Взаимодействие тиофлавина T с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик красителя тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Сулацкая, Анна Игоревна

• Сулацкая, Анна Игоревна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сулацкая, Анна Игоревна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Научная новизна исследований

Теоретическое и практическое значение работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные представления о фолдинге белков. Амилоидные

фибриллы

1.1.1. Фолдинг белков

1.1.2. Возможные пути возникновения белковых агрегатов

1.1.3. Амилоидные фибриллы in vivo

1.1.4. Амилоидные фибриллы in vitro

1.1.5. Структурный полиморфизм амилоидных фибрилл

1.2. Флуоресцентный зонд тиофлавин Т - структура, фотофизические

свойства, взаимодействие с амилоидными фибриллами

1.2.1.Строение молекулы тиофлавина Т. Результаты квантово-химических расчетов молекулы красителя в основном и возбужденном состояниях

1.2.2. Спектральные свойства тиофлавниа Т в растворителях с

различной полярностью и вязкостью

1.2.3. Природа «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ThT. Модели связывания ThT с амилоидными фибриллами

1.2.4. Определение параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами и спектральных свойств связанного с фибриллами

красителя

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Препараты

2.2. Подготовка образцов

2.3. Измерение спектров поглощения

2.4. Определение истинных спектров поглощения растворов со

значительным светорассеянием

2.5 Измерение спектров флуоресценции

2.6 Регистрация и анализ кривых затухания флуоресценции

2.7 Электронная микроскопия

2.8 Равновесный микродиализ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Спектральные свойства ТИТ и механизм связывания красителя с амилоидными фибриллами

3.1.1.Объяснение существования коротковолновых спектров флуоресценции и возбуждения флуоресценции красителя в водном растворе

3.1.2. Причины возрастания квантового выхода флуоресценции ТЪТ при его встраивании в амилоидные фибриллы Флуоресцентные свойства ТЬТ в растворителях с различной вязкостью и температурой

3.1.3. Модель встраивания ТЬТ в амилоидные фибриллы

3.2. Структурные параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами

и фотофизические характеристики связанного красителя

3.2.1. Методика определения параметров связывания ТІїТ с амилоидными фибриллами

3.2.2. Получение амилоидных фибрилл и их визуализация

3.2.3. Определение спектров поглощения ТЬТ, связанного с амилоидными фибриллами

3.2.4. Определение параметров связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами

3.2.5. Взаимодействие ТЬТ с ацетилхолинэстеразой

3.2.6. Универсальность предложенного подхода и возможность его использования для определения параметров связывания

поглощающих лигандов с рецепторами

3.2.7. Определение коэффициентов молярной экстинкции ТЬТ,

связанного с амилоидными фибриллами

3.2.8. Корректировка зарегистрированной интенсивности

флуоресценции связанного с фибриллами ТЬТ

3.2.9. Определение квантового выхода флуоресценции ТЪТ,

связанного с амилоидными фибриллами

3.3 Протокол определения параметров связывания ТИТ с амилоидными фибриллами и фотофизических характеристик связанного красителя

3.1.1.Определение числа мест связывания (я;) и констант связывания (Кь,) ТЪТ с амилоидными фибриллами

3.1.2.Определение коэффициентов молярной экстинкции ТЪТ,

связанного с фибриллами (еь,)

3.1.3. Определение квантового выхода ТЬТ, связанного с фибриллами

(Яь,)

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Взаимодействие тиофлавина T с амилоидными фибриллами: механизм встраивания, параметры связывания, изменение фотофизических характеристик красителя»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Вопрос о том, как полипептидная цепь глобулярных белков сворачивается в уникальную, компактную, высокоорганизованную, функционально-активную структуру, является одним из центральных вопросов физико-химической и клеточной биологии. Уже давно было замечено, что при сворачивании белков могут возникать частично-свернутые состояния, содержащие элементы структуры, которых нет в нативном белке и возникновение которых определяет склонность белка к образованию агрегатов [1]. Кроме того, необходимо учитывать, что жизненный цикл белка проходит в условиях густонаселенной среды клетки. При этом стимулируются процессы, приводящие к увеличению доступного клеточного объема, в том числе процессы фолдинга и агрегации белков [2,3].

