Антигенные свойства инфекционных и термоинактивированных препаратов вакцинных штаммов вируса болезни Марека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Бобровская, Ирина Владимировна

• Бобровская, Ирина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Бобровская, Ирина Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1. ВИРУС БОЛЕЗНИ МАРЕКА.

1Л .1. Классификация ВБМ.

1.1.2. Биологические характеристики ВБМ, ВГК и ВГИ.

1.1.3. Морфология и морфогенез.

1.1.4. Патогенез и типы взаимодействия вируса с клеткой.

1.2. ВИРУСНЫЕ БЕЛКИ И АНТИГЕНЫ.

1.2.1. Основные антигены ВБМ и ВГИ.

1.2.2. Другие белковые комплексы, кодирующие ВБМ и ВГИ.

1.3. ВАКЦИНОНРОФИЛАКТИКА БОЛЕЗНИ МАРЕКА.

1.3Л. Вакцины на основе штаммов серотипа 1.

1.3.2. Вакцины на основе штаммов серотипа 2.

1.3.3. Вакцины на основе штаммов серотипа 3.

1.3.4. Поливалентные вакцины.

1.3.5. Рекомбинантные вакцины.

1.4. СПОСОБЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИГЕННОЙ И ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВБМ, ВГК И ВГИ.

1.4.1. Серологические методы.

1.4.2. Применение ИФА для идентификации антигенов ВБМ, В) К и ВГИ и антител к ним.

1.5. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

ПЦР) ДЛЯ ТИПИРОВАНИЯ ВБМ.

1.6.3 АКЛЮЧЕНИЕ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3 Л. СИНТЕЗ ИММУНОГШРОКСИДАЗНОГО КОНЪЮГАТА.

ЗЛЛ. Выделение, очистка и концентрирование из жел тков яиц

3.1.2. Исследование в РДГ1 и в ИФА антисывороток к ^О кур, полученных на баранах и кроликах.

ЗЛ.З. Выделение из гипериммунных сывороток баранов и кроликов специфических антивидовых антител к желткам кур методом аффинной хроматографии.

ЗЛЛ. Конъюгация бараньих и кроличьих анти-

§0 антител кур с пероксидазой и подбор их рабочих разведений.

3.2. ИЗУЧЕНИЕ ФРАКЦИОННОГО И МОРФОЛОГИЧЕСКО! О СОСТАВА БЕСКЛЕТОЧНОГО ВГИ (ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ СЕРИИ СУХОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БМ НА ОСНОВЕ ШТАММА БС-Ш).'.

3.3. ПОЛУЧЕНИЕ АНТИГ ЕНОВ ВБМ, РАЗЛИЧАЮЩИЕСЯ ПО ПЕРЕКРЕСТНОЙ СЕРОТИПИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ (ТЕРМОДЕНАТУРАЦИЯ).

3.3.1. Влияние термоденатурации на антигенную активность препаратов на основе ВГИ.

3.3.2. Изучение антигенных свойств препаратов на основе вируса герпеса кур (ВГК).

3.4. ПРИМЕНЕНИЕ ПОЛИ- И МОНОКЛОНАЛЬНЫХ ЛИШИЛ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СТРУКТУРНЫХ БЕЛКОВ БОЛЕЗНИ МАРЕКА.

3.5. ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЬЮТЕРНОЙ ПРОГРАММЫ ДЛЯ О! I-РЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ВИРУСА В ВАКЦИНЕ ПРОТИВ БМ

Cl 1ИСОК СОК РА ЩК11 НИ

ЛГ - антиген

ACJI - антиген сенсибилизирующие лимфоциты

AT - антитело

БМ - болезнь Марека

ВБМ •- ни рус болен ш Марека

ВВА - нирусный внутренний антиген вВБМ - вирулентный ВБМ ввВБМ ( ОВВБМ ) - высоковирулентный (особовирулентпый) ВБМ ввВЬМ I - ВБМ с наиболее высокой вирулентностью

В1И - ВБМ 3 серотипа

В ПС - ВБМ 2 серотипа

BMA - вирусный мембранный антиген

ВОЗ - Всемирная Организация Здравоохранения

ГКГ - главный комплекс гистосовместимости

Д- дальтоп, кД- килодальтон (1000 дальгон)

ДМСО - диметилсульфоксид

Д1IK - дсзоксирпбопуклеиповая кислота

ДС11 - додецилсульфат натрия

ИФ - нммуно(|)люоресцеицпя

ИФА - пммуноферментный анализ

ICIC - культура клеток

KICK'") - культура клеток куриных эмбрионов КК1Г) - культура клеток перепелиных эмбрионов ЮСУ') - культура клеток утиных эмбрионов 1СРС - крупный рогатый скот МАТ - мопоклопапьпые антитела Ol 1 - оп тическая плотность

OPC c)i крытая рамка считывания

ПЛАТ полиакриламидный гель п.и. - пары нуклеотидов

ПХ - пероксидаза хрена

I НДР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ-6000 - полиэтиленгликоль с мол.массой 6000 Д

РГ 3 Г - реакция гиперчувствительности замедленного типа

РДП - реакция диффузионной преципитации

PI IPC) - реакция непрямого розеткообразования

РЭА - рестрикционный эндонуклеазный анализ см1 - кубический сантиметр

СФГЛ - сахарозо-альбуминовая среда

ТИА - тонкослойный иммунный анализ

УЗ - ультразвук

ФИ ГЦ - флюоресцнп изотиоциоиат

ХАО - хорион аллаптоиеная оболочка

ЦПД - цнтопатическое действие

ЭПФ - >iiuгелий перьевых фолликул

1а - связанный с 1-областыо ан тиген

IgG - иммуноглобулин класса G g- гликонротеин с большой молекулярной массой gp - гликонротеин с низкой молекулярной массой рр - фосфопротеии iFPV-gß - рекомбипаптный вирус оспы, экспрессирующип gIJ-ген HUM

RZ - показа тель чистоты (от нем. Reinheil-Zahl)

SPP - свободный от специфических патогенных возбудителей

Ui - большая уникальная область

Us - малая уникальная область

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Антигенные свойства инфекционных и термоинактивированных препаратов вакцинных штаммов вируса болезни Марека»

Актуальность проблемы. Вирус болезни Марека (ВБМ) - высоко патогенный i ерпесвирус, который может вызывать: 1) Т-клеточные лимфомы; 2) изменения периферических нервов, характеризующиеся лимфопролифера-тивной инфильтрацией и демиелинизацией, как правило, приводящие к параличу или слепоте; 3) различные проявления иммунодефицита и 4) атеросклероз у цыплят с нормальной холистеринемией, необыкновенно схожие с болезнями человека (37,16).

В настоящее время определены три серотипа ВБМ. К первому серо-типу относятся патогенные (опкогенные) и аттенуированные (неонкоген-пые) штамма. Ко второму серотипу - природные непатогенные штаммы вируса герпеса кур (ВГК). К третьему - антигенно-родственный ВБМ, вирус герпеса индеек (ВГИ) (59, 64, 85, 152).

Согласно принятой классификации данный ДНК-содержащий вирус в нас тоящее время относится к подсемейству Gammaherpesvirinae (36, 64). Однако в многочисленных сообщениях по структуре генома ВБМ и перекрестным антигенным реакциям с вирусом простого герпеса (ВПГ) человека. его предлагают отнести к подсемейству Alphaherpesvirinae (54,56, 57, 58, 7'}/)3).

Гак, Davidson I. et al. показали в своей работе (78), что чувствительные к назреванию олигомеры структурного антигена В ВБМ содержат конфирмационные энитопы, родственные олигомерам гликопротеина В (gB) альфагерпесвирусов ВГТГ-1 и ВПГ-2. Brunovskis и Velicer предполагают, что по антигенной структуре ВБМ и ВГИ филогенетически более связаны с альфа-, чем с гаммагерпесвирусами.

Хотя три серотипа различимы в серологических реакциях, они имеют много общих антигенов. Сыворотка против одного серотипа ВБМ обычно перекрестно реагирует с антигенами других серотипов, но гораздо cjimGcc, чем с гомологичными (85, 82). ффектиш1ым инструментов для идентификации вирусных антигенов являются моноклопальпые антитела (МАТ), которые позволяют изучит!. структуру и функции вирусных белков (106, 112, 134, 160). Так, недавно, Bullow и Biggs подтвердили, что А-АГ является группоепецифиче-ским, по тем не менее имеет и типоспецифические детерминанты (64,1 36)

Davidson I. и Malkinson М. показали, что серотип-общие нейтрализующие домены располагаются в термостабильных олигомерных формах В-АГ с высокой молекулярной массой, а термолабильный мопомериый комплекс В-АГ имеет серотин-ограниченные эиитопы (74, 76, 105).

В последнее время для идентификации патогенных и пепатогенных штаммов и изолятов ВБМ широко применяют такие высокочувствительные методы исследования генома, как рестрикционпый анализ, полиме-разная цепная реакция, молекулярная гибридизация и секвенирование (60, 75, 138, 140, 167).

1 применение рестрикционного эпдопуклеазпого анализа показало существенное различие между образцами ДИК 1, 2 и 3 серотипов, а также между ДНК вирусов низкого и высокого пассажа в культуре клеток (93, 104, 128).

