruglova, Tatiana Tsoy, Maria Byazrova, Alexander Filatov (2018) Is LPAP a signaling molecule? EMBO Conference «Lymphocyte Antigen Receptor Signalling», Italy, Siena, 25-29 August 2018. Опубликованы в сборнике тезисов, р 45.

3. Kruglova N., Meshkova T., Kopylov A., Mazurov D., Filatov A. (2017) The phosphorylation status of lymphocyte phoshatase-associated phosphoprotein (LPAP) changes dynamically upon lymphocyte activation. 42nd FEBS Congress, From Molecules to Cells and Back, Jerusalem, Israel, 10-14 September 2017. Опубликованы в сборнике The FEBS Journal 284 (Suppl. 1) 2017, p348, abstract № PP.5.4-005.

4. А. В. Филатов, Н. А. Круглова, Т. Д. Мешкова, Д. В. Мазуров (2017) Участие лимфоцитарного фосфатаза-ассоциированного фосфопротеина в активации лимфоцитов. Медицинская иммунология. т. 19, № спецвыпуск. с. 66-67.

5. Н.А. Круглова, А.Т. Копылов, Т.Д. Мешкова, А.В. Филатов. (2017) Таргетная протеомика лимфоцитарного фосфатаза-ассоциированного фосфопротеина (LPAP). Научные труды. Объединенный научный форум. Международная конференция по биоорганической химии «XII чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова», VIII Российский симпозиум «Белки и пептиды» Москва, 18 - 22 сентября 2017. Acta Naturae, спецвыпуск, стр. 21-22.

6. А.В. Филатов, Н.А. Круглова, Т.Д. Мешкова, М.Г. Завьялова, А.Т. Копылов, Д.В. Мазуров (2016) Лимфоцитарный фосфатазоассоциированный фосфопротеин (LPAP) - трансмембранный белок с неизвестной функцией. V Съезд биохимиков России, Сочи-Дагомыс, Россия 4-9 октября 2016. Acta Naturae 2016, том 2, стр. 164165.

7. Kruglova N.A., Meshkova T.D., Filatov A.V. (2016) Proteoforms of lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein. Biomembranes 2016, Долгопрудный, Россия, 26-30 сентября 2016. Опубликованы в сборнике BIOMEMBRANES 2016: Mechanisms of Aging and Age-Related Diseases, Book of Abstracts, p115.

8. Круглова Н.А., Мешкова Т.Д. (2016) Исследование протеоформ Лимфоцитарного Фосфатазо-Ассоциированного Фосфопротеина. XV научная конференция молодых ученых «Иммунология сегодня: традиции и инновации», ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Россия, 22 апреля 2016, в сборнике материалов конференции с.8 .

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и

методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка

литературы, который включает 227 источников. Работа изложена на 140 страницах, содержит 36 рисунков и 2 таблицы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Антигенспецифическая активация Т-клеток

Т-клетки являются важнейшим компонентом адаптивной иммунной системы, обеспечивая защиту организма от инфекций, опухолей и поддерживая тканевой гомеостаз. Исследования того, каким образом Т-клетки выполняют свои функции, начались в середине 1970-х, после экспериментов Р. Цинкернагеля и П. Догерти, показавших, что Т-клетки распознают лиганд в контексте молекул МНС [1]. Следом была понята структура Т-клеточного рецептора [2] и начались исследования сигнального каскада.

Сигналом к активации Т-клеток служит связывание TCR с комплексом [МНС-пептид] на поверхности АПК. Т-клетки способны распознавать не один единственный лиганд, а серию лигандов с разной аффинностью в диапазоне ^=1-100 мкМ [3]. В зависимости от аффинности взаимодействия TCR-[MHC-пептид], функциональные последствия для Т-клетки могут быть различными [4]. Удивительно, что разница в аффинностях между «своим» и «чужим» пептидом очень мала [5]. Как в таком случае устанавливается порог активации, не до конца понятно. Если TCR оказывается специфичным к комплексу [МНС-пептид], запускается внутриклеточный сигнал, в результате которого изменяется транскрипционная программа клеток, их метаболизм, подвижность и в конечном счете функциональная активность.

1.1.1 Внутриклеточный сигнальный каскад, запускаемый при активации Т-клеток через TCR

Димер TCR, вместе с ко-рецептором CD4 или CD8, отвечает за распознавание, но не способен самостоятельно запустить активационный каскад, так как лишен каталитической активности и сигнальных мотивов. TCR формирует комплекс с молекулами CD3 и ^-цепями, которые во внутриклеточной части имеют мотивы 1ТАМ, содержащие остатки тирозина. При связывании с комплексом [МНС-пептид] TCR сближается с ко-рецептором, ассоциированным с киназой Lck. Lck фосфорилирует молекулы CD3 и ^-цепи по остаткам тирозина в мотивах 1ТАМ. После этого киназа Zap-70 связывается с фосфорилированными ITAMs с помощью $Н2--домена [4].

Активация Zap-70 считается ключевой проверочной точкой, после прохождения которой и запускается каскад реакций [6]. Zap-70 фосфорилирует адаптерный белок

LAT, и начинается сборка LAT-сигналосомы: на фосфорилированные остатки тирозина садятся адаптерные белки и киназы, каскад начинает ветвится по различным путям. PLCyl превращает PIP2 в IP3, необходимый для повышения концентрации кальция, и в DAG, мембранный мессенджер, служащий для активации PKC и Ras-MAPK пути. Адаптерные белки SOS и SLP-76 привлекают ГТФазы Ras, Rac и Rho, ответственные за перестройку цитоскелета. Благодаря костимуляции через CD28 активируется PI3K/Akt/mTOR путь, необходимый для подстройки метаболизма. Сигнальные пути приводят к транслокации в ядро транскрипционных факторов NFAT, NFkB, AP-1 и других и изменении транскрипционных программ клетки [7].

Рис. 1. Общая схема основных этапов Т-клеточного сигнального пути (по Gaud et al., 2018 [4] с изменениями)

В ранних этапах активации Т-клеток многое еще остается неизвестным. Имеются различные данные о состоянии киназ Lck и Zap-70 и их вкладе в запуск сигнала. Нет ясности, каков пул активированных молекул Lck в покоящихся клетках. В разных работах приводятся данные от 40% [8] до 1% [9]. В первом случае ключевая роль в запуске сигнала отводится ассоциации TCR с киназой, связанной с ко-рецептором. Во втором случае подчеркивается важность de novo фосфорилирования Lck, что

подтверждается и другими данными [10]. Сложность еще заключается в том, что однозначная связь между конформацией киназы, ее фосфорилированием и активностью не установлена [4].

Тем не менее базальная активность Lck существует. Было показано, что in vivo Ç-цепи комплекса TCR в Т-клетках фосфорилированы и даже ассоциированы с киназой Zap-70 в отсутствии стимуляции [11]. Предполагается, что конститутивная активность киназ и фосфорилирование ITAMs ограничивается ингибиторными механизмами, в первую очередь тирозиновыми фосфатазами [12]. Смещение баланса между активностью фосфатаз и киназ в сторону последних необходимо для запуска сигнального каскада.

Несмотря на множество работ по Т-клеточному сигналингу, по-прежнему нет единого мнения о том, каким образом взаимодействие TCR^MHC-rern^] переходит во внутриклеточный каскад реакций [7]. Существует несколько гипотез о природе «сопрягающего механизма». Общим для всех гипотез является предположение, что после связывания TCR Т-клетка должна пройти дополнительные «контрольные точки», прежде чем запустится активационный сигнал. Связывания TCR с нужным пептидом недостаточно для активации. В целом модель активации Т-клеток называют «kinetic proofreading model», подчеркивая, что способность клетки активироваться развивается во времени по мере прохождения контрольных механизмов [13]. Среди таких механизмов описаны оборот рецептора («receptor turnover» или «serial engagement» [14]), ко-рецепторное сканирование («co-receptor scanning» [15]), кинетическая сегрегация («kinetic segregation» [16]), олигомеризация, конформационные изменения [17] и механические силы [18]. Вероятно, все эти процессы играют роль, однако объединить их в единую схему пока не удается.

1.1.2 Основные методы исследования Т-клеточного сигнального каскада

Общая картина Т-клеточного сигнального пути начала складываться в 90-е гг. [19]. Основополагающие исследования были проведены с помощью линии Jurkat, полученной в 1980 г. [20,21]. Для расшифровки каскада реакций и поиска его новых участников использовали несколько основных методов. Первой начали применять ко-иммунопреципитацию на антителах против известного белка. Предварительное введение в клетки радиоактивного фосфора позволяло определять белки, претерпевающие (де)фосфорилирование в ответ на активацию Т-клеток, и таким образом выявлять новых участников каскада [22,23]. В конце 80-х появились анти-

фосфотирозиновые антитела, которые значительно облегчили и обезопасили изучение фосфорилирования и постепенно заменили метод авторадиографии [24]. Полученные анти-фосфотирозиновые антитела, наряду с белок-специфическими антителами, стали применять для иммунопреципитации. Благодаря этому стало возможным выделять все белки, фосфорилированные по остаткам тирозина, что ускорило процесс идентификации новых сигнальных компонентов [25,26].

На следующем этапе исследования Т-клеточного сигнального каскада были получены фосфоспецифические антитела против основных компонентов каскада. Фосфоспецифические антитела стали важнейшим инструментом для изучения сигналинга. Без нужного антитела часть сигнального пути остается для ученого белым пятном [21].

В дополнение к фосфоспецифическим антителам, вторым очень полезным инструментом оказались клеточные линии, полученные на основе линии Jurkat, нокаутные по отдельным сигнальным молекулам. Путем клонирования исходной культуры или применяя ненаправленный мутагенез, ученые отбирали клоны Jurkat, обладающие дефектами в активации (мобилизации кальция, экспрессии активационных молекул). Такие культуры помогли определить роль и механизм действия ряда важных сигнальных молекул, включая CD45, LAT, LCK, ZAP-70 [27-30].

С развитием технологий появились полнопротеомные методы (фосфопротеомика, AP/MS) и высокопроизводительные методы скрининга, основанные на RNAi или CRISPR/Cas-технологии, которые помогают получить новые данные о Т-клеточном сигналинге [31-35]. Например, они могут указать на существование петель обратной связи, выявить новых участников каскада или новых связей между известными участниками, а также идентифицировать новые регуляторные сайты фосфорилирования [36,37].

1.1.3 Регуляторный модуль Т-клеточного сигнального каскада

Важнейшую роль в регуляции Т-клеточного сигналинга играют тирозиновая киназа Lck и тирозиновая фосфатаза CD45 [4]. Считается, что баланс активности этих ферментов определяет порог активации Т-клетки. Дефицит обоих белков приводит к тяжелейшему иммунодефициту. Вклад Lck и CD45 в активацию Т-лимфоцитов рассмотрен в следующих двух разделах.

1.1.3.1 Киназа Lck в Т-клеточном сигналинге

Lck имеет молекулярную массу 56 кДа и принадлежит к семейству Src-киназ. Все девять киназ семейства обладают сходной структурой, включающей четыре домена. [38] Самый маленький N-концевой домен SH4 несет сигнал миристоилирования, необходимый для локализации Lck на мембране. Домены SH3 и SH2 служат для взаимодействия с другими белками: SH3 связывается с пролин-богатым мотивом, а SH2 - с мотивами, фосфорилированными по тирозину. Наконец, последний домен SH1 -каталитический.

||||||||||||||ц|«й1011«|||||111|||||||||||а»иш1||мтатагтштштмц|||щ|1и111|11шготша

Рис. 2. Структура киназы Lck (из Ventimiglia et al., 2013 [38]).

Т-клетки экспрессируют три Src-киназы: Lck, Fyn и в меньшей степени Src, из которых Lck вносит наибольший вклад в проведение сигнала от TCR [39]. Из трех киназ Lck способна сильнее всего фосфорилировать Zap-70 [40].

Регуляция Lck происходит с помощью фосфорилирования и локализации. В каталитическом домене есть два сайта фосфорилирования: Y505 и Y394 (номера приведены для мышиного белка). Сайт Y505 является ингибиторным. В фосфорилированном состоянии он взаимодействует с Sffi-доменом и способствует «сворачиванию» молекулы в закрытую конформацию. Дополнительно эта конформация стабилизируется при взаимодействии SH3 -домена с пролин-богатым мотивом в домене SH1. Когда Y505 дефосфорилирован, Lck способна приобрести открытую конформацию, при которой она проявляет промежуточную активность. Аутофосфорилирование по Y394 стабилизирует открытую конформацию и приводит к полной активации киназы [38].

Lck способна связываться с ко-рецепторами CD4 и CD8 [41]. Взаимодействие происходит за счет примембранного участка и зависит от ионов Zn2+ [42]. Данные о том, что стабилизация взаимодействия Lck с ко-рецептором снижает порог активации Т-клеток, легли в основу модели «сканирования ко-рецептора» [15].

Дефосфорилирование киназы Lck по Y505 и Y394 происходит за счет фосфатазы CD45, которая вносит вклад и в активацию, и в ингибирование киназы. Несколько цитоплазматических фосфатаз (PTPN2, PTPN22, SHP1 (PTPN6), PTPN12, DUSP22) тоже способны дефосфорилировать Y394 [4].

Y505 фосфорилируется киназой CSK (C-terminal Src kinase) [43]. Эта киназа по структуре похожа на Lck, но лишена сайта миристоилирования и поэтому не способна самостоятельно ассоциировать с мембраной [38]. Сближение CSK с киназой Lck происходит, когда CSK взаимодействует с адаптерными белками PAG и LIME. Оба белка имеют короткий внеклеточный фрагмент и длинный внутриклеточный участок, богатый остатками тирозина. Белок PAG в нестимулированных Т-клетках фосфорилирован (предположительно, киназой Fyn), что позволяет киназе CSK связываться с ним с помощью Sffi-доменов [44]. Поскольку PAG пальмитоилирован, он ко-локалируется с Lck в липидных рафтах, где киназа CSK сближается с Lck, фосфорилирует и ингибирует ее. При активации клеток PAG дефосфорилируется при участии CD45 и SHP-2, CSK высвобождается и создаются условия для активации Lck [45]. Белок LIME способен связываться с CSK и LCK одновременно, однако его роль в регуляции Lck менее ясна [46].

Интересно, что нокаутирование PAG или LIME в мышиных моделях не вызывает существенных изменений в активации Т-клеток. Может быть, существуют дополнительные белки-адаптеры с вырожденной функцией или при развитии в нокаутных клетках происходят некие компенсаторные механизмы, изменяющие порог активации TCR в отсутствии CSK [44,47].

Ингибиторная роль PAG была продемонстрирована в экспериментах по гиперэкспрессии этого белка. Подавление сигналинга происходило в клетках с избытком PAG дикого типа, но не мутантного PAG, лишенного способности связываться с CSK [45].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Круглова Наталья Андреевна, 2019 год

- - - - -

— — — —

Ne m m m m m

): 0 2' 5' 15' 30' 1h 2h 4h

-

~mm

- - - • - -

- te m « « Л Ml

total LPAP pSer153 pSer163 tubulin

total LPAP pSer153 pSer163 tubulin

В

A23187 (At): 0 2' 5' 15' 30' 1h 2h 4h

32kDa 28kDa

total LPAP

18%

12%

18%

12%

18%

TG (At): 0

5' 15' 30' 1h 2h 4h

32kDa 28kDa

total LPAP

18%

Рис. 17. Кинетика фосфорилирования LPAP в активированных Т-клетках.

