Биохимические и молекулярно-генетические исследования парвовируса В19 при оценке безопасности препаратов альбумина и иммуноглобулина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Филатова, Екатерина Викторовна

• Филатова, Екатерина Викторовна
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Филатова, Екатерина Викторовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История открытия парвовируса В19

1.2 Таксономическая классификация, структура и организация генома парвовируса В19

1.2.1 Таксономия представителей семейства Parvoviridae

1.2.2 Структура вириона и организация генома

1.2.3 Генетическая вариабельность парвовируса В19

1.3 Патогенез

1.3.1 Жизненный цикл и тропизм вируса

1.3.2 Культивирование парвовируса В19

1.3.3 Цитопатология

1.3.4 Патогенез и иммунный ответ

1.4 Клинические аспекты парвовирусной инфекции

1.4.1 Проявления инфекции у здоровых лиц

1.4.2 Парвовирусная инфекция у лиц с иммуннодефицитными состояниями и гематологическими заболеванями

1.5 Диагностика парвовирусной инфекции

1.6 Эпидемиология и трансмиссия

1.7 Парвовирус В19 и безопасность препаратов крови

1.7.1 Распространенность парвовируса В19 среди доноров

1.7.2 Контаминация пулов плазмы и препаратов крови парвовирусом В19

1.7.3 Основные способы получения лечебных препаратов из плазмы крови

1.7.4 Основные производственные методы инактивации/элиминации патогенов и их эффективность в отношении парвовируса В19

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Исследуемый материал

2.2 Подготовка образцов для исследования

2.3 Выделение ДНК парвовируса В19

2.4 Выявление и количественное определение ДНК парвовируса В19

2.5 Получение фрагментов ДНК парвовируса В19 для секвенирования

2.6 Секвенирование фрагментов ДНК парвовируса В19

2.7 Выведение аминокислотных последовательностей

2.8 Филогенетический анализ

2.9 Выявление и определение количественного содержания антител к парвовирусу В19

2.10 Модельное фракционирование контаминированных пулов плазмы

2.11 Определение фактора вирусной редукции

2.12 Статистическая обработка результатов

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Выявление генетических и серологических маркеров парвовируса В19 в крови доноров

3.2 Определение генотипа и филогенетический анализ российских штаммов парвовируса В19

3.3 Оценка частоты контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования

3.4 Исследование динамики изменения концентрации ДНК парвовируса В19 и оценка уровня вирусной редукции по стадиям технологического процесса

3.5 Исследование препаратов альбумина и иммуноглобулина на содержание генетических и серологических маркеров парвовируса В19

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотный остаток

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВОЗ - Всемирная организация здравоохранения

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфат

ИГВВ - иммуноглобулин для внутривенного введения

ИФА - иммуноферментный анализ

ME - международная единица

н.о. - нуклеотидное основание

ПДРФ - полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

В19V - парвовирус В19

IgA - иммуноглобулин класса А

IgG - иммуноглобулин класса G

IgM - иммуноглобулин класса М

ITR - (inverted terminal repeats) - инвертированные терминальные повторы

kDa - килодальтон

NS1 - нестуктурный вирусный белок

ORF - (open reading frame) - открытая рамка считывания

PLA2 - фосфолипаза А2

RF - (reduction factor) - фактор редукции

SD-плазма - плазма, подвергнутая сольвент/детергентной обработке

SSCP - анализ конформационного полиморфизма одиночных цепей

VL - (viral load) - вирусная нагрузка

VP1 - капсидный вирусный протеин

VPlu - уникальная область вирусного протеина

VP2 - капсидный вирусный протеин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биохимические и молекулярно-генетические исследования парвовируса В19 при оценке безопасности препаратов альбумина и иммуноглобулина»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Альбумин и иммуноглобулины являются одними из основных белков крови, принимающих участие в обеспечении важнейших функций организма [7]. В связи с этим препараты альбумина и иммуноглобулина нашли широкое применение в медицинской практике. Использование альбумина и иммуноглобулина путем введения непосредственно в кровеносное русло предъявляет повышенные требования к безопасности, направленные на предотвращение вирусного инфицирования реципиентов препаратов крови.