Долгое время процессам агрегации белков при фолдинге не уделялось должного внимания. Ситуация резко изменилась, когда стало очевидным, что возникновение упорядоченных агрегатов - амилоидных фибрилл сопряжено с возникновением многих тяжелых заболеваний, таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, прионные заболевания и др., которые часто называют "конформационными болезнями" [4-10]. Дальнейшие исследования показали, что образование амилоидных фибрилл - свойство, присущее не только тем белкам, фибриллогенез которых связан с возникновением болезней, но и многим другим (если не всем) белкам [11-15]. Оказалось также, что, несмотря на многообразие структур амилоидогенных белков, все амилоидные фибриллы имеют сходную архитектуру: они представляют собой неразветвленные образования, богатые бета-складчатой структурой, в которой антипараллельные бета-листы направлены перпендикулярно оси фибриллы [16,17]. В связи с этим долгое время считалось, что структура амилоидных

фибрилл, полученных на основе разных белков, идентична. Впоследствии, однако, оказалось, что это не совсем так: были обнаружены различия в структуре амилоидных фибрилл на основе различных амилоидогенных белков [18,19] и даже фибрилл, полученных при разных условиях на основе одного и того же белка [20]. Поскольку фибриллярное состояние, обогащенное бета-складчатыми структурами, по-видимому, является одним из основных состояний белковой молекулы, исследование амилоидных фибрилл актуально для решения фундаментальной проблемы фолдинга белков.

Для диагностики возникновения амилоидных фибрилл in vivo и in vitro давно и эффективно используется бензтиазольный краситель тиофлавин Т (ThT) [21-28]. Это обусловлено высокой специфичностью взаимодействия ThT с амилоидными фибриллами. Принято считать, что краситель не взаимодействует с белками в нативном состоянии (за исключением ацетилхолинэстеразы и сывороточных альбуминов), с белками в развернутом и промежуточных частично-свернутых состояниях, а также с аморфными агрегатами белков. При взаимодействии с белками в состоянии амилоидных фибрилл, его квантовый выход флуоресценции возрастает в несколько тысяч раз, в то время как свободный краситель в водном растворе имеет очень низкий квантовый выход флуоресценции. Несмотря на широкое использование ThT в качестве флуоресцентного зонда до сих пор нет единого мнения о механизме встраивания ThT в амилоидные фибриллы и о фотофизических свойствах этого красителя [29,30].

В последнее время стало очевидно, что ThT можно использовать не только для диагностики образования амилоидных фибрилл, но и для изучения их структуры. В связи с этим актуальной задачей является определение параметров связывания ThT с амилоидными фибриллами.

Цель и задачи исследования

Цель работы состояла в исследовании взаимодействия флуоресцентного зонда ТЬТ с амилоидными фибриллами, полученными на основе различных белков. В задачи исследования входило:

1. Изучение спектральных свойств свободного и связанного с амилоидными фибриллами ТЬТ и выяснение причин возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы.

2. Определение механизма встраивания ТЬТ в амилоидные фибриллы.

3. Разработка методики определения параметров связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами (числа центров связывания с различным сродством к ТИТ (мод связывания), констант связывания и числа мест связывания) и фотофизических характеристик красителя, связанного с амилоидными фибриллами (спектров поглощения, коэффициентов молярной экстинкции и квантового выхода флуоресценции).

4. Получение амилоидных фибрилл на основе различных амилоидогенных белков и сравнение их структуры с использованием разработанного подхода.

Основные положения, выносимые на защиту

1. «Коротковолновые» полосы флуоресценции (^^=440 нм) и возбуждения флуоресценции (Атах=340 нм) водных растворов ТЬТ обусловлены тем, что часть молекул имеет конформацию с нарушенной системой я-сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец красителя.

2. Максимум спектра поглощения ТЬТ, встроенного в амилоидные фибриллы, сдвинут относительно максимума спектра поглощения свободного ТЬТ в водном растворе (^^=412 нм) в длинноволновую область, в то время как максимумы спектров флуоресценции свободного и связанного с фибриллами красителя близки (А^^^БО нм).

3. Значение квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы определяется не только подвижностью фрагментов молекулы ТЬТ (бензтиазольного и аминобензольного колец) друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и конформацией молекул красителя в основном состоянии.

4. Существующие предположения об образовании димеров или мицелл молекулами ТЬТ в водном растворе и при встраивании в амилоидные фибриллы не обоснованы. ТЬТ встраивается в амилоидные фибриллы в мономерной форме.

5. Метод, основанный на абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с использованием равновесного микродиализа, позволяет определить параметры связывания ТЪТ с амилоидными фибриллами, а также фотофизические характеристики связанного красителя. Предложенный подход может быть использован для сравнительного изучения структуры амилоидных фибрилл.

Научная новизна исследований

Результаты исследования позволили по-новому взглянуть на фотофизические свойства свободного и связанного с амилоидными фибриллами ТЬТ. Дано новое объяснение существованию «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ТЬТ в водных растворах. Сделано заключение о том, что эти аномальные полосы обусловлены наличием в растворе молекул ТЬТ с нарушенной системой я-сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец. Измерение интенсивности флуоресценции ТЬТ в водно-глицериновых смесях позволило пересмотреть существующие представления о причинах возрастания квантового выхода флуоресценции красителя при его встраивании в амилоидные фибриллы. Впервые показано, что значение квантового выхода флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные

фибриллы обусловлено не только подвижностью бензтиазольного и аминобензольного колец молекулы ТЬТ друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и ее конформацией в основном состоянии. Были проанализированы существующие гипотезы о механизме встраивания ТЬТ в амилоидные фибриллы и сделано заключение о том, что краситель встраивается в фибриллы в мономерной форме, а предположения об образовании им димеров и мицелл не обоснованы.

