Взаимодействие рицина с клетками гибридом, секретирующих антитела против его каталитической субъединицы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Попова, Екатерина Николаевна

• Попова, Екатерина Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Попова, Екатерина Николаевна

Оглавление.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1 Токсичные пектины из семян клещевины. Особенности трехмерной организации их молекул.

1.2 Транспорт токсинов в клетке-мишени.

1.3 Синтез и секреция иммуноглобулинов.

2. Материалы и методы.

Материалы.

Выделение токсинов и их субъединиц.

Получение гибридом

Очистка мАт.

Биотинилирование белков.

Иммобилизация мАт Rchl и 2RBK1 на BrCN-активированную сефарозу 4В.

Ds-Na-ПААГ- электрофорез.

Системы ТИФА.

Изучение диссоциации субъединиц R60 и R120.

Оценка устойчивости клеток к токсинам с помощью МТТ-теста.

Выявление признаков апоптоза.

Определение R60 и RTA в супернатантах и лизатах клеток sp2/0 и гибридомы 1RAK3, предобработанных R60.

Получение конъюгатов с флуорохромами ФИТЦ и А1еха568.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия.

Предсказание антигенных детерминант RTA в области, экранированной RTB.

3 Результаты и обсуждение результатов.

3.1 Гибридомы, продуцирующие мАт против нашивного рицина и гибридомы, продуцирующие мАт против нативного агглютинина рицина.

3.2 Гибридомы, продуцирующие мАт против частично денатурированной А-субъединицы рицина.

3.3 Гибридомы, продуцирующие мАт, реагирующие с изолированной А-субъединицей рицина, но не с голотоксином.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие рицина с клетками гибридом, секретирующих антитела против его каталитической субъединицы»

Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия белкового токсина рицина (R60) из семян клещевины с клетками гибридом. Молекула R60 образована двумя субъединицами: каталитической (А или RTA), обладающей N-гликозидазной активностью в отношении p28SPHK эукариот, и пектиновой (В или RTB). Рицин проникает в клетку в результате эндоцитоза и достигает своей цитоплазматической мишени (p28SPHK) в ходе многостадийного внутриклеточного транспорта [Sendvig K.and van Deurs В., 2000]. Это делает его удобным объектом для изучения физиологически важных клеточных процессов, например рецептор-опосредованного эндоцитоза лектинов, везикулярного транспорта, сортинга, рециклинга и транслокации белков в цитозоль.

Высокая токсическая активность каталитической субъединицы рицина позволяет использовать ее для конструирования иммунотоксинов и других препаратов направленного действия для терапии опухолевых, аутоиммунных заболеваний, а также для обработки трансплантируемых органов [Sandvig and van Deurs, 1996; Kreitman, 1999]. Обсуждается также возможность создания вакцин нового поколения на основе рицина. Были получены химерные молекулы, состоящие из рекомбинантной каталитической субъединицы рицина с инактивированным ферментативным центром, лектиновой субъединицы и короткого пептида [Smith D.C., et al., 2003]. Пептид презентировался на поверхности клеток в комплексе с MHCI, после чего наблюдалась активация специфичных CD8+ Т клеток.

Гибридомные клетки, продуцирующие мАт против токсинов, эффективно используются как удобные модельные системы для изучения некоторых этапов транспорта белков [Youle R.J., Colombatti М., 1987]. В основе этих модельных систем лежит предположение, что причиной устойчивости гибридом, секретирующих мАт против токсинов, является происходящее во внутриклеточных компартментах связывание их антителами. Однако в описанных в литературе модельных системах связывание антител с токсином вне клетки невозможно было исключить полностью. Кроме того, для предотвращения взаимодействия токсина с антителами вне клетки или во внутриклеточных компартментах в системы вводились дополнительные факторы, которые могли повлиять как на внутриклеточный транспорт токсина, так и на жизнеспособность (viability) клеток гибридомы [Youle R.J., Colombatti М., 1987; Kornfeld SB, 1991; Малюченко Н.В., 1999]. Получение устойчивых к интоксикации рицином гибридом, секретирующих мАт, специфически узнающих каталитическую субъединицу, но не голотоксин, позволяет разрешить сомнения относительно корректности «гибридомной модели».

Транспорт токсина в компартмент, где происходит его связывание мАт, принципиально важен для осуществления цитотоксичности. Анализ распределения рицина и секретеруемых мАт с помощью конфокальной микроскопии позволяет количественно оценить их колокализацию, и, возможно, определить компартмент, в котором происходит это взаимодействие в гибридомной клетке.

Изучение устойчивости гибридом, полученных к ненативным токсинам - один из перспективных подходов, позволяющий в ряде случаев визуализировать конформационные изменения белков, сопряженные с их внутриклеточным транспортом [Малюченко Н.В и соавторы, 1997; Малюченко Н.В и соавторы, 2000].

Анализ внутриклеточной локализации и цитотоксичности родственных лектинов растительной и бактериальной природы таких как рицин, агглютинин рицина, вискумин, волкенсин, дифтерийный токсин, псевдомонадный экзотоксин А, холерный токсин, шига-токсин и других, в совокупности с изучением их строения может оказаться эффективным для выявления структур, вовлеченных во внутриклеточный транспорт лектинов. Изучение строения токсинов подразумевает комплексный методологический подход не только с помощью РСА и сайт-направленного мутагенеза, но и серологического анализа, атомно-силовой микроскопии, а также ТИФА.

Изучение динамики процессов эндоцитоза и рециклинга, а также детекция минорных фракций токсинов и их субъединиц в клетке требует точной количественной оценки. Эти задачи позволяют решать специфичные высокочувствительные тест-системы на основе мАт. Кроме того, тест-системы для детекции рицина могут быть использованы для его выявления в парфюмерных изделиях, касторовом масле и кормах для домашних животных.

Взаимное загрязнение препаратов субъединиц токсинов, а также взаимное загрязнение R60 и R120 создает определенные трудности, как при изучении биологии растительных токсинов, так и при использовании в медицине иммунотоксинов и вакцин на основе субъединиц R60. Эта проблема может быть во многом решена за счет использования специфичных иммуносорбентов.

Цель работы: изучение особенностей взаимодействия рицина с клетками млекопитающих с использованием модельных систем на основе гибридом и тест-систем, выявляющих минимальное количество рицина и его субъединиц.

Задачи исследования:

1. Получить гибридомы против нативного рицина, нативного агглютинина рицина (R120) и против нативной и ненативной каталитической субъединицы рицина. Оценить устойчивость полученных гибридомных клеток к интоксикации рицином.

2. Охарактеризовать полученные моноклональные антитела (мАт). На их основе создать тест-системы, позволяющие определять RTA, R60 и R120 в присутствии друг друга.

3. Используя полученные тест-системы оценить интенсивность процесса интернализации рицина, а также определить наличие свободной RTA в супернатантах и лизатах клеток полученных гибридом. Изучить внутриклеточное распределение секретируемых иммуноглобулинов (Ig) и рицина.

Научная новизна работы.

Получены уникальные гибридомы, секретируюгцие мАт против RTA, но не R60 и устойчивые к интоксикации рицином. На их основе предложена модельная система для изучения особенностей транспорта рицина, в которой абсолютно исключено взаимодействие антител с токсином вне клетки.

На основе полученных в работе мАт, созданы уникальные тест-системы для определения RTA, не чувствительные к R60, и тест-системы, позволяющие выявлять R60 и R120 в присутствии друг друга.

Впервые выявлена свободная RTA в клетках и супернатантах клеток, предобработанных R60.

Показано, что в гибридомах, секретирующих мАт против RTA, с иммуноглобулинами (Ig) колокализуется не более 2-5% внутриклеточного пула рицина. Однако, именно попадание токсина в места колокализации с Ig принципиально важно для интоксикации клетки-мишени.

Практическая значимость.

Полученные в работе иммуноферментные тест-системы могут быть использованы в лабораторной практике для решения ряда научных проблем, а также для выявления токсичных компонентов в касторовом масле, косметике и кормах для домашних животных. Полученные в работе иммуносорбенты позволили значительно повысить степень очистки препаратов R120, RTA и RTB от взаимного загрязнения.

Фундаментальные исследования механизмов взаимодействия рицина с клеткой, и особенно механизмов транслокации токсина в цитозоль, позволят повысить эффективность фармакологических препаратов, получаемых на основе токсинов, избавиться от побочных эффектов, возникающих при их применении, а также значительно расширить область их применения в клинической практике, в том числе за счет нанотехнологий.

1. Обзор литературы.

1.1 Токсичные лектины из семян клещевины. Особенности трехмерной организации их молекул.