Результаты проведения ДНК-ДНК гибридизации между геномами ВБМ и ВГИ показали, что уровень гомологии нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих gA составляет 73%, а сравнение генов, кодирующих gB трех серотипов ВБМ выявило наличие в них существенных различий (26).

Многие годы значительный процент от всех вакцин, применяемых для профилактики БМ приходился на препараты па основе штамма FC-126 ВГИ, выделенного от индеек К a warn ига и Witter (независимо друг от друга) (94, 97). Однако, в последние годы, в связи с селекцией полевых штаммов и появлением ОВВБМ данный тип вакцин значительно снизил эффективность, а порой и полностью утратил способность защищать птицу от БМ. Высоковирулентные мутанты содержат антигены-мишени, несоответствующие таковым на вакцинном вирусе (16, 91, 106, 158).

Всестороннее углубленное изучение антигенных особенностей ВБМ и его взаимосвязей с другими представителями Herpesviridae будут способствовать в дальнейшем изготовлению новых поколений вакцинных препаратов, препятствующих селекции ВБМ в природных условиях и появлению высоковирулентных патотипов вируса.

Таким образом, представляется своевременным и обоснованным изучение антигенных свойств инфекционных и инактивированных препаратов сухой вакцины па основе ВГИ (штамм FC-126) с привлечением МАТ.

Данные литературы также свидетельствуют о необходимости разработки более чувствительных и специфичных диагностических тест-систем, особенно для выявление латентных и персистирующих форм ВБМ.

Перечисленные выше обстоятельства явились основополагающими в определении выбора темы диссертационной работы. Цель и задачи исследования

Целью работы: изучить антигенные свойства инфекционных и термомнактивированных препаратов вакцинных штаммов вирусов болезни Марека с использованием поли- и моноклональных антител, а также ПЦР для выявления и типирования ДНК ВБМ.

В соответствии с целью работы поставлены следующие задачи:

Получить высокоактивные иммунопероксидазные антивидовые коныогаты (анти-IgG кур).

- Изучить фракционный и морфологический состав вирусной популяции в производственных сериях вакцины против БМ на основе ВГИ.

- Получить антигены ВБМ, различающиеся по перекрестной серотипиче-скон активности, применив приемы термоденатурации.

- Разработать варианты ИФЛ с применением поли- и моноклональных антител для выявления структурных белков ВБМ.

- Разработать компьютерную программу по обработке данных титрования антигенов в ИФА.

- Подобрать специфичные праймеры и оптимизировать условия постановки попимеразной цепной реакции для выявления и типирования ДНК вируса болезни Марека.

11аучная новизна работы.

Разработан новый способ получения чистого препарата из желтка яиц кур. Показана возможность исследования полученных гипериммунных сывороток к ^О кур в РДП и в ИФА (подана заявка на получение патента).

11олучсны и исследованы в ИФА специфичные и стабильные антигенные комплексы в пепрогретых и прогретых ультразвуковых лизатах клеток, инфицированных тремя серотипами ВБМ.

Впервые для анализа антигенного сходства поверхностных белков gB и gD разных серотипов ВБМ и ВПГ человека в ИФА были применены МА Г, направленные к белкам ВПГ.

Подобраны специфичные праймеры, комплиментарные гену гликопротеина А и последовательностям внутренних инвертированных повтор ров, позволяющие выявлять ДНК вирулентных, онкогенных штаммов 1 серотина и вакцинных штаммов вируса 3 серотипа, определены оптимальные параметры постановки ПЦР для обнаружения вирусной ДНК.

ЛИГЕ РАГУ 141Ы Й ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Бобровская, Ирина Владимировна

3. ВЫВОДЫ

3.1. Разработан новый способ выделения иммунохимически чистого препарата ^С желтка яиц кур. Показано, что гипериммунные антивидовые сыворотки, полученные иммунизацией чистым препаратом необходимо контролировать не только в РДП, но и в ИФА. Была использована баранья анти-^О кур сыворотка для синтеза высокоактивного и специфичного иммунопероксидазного конъюгата с рабочим титром 1:2000.

3.2. Проведенное исследование фракционного и морфологического состава вакцинного препарата ВГИ гель-фильтрацией на колонке с сефадек-сом С-200, в системе водорастворимых полимеров и электронной микроскопией, позволило получить антигенно- и инфекционно активную фракцию вируса с высокой (99,3%) степенью очистки от балластных белков.

3.3. Используя приемы термоденатурирования препаратов ВБМ разных серотипов, получены следующие антигенные комплексы: а) перекрестно реагирующие с АТ к вирусу 1 серотипа и с АТ к ВГИ; б) реагирующие только с АТ к ВГИ; в) реагирующие только с АТ к вирусу 1 серотипа. Получены неинфекционные, термоденатурированные, сухие антигены, сти-! мулируюгцих выработку антител, обладающих преципитирующей и вирус-нейтрал изующей активностью.

3.4. Используя модификации ИФА с использованием МАТ 4f6 и поли-клональньтх антител, было выяснено, что ВБМ и ВПГ содержат общую антигенную детерминанту в белке gD, исследование которого позволяет четко идентифицировать ВБМ 2 и ВБМ 3. Показано, что ВБМ не содержит антигенной детерминанты, опознаваемой МАТ 2С к белку gB ВПГ человека.

3.5. Разработана компьютерная программа для определения активности вируса в вакцине против БМ иммуноферментным методом.

3.6. Отработаны оптимальные условия постановки ГЩР с использованием гтраймеров, комплиментарных вариабельным участкам последовательности гена гликопротеина А ВБМ 1 и 3 серотипов, позволяющие выявлять ДНК вакцинных и вирулентных штаммов в пробах патматериала и зараженных культур клеток, содержащих 100 ФОЕ/см вируса.

3.7. Амплификация фрагментов генома ВБМ с использованием прайме-ров, фланкирующих инвертированные повторы длиной 132 п.н., позволяет дифференцировать онкогенный штамм HPRS-16 от вирусов 2 и 3 серотипов.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Разработанные «Методические указания по выявлению ДНК вируса болезни Марека с помощью полимеразной цепной реакции», могут быть использованы для выявления вирусной ДНК в патологическом материале и вируссодержащей культуралыюй жидкости, а также для идентификации возбудителя.

Разработанные «Методические указания по применению компьютерной программы для определения активности вируса в вакцине против БМ иммуноферментным методом» позволяют по трем разведениям достоверно определять активность вируса в производственных сериях вакцин против БМ.

Разработанные методические указания и методы исследований рассмотрены и одобрены на заседаниях методического совета и утверждены директором ВНИТИБП.

1.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Возбудителем БМ является клеточно-ассоциированный ДНК-содсржащий герпесвирус подсемейства Оагшт^егрезушпае (36, 64). Однако, большое количество сообщений в последнее время подтверждает гомологию ВБМ и вирусов подсемейства А1рЬа11егре5Утпае (7, 54, 56, 57, 58, 79, 89, 93). р

Как видно из обзора литературы, важное значение приобрело изучение структурных белков и антигенов ВБМ. Функционально охарактеризовать АГ в последнее время стало значительно легче благодаря усовершенствованию технологии получения типоспецифических АТ. Появление технологии г ибридом сделало возможным продуцировать МАТ высокой специфичности (64, 101).

Охарактеризовано 6 основных антигенов ВБМ и многие другие белки (33, 64, 70, 73, 76, 98, 119, 136). Основными белками, играющими важную роль в развитии иммунитета при БМ являются gA и gB. А-АГ считают группоспецифическим (общим) для всех серотипов. Хотя, появление шпор в РД! I и результаты перекрестного взаимодействия говорят о наличие и типоспецифических детерминант (26, 64, 136, 166). Установлено, что А-АГ не имее т отношение к онкогенности (45, 96, 136). В-АГ-комплекс играет центральную роль в нейтрализации вируса в организме хозяина (37,136). Однако недавние исследования показали на действительное значение отдельных фракций (76). Было показано, что серотип-общие нейтрализующие домены располагаются в термолабильных олигомерных формах В-АГ с высоким молекулярным весом, а термостабильный комплекс В-АГ имеет серотип-ограничснные эпитопы. ВБМ 1 серотипа и ВГИ имеют близкую антигенную взаимосвязь, тогда как ВБМ 2 серотипа обладает уникальными антигенным статусом (26, 74, 76, 78, 105).

Вакцинопрофилактика является основным методом борьбы с БМ. На сегодняшний момент в качестве вакцинных препаратов используют: 1) ат-тенунрованпый вирус 1 серотипа (НРН.8-16); 2) авирулентный частично аттенуированпый вирус 1 серотипа СУ1 988 ( штамм Шзреш); 3) природные неонкогенные вирусы 2 серотипа (8В-1, 301 В1, штамм "42+50"), используются в бивалентных вакцинах; 4) авирулентный вирус 3 серотипа, известный как ВГИ; 5) бивалентные вакцины ВГИ + 10-20% штамма 8В-1; 6) рекомбинантные вакцины на основе вируса оспы, ретро- и бакуловиру-сов (37).

Многолетняя вакцинация препаратами на основе ВГИ способствовала селекции полевых штаммов и появлению высоковирулентных ( а после 1995 г вв+ и вв++) изолятов ВБМ (152, 153, 157, 161, 100, 195). Обладая высокой эффективностью в первое десятилетие после внедрения (I970-1980), в последующие годы вакцины из штаммов ВГИ значительно снизили, а нередко и полностью утратили способность защищать птицу от БМ (16, 91, 106, 158).