Клетки Jurkat активировали в присутствии 10 нг/мл PMA (A), 1 мкг/мл aCD3 mAb OKT3 (Б), 5 мкМ А23187 (В) или 2 мкМ тапсигаргин (TG) (Г). Иммунопреципитированный белок LPAP разделяли с помощью SDS-электрофореза в 12% или 18% геле (как

отмечено) и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с проявкой антителом, указанным справа.

Стимуляция клеток через Т-клеточный рецептор приводила к тем же изменениям, что и РМА-активация - дефосфорилированию Ser-172 и фосфорилированию Ser-163 (Рис. 17Б). Однако в отличие от РМА-активации изменения носили временный характер. Так, дефосфорилирование по сайту Ser-172 происходило в течение первых 10 мин, но через 2 ч этот сайт снова фосфорилировался. Фосфорилирование по сайту pSer-163 обнаруживалось через 5 мин, достигало максимума через 15 мин и почти полностью пропадало к 2 ч стимуляции. Кинетика (де)фосфорилирования ЬРЛР под действием А23187 и тапсигаргина совпадала с кинетикой при aCD3-стимуляции (Рис. 17 В,Г).

В целом можно заключить, что под действием всех четырех стимулов активационный фенотип LPAP начинал проявляться на 5 мин активации и полностью формировался к 30 мин. При этом реагент РМА оказывал продолжительный эффект, в то время как aCD3-антитела и ионофоры приводили лишь к временному изменению. Это может быть связано с петлями отрицательной обратной связи, которые вовлекаются в сигнальный каскад при антиген-специфической активации лимфоцитов и проявляются в меньшей степени при сильной PMA-стимуляции.

3.1.7 Влияние фосфорилирования на стабильность белка LPAP

Фосфорилирование способно регулировать стабильность белка. В некоторых случаях оно увеличивает время жизни белка, в других, наоборот, служит сигналом к деградации. По нашим данным, более 80% молекул LPAP в клетке конститутивно фосфорилировано по Ser-153. Ранее мы высказали предположение, что фосфорилирование по этому остатку защищает LPAP от деградации [181]. Для проверки этой гипотезы мы сравнили скорость деградации LPAP дикого типа и LPAP, мутантного по Ser-153 при инкубации клеток с блокатором трансляции циклогексимидом (Рис.18). По результатам серии экспериментов был сделан вывод о том, что мутация S153A не влияет на скорость деградации LPAP.

Рис. 18. Фосфорилирование по Ser-153 не влияет на скорость деградации LPAP. Клетки линий Jurkat, Jurkat LPAP S153A и Jurkat LPAP WT инкубировали в присутствии циклогексимида (CHX) в течение 2, 4 и 6 ч, затем лизировали и определяли уровень LPAP с помощью Вестерн блоттинга. Линии Jurkat LPAP S153A и Jurkat LPAP WT были получены из линии Jurkat, нокаутной по LPAP (J531), путем лентивирусной трансфекции конструкций, несущих LPAP S153A или LPAP WT. (А) Уровень экспрессии LPAP, (Б) оценка его деградации и (В) количественный обсчет данных по трем независимым экспериментам, приведены средние значения ± SD.

3.1.8 Поиск киназ, участвующих в фосфорилировании LPAP

Чтобы напрямую оценить влияние различных ветвей сигнального каскада на статус фосфорилирования LPAP, мы использовали различные ингибиторы широкого спектра действия и ингибиторы, специфичные в отношении определенных киназ.

3.1.8.1 Ингибирование PKC препятствует появлению активационного фенотипа LPAP

В первую очередь в ингибиторный анализ был включен стауроспорин, который обладает широким спектром действия и блокирует PKC, а также ряд других киназ, включая PKA, PKG, S6K, CaMKII [182]. Инкубация клеток Jurkat со стауроспорином приводила к исчезновению нижней полосы, соответствующей форме pSer-172, у нестимулированных клеток. Стауроспорин также отменял появление полосы при 30 кДа, которая содержит форму pSer-163, как при PMA, так и при aCD3 активации (Рис. 19 А).

Рис. 19. Вклад ингибиторов PKC в фосфорилирование LPAP по Ser-163.

Клетки Jurkat (A, Б, В, Д, Е, Ж) инкубировали в присутствии (+) или в отсутствие (-) указанного ингибитора в течение 1 ч, после чего активировали с помощью PMA (10 нг/мл) или aCD3 mAb (1 мкг/мл) в течение 30 мин, контрольные образцы не подвергали активации. Иммунопреципитированный белок LPAP разделяли с помощью SDS-электрофореза в 12% или 18% геле (как отмечено) и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с проявкой антителом против тотального белка LPAP или антителом против p-Ser163-LPAP. Использовали следующие концентрации стимулов: (А) Staurosporine (STS, 1 мкМ), (Б) Go6983 (10 мкМ), GF109203X (GFx, 10 мкМ), (В) PKC 20-28 (20-28, 10 мкМ), Go6976 (10 мкМ), (Д) пептидные ингибиторы PKC9, PKCn, PKCs (ptPKCG,

ptPKCn, ptPKCs, 1 мкМ каждый), (Е) CRT0066101 (CRT, 5 мкМ), (Ж) Go6983 (10 мкМ) + CRT0066101 (Go+CRT, 5 мкМ). (Г) Клетки KG1 и KG1a активировали с помощью 10 нг/мл PMA (+) в течение 30 мин или оставляли без активации (-), после чего готовили образцы подобно описанному для клеток Jurkat.

Данные по влиянию клеточных стимулов на фосфорилирование LPAP послужили отправной точкой для выбора более специфичных ингибиторов. Наиболее выраженное изменение фосфорилирования LPAP происходило под действием реагента РМА, который имитирует диацилглицерол (DAG). Главнями мишенями DAG в клетке являются PKC, PKD и RasGRP (Krishna 2013). Среди трех классов изоформ PKC классические изоформы PKC зависят ионов кальция и DAG, новые изоформы - от DAG, в то время как атипичные изоформы не зависят ни от кальция, ни от DAG. С учетом этих сведений в первую очередь решено было проверить вклад изоформ PKC в фосфорилирование LPAP по Ser-163. Для этого мы использовали следующие ингибиторы: PKC 20-28 против классических PKCs (a, ß, у); Go6976 против классических PKCs (a, ß, у) и PKD; GF109203X против классических и новых (5, 8, n, 0) PKCs; Go6983 против всех трех классов PKCs: классических (a, ß, у), новых (5, 8, n, 0) и атипичных (Z, X/i).

Инкубация клеток Jurkat в течение 60 мин в присутствии ингибиторов PKC широкого спектра действия Go6983 или GF109203X препятствовала исчезновению фосфоформы pSer-172 и появлению pSer-163 под действием PMA (Рис. 19Б). В случае стимуляции через TCR эффект этих ингибиторов был выражен слабее. Ингибиторы классических изоформ PKC (PKC 20-28 и Go6976) не оказывали влияния на этот процесс (Рис. 19В). С этим согласуются данные по сравнению фосфорилирования LPAP в клетках KG1 и ее сублинии KG1a, которая в отличие от родительской линии не экспрессирует PKCßl и ßII изоформы и характеризуется сниженным уровнем PKCa [183]. Нами было обнаружено, что при активации РМА в обеих линиях детектируется фосфоформа LPAP pSer-163 (Рис. 19Г). Это является дополнительным аргументом в пользу того, что фосфорилирование LPAP по Ser-163 не зависит от классических PKC.

Чтобы определить, какая изоформа PKC из класса новых вносит основной вклад в появление активационного фенотипа LPAP, мы использовали специфичные ингибиторы индивидуальных изоформ PKC: 8, n и 0. Эти ингибиторы представляют собой пептиды, которые обратимо и конкурентно связываются с активным центром киназы. Ни один из ингибиторов по отдельности не блокировал появления

«активированного фенотипа» LPAP, не подействовала и комбинация всех трех ингибиторов (Рис. 19Д). Можно допустить, что ключевой для фосфорилирования LPAP изоформой является PKC5, для которой пока не описано надежного специфичного ингибитора.

Кроме PKC, РМА активирует киназу PKD, каталитическая активность которой дополнительно усиливается засчет новых изоформ РКС. Наборы мишеней этих киназ очень близки, однако в отличие от PKC, киназа PKD не зависит от DAG и способна катализировать реакции без ассоциации с мембраной. Благодаря этому PKD усиливает действие новых изоформ РКС в цитозоле [74]. CRT0066101, который является ингибитором PKD, не оказывал заметного влияния на фосфорилирование LPAP (Рис. 19Е), однако он усиливал эффект ингибитора PKC Go6983 (Рис. 19Ж). Ингибитор Go6983 выраженно блокировал фосфорилирование pSer-163 при РМА-стимуляции, но не aCD3 активации (Рис. 19Б). Go6983 в комбинации с CRT0066101 действовал также и при aCD3 активации (Рис. 19Ж).

3.1.8.2 При aCD3-стимуляции фосфорилирование LPAP по Ser-163 происходит с участием ферментов, регулирующих активность PKC

В отличие от стимуляции PMA, действующей напрямую на PKC, в случае стимуляции Jurkat через Т-клеточный рецептор киназа PKC активируется опосредованно после прохождения нескольких каталитических реакций [63,65,69]. Среди таких реакций можно выделить активацию PLCyl, которая гидролизует фосфатидилинозитол до IP3 и DAG. Ингибитор PLCyl (U73122) ослаблял фосфорилирование LPAP по Ser-163 в случае PMA-стимуляции и блокировал в случае O.CD3-стимуляции (Рис. 20А). Тот же результат был получен при стимуляции клеток в присутствии форсколина, активатора РКА, одним из эффектов которого является ингибирование PLCyl (Рис. 20Б).

Рис. 20. Ферменты, опосредующие активацию PKC, регулируют фосфорилирование LPAP по Ser-163. Клетки Jurkat инкубировали в присутствии PMA (10 нг/мл) или aCD3 mAb (1 мкг/мл) в течение 30 мин, контрольные образцы не подвергали активации. Иммунопреципитированный белок LPAP разделяли с помощью SDS-электрофореза в 12% или 18% геле (как отмечено) и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с проявкой антителом против тотального белка LPAP или антителом против p-Ser163-LPAP. Использовали следующие концентрации стимулов: (А) U73122 (5 мкМ), (Б) Forskolin (50 мкМ), (В) GSK2335570 (GSK, 1 мкМ), Wortmannin (Wort, 1 мкМ), (Г) Go6983 (10 мкМ) + CRT0066101 (CRT, 5 мкМ) + GSK2335570 (GSK, 1 мкМ).

Активность киназ PKC регулируется киназой PDK1, фосфорилирующей PKC по консервативному сайту в Т-петле [69]. В норме активность PDK1 ограничивается доступностью PIP3, липидного метаболита [184], который образуется под действием PI3K при активации Т-клеток через CD28 [185]. Мы предположили, что в клетках Jurkat киназа PDK1 может быть активна конститутивно, поскольку Jurkat мутантны по гену фосфатазы PTEN, метаболизирующей PIP3 [186,187]. Дополнительно были протестированы ингибиторы против PDK1 и PI3K. По отдельности эти ингибиторы не влияли на фосфорилирование LPAP (Рис. 20В). Тем не менее комбинация трех ингибиторов против киназ PKC, PKD и PDK1 приводила к полной блокировке активационного фенотипа LPAP, что не было достигнуто при действии индивидуальных ингибиторов (Рис. 20Г).

3.1.8.3 ERK1/2, но не p38 MAPK или JNK регулирует фосфорилирование LPAP по Ser-163

Кроме PKC, вторичный мессенджер DAG активирует белок RasGRP, что приводит к запуску MAPK-киназного каскада [63]. PKC9 способна дополнительно стимулировать RasGRP [80]. Эти молекулярные события воспроизводятся под действием PMA [188] и потенциально могут влиять на фосфорилирование LPAP. Для проверки предположения о том, что киназы MAPK-каскада вносят вклад в фосфорилирование LPAP по Ser-163, были протестированы ингибиторы Raf (Lifirafenib), MEK1/2 (Trametinib, U0126, Cobimetinib), а также ингибитор ERK1/2 (SCH772984). Кроме того, в анализ были включены ингибиторы двух других ветвей MAPK-каскада: блокаторы p38 (VX-745) и JNK (SP600125) (Рис. 21).

Рис. 21. Ингибиторы МАР&каскада блокируют фосфорилирование LPAP по Ser-163. Клетки Jurkat инкубировали в присутствии (+) или в отсутствие (-) указанного слева ингибитора, после чего активировали с помощью PMA (10 нг/мл) или aCD3 mAb (1 мкг/мл) в течение 30 мин, контрольные образцы не подвергали активации.

Иммунопреципитированный белок LPAP разделяли с помощью SDS-электрофореза в 12% или 18% геле (как отмечено) и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с проявкой антителом против тотального белка LPAP или антителом против p-Ser163-LPAP. Использовали следующие концентрации стимулов: (А) Lifirafenib (Lif, 10 мкМ, 2 ч), (Б) Trametinib (Tram, 100 нМ, 2 ч), (В) U0126 (10 мкМ, 4 ч), (Г) Cobimetinib (Cob, 0,05 или 5 мкМ, 2 ч), (Д) SCH772984 (SCH, 1 мкМ, 2 ч), (Е) PD98059 + SP600125 + VX-745 (10 мкМ каждый, 30 мин), (Ж) FRAX597 (5 мкМ, 2 ч).

Ингибиторы киназ Raf (Рис. 21 А) и МЕК1/2 (Рис. 21 Б,В,Г) в значительной степени препятствовали появлению активационного фенотипа LPAP. В присутствии ингибитора киназ ERK1/2 активационный фенотип LPAP был полностью блокирован (Рис. 21Д), а комбинация ингибиторов против p38 и JNK не оказала влияния на фосфорилирование LPAP при aCD3-стимуляции (Рис. 21Е).

Недавно был обнаружен новый способ активации MAPK-пути в Т-клетках, не зависящий от комплексов LAT, а включающий белки Bam32, PLCy1 и PAK1 [82]. Тримолекулярное взаимодействие между этими белками приводит к активации киназы PAK1, которая фосфорилирует и активирует киназы Raf-1 и МЕК-1. Вклад этого пути в фосфорилирование LPAP по Ser-163 был оценен с помощью ингибитора FRAX597, блокирующего киназы PAK1,2,3. В присутствии FRAX597 фосфорилирование Ser-163 было ослаблено в случае aCD3-стимуляции, но не при активации PMA, эффект которого не зависит от PAK киназ (Рис. 21Ж).

3.1.8.4 Пролин зависимые киназы mTOR, Cdc2, CDK2 и CDK5 не участвуют в фосфорилировании LPAP

Ser-163 расположен в составе пролин-содержащего мотива, поэтому можно ожидать, что киназа, фосфорилирующая Ser-163, относится к пролин-направленным. Наряду с MAPK-киназами, фосфорилировать LPAP по сайту Ser-163 потенциально могут такие пролин-направленные киназы, как mTOR [189] и группа киназ Cdc2, CDK2 и CDK5 [190]. Чтобы проверить эту возможность, были протестированы ингибиторы против киназы mTOR (KU0063794 и Rapamycin) и против киназ Cdc2, CDK2 и CDK5 (Roscovitine), однако они не оказали никакого влияния на активационный фенотип LPAP (Рис. 22).