Рицин (R60) и агглютинин рицина (R120) - родственные лектины из семян клещевины (Ricinus communis). R60 — гетеродимерный белок, состоящий из каталитической, A (RTA), и лектиновой, В (RTB), субъединиц, соединенных одной дисульфидной связью. Молекула R120 образована двумя рициноподобными гетеродимерами (АВ), соединенными дисульфидной связью. Токсичность данных белков обусловлена N-гликозидазной активностью А субъединиц по отношению к 28S рибосомальной РНК эукариот, приводящей к потере необратимо модифицированной рибосомой сродства к фактору элонгации II и, как следствие, остановке синтеза белка и гибели эукариотической клетки. В-субъединицы связываются с гликозилированными рецепторами на клеточной поверхности, что необходимо для эндоцитоза токсинов. Эндоцитированные белки транспортируются от поверхности клетки в цитоплазму к их рибосомальной мишени.

R60 и R120 входят в группу в разной степени гомологичных токсических лектинов - рибосоминактивирующих белков II типа (РИБ II). Помимо рицина и агглютинина рицина группа РИБ II включает растительные токсины - вискумин (mistletoe lectin I или MLI), mistletoe lectin II и III (MLII и MLIII соответственно), абрин, модецин, волкенсин, эбулин 1 и некоторые другие, а также бактериальные - дифтерийный токсин, псевдомонадный экзотоксин А, шигатоксин и другие. Рентгеноструктурный анализ (РСА) рицина, абрина, вискумина и агглютинина рицина выявил структурное сходство этих белков [Rutenber Е., Robertas J.D, 1991; Hung С.Н. et al., 1993; Tahirov TH et al., 1994; Krauspenhaar R. et al., 1999; Sweeney E.C. et al, 1997]. Структура рицина изучена подробнее структур других РИБП. Принимая во внимание гомологию аминокислотной последовательности РИБП, данные РСА рицина часто используются для определения структуры других РИБП методом молекулярного замещения.

1.1.1 Структура связывающих субъединиц рицина и агглютинина рицина.

В-субъединица рицина представляет собой гликопротеин из 262 аминокислотных остатков с молекулярной массой около 31 кДа, содержащей два сайта N-гликозилирования (рис.1). Молекула RTB образована двумя сферическими доменами (1 и 2) с диаметром 30 А [Montfort et al.,1987; Rutenber Е., Robertas J.D, 1991]. Между доменами наблюдается выраженная гомология (32%) последовательности аминокислотных остатков [Willifranca et al., 1981]. Каждый из доменов состоит из четырех субдоменов: X, а, |3 и у (рис. 1). Три из которых, а, (3 и у, гомологичны (20%) между собой и имеют сходную конфигурацию. Они содержат около 40 аминокислотных остатков, и образуют структуру «трилистника». Субдомены X образованы первыми 16 аминокислотными остатками каждого домена (1-16 и 135-150 соответственно). Структура связывающей субъединицы рицина стабилизирована сетью гидрофобных взаимодействий между а.о. субдоменов, а также четырьмя дисульфидными связями, образованными Cys20- Cys39 и Cysl51- Cysl64 внутри а-субдоменов и Cys63- Cys80 и Cysl90-Cys207 внутри (3-субдоменов. Еще одна, пятая, дисульфидная связь в молекуле рицина образована Cys4 В субъединицы и Cys259 А субъединицы. В-субъединицы рицина и агглютинина рицина различаются по 41 аминокислотному остатку и гомологичны на 81% (рис 1) [Roberts L.M., 1985].

Рисунок 1.

Б.

RTB ------------advcmd ре рivrivgrngl cvdvrdgrfhngnaiq lwpck sntdanql

ARTB sllirpwpnfnadvcmdpepivrivgrmglcvdvtgeeffdgnрiqlwpcksntdwnql RTB wtijcrdntirsngkclttygyspgvyvmitdcntaatdatrwqiwdngtiinprsslvia ARTB wtxirkdstirsngkcltiskssprqqwi yncstatvgatrwqiwdnrtiinprsglvla RTB at s gns gt tltvqtniyavsqgwlptnntqpfvttivglyglclqansgqvwiedс ssek ARTB at s gns gtkltvqtniyavsqgwlptnntqpfvttivglygmclqansgkvwledсtsek RTB aeqqwalyadgsirpqqnrdncltsdsniretwkilscgpassgqrwmfkndgtilnly ARTB ae qqwalyad gsirpqqnrdnclttdanikgtwkil s cg pas s gqrwmfknd gt ilnly RTB sglvldvrasdpslkqiilyplhgdpnqiwlplf ARTB nglvldvrrsd p slkq11vh pfhgnlnqiwlplf

А. Третичная структура связывающей субъединицы рицина (код модели в NCBI 2AAJ)

Б. Аминокислотные последовательности связывающих субъединиц рицина и агглютинина рицина [Roberts L.M., 1985].

В-субъединица R60 содержит два хорошо охарактеризованных аналогично устроенных углеводсвязывающих центра. Первый локализован в субдомене 1а, второй - в субдомене 2у [Rutenber et al., 1991]. Существуют также свидетельства существования третьего, неидентичного двум первым, углеводсвязывающего центра, расположенного в ip субдомене [Venkotesh et al., 1997, Frankel et.al 1996, Steeves et al. 1999].

Первый и второй галактозосвязывающие центры представляют собой неглубокие карманы на поверхности белка, дно кармана образовано консервативным трипептидом, включающим 24-26 а.о. в первом сайте и 236-238 во втором. В верхней части кармана расположена ароматическая боковая группа Тгр37 в первом и Тгр248 во втором сайтах. Положение молекулы галактозы фиксировано сетью водородных связей с боковыми группами нескольких полярных аминокислотных остатков, локализованных в углеводсвязывающих сайтах, и гидрофобным взаимодействием с боковой группой соответствующего аминокислотного остатка Тгр (рис. 2). Консервативные а.о. Asp22 в первом сайте и Asp234 во втором являются ключевыми для первичного взаимодействия со связываемыми сахарами. Атом Odi этих остатков образует водородную связь с Сз-гидроксилом связываемого сахара. При этом положение боковой группы Asp фиксируется водородной связью атом 0D2 - с Ne2 консервативного амида Gln47 в первом углевод-связывающем сайте и Gln256 во втором. Каждый Сз-гидроксил галактозы также формирует сильные водородные связи с атомами ND2 Asp46 в первом сайте и Asp255 во втором. Сеть водородных связей в первом углевод-связывающем сайте более сложная, чем в сайте 2, в котором NE2 Gln35 образует раздвоенную водородную связь с С4- и Сб-гидроксилами. В сайте 2 аналогом Gln35 является

11е246 и вместо водородной связи образуется гидрофобный контакт с атомом Сй сахара.

Согласно данным РСА кристаллов R120 в комплексе с (3-D-галактозой [Савочкина Ю. А., 2002], В-субъединица R120 организована аналогично В-субъединице рицина. Она образована двумя доменами, состоящими из четырех субдоменов, пространственно расположенными так же как домены и субдомены RTB. Вторичная структура связывающих субъединиц обоих токсинов характеризуется отсутствием а-спиральных участков и наличием [3-складок и неупорядоченных цепей.

Рисунок 2

КГВ ARTB

Строение углеводевязывающих центров в !а и 2у субдоменах В субъединиц рицина и агглютинина рицина [Савочкина Ю.А, 2002г] (с любезного согласия автора).

S04№S

Согласно данным РСА [Sweeney Е.С. et al, 1997; СавочкинаЮ. А., 2002г], в молекуле ARTB функционирует только один углеводсвязывающий центр, расположенный в субдомене 1а. Его структура представлена на рис.2. В ARTB, как и в RTB, Тгр37 образует гидрофобный контакт с молекулой галактозы. Аналогично Asp22 (Od1 и 0D2), Asn46 (ND2) и Gln35 (NE2) в RTB, в ARTB Asp22 (Od1-C4 gal), Asn46 (Nd2-C3 gal), Lys40 (Nz-C3 gal) и Gly25 (N-C4 gal) образуют водородные связи (рис. 2). Боковая группа Lys40 фиксирована в нужном положении водородной связью с Glu26. Таким образом, различия в формировании водородных связей с галактозой в рицине и агглютинине рицина обусловлены заменами Asp25 на Gly25 и Gly26 на Glu26. В области 2у субдомена R120, соответствующей второму углевод связывающему центру R60, галактоза отсутствует, хотя внешняя поверхность сохраняет форму открытого кармана (рис. 2). Вероятно, утрата углеводсвязывающей активности в 2у субдомене R120 связана с заменами Туг248 на His248 и А1а237 на Arg237. Обе указанные замены приводят к увеличению положительного заряда на данном участке, что препятствует правильной ориентации молекулы галактозы, и, следовательно, образованию водородных связей с соответствующими боковыми группами аминокислотных остатков. Кроме того, результаты, полученные на мутантных RTB, свидетельствуют о том, что гидрофобный контакт Туг248 с молекулой галактозы во втором углеводсвязывающем центре рицина необходим для удержания сахара в зоне контакта [Rutenber et al.,1991; Lehar et al.,1994].