Основными проблемами, затрудняющими идентификацию и дифференциацию изолятов и штаммов ВБМ общепринятыми методами ( серологические реакции) являются персистенция вирулентных и авирулентных штаммов и вариантов, а также высокий резерв изменчивости, которых играет значительную роль в изменении патогенных и онкогенных свойств вируса (30, 32, 63, 90). Кроме того, существующие методы не позволяют выявлять находящийся в латентной форме вирус. Актуальность данной проблемы связана с тем, что животные, инфицированные ВБМ, становятся пожизненными его носителями и в любой момент возможна реактивация латентного вируса.

53 р

Одним из подходов к изучению структуры генома и дифференциации существующих изолятов ВБМ является использование метода ПЦР, РЭА и картирование ДНК (125).

Рестрикционный эндонуклеазный анализ ДНК ВБМ позволяет: 1) дифференцировать три серотипа ВБМ; 2) различать индивидуальные изо-ляты; 1) устанавливать вирусы более высокого пассажа (104, 128, 140).

Данные литературы свидетельствуют о возможности применения ПЦР: 1) для выявления ВБМ в различных органах и тканях и инфицированной птицы; 2) в оценке функционального значения некоторых участков генома; 3) для дифференциации вирулентных изолятов ВБМ от вакцинных штаммов; 4) для выявления генома вируса в латентной стадии инфекции (55,60,75, 1 17, 138, 167).

Собственные исследования

2. Материалы и методы

2.1. Вирус. В работе использовали:

2.1.1. Промышленные серии нативной и сухой вакцины против БМ на основе штаммов ВГИ FC-126 и FC-126M;

2.1.2. Штаммы 1 серотипа: Jm ВБМ, любезно предоставлен Е.В. Баррос-Палома (ВГНКИ) в виде инактивированного формалином и лиофилизиро-ванного ультразвукового лизата эпителия перьевых фолликулов инфицированных SPF-цыплят; HPRS-16 (ВГНКИ).

2.1.3. ВГК (ВБМ серотипа 2): шт. «42», шт. «50» и SB-1; промышленные серии нативной поливалентной вакцины против БМ (ВГИ+ВГК);

2.1.4. В качестве контрольных препаратов использовали культуральную р жидкость, собранную с пеинфицированных клеток;

2.1.5. Ультразвуковые лизаты неинфицированных культур КККЭ и ККПЭ и перьевых фолликулов маховых перьев неинфицированных цыплят.

2.1.6. В качестве контрольных препаратов в ПЦР использовали: ИЛТ птиц, штамм I IT и ИРТ КРС, штамм ТК-А.

2.2. Антигены. В качестве антигенов использовали:

2.2.1. Ультразвуковые лизаты инфицированных КККЭ в виде свежеприготовленных, а также длительно хранившихся серий сухой вакцины против БМ на основе ВБМ третьего серотипа:

-исходные сухие;

-сухие термоденатурированные в динамике при 100°С; -восстановленные физраствором до исходного объема и термоденатурированные в динамике при 100°С;

2.2.2. Ультразвуковые лизаты инфицированных КККЭ в виде препарата на основе ВБМ второго серотипа (ВБМ 2) с высокой степенью цитопатиче-ского эффекта (ЦПД):

-исходные сухие;

-сухие термодеиатурированные в динамике нри 100° С; -восстановленные физраствором до исходного объема и термодеиатурированные в динамике при 100° С;

2.2.3. Ультразвуковые лизаты неинфицированных КККЭ:

- исходные сухие;

- сухие термодеиатурированные в динамике нри 100° С; -восстановленные физраствором до исходного объема и термодеиатурированные в динамике при 100° С;

2.2.4. В качестве антигенов в серологических реакциях использовали также все препараты, перечисленные в разделе 2.1.

2.3. Культура клеток и среды. Трипсинизацию тканей эмбрионов SPF-кур и приготовление клеточных культур проводили по общепринятым методам, описанным в литературе (4, 19, 30, 36). Для размножения и титрования внеклеточного вируса использовали первичные культуры клеток 10-12 дневных эмбрионов SPF-кур. Бесклеточный ВГИ титровали в односуточ-ной КККЭ, а клеточно-ассоциированный вирус титровали в 2-х суточной культуре клеток. Учет цитопатического действия вируса проводили на 5-6 сутки по числу фокусообразующих единиц (ФОБ) в см3 после окрашивания клеточных культур с использованием красителя амидового черного ("Reanal", BMP) и растворов уксусной кислоты по методике (30). Для обработки и трипсимизации тканей эмбрионов использовали солевой раствор Хенкса и 0,25% раствор трипсина ("Дифко", США), а для съема и дезагрегации клеточных культур - 0,125% раствор трипсина.

3 лабораторных условиях клетки и вирус выращивали в стационар

3 1 ном положении в 50 см и 1500 см флаконах с площадью поверхности соответственно 20 и 300 см3.

Применяли среды ИГЛА, ГЛАЭ, 199 или их смеси и сыворотку КРС производства Московского мясокомбината в концентрации 5-10% (для ростовой среды) и 2 % (для поддерживающей среды). В культуральные среды перед использованием добавляли антибиотики пенициллин - 100 Ед/см и стрептомицин - 100 мкг/см .

2-4. Защитные среды. В состав криозащитных сред для консервирования инфицированных вирусом клеток входили: среда Игла (рН 7,4-7,6) - 40 % , ГЛАЭ (рН 7,4-7,6) - 40%, сыворотка КРС - 10%, диметилсульфоксид (ДМСО, хч) -10%. Для .бесклеточного вируса использовали стандартную среду СФГА, а также среду на основе безбелкового стабилизатора - 8% сахарозу.

2.5. Термообработка вируссодержащих лизатов. Сухие и восстановленные физраствором ультразвуковые лизаты клеток, инфицированных ВБМ 2 и ВБМ 3, подвергали либо термостатированию при 37,5° С разные сроки, либо термоденатурированию при 100° С в течение 5-15, 30, 45 и 60 мин. Антигенную активность, специфичность и инфекционность термообрабо-танных и необработанных лизатов устанавливали в РДП, ИФА и титрованием па культуре клеток эмбрионов БРГ- кур.

2.6. Экспериментальные животные. В опытах по получению анти-1§С желтка яиц кур использовали кроликов и баранов. Сыворотки к неинфек-ционпым препаратам ВБМ получали от морских свинок. Цыплята были использованы для получения ультразвуковых лизатов перьевых фолликулов. Специфические к ВГИ (штамм БС-126 М) сыворотки брали от 50-90 дневных 8РГ-цыплят. Пробы селезенки и фабрициевой сумки для проведения ПЦР были взяты от 7-ми, 14-ти и 21-подневных цыплят, вакцинированных в суточном возрасте ВГИ.

2.7. Схемы иммунизации. Морских свинок иммунизировали по следующей схеме: препараты вводили внутримышечно по 0,5 см3 трехкратно через недельный интервал. Через 7 дней после последнего введения брали сыворотки крови.

Для получения ультразвуковых лизатов перьевых фолликулов препараты ВБМ вводили БРЕ-цыплятам. Через 14 дней получали лизаты фолликул маховых перьев, озвучиванием очинов на ультразвуковом дисперга-торе УЗД! I-1 при силе тока 1=0,4 А в течение 3 сек. пятикратно.

Специфические к ВГК (штаммы "42"+"50") сыворотки получали от 47-50~дневных цыплят, иммунизированных в суточном возрасте препара

5 3 тами вируса в дозе 1х 10" ФОЕ/0,2 см'.

Специфические к ВГИ штамм ЕС-126М сыворотки получали от 50р

90-дневных цыплят, иммунизированных в суточном возрасте препаратами в дозе 2х 105 ФОЕ/0,2 см3.

Для диагностики БМ методом ПЦР в патологоанатомическом материале суточным 8РЕ-цыплятам вводили 10-ти кратную дозу ВГИ, штамм ЕС-126.

Для получения антивидовых сывороток к желтков яиц кур, использовали кроликов и баранов, которых иммунизировали препаратами ^С по схемам С. В. Кузнецовой (44) и Б.Б. Першина (3), соответственно. 2.8. Фракционирование ВГИ. Бесклеточный препарат ВГИ фракционировали на колонке модели К 29/100, заполненной сефадексом С-200 (8). Образец восстанавливали в рабочем буфере (0,05 М Трис-НС1, рН 8,6), наносили на подготовленную и откалиброванную колонку, скорость потока устанавливали равной 1 капля/15 сек. Объем фракций составлял 3 см .

Профиль элюирования белков с колонки вычерчивали по данным измерений оптических плотностей (ОП) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 1=280 нм. Активность и специфичность фракций вируса определяли на культуре клеток и в ИФА, а однородность и чистоту - методом электрофореза в иолиакриламидном геле (ПААГ) (6).

2-9. Концентрирование и фракционирование внеклеточного ВГИ методоммежфазного разделения вирусных частиц в водных растворах полимеров.