Рис. 22. Циклин-зависимые киназы и mTOR не влияют на фосфорилирование LPAP по Ser-163. Клетки Jurkat инкубировали в присутствии (+) или в отсутствие (-) указанного слева ингибитора, после чего активировали с помощью PMA (10 нг/мл) или aCD3 mAb (1 мкг/мл) в течение 30 мин, контрольные образцы не подвергали активации. Иммунопреципитированный белок LPAP разделяли с помощью SDS-электрофореза в 18% геле и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с проявкой антителом против тотального белка LPAP. Использовали следующие концентрации стимулов: (А) KU0063794 (KU, 1 мкМ, 30 мин), (Б) Rapamycin (Rap, 100 нМ, 30 мин), (В) Roscovitine (10 мкМ, 4 ч).

3.1.8.5 Ингибирование серин-треониновых фосфатаз приводит к фосфорилированию Ser-163

В дополнение к ингибиторам киназ было протестировано три ингибитора фосфатаз: циклоспорин А - против фосфатазы кальциневрина (PP2B), окадаевая кислота - против фосфатаз PP1 и PP2A, а таже каликулин А - против фосфатаз PP1, PP2A, PP4, PP5 [191]. Инкубация клеток с циклоспорином не влияла на статус фосфорилирования LPAP ни в покоящихся клетках, ни в клетках, активированных с помощью aCD3 (Рис. 23 А). Это исключает участие фосфатазы кальциневрина в дефосфорилировании LPAP по Ser-172. Интересно, что инкубация клеток с каликулином А, ингибитором конститутивно активных фосфатаз PP2A,4,6, оказывала на LPAP действие, подобное aCD3-стимуляции (Рис. 23Б). Это указывает на то, что каликулин А блокировал некую фосфатазу, что приводило к активации киназы, опосредующей фосфорилирование Ser-

163. Например, известно, что обработка клеток Jurkat каликулином А приводит к активации ERK1/2 [192]. Ни каликулин А, ни окадаевая кислота не влияли на проявление активационного фенотипа LPAP при aCD3 стимуляции (Рис. 23В).

Рис. 23. Влияние ингибиторов фосфатаз на статус фосфорилирования LPAP.

Клетки Jurkat инкубировали в присутствии (+) или в отсутствие (-) указанного слева ингибитора, после чего активировали с помощью aCD3 mAb (1 мкг/мл) в течение 30 мин, контрольные образцы не подвергали активации. Иммунопреципитированный белок LPAP разделяли с помощью SDS-электрофореза в 18% геле и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с проявкой антителом против тотального белка LPAP. Использовали следующие концентрации стимулов: (А) циклоспорин A (CsA, 50 нМ), (Б) каликулин A (50 нМ), (В) окадаевая кислота (ОА, 62 нМ), стауроспорин (STS, 1 мкМ). Образец на дорожке №2 был обработан фосфатазой CIP in vitro.

3.1.8.6 ERK фосфорилирует LPAP по Ser-163 in vitro

Результаты ингибиторного анализа показали, что фосфорилирование LPAP по Ser-163 связано с активностью MAPK-киназного каскада. Киназа ERK1/2 является последним звеном цепи, ингибирование которого в наших экспериментах полностью блокировало активационный фенотип LPAP. Следовательно, киназы, расположенные в цепи реакций выше ERK, не подходят на роль киназ для LPAP. Кроме того, такие киназы, как PKC, Raf, MEK, фосфорилируют мотивы, отличные от последовательности, в которой расположен сайт Ser-163 [193-195]. Ингибирование других пролин-

направленных киназ, mTOR, Cdc2, CDK2 и CDK5, не влияло на статус фосфорилирования Ser-163.

Полученные результаты позволили нам предположить, что именно киназа ERK1/2 ответственна за фосфорилирование LPAP по Ser-163. Чтобы продемонстрировать способность ERK1/2 фосфорилировать LPAP, нами был проведен in vitro киназный тест. Для этого клетки Jurkat активировали с помощью PMA, и белок LPAP, in vivo фосфорилированный по Ser-163 (Рис. 24 А,Б дорожка «contr»), выделяли на аффинном сорбенте. В опытный образец добавляли фосфатазу CIP и проводили дефосфорилирование (Рис. 24 А,Б дорожка «0»). Затем дефосфорилированный белок LPAP инкубировали в присутствии рекомбинантной киназы ERK1 или ERK2 в буфере с ATP и оценивали фосфорилирование Ser-163 с помощью Вестерн-блоттинга с проявкой фосфоспецифическим антителом или антителом против тотального белка LPAP. Добавление к образцу 500 нг киназы ERK1 приводило к выраженному фосфорилированию Ser-163, а в присутствии 1000 нг этой киназы уровень pSer-163 восстанавливался до контрольного. Действие киназы ERK1 было специфично в отношении Ser-163, так как добавление ERK1 никак не влияла на фосфорилирование Ser-153. Те же количества киназы ERK2 оказывали минимальное влияние на фосфорилирование LPAP. Таким образом, in vitro киназный тест, показал, что ERK1 может напрямую фосфорилировать LPAP.

Рис. 24. ERK in vitro фосфорилирует LPAP по Ser-163. Клетки Jurkat активировали с помощью PMA (10 нг/мл) в течение 30 мин. LPAP выделяли на аффинном сорбенте и обрабатывали с помощью фосфатазы CIP. Контрольный образец не подвергали дефосфорилированию (дорожка 1). In vitro киназный тест проводили с указанным количеством активной ERK1 (A) или ERK2 (Б) при 37 °C в течение 30 мин. LPAP разделяли с помощью SDS-электрофореза в 12% геле и анализировали с помощью Вестерн-блоттинга с проявкой антителом против тотального белка LPAP, антителом против p-Ser163-LPAP или p-Ser153-LPAP.

3.1.9 Фосфорилирование LPAP по Ser-163 не зависит от статуса фосфорилирования других сайтов

В некоторых случаях фосфорилирование белка по одному сайту создает или нарушает сайт распознавания другой киназой и возникает явление, называемое иерархическим фосфорилированием [196]. Мы предположили, что сайт фосфорилирования LPAP Ser-163 может быть подвержен иерархическому фосфорилированию. В этом случае нарушение

фосфорилирования/дефосфорилирования по какому-либо из трех известных сайтов, Ser-99, Ser-153 или Ser-172, блокировало бы фосфорилирование LPAP по Ser-163. Для анализа были выбраны два точечных мутанта LPAP: S172D и 3х ^99А, S153A, S172A).

Мутация S172D имитировала конститутивно фосфорилированное состояние сайта Ser-172. В 18% геле мутантный белок S172D мигрировал в виде одной полосы с молекулярной массой 29 кДа, что соответствовало полосе LPAP с фосфорилированным Ser-172 (Рис. 25А). Вопреки предположению, при активации клеток с помощью PMA или aCD3-антитела белок с мутацией S172D фосфорилировался по Ser-163, как и белок дикого типа (Рис. 25Б).

Рис. 25. Фосфорилирование белка LPAP по Ser-99 и Ser-163 не зависит от фосфорилирования по Ser-172. (А) LPAP из клеток CEM дикого типа и CEM LPAP KO, трансфицированных плазмидой с мутантной формой LPAP (S172D), анализировали с помощью электрофореза в 18% геле и Вестерн блоттинга с антителом против LPAP. (Б) Клетки линии CEM LPAP KO, трансфицированные плазмидой с мутантной формой LPAP (S172D), и клети CEM дикого типа активировали в присутствии 10 нг/мл PMA или 1 мкг/мл антитела OKT3. LPAP иммунопреципитировали, половину образца обрабатывали фосфатазой CIP, затем образцы разделяли методом электрофореза в 12% геле, проводили Вестерн блоттинг с проявкой антителом против тотального белка LPAP

или указанным фосфоспецифическим антителом. Снизу приведено соотношение сигнала фосфорилированного LPAP к общему белку LPAP, нормированное на соотношение в первой дорожке.

Мутант «3х» с заменами по всем конститутивным сайтам при активации клеток фосфорилировался по Ser-163, как и белок дикого типа (Рис. 26). Следовательно, фосфорилирование по Бег-153, как вызванное активацией дефосфорилирование Бег-99 и Бег-172 не влияют на фосфорилирование ЬРЛР по Бег-163.

Рис. 26. Фосфорилирование белка LPAP по Ser-163 не зависит от фосфорилирования по Ser-99, Ser-153 и Ser-172. Клетки линии CEM LPAP KO, трансфицированные плазмидой с мутантной формой LPAP («3x» - S99A, S153A, S172A), и клетки CEM дикого типа активировали в присутствии 10 нг/мл PMA или 1 мкг/мл антитела OKT3. LPAP иммунопреципитировали, половину образца обрабатывали фосфатазой CIP, затем образцы разделяли методом электрофореза в 12% геле, проводили Вестерн блоттинг с проявкой антителом против тотального белка LPAP или указанным фосфоспецифическим антителом.

Наконец, фосфорилирование того или иного сайта может зависеть от присутствия в белке определенных мотивов, способных служить сайтами посадки киназ. Мы решили проверить, будет ли происходить фосфорилирование по Ser-163 в укороченных формах белка. Для этого была выбрана форма LPAP Д184-206, лишенная С-концевого фрагмента. Однако эта форма белка при активации фосфорилировалась по Ser-163, как и белок дикого типа (Рис. 27).

Рис. 27. Укороченная форма белка LPAP (Л184-206) фосфорилируется по Ser-

163. Клетки линии CEM LPAP KO, трансфицированные плазмидой с мутантной формой LPAP (Д184-206), и клети CEM дикого типа активировали в присутствии 10 нг/мл PMA. LPAP иммунопреципитировали, половину образца обрабатывали фосфатазой CIP, затем образцы разделяли с помощью электрофореза в 12% геле, проводили Вестерн блоттинг с проявкой антителом против тотального белка LPAP или указанным фосфоспецифическим антителом.

Таким образом, в клетках Jurkat фосфорилирование LPAP по Ser-163 не зависело от состояния сайтов Ser-99, Ser-172 и Ser-153, а также не нарушалось при укорочении белка на 22 аминокислотных остатка с С-конца.

3.2 Поиск белков-партнеров LPAP

Участие белка в том или ином клеточном процессе можно предсказать, изучив, с какими молекулами-партнерами он взаимодействует. Эти взаимодействия часто происходят за счет определенных белковых доменов или мотивов, поэтому знание о доменной организации исследуемого белка может помочь при поиске его партнеров. В белке LPAP четко выраженные домены и мотивы отсутствуют, поэтому на основании первичной последовательности не удается заранее предсказать, с какими белками он способен взаимодействовать.

Для более полной характеристики белка LPAP, мы поставили перед собой задачу изучить интерактом этого белка, а именно: провести поиск и идентификацию белков, взаимодействующих с белком LPAP, и исследовать функциональную значимость обнаруженных взаимодействий. Для этого мы использовали два основных подхода: Co-IP/MS и Blue Native-PAGE.

3.3.1 Поиск белков-партнеров LPAP с помощью метода FIPA

Для обнаружения белков, образующих прочные комплексы с LPAP, в первую очередь был применен метод иммунопреципитационного анализа с флуоресцентной меткой (FIPA) [160]. Клеточные белки метили флуоресцентным красителем и иммунопреципитировали на сорбенте с антителами против LPAP, далее проводили электрофорез, регистрировали флуоресцентный сигнал и сравнивали полосы копреципитации в опытном и контрольном образцах. Опытный образец лизировали в мягком буфере, содержащем 1% Вгу58, в котором сохраняются многие межбелковые взаимодействия. Контрольный образец готовили в более жестком буфере с 1% ТХ-100, в котором комплексы как правило разрушаются. Опытные образцы из Т-клеточной линии СЕМ в дополнение к полосе белка LPAP содержали полосы копреципитации, отсутствующие в контрольном образце (Рис. 28А, дорожки 1 и 2). Наиболее выраженная полоса коиммунопреципитации, локализованная в районе молекул размером около 200 кДа, соответствовала белку CD45, что было подтверждено Вестерн-блоттингом и обратной иммунопреципитацией (Рис. 28А, дорожки 3 и 4). Более слабые полосы вырезали и анализировали методом масс-спектрометрии (Рис. 28Б). Для сравнения использовали также образцы из В-клеточной линии Raji (Рис. 28Б). Среди идентифицированных белков большую часть составляли белки цитоскелета. В обоих случаях удалось идентифицировать белок CD71, а в случае клеток Raij - молекулу HLA II (Рис. 28Б), представленную на клетках Raji, но не СЕМ.

Рис. 28. Анализ белков, копреципитированных антителами против LPAP и CD45, с помощью иммунопреципитации с флуоресцентной меткой. (А) Клетки СЕМ метили родамином 6G, лизировали в 1%-ном ТХ-100 или Вгу58. Иммунопреципитацию проводили на антителах против LPAP или CD45. Выделенные белки разделяли в 12%-

ном SDS-PAGE в невосстанавливающих условиях. После регистрации флуоресценции (верхняя панель) белки переносили на PVDF-мембрану и проявляли c помощью Вестерн-блоттинга антителами против CD45 или LPAP (средняя и нижняя панели). (Б) Белки из клеток CEM и Raji копреципитировали на антителе против LPAP и разделяли в 10%-ном SDS-PAGE в восстанавливающих условиях. Полосы 1-5 вырезали для дальнейшего анализа, справа указаны белки, идентифицированные методом масс-спектрометрии в соответствующих полосах.

3.3.2 Коиммунопреципитация/масс-спектрометрия без кросс-линкирования Метод FIPA позволяет определять белки, присутствующие в молекулярных комплексах в достаточно больших количествах. Белки, которые образуют комплекс лишь с небольшой долей молекул партнера, не будут давать явно выраженную полосу копреципитации. Кроме того, некоторые белки плохо взаимодействуют с красителем и также не дают сигнала в FIPA. Взаимодействия с такими белками можно выявлять с помощью другого подхода - коиммунопреципитации, совмещенной с последующим масс-спектрометрическим анализом (co-IP/MS). В этом случае проводят очень короткий электрофорез белков, полученных после иммунопреципитации комплексов, при котором белки входят в гель, но заметного их разделения еще не происходит. Затем участок геля, который содержит полный набор белков из элюата, обрабатывают трипсином, полученные пептиды анализируют с помощью масс-спектрометрии. Таким способом можно найти дополнительные белки, которые невозможно выявить методом FIPA. Поиск белков-партнеров проводили в клеточной линии CEM, контрольный иммунопреципитат готовили из клеток CEM с нокаутом LPAP. Чтобы выявить специфически преципитированные белки, из списка молекул, идентифицированных в опытном образце, исключали белки, определенные в контрольном образце. Было проведено три эксперимента в трех повторностях, в каждой из которых кроме CD45 обнаружены еще три белка (Табл. 2).