Согласно данным сайт-специфического мутагенеза, рекомбинантные RTB, несущие замены в субдоменах 1а и 2у, сохраняли лектиновую активность. В то время как В-цепь рицина, которая имела замены в субдоменах 1а, 1р, 2у по аминокислотам, участвующих в стекинг-взаимодействиях, Trp37—»Ser, Tyr248—»His, Tyr78—»His, теряла способность связываться с галактозидами, находящимися как в составе асиалофетуина, так и на поверхности клетки [Frankel А.Е., 1996]. При изучении биологической активности in vitro и in vivo гетеродимеров, содержащих мутантную RTB, показано, что при вышеуказанных заменах происходит значительное снижение токсичности химерных белков. Величина 1С50 в экспериментах на клеточной линии лейкемии человека HUT 102 составила 5* 10"9М, в экспериментах in vivo LD50 составила 10 мкг/мышь. Тогда как эти значения для рицина составили 4* 10"12 М и 75 нг/мышь соответственно [Fu et al., 1996]. Однако, в субдомене 1р отсутствуют остатки, эквивалентные Asp22 и Asp46 (la) Asp234 и Asp255 (2у), которые образуют водородные связи с гидроксильными группами при атомах СЗ и С4 галактозы. Возможно, возникновение комплекса с галактозой обусловлено полярными взаимодействиями боковых радикалов аминокислот с ОН-группами при атомах С2 и С4, и, таким образом, нельзя ожидать, что аминокислоты, занимающие аналогичное положение в пространстве, будут консервативны как для сайта 1(3, так и для хорошо изученных сайтов la и 2у.

Углеводная специфичность и рецепторы рицина.

Рицин и агглютигин рицина связываются с концевой галактозой поверхностных гликопротеинов и/или гликолипидов клеток. Оба токсина связывают простые сахара, такие как галактоза и лактоза. Методом равновесного диализа с мечеными сахарами были определены константы аффинности углеводсвязывающих центров рицина [Shimoda et al., 1985] и агглютинина рицина [Podder et al., 1974]. Согласно полученным результатам сродство к галактозе двух углеводсвязывающих центров рицина значительно различается и равно при 4°С 2800 М"1 и 35000 М"1, и при 25°С 3000 М"1 и 19000 М"1 для первого и второго центров соответственно. Аналогичные результаты были получены для лактозы. Константа ассоциации R120 с галактозой при 5°С равна 1,2 мМ"1 [Podder et al., 1974], то есть, сравнима с константой первого низкоаффинного углеводсвязывающего центра рицина.

Baenziger и Fiete (1979) показали, что константа связывания рицина с концевой галактозой в составе олигосахаридов в 1000 раз превышает константу связывания с отдельной молекулой галактозы или лактозы [Baenziger J.U., Fiete D, 1997]. Рицин не связывается с олигосахаридами, содержащими концевой N-ацетилгалактозамин. Сиаловая кислота, присоединенная к галактозе в положении а2—>6 в 2-4 раза снижает константу связывания рицина с Gal. Наибольшая константа связывания рицина с сахаром (14.4x106 М"1) наблюдается при взаимодействии с олигосахаридом, содержащим три остатка галактозы.

Галактозид-связывающую активность рицина изучали методом рентгено-структурного анализа, используя разветвленный олигосахарид с двумя концевыми остатками галактозы [Rutenberg and Robertus, 1991]. Расстояние между двумя галатозосвязывающими участками рицина (70 А) не позволяет одной молекуле рицина одновременно связывать два концевых остатка галактозы одного олигосахарида. Однако концевые остатки Gal олигосахарида связывают две молекулы рицина. Таким образом, разветвленные рецепторы могут связывать разные молекулы рицина без стерических затруднений.

Большинство галактозо-содержащих олигосахаридов клеточной поверхности имеют структуру, очень схожую с той, которой обладают углеводные цепи фетуина. N-связанные олигосахариды белка асиалофетуина взаимодействуют с рицином, причем константа аффинности превосходит 107М"\ Steeves et al (1999) предполагают, что для лиганда подобной структуры характерны многоточечные взаимодействия с поверхностью всего углевод-связывающего субдомена, а не только с самим «карманом». Возможно, это и объясняет 1000-кратное увеличение константы аффинности при связывании олигосахаридов.

Было показано, что рицин способен связывать N-ацетилгалактозамин (GalNAc) , но только в сайте 2. Rutenber и Robertus (1991) отмечали, что N-ацетильная группа галатозамина и остаток Asp44 могли бы создать стерические напряжения в сайте 1, тогда как в сайте 2 N-ацетильная группа экспонирована в водную фазу. Агглютинин рицина лишен такой способности, что, вероятно, сопряжено с отсутствием у ARTB второго углеводсвязывающего центра [Baerziger et al., 1979].

Любая клетка является потенциальной мишенью для растительных РИБ II, так как имеет на своей поверхности концевые остатки галактозы, поэтому эти белки действуют неизбирательно. Количество рецепторов для разных токсинов на поверхности клеток отличается. Например, на мембране клеток Hela имеется 3x107 рецепторов для рицина и абрина и только 2x105 для вискумина [Тоневицкий и др., 1995]. При изучении взаимодействия рицина с клетками-мишенями выяснилось, что на поверхности клеток различных популяций существуют как низкоаффинные так и высокоаффинные рецепторы [Leonard et al., 1988, Decastel et al., 1989]. Кроме того, на эндотелиальных клетках печени и макрофагах показано, что рицин связывается не только с рецепторами, содержащими концевые остатки галактозы, но и с поверхностными маннозными рецепторами через остатки маннозы олигосахаридов, входящих в состав рицина. Это обеспечивает альтернативный путь поступления токсина в клетку [Magnusson et al., 1991, Simmons et al., 1986].

1.1.2 Структура каталитических субъединиц рицина и агглютинина рицина.

Каталитические субъединицы R60 и R120 представляют собой глобулярные гликопротеины с двумя сайтами гликозилирования. Существуют две в разной степени гликозилированные формы А-субъединиц рицина и агглютинина рицина, которые выявляются с помощью SDS-PAGE-электрофореза в виде двух полос, соответствующих примерно 29 kDa [Hegde R. and Podder S.K., 1998]. Структура RTA (рис. 3) сформирована тремя доменами: первый включает 1-117, второй - 118-210 и третий -211-267 аминокислотные остатки. Первый домен включает пять р-складчатых участков и две ос-спирали (А и В), второй - 5 ос-спиралей (C-G), третий - одну а-спираль (Н), а также петли и взаимодействует с двумя другими доменами, и с В-субъединицей (рис 3) [Rutenber Е., Robertus J.D, 1991]. Согласно данным PC А вторичная структура и общая организация А-субъединиц рицина и агглютинина рицина существенно не различаются [Sweeney Е.С. et al, 1997; Савочкина Ю. А., 2001г]. Каталитические субъединицы рицина и агглютинина рицина не содержат внутренних дисульфидных связей и их третичная структура стабилизируется сетью полярных и гидрофобных взаимодействий. А1 и А2 -субъединицы агглютинина соединены дисульфидной связью длиной 2,13А, образованной Cysl56.

А-субъединицы R60 и R120, как и других РИБ II, - N-гликозидазы, субстратом которых являются рибосомальные 28S РНК эукариот. Они осуществляют выщепление аденина (А4324 в клетках печени крыс) входящего в состав полностью консервативного тетрануклеотида GAGA, расположенного в петле или стеблевой части 28S РНК [Endo et. al., 1987; Gluck et al.,1994]. Распознавание А-субъединицей консервативного тетрапептида GAGA, по-видимому, зависит от его конформации в рибосоме. Так, для выщепления аденина из очищенной 28S рРНК или 20-35-членных синтетических олигонуклеотидов, включающих сайты депуринизации а-сарцина-рицина, требуются более высокие концентрации RTA, чем для депуринизации нативной рибосомы [Endo et al., 1988]. Кроме того, несмотря на консервативность сайта депуринизации, чувствительность рибосом разного происхождения к RTA заметно различается: растительные рибосомы намного устойчивее к RTA, чем рибосомы клеток млекопитающих и дрожжей, а рибосомы прокариот - полностью резистентны [Lord et al., 1991].

Представление о механизме ферментативного катализа, осуществляемого А-субъединицей, основано на данных рентгено-структурного анализа рицина и комплекса рекомбинантной А-субъединицы рицина с аналогами субстрата аденил(3'-5')-гуанозином и формицин монофосфатом, а также данных о ферментативной активности мутантных форм А-субъединицы [Monzingo and Robertus, 1992]. Данная модель построена по аналогии с детально охарактеризованным механизмом расщепления АМФ-нуклеозидазой связи между аденином и рибозой в АМФ.

Рисунок 3.

Б.