Впервые для определения параметров связывания ТИТ с амилоидными фибриллами использован метод, основанный на прямом спектрофотометрическом определении концентрации свободного и связанного с фибриллами красителя в растворах, полученных методом равновесного микродиализа. Этот подход позволяет также определять спектры поглощения, коэффициенты молярной экстинкции и квантовый выход флуоресценции ТЬТ (при измерении интенсивности флуоресценции тех же растворов), взаимодействующего с сайтами каждой из мод связывания.

Показано что, параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида и характеристики встроенного в них красителя существенно различаются. Подход, разработанный в настоящей работе, может быть использован для изучения полиморфизма амилоидных фибрилл и сравнительного изучения структуры амилоидных фибрилл, полученных на основе различных белков.

Теоретическое и практическое значение

В связи с эффективным применением ТЬТ в качестве флуоресцентного зонда и перспективами его использования для изучения структуры амилоидных фибрилл, а его аналогов - в качестве терапевтических агентов, выяснение специфических особенностей этого красителя и формирование

представлений о его фотофизических свойствах имеет существенное теоретическое и практическое значение.

Разработка специальной методики, позволяющей получать информацию о параметрах связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами, а также о спектральных свойствах и квантовом выходе флуоресценции связанного красителя, является важным шагом на пути изучения структуры амилоидных фибрилл, что, в свою очередь, может дать важнейшую информацию для выяснения факторов, способствующих фибриллообразованию, и о механизмах этого процесса. Таким образом, результаты проведенной работы могут быть существенны для понимания фундаментальных основ фолдинга и агрегации (нарушения фолдинга) белков.

Проведенные исследования имеют существенное прикладное значение в виду широкого распространения заболеваний, вызванных или сопровождающихся образованием амилоидных фибрилл. Показано, что образованием амилоидных бляшек сопровождаются все нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера, Паркинсона, Гентингтона, Пика. Известны также амилоидозы, которые не связаны напрямую с основным заболеванием, а являются осложнениями лечебных мероприятий. К этому виду патологии можно отнести инсулиновый амилоидоз и так называемый гемодиализный амилоидоз, которые приводят к существенному снижению качества жизни больных. Изучение взаимодействия флуоресцентных красителей с амилоидными фибриллами может рассматриваться как перспективный подход для создания биосенсорных систем для ранней диагностики заболеваний, сопровождаемых различного рода амилоидозами.

Поскольку разработанный нами подход к исследованию взаимодействия ТЬТ с амилоидными фибриллами универсален, он может быть востребован в молекулярной фармакологии при определении параметров связывания белков с активными веществами (лигандами), в том числе с лекарствами. В

частности, чрезвычайно важно правильное определение константы связывания красителей, способных преодолевать гематоэнцефалический барьер. Кроме того, результаты работы могут быть использованы для анализа взаимодействия амилоидных фибрилл с химическими веществами (в том числе нефлуоресцирующими), которые способны подавлять процесс образования амилоидных фибрилл.

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов 4 курса Кафедры биофизики СПбГПУ.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Сулацкая, Анна Игоревна

выводы

1. На основании измерения спектров поглощения и спектров возбуждения флуоресценции свободного и связанного с амилоидными фибриллами ТЬТ, с учетом результатов квантово-химических расчетов молекулы красителя, сделан вывод о том, что существование «коротковолновых» полос флуоресценции и возбуждения флуоресценции ТЬТ в водных растворах обусловлено наличием в растворе молекул ТЬТ с нарушенной системой л-сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец.

2. На основании измерения зависимости квантового выхода флуоресценции ТЬТ от температуры и вязкости растворителя сделано заключение о том, что квантовый выход флуоресценции красителя при встраивании в амилоидные фибриллы определяется не только подвижностью фрагментов молекулы ТЬТ друг относительно друга в возбужденном состоянии, но и конформацией молекул красителя в основном состоянии.

3. Показано, что существующие предположения об образовании димеров или мицелл молекулами ТЬТ в водном растворе и при встраивании в амилоидные фибриллы не обоснованы. ТЬТ встраивается в амилоидные фибриллы в мономерной форме.

4. Показано, что метод, основанный на абсорбционной спектрофотометрии растворов, полученных с использованием равновесного микродиализа, позволяет определять параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами, а также фотофизические характеристики связанного красителя. Предложенный подход может быть использован для изучения структуры амилоидных фибрилл.