Таблица 2. Белки, копреципитируемые с белком LPAP

Белок Ген Номер в базе данных Swiss-Prot

Рецептор трансферрина CD71 TFRC P02786

Тяжелая цепь поверхностного белка CD98 SLC3A2 (MDU1) P08195

Моэзин MSN P26038

В двух повторностях было детектировано 23 белка, в том числе белки клеточного метаболизма (транскетолаза, фосфоглицераткиназа, альдолаза), белки с ядерной локализацией (импортин, HNRNPA2B1, FLII, SIPA1), компоненты и регуляторы цитоскелета (тропомодулин, плектин, а-актинин), мембранный белок SLC1A4, который, как и CD98, участвует в транспорте аминокислот. Наконец, обнаружен белок HS1, участвующий в передаче внутриклеточного сигнала.

3.3.3 Коиммунопреципитация/масс-спектрометрия с предварительным кросс-линкированием взаимодействующих белков

Многие белковые взаимодействия носят временный характер или являются очень слабыми, поэтому традиционные методы копреципитации не подходят для их обнаружения. Фиксировать такие взаимодействия можно с использованием сшивающих реагентов, способных стабилизировать комплексы.

Для кросс-линкирования LPAP с потенциальными партнерами подходит сульфгидрильная группировка Cys134, расположенного в средней части молекулы LPAP. Однако обработка клеток гомобифункциональным агентом DTME не приводила к заметному сшиванию LPAP. Это может свидетельствовать об отсутствии пространственно сближенных с Cys134 (длина DTME составляет около 13 А) белков со стерически доступными свободными сульфгидрильными группами.

Другой популярный агент - DSP, сшивает белки по аминогруппам лизина. LPAP не содержит остатков этой аминокислоты, поэтому DSP способен сшивать белок LPAP только через аминогруппу, расположенную на его свободном N-конце. Чтобы повысить эффективность сшивания с помощью DSP, мы использовали клеточную линию Jurkat

LPAP-FLAG, в которой LPAP на С-конце дополнительно несет FLAG-последовательность (DYKDDDDK), включающую два остатка лизина.

Реагент DSP успешно сшивал LPAP с другими белками с образованием высокомолекулярных комплексов. Это проявлялось в том, что при электрофорезе в невосстанавливающих условиях снижалась интенсивность полосы LPAP, определенная как по флуоресценции, так и с помощью Вестерн-блот-анализа (Рис. 29А, дорожки 2 и 4). Эффект сшивки белка CD45 был еще более выражен (Рис. 29А, дорожка 6). Это легко объяснить большим количеством остатков лизина в молекуле CD45. Сшивки могут нарушать распознаваемый антителом эпитоп белка и препятствовать коиммунопреципитации. Мы сравнили эффективность выделения белка LPAP с использованием двух антител, CL7 и CL3, которые реагировали с разными эпитопами LPAP (Рис. 29, дорожки 1-4). Картины, полученные с помощью обоих антител, были сходными, при этом антитело CL7 обеспечивало, как правило, более высокий уровень иммунопреципитации. DSP содержит S-S-связь, которая легко разрывается в восстанавливающих условиях при добавлении 2-меркаптоэтанола, и компоненты комплекса высвобождаются в виде отдельных молекул. В соответствии с этим при электрофорезе в восстанавливающих условиях в дорожках после обратотки DSP наблюдали повышение интенсивности ко-преципитационных полос (Рис. 29Б, дорожки 2 и 4).

Рис. 29. Влияние сшивания с помощью DSP на образование комплексов белков LPAP и CD45. Белки клеток Jurkat LPAP-FLAG сшивали с помощью 1 мМ DSP, клетки лизировали в буфере RIPA, белки метили по SH-группам с помощью красителя Dy547-Maleimide, иммунопреципитировали на антителах против LPAP (CL7 или CL3)

или против CD45. Выделенные белки разделяли в 12%-ном SDS-PAGE в невосстанавливающих (А) или восстанавливающих (Б) условиях. После регистрации флуоресценции (верхние панели) белки переносили на PVDF-мембрану и проявляли методом Вестерн-блоттинга с антителом против LPAP (нижние панели).

Дальнейшие эксперименты по co-IP/MS были проведены с использованием DSP. Образцы для масс-спектрометрического анализа готовили следующим образом. Клетки Jurkat LPAP-FLAG инкубировали с 1 мМ DSP, лизировали в жестком буфере RIPA и иммунопреципитировали комплексы на сорбенте с антителом против LPAP (CL7). В буфере RIPA белковые взаимодействия нарушаются, поэтому при лизисе клеток в таких условиях образец без кросс-линкирования мог служить отрицательным контролем для образца с кросс-линкированием. Элюаты после иммунопреципитации подвергали краткому электрофорезу, кусочек геля с полным элюатом трипсинизировали и проводили масс-спектрометрический анализ. По результатам трех экспериментов проводили поиск белков, идентифицированных в опытных образцах, которые отсутствовали в контрольных образцах. Во всех трех экспериментах был идентифицирован лишь один такой белок - CD45.

3.3.4 Комплексы LPAP, проявляемые с помощью голубого нативного электрофореза

Антитела против LPAP, использованные в экспериментах по иммунопреципитации, распознают внутриклеточные эпитопы, расположенные в центральной части белка. Взаимодействие антитела с белком может нарушать ассоциацию LPAP с белками-партнерами и преципитировать только свободный LPAP. Чтобы преодолеть это затруднение, мы использовали Blue-Native PAGE. В этом случае белковые комплексы выделяют в мягких условиях без стадии иммунопреципитации и разделяют с помощью нативного электрофореза. Этот метод позволяет не только определить белки-партнеры, но и сделать выводы о составе комплексов и стехиометрии входящих в них компонентов [177].

Клетки Jurkat лизировали в мягких условиях в присутствии 0.1% ТХ-100 или 0.1% Brij97. В низкомолекулярной части геля обнаруживалась полоса, которая окрашивалась антителом против LPAP, но не против CD45 (Рис. 30). Подвижность этой полосы была несколько выше в образцах, лизированных в детергенте TX-100, чем в Brij97. Очевидно, эта полоса связана с мономерным LPAP. В высокомолекулярной части геля находилась

полоса, которая окрашивалась антителом против CD45, но не против LPAP. Эта полоса отнесена нами к мономерному CD45.

Наряду с полосами мономерного LPAP и CD45 на электрофореграммах обнаружена более высокомолекулярная полоса, которая при проведении Вестерн-блотинга окрашивалась антителами как против LPAP, так и против CD45 (Рис. 30). Очевидно, эта полоса связана с комплексом LPAP-CD45. Соотношение [комплекс : свободные мономеры] определяли путем денситометрии соответствующих полос. Долю свободного LPAP можно оценить в пределах 1% в растворе 0.1%-ного ТХ-100 и около 23% в растворе 0.1%-ного Вгу97. В случае мономерного CD45 соответствующие показатели составили 74 и 14%. При активации клеток с помощью антител против CD3 доли молекул LPAP и CD45, образовавших комплекс, увеличивались.

Рис. 30. Определение комплексов белков LPAP и CD45 с помощью Blue-Native PAGE. Клетки Jurkat активировали в течение 15 мин с помощью 1 мкг/мл антитела против CD3 (OKT3), затем лизировали в 0.1%-ном ТХ-100 или 0.1%-ном Brij97. Белки разделяли с помощью Blue-Native PAGE и проявляли методом Вестерн-блоттинга с антителами против LPAP (левая панель) или CD45 (правая панель). В контроле клетки не подвергали активации.

3.3 Изучение роли взаимодействия LPAP с фосфатазой CD45

3.3.1 Уровень экспрессии белка LPAP падает в отсутствие CD45

Образование прочного комплекса между белками LPAP и CD45 позволяет предположить, что эти белки связаны функционально. В литературе есть данные о том, что белок LPAP быстро деградирует в отсутствие CD45 [129]. По данным двух научных

групп, лимфоциты мышей, нокаутных по LPAP, имеют сниженный уровень CD45 [166,167].

Чтобы более детально исследовать взаимосвязь между экспрессией двух белков, мы нокаутировали CD45 в двух T-клеточных линиях CEM и Jurkat. Это привело к падению уровня LPAP в обеих линиях до 10% (Рис. 31 А). Результат по Вестерн-блоттингу дополняют данные проточной цитометрии (Рис. 31 Б, В).

СЕМ Jurkat

_„ _„ CD98 CD45 LPAP

CD45 LPAP

Рис. 31. Экспрессия LPAP снижается при нокаутировании CD45. (А) Уровень белка LPAP анализировали в клеточных линиях CEM и Jurkat CD45 KO. Клетки лизировали, образцы разделяли методом электрофореза в 18% геле и проводили Вестерн блоттинг с проявкой фосфоспецифическим антителом против pSer-153 LPAP, антителом против тотального белка LPAP или против тубулина. (Б) Уровень белка LPAP в клетках Jurkat WT и Jurkat CD45 KO анализировали с помощью проточной цитометрии. Клетки фиксировали, пермеабилизировали и окрашивали антителом против LPAP, меченным Alexa-594. Количественный обсчет по результатам 7 экспериментов приведен в (В). Нормализованный уровень экспрессии LPAP в клетках CD45 KO сравнивали со значением 100 с помощью одновыборочного t-критерия, ****p<0.0001. (Г) Сравнение уровня LPAP в клеточных линиях Jurkat и J45.01 с помощью проточной цитометрии. (Д) Нокдаун CD45 с помощью shRNA приводит к падению уровня LPAP. Клетки CEM стабильно трансдуцированные конструкцией с shRNA против CD45 или белка RSV

анализировали с помощью проточной цитометрии. Приведены средние значения MFI ±SD по результатам трех независимых экспериментов. Сравнение двух групп проводили с помощью двухвыборочного ^критерия для независимых выборок, *р<0.05.

Клеточная линия J45.01, полученная на основе Jurkat и имеющая лишь 5-8% CD45 [27], экспрессировала в три раза более низкий уровень LPAP (Рис. 31Г). Наконец, при нокдауне CD45 с помощью shRNA экспрессия ЬРЛР также снижалась более чем в два раза (Рис. 31Д). Таким образом, серия экспериментов на разных линиях клеток с использованием технологий нокаута и нокдауна показала, что при снижении уровня CD45 экспрессия LPAP существенно снижается.

3.3.2 Фосфорилирование LPAP в клетках с нокаутом CD45

Учитывая прочную связь LPAP с молекулой CD45, мы оценили изменение статуса фосфорилирования LPAP в отсутствие CD45. Низкий уровень экспрессии LPAP в клетках с дефицитом CD45 не позволил сделать однозначный вывод о фосфорилировании Ser-172 в отсутствие CD45. Тем не менее, можно утверждать, что LPAP из клеток с дефицитом CD45 окрашивался фосфоспецифическим антителом pSer-153 (Рис. 31 А). Для выявления фосфоформы pSer-163 мы использовали фосфо-аффинный электрофорез, в котором эта фосфоформа представлена отдельной полосой. Хорошо видно, что эта полоса сохраняется в клетках СЕМ и Jurkat с нокаутом CD45. Наиболее выраженные изменения обнаружены при сравнении данных фосфо-аффинного электрофореза нестимулированных клеток дикого типа и CD45 КО клеток (Рис. 32 А,Б, дорожки 1 и 4). Ранее было показано (Рис. 11), что фосфорилирование Ser-99 и Ser-172, а также их комбинация приводят к появлению трех полос со сниженной электрофоретической подвижностью. При нокауте CD45 эти полосы или полностью исчезали (клетки Jurkat), или вместо них обнаруживались полосы низкой интенсивности с иным расположением (клетки СЕМ). Это можно рассматривать как свидетельство того, что в отсутствие CD45 белок LPAP не подвергается фосфорилированию по Ser-99 и Ser-172.

Рис. 32. Фосфорилирование LPAP в клетках CEM и Jurkat с дефицитом CD45. LPAP иммунопреципитировали из клеток CEM (А) и Jurkat (Б) или их вариантов с нокаутом по CD45 (CD45 KO), активированных с помощью PMA (дорожки PMA+) или неактивированных (PMA-). Образцы дефосфорилировали с помощью фосфатазы CIP (дорожки CIP+). Фосфоформы разделяли методом фосфо-аффиннного электрофореза и проявляли методом Вестерн-блоттинга с антителом против общего LPAP. Образцы уравнены по количеству LPAP.

3.3.3 Уровень белка CD45 падает при нокаутировании LPAP

На следующем этапе был поставлен вопрос, изменится ли уровень CD45 в клетках без белка LPAP. Для этого с помощью технологии CRISPR/Cas9 и последующего клонирования было получено несколько моноклональных культур Jurkat LPAP KO. Мы проанализировали экспрессию CD45 в этих клетках и обнаружили, что во всех культурах она оказалась сниженной и в среднем составила 30% от уровня дикого типа (Рис. 33А). Столь сильного снижения экспрессии не наблюдалось для двух «посторонних» белков CD59 и CD98.

Принимая во внимание гетерогенность культуры Jurkat и сопряженной с этим вариабельности отдельных клонов, с помощью метода SORTS [176] мы получили поликлональную культуру Jurkat, нокаутную по гену LPAP. Эти клетки получили название Jurkat KIO. Уровень CD45 в клетках Jurkat KIO составлял 37% от уровня CD45

в клетках дикого типа (Рис. 33Б), в то время как экспрессия посторонних белков CD59 и CD98 изменялась не столь значительно.

Рис. 33. Экспрессия СБ45 снижается при нокаутировании ЬРЛР. Уровень белков CD45, CD59 и CD98 определяли в клонах LPAP KО (А) или в поликлональной популяции Jurkat LPAP KЮ (Б) с помощью проточной цитометрии. CD45 и CD59 окрашивали антителами, меченными Alexa-594, для детекции CD98 использовали первичные антитела против CD98 и вторичные SHAM-FITC. Нормализованные уровни экспрессии белков в клетках LPAP KO сравнивали с контрольным значением 100 с помощью одновыборочного ^критерия. *p<0.05, ****p<0.0001.

3.3.4 Экспрессия CD45 коррелирует с уровнем белка LPAP в клетках Jurkat

Обнаружив, что нокаутирование LPAP приводит к падению уровня CD45, мы решили выяснить, способно ли восстановление уровня LPAP повысить экспрессию фосфатазы. С этой целью мы выбрали один из клонов Jurkat LPAP KO и с помощью стабильной трансфекции ввели в него LPAP WT. Затем полученную популяцию клонировали и оценили экспрессию белков LPAP и CD45 с помощью проточной цитометрии. В серии клонов уровень LPAP коррелировал с уровнем CD45, чего не

наблюдалось для постороннего белка CD98 (Рис. 34 А,Б). В качестве дополнительного контроля мы клонировали исходную популяцию клеток Jurkat, в которых не прослеживалось корреляции между уровнем LPAP и CD45 (Рис. 34В).