Работу проводили в соответствии с методом, предложенным Альбертсо-иом (1974), используя внеклеточный ВГИ. Для выбора точки концентрирования построение фазовых диаграмм для каждой серии препарата производили по методике, разработанной во ВНИТИБП (24, 34). Затем в ви-руссодержащую суспензию приливали растворы полимеров (20 % раствор Т-фракций декстрана м.м. 500 кД, производства фирмы "Pharmacia", Швеция ), 40% раствор полиэтиленгликоля м. м. 6 кД и 5 М раствар NaCl до конечной концентрации, соответствующей выбранной точке концентрирования вируса. После перемешивания на магнитной мешалке в течение 30 мин смесь переливали в делительные воронки и оставляли на холоде (5:): 1°С) па 18-20 ч, в течение которых наблюдалось полное расслоение фаз. Затем фазы анализировали на наличие вируса титрованием в культуре клеток, методами ИФА и электронной микроскопии. 240. Электронная микроскопия. Морфологию ВГИ изучали методом ультратонких срезов и негативного контрастирования (А.Ф. Марыгина, 1987). Образцы исследуемого материала наносили на коллодиевую пленку, укрепленную углем, и контрастировали раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты, (рН 7,0). Полученные препараты просматривали в электронном микроскопе ДЖГМ-100Б (Япония). Электронограммы получали на фотопластинках MR типа «ядерные» с последующим экспонированием на фотобумагу. Работа выполнялась в институте теоретической и экспериментальной биофизики (г. Пущино), в лаб. ультраструктуры нейрона совместно со ст. науч. сотр. И.М. Санталовой (зав. лаб. проф. Д.А. Мошков).

2.11 .Выделение и очистка иммуноглобулинов класса G желтка яиц кур.

2.1 1.1. За основу выделения иммуноглобулинов класса G желтка яиц кур был взят метод двукратного переосаждения ПЭГ-6000 с доочисткой обог тащенной IgG фракции на сефадексе G-200 (43). Первоначально желток отделя ли от белка на сите, отмывали от липидного слоя фосфатным буфером ( 0.01 М К-ФБР, рН 7,5 с 0,1 М NaCl ) и гомогенизировали с двумя объемами этого же буфера. От липидов и пигментов освобождались экстрагированием полиэтиленгликолем (ПЭГ) с м.м. 6000 Д (3,5% вес/объем) и центрифугированием при 10000 об/мин в течение 10 мин. Глобулиновую фракцию осаждали из супернатанта двукратной преципитацией ПЭГ-6000 до конечной концентрации 12 % . Иммунохимически чистый IgG желтка яиц кур получали из глобулиновой фракции гель-хроматографией на се-фадексс G-200 ("Pharmacia", Швеция) на колонках К 26/100 ("Pharmacia", Швеция) общепринятыми методами (1). Профиль эшоирования белков с колонок регистрировали с помощью СФ-26.

2.11.2.Концентрацию IgG подсчитывали, учитывая величину оптической плотности ОП28(ь по формуле : i.uG) V х ( ()I I,so /1,31 ), где

IgG ) - выход иммуноглобулина G в мг; V - объем раствора в см 3;

ОП280 - оптическая плотность раствора; 1,31 - экстинкция раствора IgG с концентрацией 1 мг/см \

2.11.3. Чистоту выделенных препаратов IgG проверяли совместно с зав. лаб. биохимии ВНИиВВиМ, А.Д. Середой методом электрофореза в ПААГ с додецилсульфатом натрия (ДСП), используя в качестве маркеров набор белков с определенной молекулярной массой (м.м.) (6). После построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы по статистической обработки Stargraff, находили м.м. белков в исследуемых пробах. Специфичность выделенных препаратов проверяли методом иммуно-электрофореза с полиспецифической сывороткой, полученной на протеины желтка яиц кур на стеклах размером 6 х 9 см в 1%-ном агаре "Дифко" по общепринятым методикам (13, 36).

2.12.Активность и специфичность гипериммунных сывороток кроликов и баранов, содержащих анти-IgG антитела кур определяли в РДП и в ИФА.

2.13.Выделение специфических антител из сывороток крови.

Антитела из гиперимунных антивидовых сывороток крови баранов и кроликов выделяли методом аффинной хроматографии на колонках 26 х 40, предварительно проведя двукратное высаливание сульфат риванолом. Специфические сорбенты получали ковалентной иммобилизацией иммуноглобулинов класса G на активированной BrCN-сефарозе 4В ("Pharmacia", Швеция) и BrCN-агарозе отечественного производства (1, 22). Сорбцию иммуноглобулинов класса G, добавленных в соотношении 1:1- 1:3, проводили при постоянном перемешивании на роторной мешалке в течение 16-18 ч при +4°С. Затем промывали носитель 500-1000 см 26 мМ фосфатного буферного раствора, содержащего 0,15 M NaCl (рН 7,1) на р стеклянном фильтре. Готовый сорбент осушали с помощью вакуумного насоса и переносили в колонку. Вносили 20 см3 кроличьей антисыворотки (с титром преципитирующих антител 1:16-1:32 ). Для выделения специфических антител из бараньей антисыворотки 20 см3 ее (с титром - 1:128) наносили на сорбент. Инкубировали сыворотки с сорбентом путем подачи па колонку элюирующего буфера в течение 4-5 ч со скоростью подачи 30 см3/с. Диссоциацию комплекса антиген - антитело вызывали снижением рН до величины 2,2-2,8 после предварительного отмывания иммуносор-бента от неспецифически связавшихся белков сыворотки. Раствор антител нейтрализовали добавлением 1М К2НРО4 до величины рН 7,2-7,4.

Выделенные антитела концентрировали до содержания белка 7 мг/см на ультрафильтрационной ячейке ФМ02 с мембраной УАМ при давлении 0,3 МНа при (5-Ы°С). Чистоту и специфичность антител контролировали методом нммуноэлектрофореза в агаре с IgG желтка яиц кур (13).

2.14. Комыогация антител с пероксидазой. Синтез конъюгатов пероксида-зы (1IX) с аффинно очищенными антителами осуществляли перйодатным методом, описанным Р. К. Nakane и A.Kawaoi (110) и М.В. Wilson и Р. К. Nakanc и A. Kawaoi (150). Для этих целей использовали ПХ с RZ (показатель чистоты) = ОП403/ОП280 > 2,8.

Концентрацию конъюгата оценивали спектрофометрически по количеству I1X, входящей в его состав, используя формулу , предложенную Р. Keilin (150). Активность и специфичность полученных конъюгатов определяли в ИФА титрованием с IgG желтка яиц кур (гомологичные иммуноглобулины, положительный антиген), и IgG кролика (гетерологичные иммуноглобулины, отрицательный антиген), адсорбированными в лунках полистироловых микроплат. За рабочее разведение конъюгата принимали наибольшее разведение, для которого в реакции с положительным антигеном ОГ1.150 > 1,5 опт. ед., а в реакции с отрицательным антигеном ОП450 < 0,05 опт. ед. Конъюгаты консервировали глицерином (1:1). Антимышиные антитела, меченные ПХ, получали в институте вирусологии им. Д.И. Ивановского.

2-15. Иммуноферментный анализ.

2.15.1. Иммуноферментный анализ для определения серотипоспецифиче-ских антигенов ВБМ с использованием иммобилизованных антигенов и моноклоиальных антител, направленных к белкам ВПГ человека. В качестве дифференцирующих антител применяли мышиные моноклональные антитела (МАТ любезно предоставленные зав. лаб. института вирусологии им. Д.И. Ивановского, проф., Кущ A.A.) к структурным компонентам ВПГ:

- MAT 4f6, направленные к гликопротеину Д ^Д);

- MAT 2С, направленные к гликопротеину В (gB);

- копъюгат мышиных анти - gD антител с ПХ.

2.15.2. Твердофазный ИФА - "сендвич" метод с использованием МАТ к gü

96 - луночные микропланшеты сенсибилизировали анти - gD МАТ (4Г6) в рабочих разведениях в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере (рН 9,5) в течение ночи при 20°С. На втором этапе вносили раститрованные (прогретые и непрогретые) ультразвуковые лизаты и клеточно-ассоцпированные препараты вируса (см. п.п. 2.1.4. и п.п. 2.2.), затем вносили мышиные анти- gD антитела, конъюгированные с ПХ. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамшт. Учет результатов проводили р па автоматическом считывающем фотометре при длине волны 450 нм. 2.15.3. Твердофазный ИФА с прямой сорбцией антигена.

Микропланшеты сенсибилизировали антигенами на физиологическом растворе в течение ночи при 4°С. На втором этапе вносили поликло-нальные куриные и моноклопальные мышиные антитела. На третьем этапе вносили соответствующие антивидовые конъюгаты с ПХ. Затем завершали ИФА как описано выше,

2.16. Реакция нейтрализации. Реакцию нейтрализации вирусной активности проводили на культуре ККЭ. Для этого сыворотки морских свинок разводили с двукратным интервалом от 1:4 до 1:512. В качестве вируссо-держащего материала использовали одну серию вакцины на основе ВГИ (штамм ?С-\26) с предварительно оттитрованной дозой вируса (300 ФОБ в 0,1 см3). Разведенный вирус с постоянной дозой смешивали с равным объемом разведений испытуемых сывороток. Смеси вируса и сывороток перемешивали встряхиванием при комнатной температуре в течение 1 часа. Каждую смесь вносили по 0,2 см3 в плоскостенные 50 см3 флаконы с мо-нослойной культурой с предварительно слитой питательной средой и оставляли для контакта в течение часа при 37°С. Затем добавляли поддерживающую среду. Учет реакции нейтрализации проводили на 7-й день. Титром антител считали то наивысшее разведение сывороток, которое подавляет фокусообразование не менее чем на 50% во всех зараженных данной смесью флаконах.