Безопасность препаратов крови в отношении социально-значимых вирусов гепатитов В и С, вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) хорошо изучена и подтверждена многолетней практикой клинического применения. Однако спектр инфекционных агентов, передающихся через кровь, постоянно расширяется. В настоящее время все большее внимание уделяется парвовирусу В19 (В19У).

Инфицирование В19У представляет опасность для беременных, лиц с иммунодефицитными состояниями и гематологическими заболеваниями, которые являются основными реципиентами крови и ее дериватов. Поражая клетки-предшественники эритроцитов, В19У может вызвать развитие тяжелой анемии и патологии во время беременности [51]. В связи с этим в развитых странах активно ведутся комплексные исследования парвовируса В19, направленные на обеспечение безопасности препаратов крови.

Недостаточная изученность распространенности маркеров В19У среди доноров России, отсутствие знаний о молекулярно-генетических свойствах российских штаммов вируса и возможности их трансмиссии через препараты крови определили актуальность проблемы и явились основанием для проведения настоящего исследования.

Цель работы - комплексное исследование парвовируса В19 при оценке безопасности препаратов альбумина и иммуноглобулина, получаемых из плазмы крови доноров методом спиртового фракционирования.

Задачи исследования:

1. Определить частоту выявления генетических и серологических маркеров B19V в крови доноров.

2. Установить генотип выявленных штаммов B19V с использованием частичного секвенирования генома.

3. Определить частоту контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования.

4. Проследить изменение концентрации ДНК B19V и оценить уровень вирусной редукции по стадиям технологического процесса получения препаратов альбумина и иммуноглобулина из плазмы крови методом спиртового фракционирования в модельном эксперименте.

5. Исследовать препараты альбумина и иммуноглобулина, полученные на филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио», на содержание генетических и серологических маркеров В19V.

Научная новизна работы:

Получены новые данные о распространенности B19V среди доноров.

Впервые в России определены нуклеотидные последовательности NSl/VPlu области генома российских изолятов B19V, которые депонированы в GenBank/EMBL/DDBJ под номерами JQ518457-JQ518464, что расширяет международную базу нуклеотидных последовательностей генома B19V. Установлена принадлежность обнаруженных штаммов B19V к генотипу 1 субтипу 1а.

Впервые в России определена частота контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования отечественных производителей препаратов крови.

Впервые показано изменение концентрации ДНК B19V и оценен уровень вирусной редукции по стадиям технологического процесса получения лечебных препаратов альбумина и иммуноглобулина из плазмы крови доноров методом спиртового фракционирования.

Практическая значимость работы:

С участием автора составлены Методические рекомендации «Порядок проведения входного контроля на вирусную безопасность сырья для производства препаратов из плазмы крови доноров» (утверждены и введены в действие приказом директора ФГБУ «ГИСК им. JI.A. Тарасевича» Минздравсоцразвития России от 21.07.2011 № 59-ОД).

Результаты, полученные в ходе настоящей работы, могут стать основой для пересмотра стратегии обеспечения вирусной безопасности в плане расширения спектра вирусных маркеров, обязательных для тестирования, не только при производстве препаратов крови, но и в отечественной трансфузионной медицине и Службе Крови России.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Генетические маркеры B19V генотипа 1а выявлены у 1,0% доноров

крови.

2. Высокая частота выявления ДНК B19V в производственных пулах плазмы для фракционирования предполагает возможность контаминации готовых препаратов.

3. Спиртовое фракционирование вносит существенный вклад в редукцию B19V, но при отсутствии дополнительных стадий вирусной инактивации/элиминации не гарантирует безопасность препаратов.

4. Исследованные партии препаратов альбумина и иммуноглобулина не содержат B19V, но риск трансмиссии данного патогена через препараты крови должен рассматриваться.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

VII Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (г. Москва, 2013 г.);

заседании научно-технического совета филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио»;

заседании Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н. Блохиной.

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 117 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 222 литературных источника, из них 214 - зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 14 рисунками и 6 таблицами.

По результатам диссертации опубликовано 7 печатных работ.

Работа выполнена в рамках научной тематики 06-2 «Обеспечение вирусной безопасности препаратов крови человека» филиала ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава России «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио».