RTA mvpkqypiinettagatvqsytnfiravrgrlttgadvrheipvlpnrvglpinqrfilv ARTA ifpkqypiinfttadatvesytnfiravrshlttgadvrheipvlpnrvglpisqrfilv RTA e l snhael s vtlald vtnaywgyragn s A y f fh pdnqedAEAit hl ftdvqnryt fafg ARTA e l s n hae l s vtlald vtnaywgc ragns ay f fh pdnqed aeait h lftdvqn s ft fafg RTA gnydrleq lagnlrenielgngpleeaisalyyystggt qlptlarsfxiсiqmiseaar ARTA gnydrijsqlgg-lrenielgtgpledaisalyyystcgtqiptlarsfmvciqmiseaar RTA fq yIE gemrtrir ynrr sapdpsvitlen s wgrl s T Al qe snqgafas pi q lqrrng s kf ARTA fqyiegemrtrirynrrsapdpsvitlenswgrlstAIqesnqgafas piqlqrrngskf

RTA svydvsIlIP11almvyrcappp---

ARTA nvydvs xlIPIialmvyrcapppssqf

А. Структура каталитической субъединицы рицина (код модели в NCBI 2AAI) Б. Аминокислотные последовательности каталитических субъединиц рицина и агглютинина рицина [Roberts L.M., 1985].

Согласно модели, предложенной Monzingo и Robertus (1992) (рис. 4), консервативные Giul77 и ArglSO непосредственно участвуют в депуринизании. Argl80 образует водородную связь с N3 атомом аденозина (протонирует его), что облегчает разрыв гликозидной связи N9-C1. Glul77 поляризует молекулу воды, локализованную в активном центре. Затем происходит реакция нуклеофильного замещения: атом кислорода поляризованной воды атакует связь N9-C1 и замещает атом N9 аденозина, протон воды переходит к N9 атому аденозина.

Рисунок 4.

RTA ARTA

Строение ферментативных центров А субъединиц рицина и агглютинина рицина [Савочкина Ю.А., 2002] (с любезного разрешения автора).

Результаты, полученные с помощью сайт-специфического мутагенеза RTA, свидетельствуют, что в случае замены Glu I 77 на Ala роль G ] и 1 77 может выполнять G!u208, также локализованный в кармане активного центра, хотя такой мутант в 5 раз менее активен, чем белок дикого типа, а замена Glu208 на Asp не влияет на ферментативную активность RTA. Двойной мутант Glu 1 77А1а GIu208Asp практически не активен [Frankel et al., 1990]. Участие положительно заряженной боковой группы Argl80 в ферментативном катализе была показана на мутантной RTA в которой Arg 180 был заменен на Lys или на His [Frankel et al., 1990]. Ферментативная активность мутанта Arg 18 О/Lys была только в 4 раза ниже, а мутанта Arg 18 О/His в 1 ООО раз ниже активности нативной RTA.

Инвариантные ароматические аминокислотные остатки Туг80 и Туг 123 участвуют в связывании субстрата [Ready М.Р. et al., 1991]. В комплексе рекомбинантной А-субъединицы рицина с аденил(3'-5')-гуанозином и формицин монофосфатом пуриновое кольцо аналога субстрата фиксируется между ароматическими кольцами Туг80 и Туг123 с помощью стекинг - взаимодействия. При этом плоскость пуринового кольца практически параллельна ароматическому кольцу Туг80. Положение Туг80 в комплексе отличается от его положения в свободной А-субъединице поворотом, для которого необходим разрыв водородной связи с Gly 121. По данным мутагенеза, замена инвариантных Туг80 и Туг123 на ароматический Phe снижала ферментативную активность RTA лишь в 15 и в 7 раз соответственно. В то время как их замена на Ser снижала активность в 160 и 70 раз соответственно [Ready et al.; 1991].

Инвариантный Туг21 принимает участие в формировании структуры активного центра, образуя водородную связь с атомом О Metl74. В данном сайте спираль Е образует изгиб, в результате чего ключевые для ферментативного катализа аминокислотные остатки Glul77 и Argl80, оказываются на поверхности кармана активного центра.

Кроме описанных инвариантных аминокислотных остатков А-субъединицы РИБП содержат другие высококонсервативные аминокислотные остатки, например Asn 78, Argl 34, Glnl73, Glu208 и Asn209, функция которых пока не известна. Возможно, они также участвуют в формировании и стабилизации структуры активного центра или связывании каталитической субъединицы с субстратом.

Механизм действия А-субъединиц рицина и агглютинина рицина, по-видимому, идентичен [Lord and Roberts, 1996]. Как и у рицина, каталитический центр агглютинина рицина располагается в открытом кармане А-субъединицы и содержит ключевые аминокислотные остатки Glul76, Arg 179, Тгр210, Туг80 и Туг 123 (рис. 4). Его пространственное строение аналогично строению каталитического центра рицина (рис. 4) [Савочкина Ю.А., 2002]. В кармане активного центра агглютинина рицина, также как и у рицина, локализована одна молекула воды, W277, которая образует водородные связи с ключевыми аминокислотными остатками Glul76 ОЕ2, Glul76 ОЕ1, Argl79 NH1 и Cln207 О. Очевидно, локализованная в ферментативном центре агглютинина рицина молекула W277, также как у рицина, является непосредственным участником реакции N-гликозилирования.

1.1.3 Межсубъединичные взаимодействия в рицине и агглютинине рицина.

Каталитическая и лектиновая субъединицы рицина и агглютинина рицина соединяются в голотоксинах дисульфидной связью, образуемой 259 (258 в R120) в А-субъединицах и 4 в В-субъединицах остатками цистеина. В результате взаимодействия ЫН2-концевых аминокислотных остатков В-субъединицы с СООН-концевым участком А-субъединицы формируется удлиненная структура, которая содержит экспонированную на поверхность молекулы R60 дисульфидную связь [Montfort et al., 1987; Weston et al., 1994]. С помощью рентгеноструктурного анализа с разрешением

2,5 А показано, что область контакта между А- и В-субъединицами рицина равна 1600 А, что составляет примерно 14% от общей поверхности каждой субъединицы [Katzin et al., 1991]. А и В субъединицы рицина кроме ковалентной S-S-связи удерживаются вместе сетью полярных, гидрофобных и стеккинг-взаимодействий боковых групп аминокислотных остатков, в зоне контакта [Krauspenhaar et al., 1999] (табл. 1). Участвующие во взаимодействиях аминокислотные остатки субъединиц расположены группами по всей поверхности контакта.

Таблица 1.

RTA RTB

Полярные взаимодействия

Asn223 Asp7

Gln224 Asn7

His40 Asp95

Asp245 Alal34

Arg235 Vail 42

Glnl83 Asn222

Ile250 Asn222

Leu253 Asn222

Arg235 Phe264

Try184 Phe264

Glu41 Lys221

Гидрофобные взаимодействия

Prol51 Phe220

Pro251 Pro262

Ile252 Pro262

Ala251 Pro262

Стекинг-взаимодействия

Phe241 Phel41

Phe241 Phe264

Tyrl84 Phe264

Дисульфидная связь

Cys4 Cys260

Аминокислотные остатки RTA и RTB, взаимодействующие друг с другом в области контакта субъединиц, по [Krauspenhaar et al., 1999].

После разделения субъединиц экспонируются скрытые в нативном токсине гидрофобные участки субъединиц. Показано, что свободная RTA способна взаимодействовать с липидными мембранами [Ramalingam et al., 1994; Utsumi et al., 1984; Utsumi et al., 1987 Utsumi et al., 1988] за счет гидрофобного участка, экранированного в нативном токсине [Simpson J.C., 1995]. Возможно, погружение RTA в мембрану инициирует процесс ее транслокации в цитоплазму, однако, не исключено, что встроенная в мембрану RTA может транспортироваться к месту транслокации за счет рециркуляции мембран. Предполагается, что встроившись в мембрану RTA приобретает конформацию «расплавленная глобула», и после завершения транс-мембранного переноса в цитоплазме происходит восстановление глобулярной структуры RTA, сопровождающееся перегруппировками в субстрат-связывающем сайте, необходимым и для активации фермента [Argent R.H., 1994; Argent R.H., 2000].

Несмотря на высокую гомологию аминокислотной последовательности, а также сходства в способах укладки А- и В-цепей рицина и агглютинина рицина, существуют различия в нековалентных межсубъединичных взаимодействиях этих белков. Согласно данным РСА, в молекуле R120 присутствует 4 дополнительных гидрофобных контакта по сравнению с R60. [Савочкина Ю.А., 2002]. Более плотный контакт между А- и В-субъединицами в R120 по сравнению с R60 может быть одной из причин различий в биологической активности этих родственных токсинов.