2.17. Реакция непрямой иммунофлюоресценции (ИФ).

Для постановки реакции непрямой ИФ КККЭ выращивали на покровных стеклах в течении 24 ч. Затем монослои КККЭ инфицировали ВГИ или ВГК из расчета 200 фокусообразующих единиц на см площади покровного стекла. Через 24, 48 и 72 ч после заражения инфицированные клетки промывали 0,1 М фосфатно-солевым буфером рН 7,4, высушивали на воздухе, фиксировали холодным ацетоном 10 мин. На фиксированные препараты наносили очищенные МАТ, направленные на белок gB и инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Затем промывали проточной водой и наслаивали антивидовую сыворотку, меченную ФИТЦ, с AT ко всему gB (производство НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи) в течение 30 мин. При 37°С. Окрашенные препараты исследовали с помощью люминесцентного микроскопа ЛЮМИНИ-1. 2-18. Двойная радиальная иммунодиффузия по Оухтерлони (РДП).

Реакцию ставили общепринятым методом (13, 36). Вырезанные в слое агарового геля равномерной толщины лунки заполняли препаратами, перечисленными в п.п. 2.1. и 2.2. и антисыворотками. Реакцию учитывали после образования иммунных комплексов (через 24-72 ч), которые визуально выявлялись в виде линий преципитации. 2.19. Реактивы и ферменты, используемые для постановки ПЦР.

В работе использовали реактивы отечественного производства: борная кислота, уксусная кислота, фенол, спирт этиловый, хлороформ, натрий хлористый, магний хлористый, калий фосфорнокислый двухзамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, натрий фосфорнокислый одно-замещенный, натрий фосфорнокислый двузамещенный.

Импортные реактивы: трис основной, ЭДТА-Ыа2 соль, бромистый этидпй, доделил сульфат натрия, бычий сывороточный альбумин, ацетат

Н М натрия, дсзоксирибопуклеотидтри-фосфаты ("Serva", ФРГ; Pharmacia;

Швеция). Ферменты: Taq-полимераза производства фирмы "Fermentas", Литва);

2.20. Оборудование для проведения ПЦР.

Амилификатор "Touch Down", Hybaid, Англия; комплект типа Эп-пендорф, состоящий из центрифуги, термостата, миксера; набор автомата^ ческих микропипеток "Gilson", Франция; система для электрофоретиче-ского разделения ДНК "Hoeffer Scientific Instruments", США; трансиллюминатор, США.

2.21. Выделение ДНК из препаратов вируса.

К 0,5 см вирусной суспензии в буфере ТЕ (20 мМ Трис, рН 8.0, 1 мМ ЭДТА) добавляли протеиназу К (100 мкг/см ) и инкубировали 30 мин при температуре 56° С. Затем в эту смесь добавляли 10% раствор ДСН до конечной концентрации 0,5% и выдерживали при температуре 56° С в течение 20 мин. К суспензии добавляли равный объем 80% свежеперегнан-иого фенола (рН 8,0) и осторожно смешивали водную и фенольную фазы. Разделение фаз осуществляли центрифугированием при 10 000 об/мин в течение 5 мин. Водную фазу, содержащую ДНК, осторожно отбирали и повторно обрабатывали фенолом и смесью фенол : хлороформ в том же режиме. ДНК переосаждали 2,5 объемами перегнанного этанола при -20° С. По лученные препараты ДНК хранили при -20° С.

2.22. 1 ¡остановка ПНР.

Пробу исследуемой ДНК в объеме 10 мкл амплифицировали в 50 мкл реакционной смеси, содержащей 1 тМ каждого праймера, 200 мкМ каждого dNTP, 10 тМ Tris НС1 (рН 8,3), 50 тМ КС1, 3,0 тМ MgCl2 и 2,5 ед. Taq-полимеразы. Амплификация гтроходила в термоциклере Hybaid (Англия) но следующим программам: 3 цикла (денатурация ДНК при 94° С - 30-00 сек, отжиг ДНК при 50-60° С - 30-90 сек, синтез при 72° С - 60-90 сек), следующие 30 циклов (денатурация при 94° С - 30 сек, отжиг при 50°

С - 40 сек, синтез при 72° С - 50 сек). Аликвоты ПЦР продуктов объемом 5-10 мкл разделяли в 2,0% агарозном геле.

Учет результатов амплификации проводили при помощи электрофореза в агарозпом геле по размеру ГЩР-продуктов. Сравнивая размеры и расстояния пробегов маркерных ДНК (рестрикцированная Hind III ДНК фага лямбда), и полученных ПЦР продуктов вычисляли размеры исследуемых фрагментов ДНК (9, 75). Работу с использованием ПЦР проводили совместно со ст. науч. сотр. лаб. биофизики ВНИИИиМ Цыбановой JI. Я. 2.23. Статистическия обработка результатов исследований.

Все опыты ставили с числом повторпостей (>3), обеспечивающих получение достоверных результатов. Цифровые данные подвергали статистической обработке величин и их ошибок ( Меркурьев Е.К., 1979; Урбах В.Ю., 1975; Лакин Г.Ф., 1980). Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по разностному методу Стью-дента - Фишера, согласно которому для большинства биологических экспериментов уровень вероятности Р>0,05, свидетельствует об отсутствии закономерных отличий между сравниваемыми величинами.

При разработке компьютерной программы для определения активности вируса в вакцине против БМ иммуноферментным методом был использован пакет прикладных программ Microsoft Developer Studio. Для аппроксимации результатов вычислений применяли математический метод наименьших квадратов. Молекулярные массы белков в препаратах IgG находили после построения калибровочной кривой с помощью компьютерной программы по статистической обработки Stargraff.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Бобровская, Ирина Владимировна, 2000 год

1. Аффинная хроматография. Методы. / Под ред. П. Дина, У. Джонсона, Ф. Мидла. М.: Мир, 1988, 278 с.

2. Белкина И.В., Хлопина А.Ф., Придыбайло Н.Д. Определение клеточного иммунного ответа при болезни Марека. // Тез. докл. конф. по птицеводству. Сергиев Посад: 1995, с. 101-102.

3. Быкова H.H. Разработка иммуноферментного анализа для индикации антигенов вируса парагриппа-3 КРС и антител к ниму. / Автореф. диссертации канд. биол. наук. Щелково: 1989, 24 с. Список работ авт. - 19 наимен.

4. Вирусология. Методы. / Под ред. Б.Мейхи. М.: Мир, 1988, 344 с.

5. Выделение и использование апатогенных штаммов вируса болезни Марека второго серотипа. / Лукина В.А. и др. // Сб. Производство и контроль мед., вет. препаратов, опыт применения и реализация их в странах СНГ. п. Вольгинский: 1999, с.48-49.

6. Гааль Э., Медьеши Г., Верцкеи JI. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. // М.: Мир, 1982, с 214-224.

7. Горбовицкая М. Диагностика болезни Марека с использованием ДНК зондов. // Птицеводство, № 2. М.: 1996, с 27-28.

8. Гринин A.C., Титов И.Н. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных. М.: 1971, с. 136-141.

9. Гусева Е.В., Сатина Т.А. Вирусные болезни кур. // Из кн.: Ветеринарные аспекты вет. паталогии животных. Владимир: 1998, с.128-146.

10. Джавадов Э.Д., Кудрявцев Ф.С., Кожемяка Н.В. Эффективность вакцинации против болезни Марека. // Ветеринария, №9. М.: 1999, с. 28-30.

11. Диагностическая ценность ускоренного иммуноферментного метода. /В.А.Мищенко, М.Г. Костюченко, А.Б. Смирнов и др. // Сб. Вирусные и микробные бол. жив-х. Владимир: 1995, с. 143-146.

12. Жаков М.С., ГТрибытько С.П. Иммуноморфологические реакции в крови и органах цыплят, вакцинированных против БМ совместно с иммуностимулятором натрия тиосульфатом. // Ученые записки Витебской гос. акад. вет. мед. — Витебск: 1994, т.31, с. 93-96.

13. Иммунология. / Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1987, т.З, 360 с.

14. Клонирование и секвенирование генов, кодирующих гликопротеины А и В-антигенов онкогенного штамма Jm вируса болезни Марека. / Бедристов А.И., Бахтина М.М. и др. // Молек. генет., микробиол. и вирус. №3. 1996, с. 6-11.

15. Коровин Р.И., Зеленский В.П. Болезнь Марека, лейкоз и саркома птиц. // Метод, рекомендации. JI.: 1989, с. 5-32.

16. Коровин Р.И., Придыбайло И.Д. Основы профилактики болезни Марека // Тез. докл. конф. по птицеводству. Сергиев Посад: 1995, с.99-100.

17. Лукина В.А. Разработка иммуноферментного анализа для изучения свойств вируса герпеса индеек. // Тез. докл. 4-й Всесоюз. конф. «Научн. основы технологии промышленного произв. вет. биол. препаратов». -М.: 1991, с. 107- 108.

18. Лукина В.А. Вакцина против болезни Марека и оценка ее активности иммуноферментным анализом. // Автореф. диссертации док. биол. наук. М.: 1992, 46 с. Список работ авт. - 47 наимен.

19. Лукина В.А. Теоретические и экспериментальные предпосылки изготовления moho-, би- и поливалентной вакцины против болезни Марека. // Тез. докл. научно-произв. конф. «100 лет Курской биофабрике и агробиопромышленности России». Курск: 1996, с. 1841 89.