Рис. 34. Уровень CD45 коррелирует с уровнем белка LPAP. Корреляция между уровнями LPAP и CD45 (А) или CD98 (Б) в клонах Jurkat LPAP KO, стабильно трансфицированных LPAP WT. (В) Корреляция между уровнями LPAP и CD45 в клонах Jurkat WT. Уровень LPAP (Г) и CD45 (Д, Е) на клетках Jurkat КЮ, стабильно трансфицированных различной дозой вируса, несущего LPAP WT (#1, #2, #3) или GFP. Для CD45 показаны значения для поверхностного ^ CD45 - Д) и общего ^ CD45 - Е) уровня. Значения МР! нормализованы относительно среднего значения для Jurkat после

вычитания фонового уровня в клетках Jurkat CD45 KO, приведены индивидуальные значения, среднее±SD. Для сравнения уровня поверхностного и общего CD45 в клетках KIO и трансдуцентах использовали метод ANOVA с post hoc анализом с помощью теста Тьюки. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001. Средние значения для уровня LPAP и CD45 s из (Д) использованы для расчета корреляции (Ж). (З) Корреляция между уровнем LPAP и CD45 на различных клеточных линиях лимфоидного (черные точки) и миелоидного (белые точки) происхождения. Уровень белков LPAP, CD45 и CD98 определяли с помощью проточной цитометрии. CD45 (s) и CD59 окрашивали на живых клетках с помощью антител, меченных Alexa-594. LPAP и CD45 (t) детектировали на фиксированных и пермеабилизированных клетках с антителами, меченными Alexa-594.

Поскольку описанный результат был показан на клетках, полученных из единственного клона Jurkat, и мог быть обусловлен особенностями выбранного клона, мы решили подкрепить его с помощью данных по поликлональной популяции. Для этого в клетки Jurkat KIO путем лентивирусной трансдукции был введен ген, кодирующий LPAP WT, или ген GFP в случае контроля. При трансдукции LPAP использовали три различные дозы вируса. После этого в полученных культурах анализировали экспрессию LPAP и CD45 с помощью проточной цитометрии. При увеличении уровня LPAP (Рис. 34Г), количество CD45 в клетках также возрастало (Рис. 34Д, Е, Ж). Различие между уровнем поверхностного и общего CD45, наблюдаемое в клетках KIO, не исчезало при трансфекции LPAP (Рис. 34Д, Е). Это свидетельствует о том, что в отсутствие LPAP происходит именно деградация CD45, а не задержка и накопление зрелой фосфатазы в везикулярной системе клетки.

Наконец, корреляция между уровнем LPAP и CD45 наблюдалась при сравнении различных клеточных линий лимфоидного происхождения (Рис. 35 З, черные точки). Так, клетки YT и HUT78 имели самый высокий уровень CD45 и одновременно характеризовались высокой экспрессией LPAP. В то же время линии NALM-6, RPMI 8226 и HPB-ALL имели самые низкие значения CD45 и LPAP. Такой корреляции не наблюдалось для клеток эритроидной и миелоидной линий дифференцировки (Рис. 34 З, белые точки). Например, клетки THP-1, Mono-Mac-6 и K-562 несли высокий уровень CD45, но практически не окрашивались антителом против LPAP. Клеточной линии, которая бы экспрессировала LPAP, но не несла CD45, нами обнаружено не было.

4. Обсуждение

В протеоме человека описано более 200 000 сайтов фосфорилирования [148]. Однако несмотря на значительные успехи в изучении фосфопротеома, функциональная роль большинства этих модификаций неизвестна. Соответствующие киназы определены для менее чем 5% сайтов, а функциональные последствия фосфорилирования известны для менее чем 3%. Таким образом, исследование роли фосфорилирования индивидуальных сайтов остается ключевой задачей фосфопротеомики [77].

Обратимые реакции фосфорилирования-дефосфорилирования являются важнейшим способом регуляции сигнальных путей, включая Т-клеточный активационный каскад. Белок LPAP имеет несколько сайтов фосфорилирования и, находясь в тесной связи с молекулой CD45, претендует на роль участника Т-клеточного активационного каскада. Будучи обнаруженным в комплексе с фосфатазой CD45, LPAP сразу привлек к себе внимание ученых [129,138]. Однако прогресс в понимании роли белка LPAP продвигался крайне медленно. Это было связано с рядом обстоятельств. Во-первых, три линии нокаутных по LPAP мышей не продемонстрировали яркого фенотипа [166-168]. Во-вторых, в белке LPAP отсутствуют фосфорилированные остатки тирозина, и фосфоспецифические антитела были долгое время недоступными. Наконец, три сайта фосфорилирования белка LPAP находятся в очень крупных триптических фрагментах, что значительно осложняет определение фосфорилирования LPAP протеомными методами [149].

Функция LPAP по-прежнему остается неизвестной. Имеются лишь косвенные данные о его роли в ответе Т-клеток на низкоаффинные лиганды [172], что, возможно, связано с его способностью регулировать димеризацию и активность CD45 [142]. Данные одной работы указывают на то, что LPAP участвует в регуляции дифференцировки В-клеток [135]. Однако детали этих процессов не установлены. Хотя давно было показано, что статус фосфорилирования LPAP изменяется при активации лимфоцитов через CD2, CD3 и с помощью РМА [138], связь фосфорилирования LPAP с сигнальными путями лимфоцитов также не определена.

Одна из задач данной работы состояла в том, чтобы всесторонне изучить процесс фосфорилирования LPAP с целью определить место этого белка в сигнальной сети лимфоцитов. Поскольку регуляторные события

фосфорилирования/дефосфорилирования происходят в ответ на некий клеточный стимул, важно было выяснить, каким образом статус фосфорилирования LPAP

изменяется при активации клеток. С этой целью в работе был проанализирован статус фосфорилирования LPAP при активации различных клеточных линий и первичных клеток. С помощью фосфо-аффинного электрофореза была обнаружена новая фосфоформа, характерная только для активированных клеток. С помощью масс-спектрометрии было показано, что эта форма LPAP несет фосфогруппу в положении Ser-163. Эти данные были подтверждены двумя независимыми методами: путем направленного мутагенеза и последующего анализа протеоформ, а также с помощью фосфоспецифических антител. Последние стали незаменимым инструментом при дальнейшем анализе фосфорилирования LPAP.

Первые эксперименты по активации были проведены с использованием реагента РМА, сильного неспецифического митогена. После чего решено было перейти к более физиологическому стимулу, а именно к активации лимфоцитов путем кросс-линкирования антиген-специфического рецептора. Кроме того, круг стимулов был дополнен ионофорами. Все эти стимулы в общем приводили к одним и тем же изменениям статуса фосфорилирования LPAP, которые нами были названы «активационным фенотипом» (Рис. 35). Общими чертами активационного фенотипа LPAP явилось полное или частичное дефосфорилирование сайтов Ser-99 и Ser-172 и фосфорилирование сайта Ser-163. Наиболее выраженные изменения происходили под действием РМА, который вызывал стойкие изменения, наблюдаемые в течение всего времени эксперимента (4 h). В отличие от этого связывание антигенспецифического рецептора или добавление ионофоров приводили к временному изменению фосфорилирования LPAP, которое возвращалось в исходное состояние в течение 4 ч. Это согласуется с данными ряда работ, в которых показано, что стимуляция растворимыми антителами против TCR вызывает лишь непродолжительную активацию сигнального каскада и не приводит к пролиферации Т-клеток [111,114,121]. Причиной тому служит вовлечение петель отрицательной обратной связи с участием молекул c-Cbl и DOK-2 [114].

Рис. 35. Изменение статуса фосфорилирования ЬРЛР при активации клеток.

На схеме отражены события (де)фосфорилирования LPAP, происходящие при активации клетки. В нормальных условиях LPAP существует в виде набора протеоформ, моно-, ди- и три-фосфорилированных по Ser-99, Ser-153 и Ser-172. В первые 5 мин после начала активации Ser-99 и Ser-172 дефосфорилируются, в то же время начинается фосфорилирование сайта Ser-163, которое достигает максимального уровня через 15-20 мин активации. Это состояние мы назвали «активационным фенотипом LPAP».

Данные по стимуляции клеток с помощью РМА показали, что в различных лимфоидных клеточных линиях, а также в PBMC набор протеоформ LPAP качественно сходнен и претерпевает одинаковые изменения в условиях активации. Это указывает на то, что идентифицированные для линии Jurkat сайты фосфорилирования LPAP и динамика их фосфорилирования могут быть релевантными для условий in vivo.

Многие белки имеют несколько сайтов фосфорилирования и, следовательно, могут существовать как минимум в N+1 состояниях фосфорилирования (где N - число фосфосайтов). В таких белках сайты фосфорилирования часто встречаются в определенных кластерах, и установлено, что около 50% фосфорилированных остатков серина и треонина расположены в пределах 4 аминокислот друг от друга [197]. Фосфорилирование по множественным сайтам может происходить случайным образом или последовательно и способно выполнять различные функции. Например, присоединение нескольких фосфогрупп к белкам Vav, LAT и SLP-76 позволяет им одновременно взаимодействовать с различными партнерами и формировать

сигналосомы для запуска активационного каскада [4]. Последовательное фосфорилирование транскрипционного фактора ОТ^Т по более чем 10 сайтам приводит к изменению его конформации и экспорту из ядра [198]. Для некоторых белков описано явление, называемое иерархическим фосфорилированием [196]. Оно заключается в том, что фосфорилирование по одному сайту создает мотив, распознаваемый другой киназой, фосфорилирующей соседней сайт этого же белка. GSK3 и СК1 являются наиболее известными примерами киназ, которые распознают мотивы, в определенных положениях содержащие фосфорилированные остатки серина [199,200].

Поскольку LPAP имеет 4 сайта фосфорилирования, решено было проверить, зависит ли фосфорилирование по одним его сайтам от статуса других сайтов. Для этого мы оценили фосфорилирование Ser-163 при мутации белка LPAP по одному или нескольким другим сайтам. Полученные нами данные позволяют сделать вывод о том, что фосфорилирование LPAP по Ser-163 не зависит от статуса Ser-99, Ser-153 и Ser-172. Таким образом, тот факт, что фосфорилирование Ser-163 наступает только после дефосфорилирования Ser-172, не связан с иерархическим фосфорилированием, а имеет имеет чисто кинетические причины.

На следующем этапе мы задались вопросом, какие сигнальные пути вносят вклад в изменение статуса фосфорилирования LPAP. Для поиска кандидатных звеньев сигнального каскада использовали ингибиторный анализ, в который включили 29 ингибиторов киназ и фосфатаз широкого спектра действия и узко специфичных. Результаты ингибиторного анализа показали, что фосфорилирование LPAP по Ser-163 ослаблялось или полностью блокировалось при ингибировании киназ пБКС, Raf, МЕК1/2 и ERK1/2, которые в активационном MAPK каскаде следуют друг за другом [63]. Напротив, использование ингибиторов, блокирующих иные сигнальные пути, не оказывало влияния на фосфорилирование LPAP по Ser-163 (Рис. 36).

Стоит отметить, что при стимуляции Т-клеток через CD3 фосфорилирование LPAP по Ser-163 зависело от ферментов, регулирующих активность PKC. Ингибиторный анализ показал, что в этот процесс вносят вклад PLCy1 и киназа PAK1. Эффект блокировки этих ферментов был выражен гораздо сильнее при aCD3-стимуляции по сравнению с PMA-стимуляцией. Это объясняется тем, что РМА действует на РКС напрямую, в то время как кросс-линкирование CD3 активирует PKC опосредованно с участием ряда сигнальных элементов [63].

ЕКК1/2 являлась наиболее дистальной киназой, которая влияла на фосфорилирование LPAP. По данным PhosphositePlus, число субстратов для ЕЯЮ

(MAPK3) и ERK2 (MAPK1) превышает 300 и 500 белков, соответственно [77]. Среди этих мишеней есть большое число киназ, например, RSK (ribosomal S6 kinase), MSK (MAPK/SAPK-activated kinase), MNK1/2 (MAPK signal-interacting kinases 1, 2), MAPKAPK3/5 и многие другие [78,201], которые, однако, имеют другие консенсусные мотивы и не могут являться киназами для Ser-163 белка LPAP.

Рис. 36. Анализ основных путей Т-клеточного сигнального каскада с помощью ингибиторного анализа. Схема показывает основные пути TCR-сигнального каскада, вклад которых в фосфорилирование LPAP изучали в данной работе. Голубые значки показывают ферменты, ингибирование которых не влияло на фосфорилирование LPAP. Красные значки обозначают ферменты, ингибирование которых ослабляло или блокировали фосфорилирование LPAP по Ser-163. Зелеными значками отмечены киназы, ингибирование которых имело эффект только в комбинации с другим ингибитором.

Результаты ингибиторного анализа косвенно подкрепляются данными по кинетике фосфорилирования Ser-163, сопоставимой с таковой для активации ERK1/2 [114]. Фосфорилирование ERK1/2 регистрируется уже через 1 мин после активации Т-клеток [114,202,203], а фосфорилирование LPAP по Ser-163 регистрируется через 5 мин. В случае стимуляции растворимыми антителами сигнал pERK падает через 30 мин, а в случае стимуляции PMA - сохраняется в течение нескольких часов [114]. Подобная кинетика наблюдается и для сигнала pSer-163.

Третьим аргументом в пользу того, что ERK1/2 фосфорилирует LPAP, стали результаты in vitro киназного теста. Интересно отметить, что in vitro ERK1 фосфорилировала LPAP в 10 раз активней, чем ERK2. Пока преждевременно предполагать, что эта селективность сохраняется и in vivo. Известно, что наборы мишеней ERK1 и ERK2 существенно перекрываются, и предполагается, что ключевую роль играет суммарный уровень активной ERK в клетке, а не уровень отдельных изоформ [204]. Считается, что две изоформы ERK обладают сходными биохимическими свойствами [205]. Однако у ERK1 и ERK2, возможно, существуют и невырожденные функции [206-208]. Обнаруженная нами разница между ERK1 и ERK2 в отношении фосфорилирования LPAP требует проверки независимым методом.

Наконец, еще одним свидетельством в пользу того, что LPAP является субстратом ERK1/2, стали данные о мотиве сайта Ser-163. Этот сайт находится в составе мотива LVLG{S}PGP, который соответствует консенсусной последовательности S/T-P, распознаваемой ERK1/2 [148]. Эта последовательность всегда содержит остаток пролина в положении +1 и обычно несколько пролиновых остатков в окрестности от фосфорилируемого серина. В особенности важным является пролин в проложении -2, однако это требование не является абсолютным. В исследовании Xue et al. (2014) было показано, что среди 60 фосфопептидов из 46 различных ERK1/2 субстратов, 29 фосфопептидов не имели пролина в положении -2 [209]. У 16 из них в этом положении находился гидрофобный остаток лейцина, валина или изолейцина, один из таких остатков, а именно лейцин, стоит в положении -2 в мотиве Ser-163 LPAP. Кроме того, в последовательности LPAP в положении +2 находится остаток глицина, который встречается с наибольшей частотой в этом положении консенсусной последовательсности мотива ERK1/2.

Таким образом, в данной работе представлено несколько аргументов в пользу того, что киназой, ответственной за фосфорилирование LPAP по Ser-163, является ERK1/2. На это указывают данные ингибиторного анализа, сопоставление кинетики фосфорилирования Ser-163 с кинетикой активации ERK1/2, результаты in vitro киназного теста, и, наконец, сравнение мотива Ser-163 с консенсусным мотивом ERK1/2.