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 История открытия парвовируса В19

Парвовирус В19 был открыт в 1975 году австралийским вирусологом А. Cossart при тестировании сыворотки крови на поверхностный антиген вируса гепатита В [152]. Название вируса происходит от номера сыворотки (№ 19) панели В, при исследовании которой методами встречного иммуноэлектрофореза и радиоиммунного анализа был получен аномальный результат. Электронная микроскопия выявила частицы диаметром 23 нм сходные с парвовирусом животных. Через 5 лет В19V был независимо открыт в Японии и получил название «Nakatani». При последующих исследованиях была установлена их идентичность [79].

В 1985 г. Международным комитетом по таксономии вирусов выявленные «парвовирус-подобные частицы» были названы В19 и отнесены к семейству Parvoviridae [42].

В 1980 году сообщалось об эпизоде незначительной лихорадки у двух солдат, в сыворотке которых при электронной микроскопии был выявлен B19V. В 1981 году этот вирус был ассоциирован с кратковременным апластическим кризом у больных серповидно-клеточной анемией. Через два года серологически была доказана связь детской болезни «инфекционная эритема» с B19V, который в настоящее время считается этиологическим агентом данного заболевания [79]. Позже были описаны другие синдромы, ассоциированные с B19V, такие как потеря плода во втором триместре беременности из-за вертикальной передачи вируса от матери, постинфекционная симметричная полиартропатия и артрит у взрослых. Хронические формы парвовирусной инфекции были выявлены при парциальной аплазии эритроцитов [86, 95, 108, 165].

1.2 Таксономическая классификация, структура и организация генома

парвовируса В19 1.2.1 Таксономия представителей семейства Parvoviridae

Классификация представителей семейства Parvoviridae основана на их морфологических и функциональных характеристиках. Парвовирусы, до открытия Circovirus и TT вируса, являлись самыми маленькими ДНК-содержащими вирусами, которые поражают клетки млекопитающих («parvum» (лат.) - маленький). Основываясь на способности вируса инфицировать клетки позвоночных и беспозвоночных животных, семейство Parvoviridae разделено, соответственно, на подсемейства Parvovirinae и Densovirinae.

Parvovirinae включает в себя 3 рода: Dependovirus, Parvovirus, Erythrovirus. В основе этого деления лежит анализ транскрипционных карт генома и способность вирусов к самостоятельной эффективной репликации [79]. Недавно Международным комитетом по таксономии вирусов с использованием филогенетического анализа из рода Parvovirus были выделены два самостоятельных рода: Amdovirus, включающий единственного представителя - возбудителя алеутской болезни норок, и Bocavirus, к которому относятся парвовирусы крупного рогатого скота (bovine parvovirus) и собак (canine parvovirus), давшие название роду, а также бокавирус человека, недавно обнаруженный в образцах из респираторного тракта (рис 1).

В настоящее время рассматривается возможность выделения в отдельный род Avetalvirus парвовирусов цыплят и индюков, а идентифицированный в плазме для фракционирования парвовирус 4 (PARV4) - в род Partetravirus [220].

B19V способен к автономной репликации, поэтому изначально был отнесен к роду Parvovirus. Однако из-за способности вируса селективно реплицироваться только в активно делящихся клетках, таких как клетки костного мозга, эмбриональные клетки и клетки-предшественники эритроцитов, В19V был классифицирован как представитель рода Erythrovirus,

к которому также относятся парвовирус обезьян, парвовирус макак-резус и свинохвостых макак [18].

парвовирус бурундуков,

Рис. 1. Таксономия подсемейства Рапюутпае.

1.2.2 Структура вириона и организация генома

Парвовирус В19 (или эритровирус В19) имеет простую структуру, включающую два белка, формирующих капсид (УР1 и УР2), и линейную однонитевую молекулу ДНК. Липидная оболочка отсутствует [57]. Зрелые инфекционные вирусные частицы имеют молекулярную массу 5,6хЮ6 Ба, из которых около 80% приходится на белки и около 20% - на ДНК. Плотность в градиенте хлористого цезия составляет 1,41 г/мл [76].