А1- и А2 -субъединицы агглютинина соединены дисульфидной связью длиной 2,13А, образованной Cysl56. Cysl56 расположен в гидрофильной петле между D и Е а-спиралями ARTA [Sweeney Е.С. et al, 1997]. В А-цепи рицина на месте данного аминокислотного остатка находится С1у157. А-субъединицы агглютинина рицина удерживаются вместе также за счет гидрофобных взаимодействий между аминокислотными остатками с113по118 [Савочкина Ю.А., 2001 ]. В данной области в молекуле рицина вместо Serl 1 бнаходится положительно заряженный аминокислотный остаток Argl 15. Положительный заряд боковой цепи Argl 15, по-видимому, является препятствием для сближения указанных областей А-субъединиц рицина.

R120 - не единственный тетрамерный РИБП. Для рицина, абрина и вискумина была показана способность к самопроизвольной тетрамеризации в растворах [Tahirov et al., 1995, Sweeney et al., 1998, Малюченко H.B., 2003]. Причем рицин и абрин образуют тетрамеры в результате взаимодействия их А- субъединиц, а вискумин - в результате взаимодействия В-субъединиц. Значение тетрамеризации РИБП пока не известно. Однако следует отметить, что токсины, образующие более стабильные тетрамеры, такие как агглютинин рицина или вискумин, обладают меньшей токсичностью в отношении клеток млекопитающих, нежели рицин или абрин [Barbieri L., 1993].

1.1.4 Синтез рицина. Мультигенное семейство, кодирующее рицин и агглютинин рицина.

Рицин синтезируется в виде препрорицина - полипептида длиной в 576 аминокислотных остатков, который включает в себя добавочную N-концевую сигнальную последовательность из 35 остатков, 267 остатков RTA, связывающий линкер из 12 остатков и 262 остатка RTB [Lord J.M., 1982; Lord J.M., 1985]. N-концевая сигнальная последовательность обеспечивает транспорт препрорицина в просвет ЭР. В ЭР препрорицин подвергается ко-трансляционным модификациям: отщепляется сигнальная последовательность сигнальной пептидазой, полипептид гликозилируется, внутри его формируются все пять дисульфидных связей, присутствующих в рицине. Модифицированный таким образом препорорицин называют прорицин. Прорицин перемещается путем везикулярного транспорта из ЭР через аппарат Гольджи в вакуоль растительной клетки. Транспорт прорицина в ЭР и аппарате Гольджи сопровождается некоторыми слабо охарактеризованными пост-трансляционными модификациями. В вакуоли кислые эндопротеазы вырезают из прорицина все оставшиеся N-концевые аминокислотные остатки и состоящий из 12 АК остатков пептид-линкер между RTA и RTB. Т.о. образуется соединенный дисульфидной связью гетеродимер рицин [Lord J.M., Roberts L.M., 1996]. Биосинтез агглютинина рицина протекает сходным образом [Roberts and Lord, 1981].

Рицин и агглютинин рицина кодируются семейством генов [Tregear et а1.,1992]. В растительной клетке одновременно синтезируются различные варианты рицина и агглютинина рицина. Об этом свидетельствуют как анализ клонов к ДНК [Ladin B.F., 1987], так и серологический анализ лектинов, выделенных из семян клещевины [Hagde R., Podder S.K., 1998]. Согласно данным, полученным Ladin B.F (1987) и сотрудниками, клоны кДНК разделяются на два класса, различающихся по кодированию некоторых аминокислотных остатков, включая аминокислотные остатки с заряженными боковыми группами. Серологический анализ рицина, выделенного из семян клещевины, также позволяет разделить варианты рицина на две основные группы (примерно по

12 вариантов в группе), различающиеся диапазоном pi. Так называемые рицин I и II при изоэлектрофокусировании образуют полосы в диапазоне 6,0-7,4 pi, рицин III - в диапазоне 8,2-8,2 pi. Анализ изолированных субъединиц рицина, выделенных из общей фракции рицина, и его субфракций, выявил неоднородность как В, так и А субъединиц. Рицин III составляет 30% общего количества рицина. Любопытно, что анализ связывания А-субъединицы рицина с аденином показал, что примерно 30% от общего количества рицина связывается с аденином с высокой аффинностью (3,3* 103М" 1) и 70% - с низкой (0,35* К^М"1) [Hagde R., Podder S.K., 1998]. Авторы предполагают, что высокой аффинностью обладает рицин III. Сравнивая диапазоны pi рицина, субфракций рицина, агглютинина рицина, субъединиц этих лектинов, а также основываясь на данных о связывании А-субъединицами аденина, исследователи предполагают, что ген агглютинина рицина мог возникнуть в результате слияния гена из группы I и II с геном из группы III. Это предположение согласуется с ранее полученными данными для так называемых рицина D и рицина Е. Рицин D и присутствующий в семенах таиландской клещевины рицин Е, описанные Araki и Funatsu [Araki Т., Funatsu G., 1987], различались диапазоном pi, их первичная структура различалась по некоторым заряженными аминокислотным остаткам. Анализ кДНК рицина D, рицина Е и одного из димеров агглютинина рицина [Araki Т., Funatsu G, 1987] показал, что А цепи рицина D и рицина Е идентичны, в то время как В-цепь рицина Е образована N-концевой половиной рицина D и С-концевой - агглютинина рицина. Предполагается, что рицин D представляет собой варианты рицина I и II, а рицин Е - варианты рицина III, описаных Hegde и Podder [Hagde R., Podder S.K., 1998].

Заключение диссертации по теме «Аллергология и иммулология», Попова, Екатерина Николаевна

Выводы:

1. Получено и охарактеризовано 17 новых гибридом против субъединиц рицина: 1 - против RTB и 16 - против RTA. Кроме того, получено 4 клона гибридом против агглютинина рицина. Предложена модель для изучения транспорта рицина на основе гибридом, секретирующих мАт против RTA, но не связывающих R60. В предложенной модельной системе взаимодействие токсина с антителами вне клетки исключено.

2. На основе анти-RTA мАт и aHTH-R120 мАт созданы тест-системы, позволяющие выявлять менее 0,3нг R60 и RTA и менее Знг R120 в присутствии друг друга. Тест-системы, позволяющие различать R60, R120 и RTA получены впервые.

3. Впервые выявлена свободная RTA в супернатантах и лизатах клетки-мишени. Показано, что диссоциация субъединиц рицина происходит во внутриклеточных компартментах до транслокации в цитоплазму, а также, что диссоциация субъединиц рицина необходима для интоксикации клеток.

4. Установлено, что интоксикация клеток определяется транспортом токсина в компартменты, где в гибридомных клетках присутствуют иммуноглобулины. Показано, что в эти компартменты транспортируется лишь незначительная фракция токсина (не более 2-5%).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Попова, Екатерина Николаевна, 2004 год

1. Agapov I.I., Tonevitsky A.G., Shamshiev A.T., Pohl E., Pohl P., Palmer R.A., Kirpichnikov M.P. // The role of structural domains in RIP II toxin model membrane binding. // FEBS Lett, V. 402, PP. 91-93, 1997

2. Alessenko Alice V., Boikov Peter Ya.,. Filippova Galina N, Khrenov Alexey V.,. Loginov Anatoliy S, Makarieva Elena D. Mechanisms of cycloheximide-induced apoptosis in liver cells. // FEBS Letters, V. 416, pp. 113-116, 1997.

3. Araki Т., Funatsu G. The complete amino acid sequence of the Bchain of ricin E isolated from small-grain bean seeds. //Biochim. Biophys. Acta, v.911, pp.191-200. 1987.

4. Argent R.H., Parrott A.M., Day P J., Roberts L.M., Stockley P.G., Lord J.M., Radford S.E. // Ribosome-mediated folding of partially unfolded ricin A-chain. // J Biol Chem, V. 275(13), PP. 9263-9, Mar 31, 2000

5. Argent R.H., Roberts L.M., Wales R., et al // Introduction of a disulfide bond into ricin A-chain decreases the cytotoxicity of the ricin holotoxin. // J. Biol. Chem., V. 269, PP. 26705-26710, 1994

6. Arvan Peter and Castle David. Sorting and storage during secretory granule biogenesis : looking backward and looking forward. // Biochem. J., V.332, pp. 593-610, 1998.

7. Baenziger J.U., Fiete D. Structural determinants of Ricinus communis agglutinin and toxin specificity for oligosaccharides. // J. Biol. Chem., v.254, pp.9795-9799. 1979.

8. Baenziger J.U., Fiete D. Structural determination of Ricinus Communis agglutinin and toxin specificity for oligosaccharides.// J.Biol.Chem., v.254, pp.9795-9799, 1979.

9. Barbieri L., Battelli M.G., Stirpe F. // Ribosome-inactivating proteins from plants. // Biochim. Biophys. Acta., V. 1154, pp. 237-282. 1993.

10. Bau M-Y and Drapper R.K. Ricinintoxicates End4 mutants that have an aberrant Golgi complex. // J. Biol. Chem., v.268, pp. 1993919942. 1993.

11. Beaumelle В., Alami M., Hopkins C. ATP-dependent translocation of ricin across the membrane of purified endosomes. // J. Biol. Chem., v.268, n.31, pp.323661-23669. 1993.