Субстрат, с которым связывается ERK, как правило имеет один из возможных докинг-сайтов: D-домен или DEF-домен [210,211]. DEF представлен последовательностью FX(F/Y)P, которая встречается в фосфорилируемых ERK транскрипционных факторах, и в LPAP этот мотив не обнаруживается. D-домен состоит из кластера основных аминокислотных остатков, следующего за ним короткого спейсера

от 1 до 6 остатков и мотива ф-Х-ф, где ф - гидрофобная аминокислота (K/R-X1-6-9-X-ф) [212]. На С-конце LPAP имеется мотив 194-R-AAGGQG-L-H-V-202, который напоминает D-домен. Чаще всего D-домен начинается с двух основных остатков, а в мотиве 194-R-AAGGQG-L-H-V-202 присутствует только один такой остаток R195. Укороченная форма LPAP Д184-206, лишенная последовательности 194-R-AAGGQG-L-H-V-202, фосфорилировалась по Ser-163 так же эффективно, как и полноразмерная форма LPAP. Это свидетельствует о том, что предполагаемый мотив не является D-доменом. Другим кандидатом на роль D-домена является последовательность 76-RTRR-L-LWA-84, имеющая три основных остатка R, однако спейсер между ними и субмотивом ф-Х-ф состоит всего из одного остатка L. Требуется проведение дополнительных экспериментов для того, чтобы определить, выполняет ли мотив 76-RTRR-L-LWA-84 функцию D-домена при распознавании LPAP киназой ERK. В пользу этого предположения свидетельствует тот факт, что рассматриваемая область белка является довольно консервативной, как показывает сравнение первичных последовательностей гомологичных LPAP белков других млекопитающих.

Известно, что киназа ERK1/2 запускает различные петли отрицательной и положительной обратной связи, необходимые для тонкой регуляции Т-клеточного сигнального каскада. Например, Helou et al. (2013) сравнили фосфорилирование сигнальных молекул Т-клеток при активации в норме и в присутствии ингибитора MEK1/2 [125]. Авторы обнаружили значительное снижение фосфорилирования многих ключевых проксимальных киназ, находящихся в каскаде выше киназы ERK. Это свидетельствует о большом вкладе петель обратной связи в проведение сигнала.

Примером обратной связи может являться ERKl/2-зависимое фосфорилирование киназы Lck по Ser-59, которое служит «контрольным» механизмом, ограничивающим активацию в неоптимальных условиях [213]. Дефосфорилирование этого остатка при участии кальциневрина оказалось необходимым для нормального фосфорилирования молекул Zap-70, LAT, SLP76 и клеточной адгезии [48]. Кроме прямого действия на проксимальные киназы, ERK1/2 может регулировать их опосредованно, фосфорилируя адаптерные белки и препятствуя сборке сигналосом. Например, было показано, что фосфорилирование адаптерного белка LAT по Thr-155 при участии ERK1/2 мешает взаимодействую LAT c PLCyl и ослабляет сигналинг [214]. Описаны и другие пути обратной регуляции с участием ERK [215,216]. Поскольку LPAP тесно ассоциирован с CD45 [129], CD4 [160] and Lck [141], которые являются проксимальными звеньями TCR-

сигнального каскада, мы предполагаем, что фосфорилирование LPAP по Ser-163 может являться еще одной петлей обратной связи.

Существует мнение, что большинство событий фосфорилирования не выполняет никакой функции и происходит в результате побочной активности киназ. В литературе даже встречаются выражения «темный фосфопротеом» (dark phosphoproteome) и молчащее фосфорилирование» (silent phosphorylation) [77]. Было бы заманчиво предположить, что фосфорилирование LPAP по Ser-163 под действием ERK не относится к разряду «темного фосфопротеома», а является одним из регуляторных событий Т-клеточного сигнального пути. Благодаря тесной связи LPAP с фосфатазой CD45, это представляется возможным.

Вопрос о фосфатазах, ответственных за дефосфорилирование LPAP по Ser-99, Ser-172 и Ser-163, остается открытым. Можно лишь утверждать, что к этим событиям не имеет отношения фосфатаза кальциневрин, что было показано с помощью ингибиторного анализа. Вклад других фосфатаз оценивать сложнее по двум основным причинам. Во-первых, набор ингибиторов фосфатаз существенно ограничен по сравнению с ингибиторами киназ и не позволяет надежно различить эффекты клеточных фосфатаз [191]. Например, с помощью ингибиторного анализа невозможно отделить эффект PP2A фосфатаз от РР4/6 или эффект РР1 от РР5. Выводы о различном вкладе фосфатаз РР1 и РР2А на основании сравнительных данных по действию окадаевой кислоты и каликулина А подвергаются критике [191]. Причиной тому служит опасение, что действующая концентрация этих двух ингибиторов может сильно отличаться от рассчитанной из-за их высокой гидрофобности. Стоит также отметить, что серин-треониновые фосфатазы состоят из трех субъединиц, каждая из которых имеет несколько изоформ. В результате только одна фосфатаза PP2A может быть представлена в виде 90 различных комплексов [217]. Ингибиторный анализ без дополнительных экспериментов по выключению отдельных изоформ не способен дать информацию о том, какой именно комплекс фосфатазы участвует в рассматриваемом процессе.

Во-вторых, при ингибировании фосфатаз в клетке может происходить активация киназ, регулируемых путем дефосфорилирования, в результате чего исследуемое событие окажется замаскированным. Подобный эффект мы наблюдали при инкубации клеток с каликулином А, которая повлияла на статус фосфорилирования LPAP так же, как и aCD3-стимуляция (Рис. 26Б).

При поиске функции белка очень полезным может оказаться знание о его белках-партнерах. Для LPAP единственным надежно подтвержденным партнером является фосфатаза CD45, а также есть единичные сообщения о взаимодействии LPAP с CD4 и Lck [129,141,160]. Для более полной характеристики белка LPAP, мы поставили перед собой задачу изучить интерактом этого белка, а именно: провести поиск и идентификацию белков, взаимодействующих с белком LPAP, и исследовать функциональную значимость обнаруженных взаимодействий. Для этого мы использовали два основных подхода: Co-IP/MS и Blue Native-PAGE.

Для идентификации белков-партнеров LPAP мы использовали ряд протеомных методов, позволяющих детектировать как прочные, так и слабые и/или временные взаимодействия. Группа методов включала стадию иммунопреципитации. Эффективность этих методов зависит от способности антител распознавать белок и при этом не нарушать его взаимодействие с белками-партнерами. Альтернативный подход с использованием Blue-Native PAGE позволяет наблюдать комплексы без их предварительного выделения. Совокупность полученных данных позволяет утверждать, что основным партнером LPAP является фосфатаза CD45. Это хорошо соответствует опубликованным данным. Новизна нашего исследования состоит в том, что мы смогли оценить соотношение свободных и ассоциированных молекул. Стехиометрическое соотношение молекул LPAP и CD45 в комплексе до сих пор не установлено. К сожалению, методом нативного электрофореза трудно точно определить молекулярные массы разделяемых белков, однако можно оценить, что разница в электрофоретической подвижности комплекса CD45-LPAP и мономерного CD45 соответствует массе одного мономерного LPAP. Это позволяет предположить, что в составе комплекса LPAP и CD45 существуют в стехиометрическом соотношении 1 : 1.

В качестве дополнительных партнеров нами обнаружены такие белки, как CD71, CD98, моэзин и некоторые другие компоненты цитоскелета. Эти белки частично соответствовали определенным ранее в комплексе, образованном молекулой CD4. В этом комплексе CD71 напрямую взаимодействует с CD45 [160], поэтому весьма вероятно, что этот белок образует комплекс с LPAP не напрямую, а опосредованно через молекулу CD45. Наконец, среди белков-партнеров LPAP нами обнаружены переносчик аминокислот SLC1A4 и белок HS1 (Hematopoietic lineage cell-specific protein), который регулирует полимеризацию актина при активации лимфоцитов [218].

При сравнении результатов, полученных с помощью различных методов, стоит отметить, что во всех случаях обнаружено взаимодействие LPAP с фосфатазой CD45.

Фосфатаза CD45 выявлена в качестве партнера LPAP с помощью методов с использованием коиммунопреципитации, а также независимого подхода - Blue-Native PAGE. Другой партнер, взаимодействие которого с белком LPAP подтверждено более чем одним методом, - CD71. Этот белок обнаружен как методом FIPA, так и с помощью co-IP/MS. Остальные потенциальные партнеры удалось идентифицировать только при масс-спектрометрическом анализе преципитатов LPAP. Можно заключить, что лишь небольшая доля молекул LPAP вступает во взаимодействие c этими белками, в то время как с фосфатазой CD45 связано более половины мономеров LPAP.

Ранее с использованием двугибридной системы в качестве партнера LPAP был идентифицирован фактор транскрипции EEF1A1 [219], который регулирует продукцию цитокинов в клетках Th1 [220], а также белок DCDC2, вовлеченный в сигнальный путь Wnt [221]. Однако эти взаимодействия не подтверждены независимыми методами аффинного выделения с пептидной меткой или иммунопреципитации нативного белка. Описанное взаимодействие LPAP с киназами Lck и Zap-70 [137,141] в наших экспериментах не зафиксировано.

Анализ аминокислотной последовательности LPAP показывает, что C-концевой домен этого белка (остатки 98-173) является внутренне неупорядоченным (Intrinsically Disordered Region). Такие домены, как правило, позволяют реагировать с большим количеством белков [222]. Тем не менее основным и, пожалуй, единственным партнером белка LPAP является фосфатаза CD45.

Образование прочного комплекса между LPAP и CD45 позволяет предположить, что эти белки связаны функционально. В серии наблюдений показано, что молекула CD45 важна для поддержания стабильности LPAP и его мышиного гомолога CD45-AP. Во-первых, в лимфоцитарных клеточных линиях с нокдауном CD45 LPAP синтезируется, но быстро деградирует [129]. Во-вторых, в опытах на линии T-клеток с индуцируемой экспрессией CD45 установлено, что экспрессия LPAP начинается только после активации синтеза CD45 [128]. В-третьих, обнаружено, что стабильность мРНК и белка по-разному регулируется в CD45+/+ и CD45-/- линиях клеток и в разных популяциях лимфоцитов [136]. Существуют и единичные данные об обратном влиянии LPAP на CD45. В лимфоцитах мышей с нокаутом LPAP уровень CD45 снижен [166,167]. При этом фосфатазная активность CD45 повышается в присутствии мышиного гомолога LPAP [142].

Для экспериментов по влиянию LPAP и CD45 на состояние соответствующего белка-партнера важнейшим инструментом являются нокаутные клеточные линии. В

данной работе для выключения CD45 использовали «традиционную» технологию нокаутирования CRISPR/Cas9 с последующей сортировкой негативных клеток. В отношении LPAP такой подход не работал. Несмотря на то, что LPAP -трансмембранный белок, его внеклеточная часть слишком мала для распознавания антителами, поэтому для анализа LPAP в проточной цитометрии можно использовать лишь антитела, реагирующие с внутриклеточным эпитопом белка. Из-за этого отделить нокаутированные клетки от общей популяции путем сортировки не удается и единственным способом становится клонирование. Это длительный и трудоемкий процесс, где заранее трудно предсказать, какое количество клонов необходимо проанализировать, прежде чем делать вывод о наблюдаемом фенотипе, что особенно осложняется в случае гетерогенных культур, таких как Jurkat. Тем не менее, таким путем в работе было получено около 10 клонов LPAP KO. Чтобы исключить вклад особенностей отдельных клонов в наблюдаемый фенотип и получить поликлональную популяцию нокаутных клеток, мы применили метод SORTS, недавно предложенный группой Zotova et al. [176].

И в клонах, и в поликлональной популяции нокаутов уровень CD45 оказался сниженным до 30% от уровня дикого типа. При восстановлении экспрессии LPAP уровень CD45 повышался, при этом наблюдалась корреляция между уровнями обоих белков. В противоположность этому, при нокаутировании CD45 в наших экспериментах стабильность LPAP оказалась сниженной, что согласуется с опубликованными данными [129]. Кроме того, мы показали, что фосфорилирование LPAP по Ser-153 и Ser-163 не зависит от CD45. В то же время фосфорилирование по Ser-99 и Ser-172 значительно снижается в отсутствие CD45. Это хорошо согласуется с нашими данными о том, что в негемопоэтических клетках HEK293, которые не экспрессируют CD45, сохраняется фосфорилирование Ser-153 и Ser-163, но Ser-99 и Ser-172 не подвергаются фосфорилированию [181].

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что фосфатаза CD45 поддерживат стабильность LPAP и влияет на его статус фосфорилирования, а белок LPAP, в свою очередь, способен регулировать уровень CD45. Эти наблюдения порождают целый ряд вопросов. Каким образом взаимодействие этих двух белков поддерживает их стабильность и каков механизм деградации CD45 и LPAP в отсутствие белка-партнера? Почему в миелоидных клетках, не экспрессирующих LPAP, белок CD45 стабилен? Существует ли особый механизм регуляции CD45 в лимфоидных клетках, связанный с LPAP?

Можно было бы предположить, что LPAP влияет не на деградацию фосфатазы, а на ее локализацию. Однако косвенные данные о влиянии ЬРЛР на общий и поверхностный уровень CD45 (Рис. 35Д) позволяют исключить это предположение.

Группой Schraven й а1. (1994) было показано, что без CD45 белок LPAP синтезируется, но быстро деградирует [129]. Можно допустить, что верно и противоположное утверждение в отношении CD45 и взаимная регуляция уровня этих двух белков происходит на посттрансляционном уровне. Возможно, в отсутствие белка-партнера в CD45 и LPAP оказываются открытыми участки, ответственные за распознавание системой деградации. Поврежденные или неправильно уложенные мембранные белки могут выбраковываться на разных этапах везикулярного пути от ЭПР до плазматической мембраны. Считается, что белки, поврежденные в составе ЭПР, направляются на расщепление в протеасомы, а если они достигли комплекса Гольджи и повреждение обнаружилось в нем, то деградация идет по лизосомальному пути. Поврежденные белки с плазматической мембраны также могут удаляться с помощью протеасом и лизосом, в обоих путях большую роль играет убиквитинирование [223]. Баланс активности убиквитинлигаз и деубиквитинирующих белков важен для регуляции сигнальных путей, включая каскад от Т-клеточного рецептора [4]. Например, убиквитинирование цепей TCR под действием CBL-b необходимо для деградации рецептора и ослабления сигналинга на поздних этапах активации Т-клеток.

Большая часть цитоплазматического участка ЬРЛР, по предсказаниям, не имеет выраженной структуры [224], поэтому LPAP можно отнести к внутренне неупорядоченным белкам (ГОР). Такие белки, однако, могут приобретать определенную конформацию при взаимодействии с молекулой-партнером [225]. Внутренне неупорядоченные белки, благодаря своей способности взаимодействовать с различными партнерами, часто выступают в роли белков-адаптеров или белков-платформ для сборки многокомпонентных комплексов. Они могут вступать во взаимодействия с высокой специфичностью и умеренной аффинностью, что необходимо для строго регулируемых во времени процессов и также делает их важными участниками сигнальных каскадов [226]. Возможно, LPAP опосредует взаимодействия CD45 с другими белками, однако полученные данные по молекулам-партнерам LPAP не позволили выделить таких связей. Интересно, что в примембранной области CD45 содержится мотив, называемый «^её§е»-мотивом, который, по предположениям, ингибирует фосфатазную активность соседней молекулы при димеризации CD45 [227]. Поскольку LPAP взаимодействует с

CD45 за счет мембранного домена и небольшой примембранной области [137,158], представляется возможным, что он участвует в функционировании «wedge»-мотива.