5. Параметры связывания ТЬТ с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима и Абета-пептида, а также фотофизические характеристики связанного с фибриллами красителя, существенно различаются, что свидетельствует о различии их структуры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последнее десятилетие изучение амилоидных фибрилл превратилось в активно развивающееся научное направление, объединяющее усилия исследователей различных областей знания. Это объясняется, по крайней мере, тремя факторами. Во-первых, в связи с увеличением продолжительности жизни, болезни, которые раньше считались редкими, в развитых странах приобретают размах эпидемий, и государства тратят огромные средства на лечение и содержание больных. Во-вторых, изучение амилоидных фибрилл заставило исследователей по-новому взглянуть на проблему фолдинга белков. Оказалось, что глобальный минимум энергии отвечает белку в состоянии амилоидных фибрилл, а не нативному состоянию, как считалось ранее. Это означает, что в клетке существуют специальные механизмы, предотвращающие переход белков в состояние амилоидных фибрилл. Наконец, исследования последних лет все чаще показывают, что образование амилоидных фибрилл не всегда связано с патологией. Амилоидные фибриллы могут играть в клетке положительную функциональную роль, в частности, участвовать в защитных механизмах клетки. Кроме того их можно рассматривать в перспективе в качестве новых сверхпрочных материалов.

По данным РиЬМеё к настоящему времени в мире опубликовано более 50 тысяч работ, посвященных этой проблеме. Появляются сборники, обобщающие накопленный экспериментальный материал [68]. Для изучения структуры и механизмов образования амилоидных фибрилл исследователи стараются привлечь разнообразные подходы: электронную микроскопию, рентгеноструктурный анализ, малоугловое рентгеновское рассеяние, ядерный магнитный резонанс, математическое моделирование.

Многие исследователи, для характеристики амилоидных фибрилл пытались использовать интенсивность флуоресценции бензтиазольного красителя тиофлавина Т (ТЪТ), который специфически взаимодействует с этими упорядоченными белковыми агрегатами. В частности, несколько десятков работ посвящено определению параметров связывания красителя с амилоидными фибриллами на основании измерения интенсивности флуоресценции от концентрации красителя. В результате проведенных в представленной диссертационной работе исследований мы сделали очень существенный, хотя и несколько неожиданный, вывод о том, что этот широко используемый подход для определения параметров связывания ТИТ с амилоидными фибриллами, может быть использован только при корректном учете эффекта внутреннего фильтра (существование которого в большинстве работ вообще не учитывалось) и то, только в случае существования одной моды связывания.

Для исследования взаимодействия ТИТ с амилоидными фибриллами нами был предложен новый спектрофотометрический подход, основанный на подготовке раствора образца и раствора сравнения методом равновесного микродиализа. Этот подход позволил получить новые данные о сайтах связывания ТИТ с амилоидными фибриллами на основе инсулина, лизоцима, Абета-пептида, а также впервые определить спектральные характеристики красителя, связанного с фибриллами - их спектры поглощения, коэффициенты молярной экстинкции и квантовые выходы флуоресценции. Предложенный подход также может быть использован для определения параметров связывания амилоидных фибрилл с производными и аналогами ТЬТ, способными преодолевать гематоэнцефалический барьер и, возможно, даже ингибировать или ускорять рост амилоидных фибрилл.

Показано, что разработанный подход универсален и может быть использован не только для исследования взаимодействия ТЬТ и его аналогов с амилоидными фибриллами, но и для других белковых рецепторов с их лигандами. В частности, применимость подхода продемонстрирована при исследовании взаимодействия ТЬТ с активным центром ацетилхолинэстеразы и флуоресцентного красителя АНС с сывороточными альбуминами.

Предложенный подход может также найти применение при широком скрининге взаимодействия разрабатываемых лекарственных средств с белковыми рецепторами - потенциальными мишенями лекарств, которыми могут быть не только амилоидные фибриллы, но также глобулярные или внутренне неупорядоченные (частично или полностью) функционально-значимые белки, нарушение взаимодействия которых с их естественными партнерами может являться причиной заболеваний, в том числе амилоидозов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сулацкая, Анна Игоревна, 2013 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Jahn TR, Radford SE (2005) The Yin and Yang of protein folding. FEBS J 272: 5962-5970.

2. Чеботарева НА, Курганов БИ, Ливанова НБ (2004) Биохимические эффекты молекулярного краудинга. Биохимия 69: 1522-1536.

3. Чеботарева НА (2006) Взаимодействия ферментов гликогенеза в условиях молекулярного краудинга. Автореферат диссертации.

4. Harper JD, Lieber CM, Lansbury PT, Jr. (1997) Atomic force microscopic imaging of seeded fibril formation and fibril branching by the Alzheimer's disease amyloid-beta protein. Chem Biol 4: 951-959.

5. Kelly JW (1997) Amyloid fibril formation and protein misassembly: a structural quest for insights into amyloid and prion diseases. Structure 5: 595-600.

6. Carrell RW, Gooptu В (1998) Conformational changes and disease-serpins, prions and Alzheimer's. Curr Opin Struct Biol 8: 799-809.