12. Bilge A., Warner C., Press O. //Translocation of ricin A-chain into proteoliposomes reconstituted from Goli and endoplasmic reticulum// J. Biol. Chem., V.270, PP 23720-23725, 1995

13. Blond-Elguindi S., Cwirla S.E., Dower W.J., Lipshutz R.J., Sprang S.R., Sambrook J.F., Gething M-J.H. Affinity panning of a library of peptides displayed on bacteriophages reveals the binding specificity of BiP. // Cell, V.75, pp.717-728, 1993

14. Bole D.G., Hendershot L.M., Kearney J.F. Posttranslational association of immunoglobulin heavy chain binding protein with nascent heavy chains in nonsecreting and secreting hybridomas. // J Cell Biol, V. 102, pp.1558-1566, 1986

15. Carayon P., Bord A., Gaillard J.P//Ricin A-chain cytotoxicity depends on its presentation to the cell membrane // Bioconjgate Chem., V. 4., PP. 146-152, 1993

16. Choe S., Bennett M.J., Fujii G., Curmi P.M.K., Kantardjieff K.A., Collier R.J. and Eisenberg D. The crystal structure of diphteria toxin. //

17. Nature, v.357, pp. 216-222. 1992.

18. Cosson P., Letourneur F.// Coatomer interaction with di-lysine endoplasmic reticulum retention motifs// Science, V. 263, PP 1629-1631, 1994

19. Davidson R.L, Gerald P.S.// Induction of mammalian somatic cell hybridization by polyethylene glycol// Methods Cell Biol., V. 15,1. P.325,1977

20. Decastel M., Haentjens G., Aubery M., amd Goussault Y. Differential entry of ricin into malignant and normal rat hepatocytes. // Exp. Cell Research, v. 180, pp.399-408. 1989.

21. Emini, E., J.V. Hughes, D.S. Perlow, and J. Boger. Induction of hepatitis A virus-neutralizing antibody by a virus-specific synthetic peptide. // J. Virol., V.55, pp.836-839,1985

22. Endo Y., Tsurugi K. RNA N-glycosidase activity of ricin A-chain. // J. Biol. Chem., v.262, pp.8128-8130. 1987

23. Endo Y., Tsurugi K.,Lambert J.M. The site of action of six different ribosome-inactivating proteins from plants on eukaryotic ribosomes: the RNA N-glycosidase activity of the proteins. // Biochem BiophysRes Commun, V. 150(3), pp.1032-1036, 1988.

24. Ey P.L., Prowse S.J., Jenkin C.R. //Isolation of pure IgGl, IgG2a and IgG2b immunoglobulins from mouse serum using protein A-sepharose // Immunochemistry, V. 15, PP. 429-436, 1978

25. Feng Y., Press В and Wadinger-Ness A. Rab7: An important regulator of late andocytic membrane traffic. //J.Cell Biol, V. 131, pp. 1435-1452, 1995.

26. Frankel A, Welsh P, Richardson J, Robertus JD. Role of arginine 180 and glutamic acid 177 of ricin toxin A chain in enzymatic inactivation of ribosomes. // Mol Cell Biol., V. 10(12), pp. 6257-6263, 1990.

27. Frankel A.E., Burbage C., Fu Т., Tagge E., Chandler J., Willingham M.C., Ricin toxin contains at least three galactose-binding sites located in В chain subdomains la, 1 p, and 2y.//Biochemistry, v. 35, pp.14749-14756, 1996.

28. Freedman R.B. The formation of protein disulphide bonds. // Curr Opin Struct Bio, V.15, pp.85-91, 1995

29. Fu Т., Burbage C., Tagge E.P., Brothers Т., Willingham M.C., Frankel A.E. Ricin toxin contains three lectin sites which contribute to its in vivo toxicity.// Int. J. Immunopharmacol., v. 18, № 12, pp. 683-692, 1996

30. Gabius H., Gabius S. Glycoscience. Chapman and Hall, 1997.

31. Gamier, J., D.J. Osguthorpe, and B. Robson. Analysis of the accuracy and implications of simple methods for predicting the secondary structure of globular proteins. // J. Mol. Bio., V.120, pp. 97120, 1978

32. Garred O., Deurs B.V., Sandvig K.//Furin-induced cleavage and activation of Shiga toxin// J.Biol.Chem., V.270, PP. 10817-10821, 1995b

33. Garred O., Dubinina E., Holm P.K., et al //Role of processing and intracellular transport for optimal toxicity of Shiga toxin and toxin mutants //Exp. Cell. Res, V. 218, PP. 39-49, 1995a

34. Ghibelli L, Coppola S, Fanelli C, Rotilio G, Civitareale P, Scovassi Al, Ciriolo MR. Glutathione depletion causes cytochrome с release even in the absence of cell commitment to apoptosis. // FASEB J. Nov; V.13(14), pp. 2031-2036, 1999.

35. Ghosh R.N, Mallet W.G, Soe T.T, MeGraw Т.Е., and Maxfield F.R. An endocytosed TGN38 chimeric protein is delivered to TGN after trafficing through the endocytic recicling compartment in CHO cell. // J. Cell Biol, V. 142, pp. 923-936, 1998.

36. Gluck A, Endo Y, Wool I. The ribosomal RNA identity elements for ricin and for alpha-sarcin: mutations in the putative CG pair that close a GAGA tetraloop. // Nucleic Acids Res, v. 22, pp. 321-324. 1994.

37. Gonzalez Ramon, Asenjo Juan A., and Andrews Barbara A. Metabolic Control Analysis of Monoclonal Antibody Synthesis. // Biotechnol. Prog., V.17, pp. 217-226, 2001.

38. Green E., Adelt G., Baenzinger J. The asparagine-linked oligosaccharides on bovine fetuin. // J.Biol.Chem., v. 263, pp. 1825318268, 1988.

39. Grossi C.E., Lydyrad P.M. In: Immunology, Roit I., Brostoff J., Male D., Mosby International Ltd, 1998

40. Hammond C, Helenius A. Folding of VSV G protein: Sequential interaction with BiP and calnexin. // Science, V.266, pp. 456-458, 1994

41. Hansen S.H., Sandvig K., Deurs B.V. // Molecules internalized by clathrin-independent endocytosis are delivered to endosomes containing transferrin receptors// J.Cell Biol., V. 123, PP 89-97, 1993

42. Hegde R. Podder S.K. Evolution of tetrameric lectin Ricinus communis agglutinin frjm two variant groups of ricin toxin dimers. // Eur. J. Biochem, V. 254, pp. 596-601, 1998.

43. Hendershot L.M. Immunoglobulin heavy chain and binding protein complexes are dissociated in vivo by light chain addition. // J Cell Biol, V.l 11, pp.829-837, 1990

44. Hudson Т.Н., Grillo F.G.// Brefeldin A enchancer ricin A-chain immunotoxins and blockade of intact ricin, modecin and abrin// J.Biol. Chem., V. 266, PP. 18586-18592, 1991

45. Hung CH, Lee MC, Lee TC, Lin JY. Primary structure of three distinct isoabrins determined by cDNA sequencing. Conservation and significance. // J Mol Biol., V. 229(1), pp.263-267, Jan 5; 1993.

46. Hwang C., Sinskey A.J. and Lodish H.F. Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. // Science, v. 257, pp. 14961502. 1992.

47. Hwang C., Sinskey A.J. and Lodish H.F. Oxidized redox state of glutathione in the endoplasmic reticulum. // Science, v. 257, pp. 14961502. 1992.

48. Iversen TG, Skretting G, Llorente A, Nicoziani P, van Deurs B, Sandvig K. Endosome to Golgi transport of ricin is independent of clathrin and of the Rab9- and Rabl 1-GTPases. // Mol Biol Cell., V. 12(7), pp. 2099-2107, 2001.

49. Johannes L., Lamaze С. Сlathrin-Dependent or Not: Is It Still the Question? // Traffic, v. 3, pp. 443-451, 2002

50. Karplus, P.A., and G.E. Schulz. Pediction of chain flexibility in proteins. //Naturwissenschaften, V.72, pp.212-213, 1985.

51. Katzin B.J., Collins E.J., Robertus J.D. The structure of ricin A-chain at 2,5 A. // Proteins, v. 10, pp. 251-259. 1991.

52. Kim P.S., Arvan P. Calnexin and BiP act as sequential molecular chaperones during thyroglobulin folding in the endoplasmic reticulum. // J Cell Bioll, V.28, pp.29-38. 1995

53. Kohler G, Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. // Nature, V. 256(5517), pp. : 495-497, Aug 7, 1975.

54. Kornfeld R., Kornfeld S. Assembly of asparagine-linked oligosaccharides. //Annu.Rev.Biochem., v.54, p 631, 1985.

55. Kornfeld S.B., Leonard J.E., Mullen M.D., Teatle R. Assessment of ligand effects in intracellular trafficing of ricin A-chain using anty-rircin hybridomas // Canser Research., v. 51, pp. 1689-1693. 1991.