С помощью Х-лучевой кристаллографии определена икосаэдрическая структура вирусного капсида (Т=1), диаметр которого составляет 22-24 нм. Вирион образован 60-ю структурными субъединицами (капсомерами). На основной структурный белок УР2 с молекулярной массой 58 Ша приходится около 95% капсомеров. УР2 содержит домены связывания с клеточными рецепторами и корецепторами [18, 52, 79, 126, 201].

Минорный белок УР1 с молекулярной массой 84 Ша составляет около 5% капсидных протеинов [137]. Функции УР1 неизвестны, но наличие домена фосфолипазы А2 (РЬА2) предполагает его роль в проникновении вируса в клетку. РЬА2-домен содержит каталитический сайт и Са-связывающий домен, необходимые для энзиматической активности [14, 18, 126].

Структурные белки УР1 и УР2 являются результатом альтернативного сплайсинга матричной РНК. УР1 коллинеарен УР2, за исключением участка из дополнительных 227 аминокислот на Ы-конце белка УР1, названного УР1 уникальный регион (УР1и) [213]. Ранее сообщалось, что УР1и локализован, по крайней мере, частично, на поверхности вирусного капсида [132, 153]. Однако последние данные указывают на то, что такое положение возникает только после соединения вируса с клеточным рецептором [178].

УР1и содержит много линейных эпитопов для связывания с нейтрализующими антителами [202, 213]. Появляющиеся новые данные указывают на то, что УР1и играет центральную роль в индукции аутоиммунных

реакций и развитию воспалительных процессов, механизм которых до конца остается неясным [27, 106, 123, 196].

При фолдинге белков образуются а-спиральные петли, формирующие на поверхности капсида антигенные детерминанты, которые распознаются иммунной системой хозяина. VP1 и VP2 могут быть экспрессированы в бактериальных клетках, а также клетках млекопитающих и насекомых. Экспрессия VP2 может осуществляться в отсутствии вирусной ДНК, приводя к формированию вирусоподобных частиц, которые по физическим, антигенным и иммуногенным свойствам сходны с нативным вирусом [9, 183].

Основной неструктурный белок эритровируса NS1 состоит из 671 а.о. и имеет молекулярную массу 77 kDa [99, 134]. NS1 представляет собой фосфолипид и выполняет важные регуляторные функции, включая контроль транскрипции и вирусной репликации. NS1 выступает как сильный транскрипционный активатор и участвует в сборке клеточного репликативного комплекса [126, 135, 172]. Анализ последовательностей, кодирующих NS1, показал, что этот белок обладает ДНК-связывающими свойствами, сайт-специфической эндонуклеазной, АТФазной, хеликазной и ник-активностью [44, 45, 51, 166]. Содержит домены для связывания нуклеозидтрифосфатов, что обеспечивает его цитотоксичность [13].

NS1 локализуется в ядре инфицированных клеток, блокирует клеточную пролиферацию и индуцирует апоптоз в эритроидных клетках [28, 147].

В дополнение к экспрессии NS1 происходит трансляция РНК размером от 500 до 600 н.о. с образованием, по крайней мере, двух полипротеинов с молекулярной массой 11 kDa и 7,5 kDa, а также предполагаемого Х-протеина массой 9 kDa, функции которых пока мало изучены [73]. В исследованиях с использованием мутантов B19V с блокированной экспрессией 11 Ша-протеина было показано, что отсутствие этого белка ведет к снижению количества капсидных протеинов и изменяет структуру их размещения в клетке. В результате белки формируют большие кластеры в ядре и не выходят в

цитоплазму. В отсутствии 11 Ша-протеина не происходит эффективной продукции и нормального распределения капсидных протеинов. Возможно, роль этого белка заключается в изменении клеточной среды для обеспечения условий репликации и созревания [126]. Недавно проведенные исследования показали, что 11 kDa-протеин необходим для индукции апоптоза [200].

Геном эритровируса В19 представлен однонитевой ДНК, которая содержит 5596 н.о. и состоит из внутренней кодирующей последовательности (4830 н.о.), ограниченной идентичными инвертированными терминальными повторами (ITR) по 383 н.о. каждый, состоящими, в основном, из GC-nap [48, 79]. ITR представляют собой палиндромы и способны принимать конфигурацию двойных шпилек, которые служат праймерами для синтеза комплементарной цепи во время репликации [79].