7. Hashimoto M, Masliah E (1999) Alpha-synuclein in Lewy body disease and Alzheimer's disease. Brain Pathol 9: 707-720.

8. Koo EH, Lansbury PT, Jr., Kelly JW (1999) Amyloid diseases: abnormal protein aggregation in neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 9989-9990.

9. Uversky VN, Talapatra A, Gillespie JR, Fink AL (1999) Protein deposits as the molecular basis of amyloidosis. II. Localized amyloidosis and neurodegenerative disorders. Med Sci Monitor 5: 1238-1254.

10. Uversky VN, Talapatra A, Gillespie JR, Fink AL (1999) Protein deposits as the molecular basis of amyloidosis. Part I. Systemic amyloidoses. Med Sci Monitor 5: 10011012.

11. Dobson CM (1999) Protein misfolding, evolution and disease. Trends Biochem Sci 24: 329-332.

12. Uversky VN, Fink AL (2004) Conformational constraints for amyloid fibrillation: the importance of being unfolded. Biochim Biophys Acta 1698: 131-153.

13. Chiti F, Dobson CM (2006) Protein misfolding, functional amyloid, and human disease. Annu Rev Biochem 75: 333-366.

14. Fandrich M, Fletcher MA, Dobson CM (2001) Amyloid fibrils from muscle myoglobin. Nature 410: 165-166.

15. Pertinhez TA, Bouchard M, Tomlinson EJ, Wain R, Ferguson S J, et al. (2001) Amyloid fibril formation by a helical cytochrome. FEBS Lett 495: 184-186.

16. Dobson CM (2003) Protein folding and misfolding. Nature 426: 884-890.

17. Dobson CM (2004) Experimental investigation of protein folding and misfolding. Methods 34: 4-14.

18. Makin OS, Serpell LC (2005) Structures for amyloid fibrils. FEBS J 272: 59505961.

19. Nielsen L, Khurana R, Coats A, Frokjaer S, Brange J, et al. (2001) Effect of environmental factors on the kinetics of insulin fibril formation: elucidation of the molecular mechanism. Biochemistry 40: 6036-6046.

20. Kodali R, Williams AD, Chemuru S, Wetzel R (2010) Abeta(l-40) forms five distinct amyloid structures whose beta-sheet contents and fibril stabilities are correlated. J Mol Biol 401: 503-517.

21. Naiki H, Higuchi K, Matsushima K, Shimada A, Chen WH, et al. (1990) Fluorometric examination of tissue amyloid fibrils in murine senile amyloidosis: use of the fluorescent indicator, thioflavine T. Lab Invest 62: 768-773.

22. Naiki H, Yamamoto S, Hasegawa K, Yamaguchi I, Goto Y, et al. (2005) Molecular interactions in the formation and deposition of beta2-microglobulin-related amyloid fibrils. Amyloid 12: 15-25.

23. LeVine H, 3rd (1993) Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease beta-amyloid peptides: detection of amyloid aggregation in solution. Protein Sci 2: 404-410.

24. Levine H, 3rd (1995) Soluble multimeric Alzheimer beta(l-40) pre-amyloid complexes in dilute solution. Neurobiol Aging 16: 755-764.

25. LeVine H, 3rd (1997) Stopped-flow kinetics reveal multiple phases of thioflavin T binding to Alzheimer beta (1-40) amyloid fibrils. Arch Biochem Biophys 342: 306316.

26. LeVine H, 3rd (1999) Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol 309: 274-284.

27. Yoshiike Y, Chui DH, Akagi T, Tanaka N, Takashima A (2003) Specific compositions of amyloid-beta peptides as the determinant of toxic beta-aggregation. J Biol Chem 278: 23648-23655.

28. Allsop D, Swanson L, Moore S, Davies Y, York A, et al. (2001) Fluorescence anisotropy: a method for early detection of Alzheimer beta-peptide (Abeta) aggregation. Biochem Biophys Res Commun 285: 58-63.

29. Schirra R (1985) Dye aggregation in freezing aqueous solutions. Chem Phys Letters 119: 229-238.

30. Khurana R, Coleman C, Ionescu-Zanetti C, Carter SA, Krishna V, et al. (2005) Mechanism of thioflavin T binding to amyloid fibrils. J Struct Biol 151: 229-238.

31. Kim PS, Baldwin RL (1990) Intermediates in the folding reactions of small proteins. Annu Rev Biochem 59: 631-660.

32. Ptitsyn OB (1995) Molten globule and protein folding. Adv Protein Chem 47: 83-229.

33. Bilsel O, Matthews CR (2000) Barriers in protein folding reactions. Adv Protein Chem 53: 153-207.

34. Dinner AR, Sali A, Smith LJ, Dobson CM, Karplus M (2000) Understanding protein folding via free-energy surfaces from theory and experiment. Trends Biochem Sci 25: 331-339.

35. Jaenicke R, Lilie H (2000) Folding and association of oligomeric and multimeric proteins. Adv Protein Chem 53: 329-401.