20. Маслов Е.В., Панферова С.М., Бойко A.A. Сравнительная характеристика препаративных методов очистки антивидовых иммуноглобулинов.// Передовой научно-произв. опыт в биологической промышленности. М.: 1985, №8, с. 34-36.

21. Нявера Ч.З. Изучение особенностей эпизоотологии и усовершенствование специфической профилактики болезни Марека в промышленных птице хозяйствах. // Автореф. диссертации канд. вет. наук. / Список работ авт. 5 наимен.- С-Г16.: 1993, 15 с.

22. Писеева Г.П., Лукина В.А., Дьяконов Л.П. Методические указания по концентрированию вируса герпеса индеек из безклеточных препаратов вакцины против болезни Марека. -М.: 1981, 8 с.

23. Пономарев Б.П. Болезнь Марека у цыплят первых дней жизни. / Из докладов ВАСХНИЛ, 1991, № Ю, с. 53-54.

24. Потехин C.B., Андреев В.Г., Куляшбекова Ш.К., Гусев A.A. Использование метода полимеразной цепной реакции для детекции и гепогипирования вируса болезни Марека. // Современные аспекты ветеринарной патологии животных, Владимир, ВНИИЗЖ, 1998, с. 159167.

25. Придыбайло Н.Д., Коровин Р.Н., Афанасьева Г.Е. Эффективность сочетанного применения вакцины против болезни Марека и иммуномодулятора тималина. // Вестн. с.-х. науки, 1991, № 7, с. 136138.

26. Производственные испытания экспериментальных серий бивалентной вакцины из штаммов FC-126 и SB-1. / Куляшбекова Ш.К., Гусев A.A., Родичкин В.И. // Тез докл. конф. "Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных". Владимир: 1997, с. 154-155.

27. Роконич В.Т. Способы определения напряженности иммунитета при болезни Марека. // Автореф. диссертации канд. вет. наук. С-Пб.: 1993, 1 с. Список работ авт. - 3 наимен.

28. Слепенко Т.Б. Выделение из клеток и изучение свойств вируса герпеса индеек. // Автореф. диссертации канд. биол. наук. М.: 1987, 24 с. Список работ авт. - 12 наимен.

29. Специфическая профилактика и механизм иммунитета при болезни Марека. /Лукина В.А., Демидов Л.Н. и др. // Из сб. Курская биофабрика. -К.: 1996, с. 422-451.

30. Способ повышения биологической активности и иммуногенных свойств производственного штамма FC-126 вируса герпеса индеек./ Куляшбекова Ш.К., Гусев A.A. и др. // Кн.: Современные аспекты вет. патологии животных. Владимир: 1998, с. 146-151.

31. Способ получения антигена вируса болезни Марека. / Писеева Г.П., Лукина В.Л., Кузнецов П.П., Дьяконов Л.П. // Авторское свидетельство №1034232, 08.04.1983.

32. Справочник ветеринарного врача. / Составитель Кунаков A.A. М.: Колос, 1996, с. 127-129.

33. Сюрин В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. / Болезнь Марека // Кн.: Диагностика вирусных болезней животных. Справочник. М.: Агропромиздат, 1991, с. 101-116.

34. Сюрин В.Н., Самуйленко А .Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Болезнь Марека. // Кн.: Вирусные болезни животных. М.: ВНИТИБП, 1998, с. 689-690.

35. Сюрин В.Н., Белоусова Р.Н., Фомина Н.В. Семейство герпесвирусов. // Кн.: Ветеринарная вирусология. -М.: 1991, с. 362-365.

36. Тыщенко И.П. Модель фенотипической классификации герпесвирусных частиц. // Ветеринария, №7. М.: 1993, с. 24-25.

37. Тыщенко И.П., Джавадов Э.Д. Тонкослойный иммуный анализ для выявления миелинспецифических антител в сыворотке крови кур при болезни Марека. // Ветеринария, №4. М.: 1992, с. 29-31.

38. Ультразвуковой фонофорез. / Акопян В.Б., Рыхлецкая О.С. и др. // Птицеводство, №7. -М.: 1991, с. 35.

39. Яковлева Л.Д., Мазуренко Н.И., Виноградов В.И. Изучение свойств штамма Кекава вируса болезни Марека в опытах на цыплятах. // Вопросы вирусологии, №5. -1973, с. 588.

40. Ярыгина Е.И. Гуморальный поствакцинальный иммунитет у кур, привитых moho-, би- и поливалентными вакцинами против болезни Марека. // Автореф. канд. биол. наук. М.: 1998. Список работ авт. - 19 наимен.

41. Ярыгина Е.И., Шкварчук Т.Я., Бойко A.A. Получение антисыворотки к JgG желтка кур. // Бюллетень ВИЭВ им. Коваленко Я.Р. Выпуск №68. -М.: 1988, с, 43-45.

42. A bivalent vaccine consisting of chínese strain of serotype 2 virus Z4 and FC-126 against Marek's disease: experimental studies and field trials. // X.1.u, R. Zhang et al. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p.305-309.

43. Aly M.M., Fadly A.M., Witter R.L. Effects of serotype 2 Marek's disease virus on development of viremia, antibody and lymphoma induced by reticuloendotheliosis virus. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam. 1992, p. 272-276.

44. Analysis of transcriptional and translational activities of Marek's disease (MD) virus genes in MD central nervous system lesions in chickens. / K.-O. Cho; D. Endoh; M. Onuma; C. Itakura. // Avian Pathology. V.28. - N.l. -2000, p. 47-53.

45. Antigenic variability of Marek's disease vaccine viruses. / Lukina V.A., Yarigina E.I., Bikova N.N., Samulenko A.Y.// 26-th World Veterinary Congress WSA, Franse, Lyon, http: w.w.w. mondiavet-99, com.

46. Bacon L.D., Witter R.L. Influence of B-haplotype on the relative efficacy of Marek's disease vaccines of different serotypes. // Avian Disease. V.37. -1993, p. 53-59.

47. Bacon L.D., Witter R.L. B-haplotype influence on the relative efficaci of Marek's disease vaccines in commercial chickens. // Poultry Sci. V.73. -N.4.- 1994, p. 481-487.

48. Becker Y. Comparative molecular biology of alphaherpesviruses: genes involved in virus pathogenicity. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p. 104-107.

49. Bradley G., Hayashi M. Structure of the MDY BAM HI-H gene family: A gene potentially important for tumor induction. // In B.: Advances in Marek's Disease Research. 1989, p. 69-75.

50. Brunovskis P., Chen X. and Velicer L.F. Anakysis of Marek's Disease virus glycoprotein D, I and E. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p. 118-121.

51. Brunovskis P., Velicer L.F. The Marek's disease virus (MDV) unigue short region: Alphaherpesvirus homologous, fowlpoxvirus - homologous and MDV - specific genes. // Virology. - V.206. -N.l. - 1995, p.324-338.

52. Brunovskis P., Velicer L.F. Genetic organization of the Marek's Disease virus unigue short region and identification of Us-encoded polypeptides. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p.74-79.

53. Bulow Won, Biggs P.M. Differentiation between strain of Marek"s disease virus and turkey herpesvirus by immunofluorescense assays. // Avian Pathol.-N.4. 1975, p. 133-162.

54. Bumstead N., Silibourne J., Rennie M., Ross N., Davison F. Quantification of Marek's -Disease Virus in Chicken Lymphocytes Using the Polymerase Chain Reaction with Fluorescence Detection. // J. Virol. Methods, 1997, 65, p. 75-81.

55. Calnek B.W. Lymphomagenesis in Marek's disease. // Avian Pathol. Oxfordshire: Carfax Pablishing Company. V.27., 1998, p. 54-64.

56. Calnek B.W., Adldinger N.K. and Kahn D.E. Feather follicle epithelium: A sourse of enveloped and infections cell-free herpesvirus from Marek's disease. //Avian Dis. -N.14., 1970, p. 219-233.

57. Calnek B.M., Harris R.W. Relationship between the immonosupressive potential and the pathotype of Marek's disease virus isolates. // Avian Disease. V.42. - 1998, p.124-132.

58. Calnek B.W., Witter R.L. Marek's disease. // In: "Disease of poultry", 9-th -1991.

59. Central nervous system lesion induced experimentally by a very virulent strain of Marek's disease virus in Marek's disease resistent chickens. / Cho. -K.O., Endoh. D., Qian. - J.F. et al. // Avian Pathol. - V.27 (5). - Oct. 1998, p.512-517.

60. Churchill A.E., Biggs P.M. Agent of Marek's disease in tissue culture. // Nature. N.215. 1967, p. 528-530.

61. Coman T., Coman S. Determination of the apathogenecity of Marek's disease herpesvirus SB-1 strain after succesive passages in chicken embryo fibroblasts. // Arch. Vet. N.19. - 1990, p.93-102.

62. Coman T., Coman S. Study on the morphological modification induced by the apathogenic Marek's disease herpesvirus SB1 strain in cell cultures. // Arch. Vet. 19 II.- 1990, p. 103-111.

63. Comparison of glycoprotein D (gD) genes of Marek's Disease virus and Herpesvirus of turkeys. / Zelnik V., Ross L.J.N., Smith G.D. et al. // In: 19th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p. 114-117.