Как и у большинства парвовирусов животных геном B19V имеет две главные открытые рамки считывания (ORF), кодирующие основные вирусные белки. Неструктурный протеин NS1 кодируется генами, расположенными в левой части генома (позиция 435-2448 н.о.), а структурные VP1 и VP2 - генами, занимающими позиции в правой части генома 2444-4787 н.о. и 3125-4787 и.о., соответственно (рис. 2). Перекрывание основных рамок считывания приводит к формированию двух небольших дополнительных ORF, кодирующих белки весом 11кЕ)а и 7,5 kDa. В VP1 регионе определена третья дополнительная рамка считывания (позиция 2694-2939 н.о.), которая возможно кодирует предполагаемый Х-протеин [51, 73, 79].

Транскрипционная карта B19V заметно отличается от карты других представителей семейства Parvoviridae, что связано с использованием единственного промотора, названного рб [213], который способен дифференцированно экспрессировать гены, кодирующие структурные и неструктурные белки [51]. Промотор локализован в 5' конце и регулирует синтез девяти вирусных транскриптов матричной РНК [79]. Один транскрипт кодирует неструктурный белок, а структурные белки VP1 и VP2 и два

небольших протеина (11 kDa и 7,5 kDa) кодируются РНК, получаемой путем сплайсинга в различных комбинациях других восьми транскриптов [34, 79, 128, 134].

Репликация эритровируса В19 приводит к образованию двунитевых промежуточных форм ДНК, которые могут быть выявлены в клинических образцах методом ДНК-гибридизации [213].

5' 3'

Геном В19

Регион,

кодирующий

VP1

Регион,

кодирующий

VP2

Регион,

кодирующий

NS1

7.5 kDa 11 kDa

Рис. 2. Схема генома и транскрипционной карты парвовируса В19 [51].

1.2.3 Генетическая вариабельность парвовируса В19

Нуклеотидная последовательность генома B19V была определена секвенированием вирусного изолята Pvbaua, выделенного из сыворотки ребенка с гомозиготной серповидноклеточной анемией [136]. Потом частично или полностью секвенировали геномы других штаммов. Различия в последовательностях определяли путем рестрикционно-ферментного анализа, анализа конформационного полиморфизма одиночных цепей (SSCP-анализа), анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ) и секвенирования [72].

Последовательность ДНК B19V долгое время рассматривалась как стабильная, с вариациями 1,0 - 3,0%. 'Большая степень вариабельности наблюдалась среди вирусных штаммов из разных эпидемиологических и географических регионов (более 4,8%) [32, 97]. Наиболее консервативным оказался ген, кодирующий неструктурный белок NS1, что связано с его ролью в размножении вируса. Регионы, кодирующие VP1 и VP2, показали большую вариабельность - от 2,0 до 3,0% [184, 191].

Однако в 1995 году от ребенка с апластической анемией и дефицитом глюкоза-6-фосфат-дегидрогеназы был выявлен вариант B19V, названный V9, нуклеотидная последовательность которого отличалась от ранее известных штаммов B19V на 11,0% [133]. Два изолята вируса, LaLi и НаАМ, представляющие другой генотип B19V, были обнаружены в образцах кожи здоровых людей, и еще один вариант А6, схожий с LaLi и НаАМ, идентифицировали у ВИЧ-инфицированного [12, 54, 96].

Анализ нуклеотидной последовательности NSl/VPlu региона разных вариантов эритровирусов показал, что штаммы можно распределить по трем филогенетическим кластерам (рис 3). На основе этого исследования Servant А. с соавторами предложили классифицировать В19 как генотип 1 эритровируса (прототипный штамм Pvbaua), новые штаммы А6 и К71 - как генотип 2

(прототипный штамм LaLi), а вариант D91.1 - как генотип 3 (прототипный штамм V9) [73].