36. Radford SE (2000) Protein folding: progress made and promises ahead. Trends Biochem Sci 25: 611-618.

37. Grantcharova V, Aim EJ, Baker D, Horwich AL (2001) Mechanisms of protein folding. Curr Opin Struct Biol 11: 70-82.

38. Plotkin SS, Onuchic JN (2002) Understanding protein folding with energy landscape theory. Part I: Basic concepts. Q Rev Biophys 35:111-167.

39. Fersht A (1998) Structure and mechanism in protein science: a guide to enzyme catalysis and protein folding. WH Freeman and Company, NY: 631.

40. Финкельштейн AB, Птицын ОБ (2005) Физика белка. М: КДУ: 456 с.

41. Kendrew JC, Watson HC, Strandberg BE, Dickerson RE, Phillips DC, et al. (1961) The amino-acid sequence x-ray methods, and its correlation with chemical data. Nature 190: 666-670.

42. Perutz MF (1963) X-ray analysis of hemoglobin. Science 140: 863-869.

43. Berman H, Henrick K, Nakamura H (2003) Announcing the worldwide Protein Data Bank. Nat Struct Biol 10: 980.

44. Uversky VN, Oldfield CJ, Dunker AK (2005) Showing your ID: intrinsic disorder as an ID for recognition, regulation and cell signaling. J Mol Recognit 18: 343384.

45. Dunker AK, Cortese MS, Romero P, Iakoucheva LM, Uversky VN (2005) Flexible nets. The roles of intrinsic disorder in protein interaction networks. FEBS J 272: 5129-5148.

46. Ohgushi M, Wada A (1983) 'Molten-globule state': a compact form of globular proteins with mobile side-chains. FEBS Lett 164: 21-24.

47. Dolgikh DA, Gilmanshin RI, Brazhnikov EV, Bychkova VE, Semisotnov GV, et al. (1981) Alpha-Lactalbumin: compact state with fluctuating tertiary structure? FEBS Lett 136: 311-315.

48. Dobson CM (1992) Unfolded proteins, compact states and molten globules. CurrOpinStructBiol 2: 6-12.

49. Uversky VN (1993) Use of fast protein size-exclusion liquid chromatography to study the unfolding of proteins which denature through the molten globule. Biochemistry 32: 13288-13298.

50. Uversky VN, Winter S, Lober G (1996) Use of fluorescence decay times of 8-ANS-protein complexes to study the conformational transitions in proteins which unfold through the molten globule state. Biophys Chem 60: 79-88.

51. Li J, Shinjo M, Matsumura Y, Morita M, Baker D, et al. (2007) An alpha-helical burst in the src SH3 folding pathway. Biochemistry 46: 5072-5082.

52. Pande VS, Grosberg A, Tanaka T, Rokhsar DS (1998) Pathways for protein folding: is a new view needed? Curr Opin Struct Biol 8: 68-79.

53. Zahn R (1999) Prion propagation and molecular chaperones. Q Rev Biophys 32: 309-370.

54. Goldschmidt L, Teng PK, Riek R, Eisenberg D (2010) Identifying the amylome, proteins capable of forming amyloid-like fibrils. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 34873492.

55. Balbirnie M, Grothe R, Eisenberg DS (2001) An amyloid-forming peptide from the yeast prion Sup35 reveals a dehydrated beta-sheet structure for amyloid. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 2375-2380.

56. Nelson R, Sawaya MR, Balbirnie M, Madsen AO, Riekel C, et al. (2005) Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils. Nature 435: 773-778.

57. Maji SK, Perrin MH, Sawaya MR, Jessberger S, Vadodaria K, et al. (2009) Functional amyloids as natural storage of peptide hormones in pituitary secretory granules. Science 325: 328-332.

58. Murray AN, Solomon JP, Wang YJ, Balch WE, Kelly JW (2010) Discovery and characterization of a mammalian amyloid disaggregation activity. Protein Sci 19: 836846.

59. Zimmerman SB, Minton AP (1993) Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct 22: 2765.

60. Ellis RJ, Hartl FU (1999) Principles of protein folding in the cellular environment. Curr Opin Struct Biol 9: 102-110.

61. Netzer WJ, Hartl FU (1998) Protein folding in the cytosol: chaperonin-dependent and -independent mechanisms. Trends Biochem Sci 23: 68-73.

62. Hartl FU, Martin J (1995) Molecular chaperones in cellular protein folding. Curr Opin Struct Biol 5: 92-102.

63. Gilbert HF (1994) Protein chaperones and protein folding. Curr Opin Biotechnol 5: 534-539.

64. Csermely P, Schnaider T, Soti C, Prohaszka Z, Nardai G (1998) The 90-kDa molecular chaperone family: structure, function, and clinical applications. A comprehensive review. Pharmacol Ther 79: 129-168.