Таким образом, нами было показано, что ассоциированный с фосфатазой лимфоцитарный фосфопротеин (LPAP) изменяет статус фосфорилирования в ответ на активацию Т-клеток через TCR. Был идентифицирован новый сайт Ser-163, претерпевающий ERK1/2-зависимое фосфорилирование только в условиях активации лимфоцитов и представляющий потенциальный регуляторный элемент TCR-сигнального каскада. Важными являются данные о взаимной регуляции уровней LPAP и CD45. Они порождают вопросы для дальнейших исследований Т-клеточного сигналинга и регуляции активности CD45.

5. Выводы

1. Обнаружена новая протеоформа белка LPAP, существующая только в активированных лимфоцитах. С помощью направленного мутагенеза и масс-спектрометрии было установлено, что ее образование связано с фосфорилированием LPAP по Ser-163. Получены моноклональные антитела, специфичные к белку LPAP, фосфорилированному по Ser-163.

2. При активации лимфоцитов под действием форболмиристатацетата или путем кросс-линкирования TCR или BCR, а также под действием ионофоров и тапсигаргина происходит быстрое дефосфорилирование LPAP по Ser-172, частичное дефосфорилирование по Ser-99 и более медленное фосфорилирование по Ser-163. Фосфорилирование сайта Ser-153 при активации сохраняется. Подобные изменения статуса фосфорилирования LPAP наблюдаются в Т-клеточных линиях Jurkat и CEM, в В-клетках Daudi, а также в первичных лимфоцитах.

3. В клетках Jurkat сигнальный путь с участием PKC, Raf, MEK и ERK1/2 приводит к фосфорилированию LPAP по Ser-163. Наиболее дистальной молекулой, которая определяет это событие, является ERK1/2. С помощью in vitro киназного теста показано, что ERK1 может напрямую фосфорилировать LPAP по Ser-163.

4. Поиск белковых взаимодействий в клеточных линиях CEM и Jurkat с помощью ряда протеомных методов позволил выделить единственного партнера LPAP - фосфатазу CD45, с которой LPAP образует прочный комплекс в соотношении 1:1.

5. Экспрессия CD45 и LPAP в клетках Jurkat взаимосвязана: в отсутствие CD45 уровень LPAP составляет 10% от уровня дикого типа; в отсутствие LPAP уровень CD45 падает до 30%. При восстановлении экспрессии LPAP уровень CD45 повышается пропорциональным образом. Возможной функцией LPAP является контроль экспрессии CD45.

6. Список литературы

1. Zinkernagel R.M., Doherty P.C. Restriction of in vitro T cell-mediated cytotoxicity in lymphocytic choriomeningitis within a syngeneic or semiallogeneic system. // Nature. 1974. Vol. 248, № 5450. P. 701-702.

2. Samelson L.E., Klausner R.D. The T-cell antigen receptor. Structure and mechanism of activation. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1988. Vol. 540. P. 1-3.

3. Davis MM. et al. LIGAND RECOGNITION BY aß T CELL RECEPTORS // Annu. Rev. Immunol. 1998. Vol. 16, № 1. P. 523-544.

4. Gaud G., Lesourne R., Love P.E. Regulatory mechanisms in T cell receptor signalling // Nat. Rev. Immunol. 2018.

5. Juang J. et al. Peptide-MHC heterodimers show that thymic positive selection requires a more restricted set of self-peptides than negative selection. // J. Exp. Med. Rockefeller University Press, 2010. Vol. 207, № 6. P. 1223-1234.

6. Thill P.A., Weiss A., Chakraborty A.K. Phosphorylation of a Tyrosine Residue on Zap70 by Lck and Its Subsequent Binding via an SH2 Domain May Be a Key Gatekeeper of T Cell Receptor Signaling In Vivo // Mol. Cell. Biol. 2016. Vol. 36, № 18. P.2396-2402.

7. Courtney A.H., Lo W.-L., Weiss A. TCR Signaling: Mechanisms of Initiation and Propagation // Trends Biochem. Sci. 2018. Vol. 43, № 2. P. 108-123.

8. Nika K. et al. Constitutively Active Lck Kinase in T Cells Drives Antigen Receptor Signal Transduction // Immunity. Cell Press, 2010. Vol. 32, № 6. P. 766-777.

9. Ballek O. et al. The pool of preactivated Lck in the initiation of T-cell signaling: a critical re-evaluation of the Lck standby model // Immunol. Cell Biol. Nature Publishing Group, 2015. Vol. 93, № 4. P. 384-395.

10. Philipsen L. et al. De novo phosphorylation and conformational opening of the tyrosine kinase Lck act in concert to initiate T cell receptor signaling // Sci. Signal. 2017. Vol. 10, № 462. P. eaaf4736.

11. van Oers N.S., Killeen N., Weiss A. ZAP-70 is constitutively associated with tyrosine-phosphorylated TCR zeta in murine thymocytes and lymph node T cells. // Immunity. 1994. Vol. 1, № 8. P. 675-685.

12. Stanford S.M., Rapini N., Bottini N. Regulation of TCR signalling by tyrosine phosphatases: from immune homeostasis to autoimmunity. // Immunology. Wiley-Blackwell, 2012. Vol. 137, № 1. P. 1-19.

13. McKeithan T.W. Kinetic proofreading in T-cell receptor signal transduction. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 1995. Vol. 92, № 11. P. 50425046.

14. Valitutti S. et al. Serial triggering of many T-cell receptors by a few peptide-MHC complexes // Nature. Nature Publishing Group, 1995. Vol. 375, № 6527. P. 148-151.

15. Stepanek O. et al. Coreceptor Scanning by the T Cell Receptor Provides a Mechanism for T Cell Tolerance // Cell. Cell Press, 2014. Vol. 159, № 2. P. 333-345.

16. Davis S.J., van der Merwe P.A. The kinetic-segregation model: TCR triggering and beyond // Nat. Immunol. Nature Publishing Group, 2006. Vol. 7, № 8. P. 803-809.

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

Kuhns M.S., Davis M.M. TCR Signaling Emerges from the Sum of Many Parts // Front. Immunol. Frontiers, 2012. Vol. 3. P. 159.

Brazin K.N. et al. Structural Features of the aßTCR Mechanotransduction Apparatus That Promote pMHC Discrimination // Front. Immunol. Frontiers, 2015. Vol. 6. P. 441. Weiss A. et al. Signal transduction by the T cell antigen receptor. // Semin. Immunol. 1991. Vol. 3, № 5. P. 313-324.

Gillis S., Watson J. Biochemical and biological characterization of lymphocyte regulatory molecules. V. Identification of an interleukin 2-producing human leukemia T cell line // J. Exp. Med. 1980. Vol. 152, № 6. P. 1709-1719.

Abraham R.T., Weiss A. Jurkat T cells and development of the T-cell receptor signalling paradigm // Nat. Rev. Immunol. 2004. Vol. 4, № 4. P. 301-308. Samelson L.E. et al. A 20-kDa protein associated with the murine T-cell antigen receptor is phosphorylated in response to activation by antigen or concanavalin A. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 1985. Vol. 82, № 7. P. 1969. Dasch J.R., Stavitsky A.B. Mitogen-induced phosphorylation of cytosolic proteins in rabbit T- and B-lymphocytes. // Mol. Immunol. 1985. Vol. 22, № 4. P. 379-389. Hsi E.D. et al. T cell activation induces rapid tyrosine phosphorylation of a limited number of cellular substrates. // J. Biol. Chem. 1989. Vol. 264, № 18. P. 10836-10842. Jin Y.J. et al. Stimulation via CD3-Ti but not CD2 induces rapid tyrosine phosphorylation of a 68-kDa protein in the human Jurkat T cell line. // J. Immunol. 1990. Vol. 144, № 2. P. 647-652.

Peyron J.-F., Ferrua B., Fehlmann M. Activation of human T cells is associated with tyrosine phosphorylation of several cellular proteins // Cell. Signal. Pergamon, 1989. Vol. 1, № 4. P. 313-322.

Koretzky G.A. et al. Tyrosine phosphatase CD45 is required for T-cell antigen receptor and CD2-mediated activation of a protein tyrosine kinase and interleukin 2 production. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 1991. Vol. 88, № 6. P. 2037-2041.

Finco T.S. et al. LAT is required for TCR-mediated activation of PLCgamma1 and the Ras pathway. // Immunity. 1998. Vol. 9, № 5. P. 617-626.

Straus D.B., Weiss A. Genetic evidence for the involvement of the lck tyrosine kinase in signal transduction through the T cell antigen receptor. // Cell. Elsevier, 1992. Vol. 70, № 4. P. 585-593.

Williams B.L. et al. Genetic evidence for differential coupling of Syk family kinases to the T-cell receptor: reconstitution studies in a ZAP-70-deficient Jurkat T-cell line. // Mol. Cell. Biol. American Society for Microbiology (ASM), 1998. Vol. 18, № 3. P. 1388-1399.

Álvarez-Salamero C., Castillo-González R., Navarro M.N. Lighting Up T Lymphocyte Signaling with Quantitative Phosphoproteomics. // Front. Immunol. Frontiers Media SA, 2017. Vol. 8. P. 938.

Roncagalli R. et al. Quantitative proteomics analysis of signalosome dynamics in primary T cells identifies the surface receptor CD6 as a Lat adaptor-independent TCR signaling hub. // Nat. Immunol. Europe PMC Funders, 2014. Vol. 15, № 4. P. 384-392. Breuer R. et al. The protein phosphatase 2A regulatory subunit B56y mediates

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

suppression of T cell receptor (TCR)-induced nuclear factor-KB (NF-kB) activity. // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2014. Vol. 289, № 21. P.14996-15004.

Shang W. et al. Genome-wide CRISPR screen identifies FAM49B as a key regulator of actin dynamics and T cell activation. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2018. Vol. 115, № 17. P. E4051-E4060.

Shifrut E. et al. Genome-wide CRISPR Screens in Primary Human T Cells Reveal Key Regulators of Immune Function // Cell. 2018. Vol. 175, № 7. P. 1958-1971.e15. Goodfellow H.S. et al. The catalytic activity of the kinase ZAP-70 mediates basal signaling and negative feedback of the T cell receptor pathway. // Sci. Signal. NIH Public Access, 2015. Vol. 8, № 377. P. ra49.

Brockmeyer C. et al. T cell receptor (TCR)-induced tyrosine phosphorylation dynamics identifies THEMIS as a new TCR signalosome component. // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2011. Vol. 286, № 9. P. 7535-7547. Ventimiglia L.N., Alonso M.A. The role of membrane rafts in Lck transport, regulation and signalling in T-cells // Biochem. J. 2013. Vol. 454, № 2. P. 169-179. Denny M.F., Patai B., Straus D.B. Differential T-cell antigen receptor signaling mediated by the Src family kinases Lck and Fyn. // Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20, № 4. P.1426-1435.

Liaunardy-Jopeace A. et al. Encoding optical control in LCK kinase to quantitatively investigate its activity in live cells // Nat. Struct. Mol. Biol. 2017. Vol. 24, № 12. Veillette A. et al. The CD4 and CD8 T cell surface antigens are associated with the internal membrane tyrosine-protein kinase p56lck. // Cell. 1988. Vol. 55, № 2. P. 301308.

Kim P.W. et al. A Zinc Clasp Structure Tethers Lck to T Cell Coreceptors CD4 and CD8 // Science (80-. ). 2003. Vol. 301, № 5640. P. 1725-1728.

Bergman M. et al. The human p50csk tyrosine kinase phosphorylates p56lck at Tyr-505 and down regulates its catalytic activity. // EMBO J. European Molecular Biology Organization, 1992. Vol. 11, № 8. P. 2919-2924.

Hrdinka M., Horejsi V. PAG - a multipurpose transmembrane adaptor protein // Oncogene. 2014. Vol. 33, № 41. P. 4881-4892.

Brdicka T. et al. Phosphoprotein associated with glycosphingolipid-enriched microdomains (PAG), a novel ubiquitously expressed transmembrane adaptor protein, binds the protein tyrosine kinase csk and is involved in regulation of T cell activation. // J. Exp. Med. 2000. Vol. 191, № 9. P. 1591-1604.

Brdickovâ N. et al. LIME: a new membrane Raft-associated adaptor protein involved in CD4 and CD8 coreceptor signaling. // J. Exp. Med. The Rockefeller University Press, 2003. Vol. 198, № 10. P. 1453-1462.

Grégoire C. et al. Deletion of the LIME adaptor protein minimally affects T and B cell development and function // Eur. J. Immunol. John Wiley & Sons, Ltd, 2007. Vol. 37, № 11. P. 3259-3269.

Dutta D. et al. Recruitment of calcineurin to the TCR positively regulates T cell activation // Nat. Immunol. 2017. Vol. 18, № 2. P. 196-204.

Granum S. et al. The kinase Itk and the adaptor TSAd change the specificity of the kinase

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

Lck in T cells by promoting the phosphorylation of Tyr192 // Sci. Signal. 2014. Vol. 7, № 355. P. ra118-ra118.

Courtney A.H. et al. A Phosphosite within the SH2 Domain of Lck Regulates Its Activation by CD45 // Mol. Cell. Cell Press, 2017. Vol. 67, № 3. P. 498-511.e6. Woodford-Thomas T., Thomas M.L. The leukocyte common antigen, CD45 and other protein tyrosine phosphatases in hematopoietic cells // Semin. Cell Biol. Academic Press, 1993. Vol. 4, № 6. P. 409-418.

Hermiston M.L., Xu Z., Weiss A. CD45: A Critical Regulator of Signaling Thresholds in Immune Cells // Annu. Rev. Immunol. 2003. Vol. 21, № 1. P. 107-137. Rheinländer A., Schraven B., Bommhardt U. CD45 in human physiology and clinical medicine // Immunol. Lett. Elsevier, 2018. Vol. 196, № November 2017. P. 22-32. Nam H.-J. et al. Structural basis for the function and regulation of the receptor protein tyrosine phosphatase CD45 // J. Exp. Med. 2005. Vol. 201, № 3. P. 441-452. Hermiston M.L., Zikherman J., Zhu J.W. CD45, CD148, and Lyp/Pep: critical phosphatases regulating Src family kinase signaling networks in immune cells // Immunol. Rev. John Wiley & Sons, Ltd (10.1111), 2009. Vol. 228, № 1. P. 288-311. Alexander D.R. The CD45 tyrosine phosphatase: A positive and negative regulator of immune cell function // Semin. Immunol. 2000. Vol. 12, № 4. P. 349-359. Benatar T. et al. Immunoglobulin-mediated signal transduction in B cells from CD45-deficient mice. // J. Exp. Med. 1996. Vol. 183, № 1. P. 329-334. Stepanek O. et al. Regulation of Src family kinases involved in T cell receptor signaling by protein-tyrosine phosphatase CD148 // J. Biol. Chem. 2011. Vol. 286, № 25. P. 22101-22112.