Дивергенция нуклеотидной последовательности V9 от последовательности штаммов В19 (V9-B19) составляет 10,5-12,0%, V9-LaLi -7,6-8,9%, B19-LaLi - 6,4-7,9%, при этом основные различия расположены в 5 позиции VPlu региона, однако вариабельность в последовательности не ограничивается этим участком, а разбросана по всему геному [73]. Сильные вариации наблюдаются в зоне промотора, в которой три вирусных генотипа отличаются друг от друга более чем на 20,0%. Дивергенция последовательностей гена NS1 между разными генотипами составляет около 13,0% на нуклеотидном уровне и около 6,0% на аминокислотном [128]. Расхождения в нуклеотидных последовательностях, кодирующих капсидные белки VP1 и VP2, между штаммами генотипов 1 (В 19), 2 (LaLi) и 3 (D91.1, V9) существенно выше (9,0-12,0%), чем различия в аминокислотных последовательностях этих белков (1,1-1,4%), что указывает на синонимичность большинства нуклеотидных замен. Выявленные различия в последовательностях не затрагивают антигенные свойства, что позволяет отнести B19V разных генотипов к одному серотипу [32].

Дальнейший филогенетический анализ показал наличие двух субтипов (За, ЗЬ) внутри генотипа 3, соответствующих прототипам штаммов V9 и D 91.1, соответственно [98, 190]. Эти субтипы показали дивергенцию в нуклеотидных последовательностях более 4,0%. Недавно Toan N.L. с соавторами при исследовании региона, кодирующего NS1/VP1/VP2, выделили два кластера внутри генотипа 1 (la, Ib), нуклеотидная дивергенция между которыми составила 5,0-6,0%, при этом внутри каждой субгруппы различия между штаммами не превышали 2,0% [158]. В 2010 году был выявлен новый вариант вируса генотипа 1, формирующий кластер, отличный от вариантов 1а и Ib [74].

Генотип 2

0.1

Рис. 3. Филогенетическое дерево B19V [73].

Генетическое разнообразие B19V генотипа 1 было описано ранее. В 1987 году Mori J. с соавторами впервые на основе рестрикционно-ферментного анализа выделили четыре геномных типа штаммов B19V [191]. Umene & Nunoe с помощью метода ПДРФ также продемонстрировали генетическую вариабельность изолятов B19V. Kerr с соавторами выделили 6 субтипов (la, lb, 2-5) среди штаммов B19V генотипа 1 на основе SSCP-анализа [22].

B19V, в отличие от других ДНК-содержащих вирусов, имеет высокую частоту возникновения эволюционно значимых замен в ДНК, более

характерную для РНК-содержащих вирусов, что объясняет наблюдаемое генетическое разнообразие [169, 190].

1.3 Патогенез 1.3.1 Жизненный цикл и тропизм вируса

Жизненный цикл B19V включает в себя следующие стадии: связывание вируса с рецепторами клетки-хозяина, проникновение в клетку, транслокация генома в клеточное ядро, репликация ДНК, транскрипция РНК, трансляция, сборка капсида и упаковка генома, выход зрелых вирионов, сопровождающийся лизисом клетки-хозяина [79].

Р-антиген (или глобозид), экспрессирующийся на поверхности клеток-предшественников эритроцитов, выступает как рецептор для прикрепления вируса [38]. Было показано, что у 1 из 200 ООО человек отсутствует эритроцитарный Р-антиген, в связи с этим инфицирование таких людей эритровирусом невозможно [51, 176]. Однако присутствие Р-антигена не достаточно для объяснения тропизма B19V. Р-антиген также присутствует на поверхности мегакариоцитов, эндотелиальных клеток, миоцитах плода, клетках печени, почек, сердца, легких, при этом ни в одном из этих типов клеток репликация вируса не наблюдалась. Проведенные исследования с плазмидами, содержащими геном B19V, показали, что в этих клетках, возможно, блокируется синтез полноразмерных транскриптов, приводя к экспрессии цитотоксического NSI, а не к формированию капсидных белков. Кроме того, уровень экспрессии Р-антигена не коррелирует с эффективностью связывания вируса с клеткой, указывая на существование предполагаемого клеточного корецептора для проникновения вируса в клетку [51]. Недавно в качестве необходимого корецептора были описаны а5р1-интегриновый комплекс и Ки80 [11, 111, 116, 211]. Роль этих корецепторов остается неясной, но предполагается, что они необходимы для проникновения вируса [36, 116].