65. Schmid FX (2002) Prolyl isomerases. Adv ProteinChem 59: 243-282.

66. Bader MV, Bardwell JCA (2002) Catalysis of disulfide bond formation and isomerization in Escherichia coli. Adv Protein Chem 59: 283-301.

67. Chen J, Walter S, Horwich AL, Smith DL (2001) Folding of malate dehydrogenase inside the GroEL-GroES cavity. Nat Struct Biol 8: 721-728.

68. Otzen D (2013) Amyloid Fibrils and Prefibrillar Aggregates: Wiley-VCH. 481

P-

69. King CY, Tittmann P, Gross H, Gebert R, Aebi M, et al. (1997) Prion-inducing domain 2-114 of yeast Sup35 protein transforms in vitro into amyloid-like filaments. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 6618-6622.

70. Jahn TR, Tennent GA, Radford SE (2008) A common beta-sheet architecture underlies in vitro and in vivo beta2-microglobulin amyloid fibrils. J Biol Chem 283: 17279-17286.

71. Wetzel R (1994) Mutations and off-pathway aggregation of proteins. Trends Biotechnol 12: 193-198.

72. Speed MA, Wang DI, King J (1996) Specific aggregation of partially folded polypeptide chains: the molecular basis of inclusion body composition. Nat Biotechnol 14: 1283-1287.

73. Fink AL (1998) Protein aggregation: folding aggregates, inclusion bodies and amyloid. Fold Des 3: R9-23.

74. Cohen FE, Kelly JW (2003) Therapeutic approaches to protein-misfolding diseases. Nature 426: 905-909.

75. Stefani M, Dobson CM (2003) Protein aggregation and aggregate toxicity: new insights into protein folding, misfolding diseases and biological evolution. J Мої Med (Berl) 81: 678-699.

76. Гусев НБ (2004) Нейродегенеративные болезни и проблема правильного сворачивания белка. СОЖ 8: 15-23.

77. Carrio М, Gonzalez-Montalban N, Vera A, Villaverde A, Ventura S (2005) Amyloid-like properties of bacterial inclusion bodies. J Мої Biol 347: 1025-1037.

78. Conchillo-Sole O, de Groot NS, Aviles FX, Vendrell J, Daura X, et al. (2007) AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of "hot spots" of aggregation in polypeptides. BMC Bioinformatics 8: 65.

79. Dumoulin M, Dobson CM (2004) Probing the origins, diagnosis and treatment of amyloid diseases using antibodies. Biochimie 86: 589-600.

80. Naiki H, Higuchi K, Hosokawa M, Takeda T (1989) Fluorometric determination of amyloid fibrils in vitro using the fluorescent dye, thioflavin Tl. Anal Biochem 177: 244-249.

81. Turoverov KK, Kuznetsova IM, Maskevich AA, Stepuro VI, Kuzmitsky VA, et al. (2007) Tht as an instrument for testing and investigation of amyloid and amyloid-like fibrils. Proc ofSPIE 6733.

82. Maskevich AA, Stsiapura VI, Kuzmitsky VA, Kuznetsova IM, Povarova OI, et al. (2007) Spectral properties of thioflavin T in solvents with different dielectric properties and in a fibril-incorporated form. J Proteome Res 6: 1392-1401.

83. Stsiapura VI, Maskevich AA, Kuzmitsky VA, Uversky VN, Kuznetsova IM, et al. (2008) Thioflavin T as a molecular rotor: fluorescent properties of thioflavin T in solvents with different viscosity. J Phys Chem B 112: 15893-15902.

84. Groenning M (2009) Binding mode of Thioflavin T and other molecular probes in the context of amyloid fibrils-current status. J Chem Biol: DOI 10.1007/sl2154-12009-10027-12155.

85. Lakowicz JR (2006) Principles of fluorescence spectroscopy. Springer, New York.

86. Gu Q, Kenny JE (2009) Improvement of inner filter effect correction based on determination of effective geometric parameters using a conventional fluorimeter. Anal Chem 81: 420-426.

87. Birdsall B, King RW, Wheeler MR, Lewis CA, Jr., Goode SR, et al. (1983) Correction for light absorption in fluorescence studies of protein-ligand interactions. Anal Biochem 132: 353-361.

88. Parker CA, Barnes WJ (1957) Some experiments with spectrofluorimeters and filter fluorimeters. Analyst 82: 606-618.

89. Goers J, Permyakov SE, Permyakov EA, Uversky VN, Fink AL (2002) Conformational prerequisites for alpha-lactalbumin fibrillation. Biochemistry 41: 1254612551.

90. Vernaglia BA, Huang J, Clark ED (2004) Guanidine hydrochloride can induce amyloid fibril formation from hen egg-white lysozyme. Biomacromolecules 5: 13621370.

91. Kayed R, Head E, Sarsoza F, Saing T, Cotman CW, et al. (2007) Fibril specific, conformation dependent antibodies recognize a generic epitope common to amyloid fibrils and fibrillar oligomers that is absent in prefibrillar oligomers. Мої Neurodegener 2: 18.