64. Cui Z., Qin A. and Lee L.F. Expression and processing of Marek's disease virus pp 38 gene in insect cells and immunological characterization of the gene product. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam -1992, p. 123-125.

65. Cui Z., You Y. and Lee L.F. Indentification and localization of the Marek's disease virus group-common antigen p79 gene. // In: 19-th World's Poultry Congress., V. 1. Amsterdam 1992, p.89-92.

66. Dandapat S. Anti-idiotype antibodies to Marek's disease associated tumour surfase antigen in protection against Marek's disease. // Vet. Immunology and Imtnunopathology. - N.40. - 1994, p. 353-366.

67. Davidson I., Becker Y., Malkinson M. Virus neutralization domains on the oligomeric (230 kDa) forms of antigen B herpesvirus turkeys and Marek's disease virus in cross-serotypic activity. // J. Vet. Med. B. - V.42. -1995, p. 100-109.

68. Davidson I., Borovskaya A. and Malkinson M. Use of the polymerase chain reaction for the diagnosis of natural infection of chickens and turkeys with Marek's disease virus and reticuloendotheliosis virus. // Avian Pathology. -N.24. 1995, p. 69-94.

69. Davidson I., Tanaka Akiko, Novoyama M. Common antigenic epitopes are present on heat-labile oligomers of MDV glycoprotein B and on HSV glycoprotein B. // Virus Res. V. 35. - N.3. - 1995, p.233-245.

70. Delecluse H.-J. and Hammershmidt W. Status of Marek's disease virus in established Lymphoma cell lines: Herpesvirus integration is common. // J. Virologc, Jan. 1993, p. 82-92.

71. Detection of poultry infection with the virus of Marek's disease using different laboratory methods. / Gagic M., Durisis S. et al. // Acta Vet. V.45. - N.2-3. - 1995, p. 127-135.

72. Efficacy and safety of recombinant fowl pox Marek's disease vaccine. / Kinney N., Page D., Taylor J. et al. // Zootécnica - International. - V.18. -N.9. - 1995, p. 32-33.

73. Enhanced expression of Marek's disease virus specific phosphoproteins afler stable transfection of MSB-t cells with Marek's disease virus homologue of ICPU. / Pratt W.-D., Cantello J., Morgan R.W., Sehat K.A. // Virology.-V.201.N.1.- 1994, p. 132-141.

74. Expression and purification of recombinant Marek's disease virus serotype 1 specific phosphorylated protein pp 38 in E. Coli. / Endoh D., Niikura M. et al. // J. Vet. Med. Sei. V. 56. -N.5. - 1994, p. 823-826.

75. Expression Marek's disease virus (MDV) serotype 2 gene with has partial homology with MDV serotipe 1 pp 38 gene. / Oho M., Maeda M.K., Kawaguchi Y. Et al. //Virus. Res. V.35. - N.2. - 1995, p. 223-229.

76. Expression of Marek's disease virus genes in recombinant fowlpox vims and protection of chickens against MD. / Nazerian K., Yanagida N., Lee L.F. et all. // in: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p.136-139.

77. Expression of the A antegen (gp 57-65) of Marek's disease virus by recombinant baculovirus. / Niikura M., Matsuura Y. et al. // J. Gen. Virol. -V.72.- 1991, p. 1099-1104.

78. Gavora J.S. Genetic aspect of interactions between Marek's disease viruses and their hosts. 11 In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam -1992, p. 175-180.

79. Gene indentification and effective expression of Marek's disease virus B antigen (gp 100, gp 60, gp 49). / Niikura M., Matsuura Y., Endoh D., Okuma M. and Mikami T. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam -1992, p. 100-102.

80. Genetics and vaccines for the future countrol of Marek's disease. / Witter R.L., Bacon L.D., Hunt H.D. and Cheng. // Proc. Annual nat., beeders round table. S.l .1994, p.90-96.

81. Gingerich E. Tools for controlling Marek's disease. // Egg. Ind. V. 95. N.3. - 1989, p. 29.

82. Hong Y., Frame M., Conssens P.M. A 14-kDa immediate-early phosphoprotein in specifically expressed in cells infected with oncogenic Marek's disease virus strains and their attenuated derivatives. // Virology. -V. 206. N. 1. - 1995, p. 695-700.

83. Isolation from turkeys of a cell-associated herpesvirus antigenically related to Marek's disease virus. / Witter R.L., Nazerian K. et al. // Am. J. Vet. Res. V.31. -1970, p. 525-538.

84. Isolation of serotype 1 Marek's disease viruses from vaccinated Australian floks./ De Laney D.B. et al. // Veter. Microbiol. V. 46. - N.l/3 - 1995, p. 213-219.

85. Istort J.R., Kung H., Velicer L.F. Indentification of the gene encoding Marek's disease herpesvirus A antigen. // J. Virol. V. 61. - N.8. - 1987, p. 2614-2620.

86. Kawamura II., King D.J. and Anderson D.P. A herpesvirus isolated from kidney cell culture of normal turkeys. // Avian Dis. Y.13. - 1969, p. 853863.

87. Kazuhiro Nakajima. Syntesis and processing of a gp 28/32 membrane glycoprotein induced by Marek's disease virus serotype 2. // J. of General Virology. -V.71.- 1990, p. 1807-1810.

88. Kreager K.S. Chicken industry strategiens for countrol of tumor virus infections. // Poultry- sci. Savoy, IL: V. 77(8). Aug. 1998, p. 1213-1216.

89. Kross I., Davis P.J., Shilleto R.W. Isolation of highly cytolytic MDV strains from Germany and Spain. // Avian Pathol. V.27(3). - June 1998, p. 313-315.

90. Lee L.F. and Witter R.L. Humoral immune responses to inactivated oil-emulsitied Marek's disease vaccine. // Avian Disease. -N.35. 1991, p. 452459.

91. Liberona P. Marek's disease vaccine still a treat! // Poultry adv. -V.XXIII. -N.l. 1990, p. 65-69.

92. Lin J.A., Tsong-Shymen Lee. Genetic susceptibility to Marek's disease virus of local chickens in Taiwan. // Avian Disease. V.40. - 1996, p. 576581.

93. Lindenmaier W., Bauer H.J. Cosmid Cloning and Restriction-Endonuclease Mapping of the Herpesvirus of Turkeys (Hvt) Genome. // Arch. Virology, 1994, 135, p. 171-177.

94. Malkinson M., Davidson I. and Becker Y. A novel immunological approach to the structure and function of antigen B. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p. 239-241.

95. Marek's disease: a comprehensive view. / Prajapat K.S., Joshi B.P. et al. // Poultry Guide. V.27. - N.l2. - 1990, p. 67-72.

96. Marek's disease field experience and vaccination strategies. // Poultry International. - N.l 1. - 1993, p. 33-36.

97. Molecular analysis of the glycoprotein C negative phenotype of attenuated Marek's disease virus. / Wilson M.R., Southwick R.A. et al. // Virology. V.199. - N.2. - 1994, p. 393-402.

98. Nagang G., Kharole M.U. Effects of levamisole on the efficacy of turkey herpesvirus vaccine against Marek's disease. // Indian J. Virol. V.ll. -N.I.-1995, p. 13-22.

99. Nakane P.K., Kawaoi A. Peroxidase labelled antibodi: a new methods of conjugation. // J. Histochem. Cytochem. - V.22. - N.12. - 1974, p. 10841091.

100. Nazerian K., Burmester B.R. Electron microscopy of a herpesvirus associated with the agent of Marek's disease in cell culture. // Cancer Res. -V.28.- 1968, p. 2454-2464.

101. Nazerian K., Witter R.L., Lee L.F. Protection and synergism by recombinant fowl pox vaccines expressing genes from Marek's disease virus. // Avian Disease. V 40. - 1996, p. 368-376.

102. New vaccine for old problem. // International Poultry Production. V.3. -N.6. - 1995, p. 17-19.

103. Ono M. Preparation of monoclonal antibodies against Marek's disease virus serotype 1 glycoprotein D expressed by a recombinant baculovirus. // Virus Res. V.38. - N.2-3. - 1995, p. 219.

104. Palya V. Manual for the production of Marek's disease, Gumboro disease and Newcastle disease vaccines. 1989, p. 3-54.

105. Parcells M.S., Anderson A.S., Morgan R.W. Retention of oncogenicity by Marek's disease virus mutant lacking six unigue short region genes. // J. Virology. V.69. - N. 12. - 1995, p. 888-898.

106. Polymerase chain reaction analysis of MDV-1 DNA. / Becker Y., Asher Y. et al. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam 1992, p.216-219.

107. Powell P.C., Lombardini F. Progress in vaccination against Marek's disease. // Clin. Vet.-V. 110.- N.I.- 1987, p. 36-41.

108. Preparation of monoclonal antibodies against Marek's disease virus serotype 1 glycoprotein D expressed by a recombinant baculovirus. / Mitsuru O., I iyung-Kwan, Ken M. et al. // Virus Res. V.38. -N.2-3. - 1995, p. 219230.

109. Protection against Marek's disease by fowlpox virus recombinant expressing the glycoprotein B of Marek's disease virus. / Nazerian K., Lee L.F. et al. // J. Virol. V.66. - 1992, p. 1409-1413.

110. Protection studies against Marek's disease using baculovirus-expressed glycoproteins B and C of Marek's disease virus type 1. / Jang H.-K., Kitazawa T., Ono M. et al. // Avian Pathology. V.25. - N.l. - 1996, p. 525.