Фиксация В19V с комплексом рецептор/корецептор приводит к структурным изменениям в капсиде, и вирус проникает в цитоплазму клетки с помощью эндоцитоза [36, 198]. Эндоцитозные везикулы, содержащие вирус, перемещаются к периферии ядра. Низкий уровень pH в везикулах приводит к конформационным изменениям, которые позволяют VP1 области, особенно РЬА2-домена, экспонироваться на поверхности вируса. РЬА2-домен воздействует на мембраны эндоцитозной везикулы, при этом вирусные частицы освобождаются в непосредственной близости от ядерной мембраны. Через поры ядерного комплекса происходит транслокация вирусного генома в ядро [18].

Вирусный белок NS1 активирует транскрипцию путем вовлечения транскрипционных факторов инфицированной клетки и участвует в репликации, проявляя свойства хеликазы и эндонуклеазы. Вирусная репликация может усиливаться за счет факторов внешней среды, таких как увеличение концентрации кислорода или экспрессия аденовирусных трансактиваторов [18]. Было показано, что репликация B19V возможна в непермиссивных клетках, таких как клетки респираторного тракта, в присутствии аденовирусов [197].

Эритровирус обладает способностью сохраняться после первичной инфекции в различных тканях человека, включая синовиальную ткань, кожу, печень, мозг, мышцы и миокард, в течение нескольких лет или всей жизни, однако механизм персистенции и типов клеток, вовлеченных в нее, до сих пор неизвестен [32, 53, 97]. Norja Р. с соавторами определили персистенцию вирусной ДНК в тканях как «биопортфолио», дающее важную информацию для изучения эволюции и молекулярной эпидемиологии вируса [33].

1.3.2 Культивирование парвовируса В19

В культурах клеток, обычно используемых в лабораторной практике, эритровирус не размножается. В19У был культивирован в клетках-

предшественниках эритроцитов из различных источников, включая клетки костного мозга человека, печени плода, пуповинной и периферической крови. Во всех системах культивирования для вирусной репликации необходим эритропоэтин, возможно, для поддержания скорости деления предшественников эритроцитов [79].

B19V может также размножаться в некоторых специализированных линиях клеток: линии клеток мегакариобластов (МВ-02, UT-7/Epo) [71, 192] и линии клеток-предшественников эритроцитов (JK-1, KU812Ep6) [107, 194]. Эти линии используют для изучения механизмов репликации, нейтрализации и анализа инфекционности [107, 167]. Однако во всех этих культурах происходит незначительное накопление вируса, поэтому они не могут быть применены с целью получения антигена для диагностических тестов.

1.3.3 Цитопатология

Цитопатический эффект при инфицировании клеток-предшественников эритроцитов эритровирусом человека и in vivo, и in vitro проявляется в виде формирования гигантских пронормобластов, впервые описанных в 1948 году при исследовании костного мозга пациентов с кратковременным апластическим кризом. Гигантские пронормобласты - ранние эритроидные клетки с диаметром от 25 до 32 цт, которые содержат эозинофильные внутриядерные включения и характеризуются цитоплазматической вакуолизацией [40, 101, 113, 138]. При исследовании методом электронной микроскопии таких клеток наблюдаются цитопатические ультраструктурные изменения, включая псевдоподные образования, примембранное расположение хроматина и наличие вирусных частиц в ядре [58].

1.3.4 Патогенез и иммунный ответ

Парвовирусная инфекция имеет бифазное клиническое течение. В первую неделю после инфицирования у взрослых наблюдается повышение

температуры, недомогание, миалгия, зуд. Через 17-18 дней начинается вторая фаза, которая характеризуется сыпью, зудом и артралгией [79].

Виремия развивается в течение первой недели после инфицирования, при

этом концентрация вирусной ДНК в крови достигает экстремально высоких

12

титров (более 10 копий/мл). В этот период наблюдается падение количества ретикулоцитов до неопределяемого уровня, и, как следствие, снижение содержания гемоглобина, которое восстанавливается спустя 7-10 дней [55].

При инфицировании В19У доминирует гуморальный иммунный ответ. Продукция специфических противовирусных антител рассматривается как важнейший механизм иммунной защиты. Интерференция антител с вирионом, связанным с клеточной поверхностью, приводит к блокированию сайта связывания рецептора или конформационным изменениям в структуре вируса, обеспечивая нейтрализующий эффект. Картирование антигенной поверхности вируса может выявить функциональные области, которые ответственны за распознавание рецептора, связывание и проникновение в клетку [111].