92. De Ferrari GV, Mallender WD, Inestrosa NC, Rosenberry TL (2001) Thioflavin T is a fluorescent probe of the acetylcholinesterase peripheral site that reveals conformational interactions between the peripheral and acylation sites. J Biol Chem 276: 23282-23287.

93. Владимиров ЮА, Литвин ФФ (1964) Фотобиология и спектральные методы исследования. Москва: Издательство "Высшая школа".

94. Turoverov КК, Biktashev AG, Dorofeiuk AV, Kuznetsova IM (1998) [A complex of apparatus and programs for the measurement of spectral, polarization and kinetic characteristics of fluorescence in solution], Tsitologiia 40: 806-817.

95. Marquardt DW (1963) An algorithm for least-squares estimation of non linear parameters. J Soc Ind Appl Math 11: 431-441.

96. Миронов AA, Комиссарчик ЯЮ, Миронов В A (1994) Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб, Наука: 400 с.

97. Сулацкая АИ, Кузнецова ИМ (2010) Взаимодействие тиофлавина Т с амилоидными фибриллами как инструмент для изучения их структуры. Цитология 52: 955-959.

98. Сулацкая АИ, Кузнецова ИМ, Туроверов КК (2011) Использование флуоресцентного красителя тиофлавина Т для изучения структуры амилоидных фибрилл. Вестник Санкт-Петербургского университета 4: 152-160.

99. Сулацкая АИ (2011) Взаимодействие флуоресцентного красителя тиофлавина Т с амилоидными фибриллами. Научно-технические ведомости СПбГПУ 3: 123-127.

100. Sulatskaya AI, Maskevich AA, Kuznetsova IM, Uversky VN, Turoverov KK (2010) Fluorescence quantum yield of thioflavin T in rigid isotropic solution and incorporated into the amyloid fibrils. PLoS One 5: ЄІ5385.

101. Sulatskaya AI, Turoverov KK, Kuznetsova IM (2010) Spectral properties and factors determining high quantum yield of thioflavin T incorporated in amyloid fibrils. Spectroscopy 24: 169-171.

102. Loutfy RO, Arnold BA (1982) Effect of viscosity and temperature on torsional relaxation of molecular rotors. J Phys Chem 86: 4205-4211.

103. Singh PK, Kumbhakar M, Pal H, Nath S (2009) Ultrafast torsional dynamics of protein binding dye thioflavin-T in nanoconfined water pool. J Phys Chem B 113: 85328538.

104. Krebs MR, Bromley EH, Donald AM (2005) The binding of thioflavin-T to amyloid fibrils: localisation and implications. J Struct Biol 149: 30-37.

105. Sulatskaya AI, Kuznetsova IM, Turoverov KK (2011) Interaction of thioflavin T with amyloid fibrils: stoichiometry and affinity of dye binding, absorption spectra of bound dye. J Phys ChemB 115: 11519-11524.

106. Kuznetsova IM, Sulatskaya AI, Uversky VN, Turoverov KK (2012) A new trend in the experimental methodology for the analysis of the thioflavin T binding to amyloid fibrils. Mol Neurobiol. Springer protocols 45: 488-498.

107. Kuznetsova IM, Sulatskaya AI, Uversky VN, Turoverov KK (2012) Analyzing thioflavin T binding to amyloid fibrils by an equilibrium microdialysis-based technique. PLoS One 7: e30724.

108. Kuznetsova IM, Sulatskaya AI, Povarova OI, Turoverov KK (2012) Réévaluation of ANS binding to human and bovine serum albumins: key role of equilibrium microdialysis in ligand - receptor binding characterization. PLoS One 7: e40845.

109. Sulatskaya AI, Povarova OI, Kuznetsova IM, Uversky VN, Turoverov KK (2012) Binding stoichiometry and affinity of fluorescent dyes to proteins in different structural states. Methods Mol Biol 895: 441-460.

110. Togashi DM, Ryder AG (2008) A fluorescence analysis of ANS bound to bovine serum albumin: binding properties revisited by using energy transfer. J Fluoresc 18: 519-526.

111. Konkoli Z (2011) Safe uses of Hill's model: an exact comparison with the Adair-Klotz model. Theor Biol Med Model 8: 10.

112. Parker CA, Rees WT (1960) Correction of fluorescence spectra and measurement of fluorescence quantum efficiency. Analyst 85: 587-600.

113. Kubista M, Sjöback R, Eriksson S, Albinsson B (1994) Experimental Correction for the Inner-Filter Effect in Fluorescence-Spectra. Analyst 119: 417-419.

114. Sulatskaya AI, Kuznetsova IM, Turoverov KK (2012) Interaction of thioflavin T with amyloid fibrils: fluorescence quantum yield of bound dye. J Phys Chem B 116: 2538-2544.