56. Kornfeld SB, Leonard JE, Mullen MD, Taetle R. Assessment of ligand effects in intracellular trafficking of ricin A chain using anti-ricin hybridomas. //Cancer Res. V. 51(6), pp. 1689-1693, Mar 15, 1991.

57. Krauspenhaar R, Eschenburg S, Perbandt M, Kornilov V, Konareva N, Mikailova I, Stoeva S, Wacker R, Maier T, Singh T,

58. Mikhailov A, Voelter W, Betzel C. Crystal structure of mistletoe lectin I from Viscum album. I I Biochem Biophys Res Commun., V.257(2), pp418-424, 1999.

59. Kreitman R.J. Immunotoxins in cancer therapy. // Curr. Opin. Immunol., V. 11, pp. 570-578, 1999.

60. Lehar S., Pedersen J., Kamath R., Swimmer C., Goldmacher V., Lambert J., Blattler W., Guild B. Mutational and structural analisis of the lectin activity in binding domain 2 of ricin В chain. // Prot.Engin., v.7, pp.1261-1266. 1994.

61. Leibiger H., Wuster D., Stigler R.-D., Marx U. Variable domain-linked oligosaccharides of human monoclonal IgG: structure and influence on antigen binding. // Biochem. J., v. 338, pp. 529-538, 1999.

62. Leitzgen Klaus, Knittler Michael R., and Haas Ingrid G. Assembly of Immunoglobulin Light Chains as a Prerequisite for Secretion. // THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 272, No. 5, Issue of January 31, pp. 3117-3123, 1997

63. Leonard J.E., Wang O.C., Kaplan N.O., and Royston I. Kinetics ofprotein synthesis inactivation in human T-lymphocytes by selective monoclonal antibody-ricin conjugates. // Canser Research, v. 45, pp.5263-5269. 1985.

64. Letourneur F., Gaynor E.C., Hennecke S. // Coatomer is essential for retrieval of dilysine-tagged proteins to the endoplasmic reticulum // Cell, V. 79, PP. 1199-1207, 1994

65. London E. //How bactreial protein toxins enter cells: the role of partial infolding in membrane translocation// Mol. Microbiol., V. 6, PP. 3277-3282, 1992

66. Lord J.M. Precursors of ricin and Ricinus communis agglutinin. Glycosilation and proccesing during synthesis and intracellular transport. //Eur. J. Biochem., v. 148, pp.411-416. 1985.

67. Lord J.M., Hartley M.R. and Roberts L.M. Ribosome-inactivating proteins of plants. // Sem. Cell. Biol., v. 2, pp. 15-22. 1991.

68. Lord J.M., Roberts L.M. // Retrograde transport: going against the flow. // Curr. Biol., V. 8, PP R56-R58, 1998a

69. Lord J.M., Roberts L.M. // The intracellular transport of ricin: why mammalian cells are killed and how Ricinus cells servive.// Plant Physiol Biochem., V. 34 (2), PP. 253-261. 1996.

70. Lord J.M, Roberts L.M. // Toxin entry: retrograde transport through the secretory pathway. // J. of Cell Biology, V. 140(4), PP. 733736, 1998b

71. Lord J.M. Sinthesis and intracellular transport of lectin and storage protein precursors in endosperm from castor bean. // Eur. J. Bioche, v. 148, pp.403-409. 1982.

72. Malhotra R, Wormald M.R, Rudd P.M., Fischer P.B, Dwek R.A, Sim R.B. Glycosylation changes of IgG associated with rheumatoid arthritis can activate complement via mannose-binding protein. // Nature.Med, v. 1, pp. 237-241, 1995.

73. Mallard F, Antony C, Tenza D., Salamero J, Goud B, Johannes L. // Direct pathway from early/recycling endosomes to the Golgiapparatus revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. // J. Cell Biol., V. 143, PP. 973-990, 1998

74. Mellman I. //Endocytosis and molecular sorting// Ann. Rev.Cell.Dev.Biol., V.12, PP. 575-625, 1996

75. Melnick J., Argon Y. Molecular chaperones and the biosynthesis of antigen receptors. // Immunol Today, V.16, pp.243-250, 1995

76. Melnick J., Dul J.L, Argon Y Sequential interaction of the chaperones BiP and GRP94 with immunoglobulin chains in the endoplasmic reticulum. // Nature, V.370, pp 373-375, 1994

77. Miettinen H.M., Matter W., hunziker J.K. et al// Fc receptor endocytosis is controlled by a cytoplasmic domain determinant that actively prevents coated pit localization // J. Cell. Biol., V. 116, PP. 875888, 1992

78. Moisenovich M, Tonevitsky A, Agapov I, Niwa H, Schewe H, Bereiter-Hahn J. Differences in endocytosis and intracellular sorting of ricin and viscumin in 3T3 cells.// Eur J Cell Biol. V. 81(10), pp. 529538,. 2002.

79. Montfort W., Villifranca J.E., Monzingo A.F., Ernst S., Katzin В., Rutenber E., Xuong N.H., Hamlin R., Robertus J.D. The three-dimensional structure of ricin at 2,8 A. // J. Biol. Chem., v.262, pp.53985403. 1987.

80. Monzingo AF, Robertus JD. X-ray analysis of substrate analogs in the ricin A-chain active site. // J Mol Biol., V. 227(4), pp. 1136-1145, Oct 20, 1992.

81. Mukherjee S., Ghosh R.N., Maxfield F. // Endocytosis // Physiol. Reviews, V. 77, PP 759-803, 1997

82. Munro S, Pelham H.R.B. A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER proteins. // Cell, V.48, pp.899-907, 1987

83. Padmalatha S. Reddy and Ronald B. Corley. Assembly, sorting, and exit of oligomeric proteins from the endoplasmic reticulum // BioEssays, V.20, pp 546-554, 1998.

84. Patel T., Parekh R., Moellering В., Prior С. Different culture methods lead to differences in glycosylation of murine IgG monoclonal antibody. //Biochem. J., v. 285, pp.839-845, 1992.

85. Podder S.K., Surolia A., Bachhawat B.K. On the specificity of carbohydrate-lectin recognition. // Eur. J. Biochem., v.44, pp.151-160. 1974.

86. Rabinovich, E., Bar-Nun, S., Amitay, R., Shachar, I., Gur, В., Taya, M., and Haimovich, J. Different assembly species of IgM are directed to distinct degradation sites along the secretory pathway. // J. Biol. Chem., V.268, pp.24145-24148, 1993

87. Ramalingam T.S., Das P.K., Podder S.K. Ricin-membrane interaction: membrane penetration depth by Fluorescence quenching and resonance energy transfer. // Biochemistry, v. 33, pp. 12247-12254. 1994.

88. Rapak A., Falnes P., Olsnes S. //Retrograde transport of mutant ricin to the endoplasmic reticulum with subsequent translocation to cytosol. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA, V. 94, PP. 3783-3788, 1997

89. Ready MP, Kim Y, Robertus JD. Site-directed mutagenesis of ricin A-chain and implications for the mechanism of action. // Proteins, V. 10(3), pp. 270-278, 1991.

90. Riederer M.A., Soldati Т., Shapiro J., Lin J., Pfeffer S.R. // Lysosome biogenesis requires Rab9 function and receptor recycling from endosomes to the trans-Golgi network. // J. Cell Biol., V. 125, PP. 573582,1994

91. Riederer M.A., Soldati Т., Shapiro J., Lin J., Pfeffer S.R. // Lysosome biogenesis requires Rab9 function and receptor recycling from endosomes to the trans-Golgi network. // J. Cell Biol., V. 125, PP. 573582,1994

92. Roberts L.M. and Lord J.M. The synthesis of Ricinus communisagglutinin. Co-translational and post-translational modification of agglutinin polypeptides. //Eur. J. Biol., v. 119, pp. 31-41. 1981.

93. Roberts L.M., Lamb F.I., Pappin D.J., Lord J.M. The primary sequence of Ricinus communis agglutinin. Comparison with ricin. // J Biol Chem., V. 260(29), 15682-15686, 1985.