111. Rapid detection and titration of Marek's disease virus vaccine on CER-cell line. / Wassel M.S., Suzan E.-M. et al. // Serum and vaccine Res. Instr. ARC, Abbasia, Cairo, ARE 1996.

112. Relationship between the immusuppressive potential and the pathotype of Marek's disease virus isolates. / Calnek,-B.W., Harris,-R.W., Buscaglia,-C. et al. // Avian Dis. Kennett Sguare, Pa. V.42(l). - Jan./Mar. 1998, p. 124-132.

113. Rodriguez J.M. Detection of Animal Pathogens by Using the Polymerase Chain Reaction. // Vet. J., 1997, 153, p. 287-305.

114. Ross L.J.N. Recombinant vaccines against Marek's disease. // Avian Pathol. Oxfordshire: Carfax Publishing Company. V.27. (Suppl 1) - Apr. 1998, p. 865-873.

115. Ross I., Miln B., Biggs P. Restriction endonuclease analysis of Marek's disease virus DNA and homology between strains. // J. Gen. Virol., 1993, 64, p. 2785-2790.

116. Sarma G. Field trial and immunogenecity studies on the polyvalent Marek's disease vaccines in chickens. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam. 1992, p. 310-314.

117. Schat K.A., Taylor R.L., Jr., Briles W.E. Resistance to Marek's disease in chickens with recombinant haplotypes of the major histocompatibility (B) complex. // Poultry Science. N.73. - 1994, p. 502-508.

118. Schat K.A., Calnek B.W. Characterization of an apparently nononcogenic Marek's disease virus. // J. Natl. Cancer Inst. V.60. - 1978, p. 1075-1082.

119. Shat K.A. Immune responses against Marek's disease virus. // In: 19-th World s Poultry Congress. V.l. Amsterdam. - 1992, p. 233-238.

120. Scholten P., Hilgert L.A.T. Detection of Marek's disease virus antigen in chickens by a novel immunoassay. // J. Virol. Meth. V.27. - N.2. - 1990, p. 221-226.

121. Serotype-specific polypeptides of Marek's disease virus identified by monoclonal antibodies reactive in enzyme-linked immunosorbent assay. / Lee L.F., Ren D., Li Y. and Sui D. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam. 1992, p. 127-130.

122. Shapiro D. Practical advice on Marek's vaccination. // Egg. Ind. V.96. -N.2.- 1990, p. 28-29.

123. Shunsuke Yachida. Comparative studies on antigens induced by Turkey Herpesvirus and Marek's disease virus. 1. Agar gel precipitation and neutralization studies. //Zbl. Vet. Med. B. 30 1983, p.609-618.

124. Significance of Marek's disease virus serotype 1-specific phosphorylated proteins in Marek's disease skin lesions. / Cho K.-O., Endon D., Kimura T. et al. // Avian Pathology V.26. - 1997, p. 707-720.

125. Silva R.F. Differentiation of Pathogenic and Nonpathogenic Serotype-Marek's Disease Viruses (Mdvs) by the Polymerase Chain-Reaction Amplification of the Tandem Direct Repeats within the MDV Genome. // Avian Diseases, 1992, 36, p. 521-528.

126. Silva R.F., Galvert EG., Lee L.F. A simple immunoperoxidase plague assay to detect guantitate Marek's disease virus plagues. // Avian Disease. -V.41. 1997, p. 528-534.

127. Silva R.F. and Barnett J.C. Restriction endonuclease analysis of Marek's disease virus DNA differentiation of viral strains and determination of passage history. // Avian Disease. 1991, p. 487-495.

128. Sithole I., Coussens P.M., Lee L.F. Identification of Marek's disease herpesvirus B antigen's precursor polipeptide and the gene encoding it. // In B.: Advances in Marek's disease research. 1989, p. 148-154.

129. Strivastava R.N., Raushik A.K., Prasad S. Enzymelinked immunosorbent assay of serum antibodies of Marek"s disease virus in vaccinated chickens. // Acta Virol. V.26. - 1982, p. 302.

130. Syngeneic lysis of reticuloendotheliosis virus transformed cell lines transfected with Marek's disease virus genes by virus — specific cytotoxic T cells. / Zehava U., Pratt W.D. et al. // Vet., Immunol, and Immunopathol. -V.44. - 1994, p. 57-69.

131. The early pathogenesis in chickens inoculated with non-pathogenes serotype 2 Marek's disease virus. / Lin J.A., Kodoma H. et al. // J. Vet. Med. Sei. -V.53. -N.2. 1991, p. 269-273.

132. The use of blood from selected chickens as an immunizing agent for Marek's disease. / Zander D.V., Hill R.W. et al. // Avian Dis. V.16. - 1972, p. 163-178.

133. Use of recombinant pp 38 antigen Marek's disease virus to identify serotype 1-specific antibodies in chickens sera by Western blotting. / Li D.S., Green P.F., Skinner M.A. et al. // J. Virol. Meth. -V.50. N.l-3.- 1994, p. 185-196.

134. Uspjesnost uzg oja tovnin pilica vakciniranin protiv Marekove bolestiuz visestruku upotrebu stelje. / Nemarnik D., Mazija H. et al. // Praxis Veter. -V.40.-N.2. 1992, p. 159-173.

135. Venugopal K., Payne L.N. Molecular pathogenesis of Marek's disease -recent development. // Avian Pathol. V.24. - N.4. - 1995, p. 597-609.

136. Wilson M.R., Tieber V.L. Molecular basis for reduced expression of glycoprotein C (GP 57-65) in attenuated Marek's disease virus. // In: 19-th World's Poultry Congress., V.l. Amsterdam. 1992, p. 108-111.

137. Witter R.L., Lee L.F., Sharma. Biological diversity among serotype 2 Marek's disease viruses. // Avian Disease. V.34. - 1990, p. 944-957.

138. Witter R.L. Very virulent Marek's disease viruses: importance and control. // World's Poultry. V.45. - N.l. - 1989, p. 60-65.

139. Witter R.L. Low enhancement serotype 2 vaccine for Marek's disease. // United States Department of Agriculture patents. Washington. - Oct. 15. -1996, (5,565,202) 1 p.

140. Witter R.L., Lee L.F. Polyvalent Marek's disease vaccines. Safety, efficacy and protective synergism in chickens with maternal antibodies. // Avian Pathol. V.13. - 1984, p. 75-92.

141. Witter R.L., Silva R., Lee F.L. New serotype 2 and attenuated serotype 1 Marek's disease vaccine viruses: selected biological and molecular characteristics. // Avian Dis. V.31. - 1987, p. 829-840.

142. Witter R.L. Attenuated reventant serotype 1 Marek's disease virus: safety and protective efficacy. // Avian Dis. V.3. - 1991, p. 877-891.

143. Witter R.L. Recent development in the prevention and control of Marek's disease. // In: 19-th World's Poultry Congress., V. 1. Amsterdam. 1992, p. 298-304.

144. Witter R.L. Very virulent Marek's disease viruses: impotance and control. // World's Poultry. -V.45. -N.l. 1989, p. 60.

145. Witter R.L. Attenuation of lymfoid lenkosis enhancement by serotype 2 Marek's disease virus. // Avian Pathology. V.24. - 1995, p. 665-678.

146. Witter R.L. Increased virulence of Marek's disease virus field isolates. // Avian Dis. -V.41.-N.l. 1997, p. 149-163.

147. Wu P., Lee L.F., Reed W.M. Serological characteristics of membrane glycoprotein gp 82 of Marek's disease virus. // Avian Dis., Kennett Sguare, Pa: American Association of Avian Pathologists Inc. V.41(4). - Oct./Dec. 1997, p. 824-831.

148. Wu C.X., Zhang R.K., Liu X.F. Comparative efficacy trials of different dose proportions of the component viruses in the Marek's disease bivalent vaccine Z4+FC-126. // Acta Vet. Zootechsin. V.25. - N.3. - 1994, p. 279283.

149. Jurajda V., Halouzka R. Incolace a studium biologickych viastnosti neonkogennich nukecich herpesvirus markovy nemoci. // Veter. Med., Praga. -N.9-10. 1992, p. 535-542.

150. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

151. ВСЕРОССИЙСКИЙ НА УЧНО-ИССЛЕДОВА ТЕЛЬСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

152. Утверждаю ор ВНИТИБП респондент РАСХМ А.Я. Самуйленко2000 г.

153. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫЯВЛЕНИЮ ДНК ВИРУСА БОЛЕЗНИ МЛ РЕКА С ПОМОЩЬЮ ПОЛИМЕРАЗИОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ1. ЩЕЛКОВО -2000 г.

154. РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК

155. ВСЕРОССИЙСКИЙ И А УЧПО-ИССЛЕДОВА ТЕЛЬСКМЙ ТЕХНОЛОГИ ЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

156. УТВЕРЖДАЮ: Директор ВНИТИБП1. ГРр^шеспондент РАСХИ1. Самуйлепко А.Я.2000 г.1. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

157. ПО ПРИМЕНЕНИЮ КОМПЬЮТЕРНОЙ ПРОГРАММЫ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ВИРУСА В ВАКЦИНЕ ПРОТИВ БОЛЕЗНИ МА РЕКА ИММУНОФЕРМЕИТНЫМ АНАЛИЗОМ1. Щелково 2000 г.