Rhee I., Veillette A. Protein tyrosine phosphatases in lymphocyte activation and autoimmunity // Nat. Immunol. 2012. Vol. 13, № 5. P. 439-447. Seavitt J.R. et al. Expression of the p56(Lck) Y505F mutation in CD45-deficient mice rescues thymocyte development. // Mol. Cell. Biol. 1999. Vol. 19, № 6. P. 4200-4208. McNeill L. et al. The Differential Regulation of Lck Kinase Phosphorylation Sites by CD45 Is Critical for T Cell Receptor Signaling Responses // Immunity. 2007. Vol. 27, № 3. P. 425-437.

Zikherman J. et al. Quantitative differences in CD45 expression unmask functions for CD45 in B-cell development, tolerance, and survival // Proc. Natl. Acad. Sci. 2012. Vol. 109, № 1. P. E3-E12.

Navarro M.N., Cantrell D.A. Serine-threonine kinases in TCR signaling // Nat. Immunol. Nature Publishing Group, 2014. Vol. 15, № 9. P. 808-814. Weiss A., Wiskocil R.L., Stobo J.D. The role of T3 surface molecules in the activation of human T cells: a two-stimulus requirement for IL 2 production reflects events occurring at a pre-translational level. // J. Immunol. 1984. Vol. 133, № 1. P. 123-128. Isakov N., Altman A. Regulation of immune system cell functions by protein kinase C. // Front. Immunol. Frontiers Media SA, 2013. Vol. 4. P. 384.

Pfeifhofer-Obermair C., Thuille N., Baier G. Involvement of distinct PKC gene products in T cell functions // Front. Immunol. 2012. Vol. 3. P. 220.

Spitaler M. et al. Diacylglycerol and Protein Kinase D Localization during T Lymphocyte Activation // Immunity. 2006. Vol. 24, № 5. P. 535-546.

68

69

70

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

Huse M. et al. Spatial and Temporal Dynamics of T Cell Receptor Signaling with a Photoactivatable Agonist // Immunity. 2007. Vol. 27, № 1. P. 76-88. Griner E.M., Kazanietz M.G. Protein kinase C and other diacylglycerol effectors in cancer // Nat. Rev. Cancer. 2007. Vol. 7, № 4. P. 281-294.

Matsumoto R. et al. Phosphorylation of CARMA1 Plays a Critical Role in T Cell Receptor-Mediated NF-kB Activation // Immunity. 2005. Vol. 23, № 6. P. 575-585. Liu X. et al. Diacylglycerol promotes centrosome polarization in T cells via reciprocal localization of dynein and myosin II // Proc. Natl. Acad. Sci. 2013. Vol. 110, № 29. P. 11976-11981.

Letschka T. et al. PKC- selectively controls the adhesion-stimulating molecule Rap1 // Blood. 2008. Vol. 112, № 12. P. 4617-4627.

Lim P.S., Sutton C.R., Rao S. Protein kinase C in the immune system: from signalling to chromatin regulation // Immunology. 2015. Vol. 146, № 4. P. 508-522. Rozengurt E., Rey O., Waldron R.T. Protein kinase D signaling. // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2005. Vol. 280, № 14. P. 13205-13208.

Jun J.E. et al. Regulation of Ras exchange factors and cellular localization of Ras activation by lipid messengers in T cells. 2013.

Seger R. et al. Purification and characterization of mitogen-activated protein kinase activator(s) from epidermal growth factor-stimulated A431 cells. // J. Biol. Chem. 1992. Vol. 267, № 20. P. 14373-14381.

Needham E.J. et al. Illuminating the dark phosphoproteome. // Sci. Signal. American Association for the Advancement of Science, 2019. Vol. 12, № 565. P. eaau8645. Keshet Y., Seger R. The MAP Kinase Signaling Cascades: A System of Hundreds of Components Regulates a Diverse Array of Physiological Functions // Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 2010. Vol. 661. P. 3-38.

Yasuda T., Kurosaki T. Regulation of lymphocyte fate by Ras/ERK signals // Cell Cycle. Taylor & Francis, 2008. Vol. 7, № 23. P. 3634-3640.

Roose J.P. et al. Unusual Interplay of Two Types of Ras Activators, RasGRP and SOS, Establishes Sensitive and Robust Ras Activation in Lymphocytes // Mol. Cell. Biol. 2007. Vol. 27, № 7. P. 2732-2745.

Dower N.A. et al. RasGRP is essential for mouse thymocyte differentiation and TCR signaling // Nat. Immunol. 2000. Vol. 1, № 4. P. 317-321.

Rouquette-Jazdanian A.K. et al. LAT-independent Erk activation via Bam32-PLC-y1-Pak1 complexes: GTPase-independent Pak1 activation. // Mol. Cell. Elsevier, 2012. Vol. 48, № 2. P. 298-312.

Kortum R.L., Rouquette-Jazdanian A.K., Samelson L.E. Ras and extracellular signalregulated kinase signaling in thymocytes and T cells // Trends Immunol. Elsevier, 2013. Vol. 34, № 6. P. 259-268.

Kortum R.L. et al. A phospholipase C-y1-independent, RasGRP1-ERK-dependent pathway drives lymphoproliferative disease in linker for activation of T cells-Y136F mutant mice. // J. Immunol. NIH Public Access, 2013. Vol. 190, № 1. P. 147-158. Newman R.H., Zhang J., Zhu H. Toward a systems-level view of dynamic phosphorylation networks // Front. Genet. 2014. Vol. 5. P. 263.

86. Chylek L.A. et al. Phosphorylation Site Dynamics of Early T-cell Receptor Signaling // PLoS One / ed. Houtman J.C.D. 2014. Vol. 9, № 8. P. e104240.

87. Jünger M.A., Aebersold R. Mass spectrometry-driven phosphoproteomics: patterning the systems biology mosaic // Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2014. Vol. 3, № 1. P. 83-112.

88. Jia M., Wai K., Souchelnytskyi S. Phosphoproteomics: Detection, Identification and Importance of Protein Phosphorylation // Integrative Proteomics. 2012.

89. Wegener A.D., Jones L.R. Phosphorylation-induced mobility shift in phospholamban in sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gels. Evidence for a protein structure consisting of multiple identical phosphorylatable subunits. // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259, № 3. P. 1834-1841.

90. Steinberg T.H. et al. Global quantitative phosphoprotein analysis using Multiplexed Proteomics technology // Proteomics. 2003. Vol. 3, № 7. P. 1128-1144.

91. Kinoshita E. et al. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins // Mol. Cell. Proteomics. 2006. Vol. 5, № 4. P. 749-757.

92. O'Farrell P.H. High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250, № 10. P. 4007-4021.

93. Deng Z., Bu S., Wang Z.Y. Quantitative analysis of protein phosphorylation using two-dimensional difference gel electrophoresis // Methods Mol. Biol. 2012.

94. Nagahara H. et al. Two-Dimensional Phosphopeptide Mapping. 2009.

95. Willars G.B., Challiss R.A.J., Blaukat A. Identification of G-Protein-Coupled Receptor Phosphorylation Sites by 2D Phosphopeptide Mapping // Receptor Signal Transduction Protocols. 2004.

96. Domina A.M. et al. MCL1 is phosphorylated in the PEST region and stabilized upon ERK activation in viable cells, and at additional sites with cytotoxic okadaic acid or taxol. // Oncogene. 2004. Vol. 23, № 31. P. 5301-5315.

97. Dephoure N. et al. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. // Mol. Biol. Cell. 2013. Vol. 24, № 5. P. 535-542.

98. Rabilloud T. et al. Fully denaturing two-dimensional electrophoresis of membrane proteins: A critical update // Proteomics. 2008.

99. Ong S.-E. et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics // Mol. Cell. Proteomics. 2002.

100. Bartlet-Jones M. et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents // Mol. Cell. Proteomics. 2004.

101. Gerber S.A. et al. Absolute quantification of proteins and phosphoproteins from cell lysates by tandem MS // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003.

102. Guo M., Huang B.X. Integration of phosphoproteomic, chemical, and biological strategies for the functional analysis of targeted protein phosphorylation. // Proteomics. 2013. Vol. 13, № 3-4. P. 424-437.

103. Manning G. et al. The protein kinase complement of the human genome // Science. 2002.

104. Linding R. et al. NetworKIN: A resource for exploring cellular phosphorylation networks // Nucleic Acids Res. 2008.

105. Kumar N., Mohanty D. Identification of substrates for Ser/Thr kinases using residue-

106

107

108

109

110

111

112

113

114

115

116

117

118

119

120

121

122

123

based statistical pair potentials // Bioinformatics. 2010.

Song C. et al. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. // Mol. Cell. Proteomics. 2012. Vol. 11, № 10. P. 1070-1083. Ptacek J. et al. Global analysis of protein phosphorylation in yeast. // Nature. 2005. Peck S.C. Analysis of protein phosphorylation: Methods and strategies for studying kinases and substrates // Plant J. 2006.

Miernyk J.A., Thelen J.J. Biochemical approaches for discovering protein-protein interactions // Plant J. 2008.

Couture C. et al. Regulation of the Lck SH2 domain by tyrosine phosphorylation. // J. Biol. Chem. 1996. Vol. 271, № 40. P. 24880-24884.

Arndt B. et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation // J. Immunol. Methods. 2013. Vol. 387, № 1-2. P. 276-283. Daniels M.A. et al. Thymic selection threshold defined by compartmentalization of Ras/MAPK signalling // Nature. 2006. Vol. 444, № 7120. P. 724-729. Dong C., Davis R.J., Flavell R A. MAP K INASES IN THE I MMUNE R ESPONSE // Annu. Rev. Immunol. 2002. Vol. 20, № 1. P. 55-72.

Poltorak M. et al. TCR activation kinetics and feedback regulation in primary human T cells. // Cell Commun. Signal. BioMed Central, 2013. Vol. 11. P. 4. Santos S.D.M., Verveer P.J., Bastiaens P.I.H. Growth factor-induced MAPK network topology shapes Erk response determining PC-12 cell fate // Nat. Cell Biol. 2007. Vol. 9, № 3. P. 324-330.

Kalergis A.M. et al. Efficient T cell activation requires an optimal dwell-time of interaction between the TCR and the pMHC complex // Nat. Immunol. 2001. Vol. 2, № 3. P. 229-234.

Govern C.C. et al. Fast on-rates allow short dwell time ligands to activate T cells. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2010. Vol. 107, № 19. P. 87248729.

Van Wauwe J., Goossens J. Mitogenic actions of Orthoclone OKT3 on human peripheral blood lymphocytes: effects of monocytes and serum components. // Int. J. Immunopharmacol. 1981. Vol. 3, № 3. P. 203-208.

Verwilghen J. et al. Differences in the stimulating capacity of immobilized anti-CD3 monoclonal antibodies: variable dependence on interleukin-1 as a helper signal for T-cell activation. // Immunology. Wiley-Blackwell, 1991. Vol. 72, № 2. P. 269-276. Manger B. et al. The role of protein kinase C in transmembrane signaling by the T cell antigen receptor complex. Effects of stimulation with soluble or immobilized CD3 antibodies. // J. Immunol. 1987. Vol. 139, № 8. P. 2755-2760.

Davis L.S., Lipsky P.E. T cell activation induced by anti-CD3 antibodies requires prolonged stimulation of protein kinase C. // Cell. Immunol. 1989. Vol. 118, № 1. P. 208-221.

Houtman J.C.D. et al. Early phosphorylation kinetics of proteins involved in proximal TCR-mediated signaling pathways. // J. Immunol. NIH Public Access, 2005. Vol. 175, № 4. P. 2449-2458.

Olsen J. V. et al. Global, In Vivo, and Site-Specific Phosphorylation Dynamics in Signaling Networks // Cell. 2006. Vol. 127, № 3. P. 635-648.

124

125

126

127

128

129

130

131

132

133

134

135

136

137

138

139

140

Pincus D. et al. Evolution of the phospho-tyrosine signaling machinery in premetazoan lineages. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2008. Vol. 105, № 28. P. 9680-9684.

Helou Y.A. et al. ERK Positive Feedback Regulates a Widespread Network of Tyrosine Phosphorylation Sites across Canonical T Cell Signaling and Actin Cytoskeletal Proteins in Jurkat T Cells // PLoS One / ed. Hirsch E. 2013. Vol. 8, № 7. P. e69641. Belmont J. et al. A PLC-y1 Feedback Pathway Regulates Lck Substrate Phosphorylation at the T-Cell Receptor and SLP-76 Complex // J. Proteome Res. 2017. Vol. 16, № 8. P. 2729-2742.

Paster W. et al. GRB2-Mediated Recruitment of THEMIS to LAT Is Essential for Thymocyte Development // J. Immunol. 2013. Vol. 190, № 7. P. 3749-3756. Schraven B. et al. A functional complex is formed in human T lymphocytes between the protein tyrosine phosphatase CD45, the protein tyrosine kinase p56lck and pp32, a possible common substrate // Eur. J. Immunol. 1991. Vol. 21, № 10. P. 2469-2477. Schraven B. et al. LPAP, a novel 32-kDa phosphoprotein that interacts with CD45 in human lymphocytes. // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, № 46. P. 29102-29111. Takeda A. et al. Molecular cloning of the CD45-associated 30-kDa protein. // J. Biol. Chem. 1994. Vol. 269, № 4. P. 2357-2360.

Shimizu Y. et al. Isolation of a cDNA clone encoding a novel membrane protein expressed in lymphocytes. // FEBS Lett. 1994. Vol. 355, № 1. P. 30-34. Kitamura K. et al. Characterization of the Interaction between CD45 and CD45-AP // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1995. Vol. 270, № 36. P. 21151-21157.

Bruyns E. et al. Sequence, Genomic Organization, and Chromosomal Localization of the Human LPAP (PTPRCAP) and Mouse CD45-AP/LSM-1 Genes // Genomics. 1996. Vol. 38, № 1. P. 79-83.

Shimizu Y. et al. Lineage- and differentiation stage-specific expression of LSM-1 (LPAP), a possible substrate for CD45, in human hematopoietic cells. // Am. J. Hematol. 1997. Vol. 54, № 1. P. 1-11.

Kleiman E. et al. Distinct Transcriptomic Features are Associated with Transitional and Mature B-Cell Populations in the Mouse Spleen. // Front. Immunol. 2015. Vol. 6. P. 30. Kitamura K. et al. CD45-associated protein is a lymphocyte-specific membrane protein expressed in two distinct forms // Eur. J. Immunol. 1997. Vol. 27, № 2. P. 383-388. Cahir McFarland E.D., Thomas M.L. CD45 protein-tyrosine phosphatase associates with the WW domain-containing protein, CD45AP, through the transmembrane region. // J. Biol. Chem. American Society for Biochemistry and Molecular Biology, 1995. Vol. 270, № 47. P. 28103-28107.

Schraven B. et al. Four CD45/P56lck-associated phosphorproteins (pp29-pp32) undergo alterations in human T cell activation // Eur. J. Immunol. John Wiley & Sons, Ltd, 1992. Vol. 22, № 7. P. 1857-1863.

Filatov A. et al. Lymphocyte phosphatase-associated phosphoprotein proteoforms analyzed using monoclonal antibodies // Clin. Transl. Immunol. 2015. Vol. 4, № 10. P. e44.

Ostergaard H., Trowbridge I. Negative regulation of CD45 protein tyrosine phosphatase

141

142