94. Robinson M. S. The role of clathrin, adaptors and dynamin in endocytosis. // Current Opinion in Cell Biology, v. 6, pp. 538-544, 1994

95. Robinson M.S. et al // Cloning and expression of y-adaptin, a component of clatrin-coated vesicles associated with Golgi apparatus// J.Cell.Biol, V. Ill, PP. 2319-2326, 1990

96. Rodman J. S., Wandinger-Ness A. // Rab GTPases coordinate endocytosis. // Journal of Cell Science, v. 113, pp. 183-192, 2000

97. Rutenber E., Robertus J.D.// Structure of Ricin B-chain at 2.5 A Resolution. // Proteins, V. 10, PP. 260-269, 1991

98. Sandvig К., Bo van Deurs // Endocytosis, intracellular transport and cytotoxic action of shiga toxin and ricin// Phys. Reviews, V. 76, PP. 949-966, 1996

99. Sandvig K.,.Ryd M., Garred O., et al .//Retrograde transport from the Golgi complex to the ER of both Shiga toxin and nontoxic shiga B-fragment is regulated by butyric acid and cAMP// J. Cell Biol., V. 126, PP. 53-64, 1994

100. Sandvig K.and van Deurs В. Entry of ricin and Shiga toxin into cells: molecular mechanisms and medical perspectives.// The EMBO Jornal, V. 19, № 22, pp. 5943-5950, 2000.

101. Schmid S. L, Damke H. Coated vesicles: a diversity of form and function. // FASEB Journal, v. 9, pp. 1445-1453, 1995

102. Schmid S.L, Carter L.L. // ATP is required for receptor-mediated endocytosis in intact cells// J. Cell Biol, V. 111, PP. 2307-2318, 1990

103. Schweizer A, Stahl P.D, Rohrer J. A di-aromatic motif in the cytosolic tail of the mannose receptor mediates endosomal sorting. // J Biol Chem, V.275(38), pp.29694-29700, 2000

104. Shachar I, Amitay R, Rabinovich E, Haimovich J, Bar-Nun S. Polymerization of secretory IgM in В lymphocytes is prevented by a prior targeting to a degradation pathway. // J Biol Chem, V.267(34), pp.24241-24247, 1992.

105. Shimoda T, Funatsu G. Binding of lactose and galactose to native and iodinated ricin D. // Agr. Biol. Chem, v.49, pp.2125-2130. 1985.

106. Simmons B.M, Stahl P.D, Russel I.H. Mannose receptor-mediated uptake of ricin toxin and ricin A chain by macrophages. Multiple intracellular pathways for A chain translocation. // J. Biol. Chem, v. 261, pp.7912-7920. 1986.

107. Simmons B.M, Stahl P.D, Russel I.H. Mannose receptor-mediated uptake of ricin toxin and ricin A chain by macrophages.

108. Multiple intracellular pathways for A chain translocation. // J. Biol. Chem., v. 261, pp.7912-7920. 1986.

109. Simpson J.C., Dascher C., Roberts L.M. et al //Ricin cytotoxicity is sensitive to recycling between the endoplasmic reticulum and the Golgi complex. // J. Biol. Chem., V. 270, PP. 20078-20083, 1995a

110. Simpson J.C., Lord J.M. and Robers L.M. Point mutations in the hydrophobic C-terminal region of ricin A chain indicate that Pro250 plays a key role in membrane translocation. // Eur. J. Biochem., v.232, pp.458-463. 19956.

111. Simpson J.C., Roberts L.M., Lord J.M. // Free ricin A-chain reaches an early compartment of the secretory pathway before it enters the cytosol// Exp. Cell Res., V. 229, PP. 447-451, 1996

112. Steeves R.M., Denton M.E., Barnard F.C., Henry A., Lambert J. Identification of three oligosacharide binding sites in ricin./ZBiochemistry, v.38, pp.117, 1999.

113. Straley K.S. et al. An atypical sorting determinant in the cytoplasmic domain of P-selectin mediates endosomal sorting. // Mol Biol Cell, V.9(7), pp. 1683-1694, 1998

114. Sweeney E.C, Tonevitsky A.G, Temiakov D.E, Agapov I.I, SawardS, Palmer R.A.Preliminary crystallographic characterization of ricin agglutinin. // Proteins., V. 28(4), pp. 586-589, 1997.

115. Sweeney EC, Tonevitsky AG, Palmer RA, Niwa H, Pfueller U, Eck J, Lentzen H, Agapov II, Kirpichnikov MP., Mistletoe lectin I forms a double trefoil structure. // FEBS Lett., V. 431(3), pp. 367-370, Jul 24, 1998

116. Tahirov Т., Lu Т., Liaw Y., Chen Y., Lin J. Crystal structure of abrin-a at 2,14 A. // J. Mol. Biol., v.250, pp.354-367. 1995.

117. Tahirov TH, Lu TH, Liaw YC, Chu SC, Lin JY. A new crystal form of abrin-a from the seeds of Abrus precatoriusio // J Mol Biol., V. 235(3), pp. 1152-1163. Jan 21, 1994.

118. Thomas P. Hopp and Kenneth R. Woods. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. // PNAS, V.78, pp.3824-3828, 1981.

119. Tonevitsky A., Agapov I., Chelnokova O., Moisenovich M., Marx U. Comparison between the mechanisms of action of plant toxins ricin and viscumin on the stage of intracellular dissociation. Drug Res. 2002, 52(6), 500-505.

120. Tonevitsky A., Shamshiev A., Prokoph'ev S., et al //Hybridoma cell producing antibodies against A-chain of mistletoe lectin I are resistant to this toxin // J.Immun.Lett., V.46, PP. 5-8, 1995 (a).

121. Tregear J., Roberts L. The lectin gene family of Ricinus communis: cloning of a functional ricin gene and three lecten pseudogen. // Plant Mol. Biol., v. 18, pp. 515-525. 1992.

122. Utsumi Т., Aizono Y., Funatsu G. Interaction of ricin and its constituent polypeptides with dipalmitoyl- phosphatidylcholine vesicles. H Bichim. Byophys. Acta., v.772, pp.202-208. 1984.

123. Utsumi Т., Aizono Y., Funatsu G. Receptor-mediated interaction of ricin with the lipid bilayer of ganglioside GM1-liposomes. // FEBS Letters, v.216, pp.99-103. 1987.

124. Van Deurs В., Sandvig K., Petersen O.W. et al // The ways of endocytosis. // Int. Rev. Cytol, V. 117, PP. 131-177, 1989

125. Van Deurs В., Sandvig К., Petersen O.W. et all // Estimation the amount of internalizated ricin that reaches the trans-Golgi network//

126. J.Cell Biol., V.106, PP. 253-267, 1988

127. Van Deurs В., Tounessen T.I., Petersen O.W., Sandvig K., Olsnes S. Routing of internalized ricin and ricin conjugates to the Golgi complex. //J. Cell. Biol., v. 102, pp.37-47. 1986.

128. Venkatesh Y.P., and Lambert J.M., Galactose-induced dimerization of blocked ricin at acidic pH: evidence for a third galactose-binding site in ricin В chain.// Glycobiology, v. 7, № 3, pp. 329-335, 1997

129. Willifranca J.E. and Robertus J.D. Ricin B-chain is a product of gene duplication. // J. Biol. Chem., v. 256, pp.554-556. 1981.

130. Winitz, D., Shachar, I., Elkabetz, Y., Amitay, R., Samuelov, M., and Bar-Nun, S. Degradation of distinct assembly forms of immunoglobulin M occurs in multiple sites in permeabilized В cells. // J. Biol. Chem., V.271, pp.27645-27651, 1996

131. Yelton D.E., Margulies D.H., Diamond В., Sharff M.D. In: Monoclonal antibodies: hybridomas a new dimention in biological analises., Kennet R.H., McKearn T.J. and Bectol K.B. (eds.), Plenium Press, New York, p. 3, 1980.

132. Youle R.J., Colombatti M. Hybridoma cells containing intracellular anti-ricin antibodies show ricin meets secretory antibodybefore entering the cytosol. // J. Biol. Chem, v. 262, pp.4676-4682, 1987.

133. Zhan J, Stayton P, Press O. //Modificatication of ricin A chain, by addition of endoplasmic reticulum (KDEL) or Golgi (YQRL) retention sequences enhances its cytotoxicity and traslocation // Cancer Immunol, Immunother, V. 46, PP 55-60, 1998

134. Малюченко H.B, Гусарова В.Ю, Мойсенович M.M, Егорова С.Г, Агапов И.И, Комолов И.С, Тоневицкий А.Г, Кирпичников М.П. Устойчивость гибридом к растительному токсину вискумину не зависит от аффинности антител. // ДАН, Т. 367(1), стр. 126-9, июль 1999.

135. Малюченко Н.В, Мойсенович М.М, Егорова С.Г, Гусарова В.Ю, Агапов И.И, Пфюллер У, Айфлер Р, Тоневицкий А.Г. // Получение моноклональных антител к различным детерминантам А-субъединицы Mistletoe lectin I. // Биотехнология, № 7-8, стр. 8-18, 1997

136. Малюченко Н.В, Мойсенович М.М, Егорова С.Г. Агапов И.И. Колесанова Е.Ф, Тоневицкий А.Г. // Разворачивание А-субъединицы вискумина в ходе внутриклеточного транспорта токсина. // Молекулярная биология, Т 34(1), 2000

137. Савочкина Ю. А. Диссертационная работа на соискание степени кандидата биологических наук.// Москва 20021. Благодарности