Антитела класса М (^М) появляются через 10-12 дней и могут персистировать в течение 5 месяцев. Первыми появляются к линейным и конформационным эпитопам УР1 и УР2. При этом ^М к минорному капсидному белку УР1 могут циркулировать несколько дольше, по сравнению с другими специфическими 1§М [68].

Также определяются антитела класса А (1§А), которые, возможно, обеспечивают протективный иммунитет против заражения назофарингеальным путем [90].

Зрелый иммунный ответ характеризуется повышением авидности, при этом преобладающими становятся антитела класса в (^в), а основной мишенью УР1. ^О обнаруживаются через две недели после инфицирования и циркулируют в течение всей жизни, обеспечивая иммунитет против вторичной инфекции (рис 4). Антитела к линейным эпитопам УР2 и, в некоторой степени,

к VP1 резко исчезают после выздоровления, тогда как IgG к конформационным эпитопам VP1 и VP2 циркулируют в течение всей жизни [76, 100].

Была изучена и оценена значимость антител к неструктурному белку NS1. Присутствие IgG к NS1 изначально ассоциировалось с персистентной В19 инфекцией, однако существенных различий в уровне этих антител между контрольной группой и пациентами с хронической парвовирусной инфекцией выявлено не было. NS1 содержит три антигенных региона (позиция 191-206, 271-286, 371-386 а.о.), которые имеют одинаковую реактивность с сыворотками как здоровых людей, перенесших парвовирусную инфекцию, так и пациентов с персистенцией вируса. Содержание антител к NS1 уменьшается после элиминации вируса, поэтому наличие IgG к NS1 может служить маркером недавней инфекции совместно с детекцией IgG к линейным эпитопам VP2 [51].

Иммунопатологическим феноменом, возникающим в течение или после парвовирусной инфекции, является продукция аутоантител, приводящим к развитию аутоиммунных заболеваний [46, 88].

0 7 14 21 28 2 4 6

ДЕНЬ МЕСЯЦ

Рис. 4. Динамика изменения циркуляции генетических и серологических маркеров в крови после инфицирования парвовирусом В19 [79].

1.4 Клинические аспекты парвовирусной инфекции

Клинические проявления парвовирусной инфекции зависят от иммунологического и гематологического статуса хозяина [43].

1.4.1 Проявления инфекции у здоровых лиц

Асимптоматическая инфекция. Субклиническая парвовирусная инфекция встречается довольно часто и у детей и у взрослых. Было показано, что у 2550% инфицированных заболевание протекало в отсутствии клинических симптомов. В некоторых случаях возникают неспецифические проявления инфекции, сходные с симптомами острых респираторных заболеваний [47, 79, 195].

Эритема инфекционная. Эритема инфекционная, или «пятая болезнь», наиболее часто встречается у детей. Это заболевание было широко известно до открытия B19V. Позже было установлено, что данный вирус является этиологическим агентом эритемы [68].

Продромальные симптомы часто остаются незамеченными, но могут проявляться в виде лихорадки, ринита, головной боли и тошноты. «Пятая болезнь» характеризуется лицевой эритемой средней интенсивности («след пощечин») и бледностью кожи вокруг рта, которые проявляются через 18 дней после инфицирования.

Вторая стадия, включающая сыпь на теле и конечностях, начинается на 1 -4 дня позже. Сыпь имеет вид розовых пятен, которые начинают бледнеть от центра к периферии, образуя своеобразный сетевидный рисунок. Возможны рецидивы высыпаний под действием солнечного света, перегрева, растираний и при эмоциональных стрессах и перегрузках. Также эритема может сопровождаться зудом, чешуйчатым дерматитом и образованием везикул. Симптомы этой болезни имму но логически опосредованы, так как связаны с формированием и накоплением иммунных комплексов в коже и других местах организма [213].

Артропатии. В 1985 году была установлена связь между артропатиями и эритровирусом В19 [86, 95]. Атралгия и артрит - основные проявления парвовирусной инфекции у взрослых, наблюдаемые у 60% женщин и 30% мужчин, при этом кожные проявления встречаются крайне редко и нехарактерны для данной возрастной категории [68, 110].

При артропатиях происходит симметричное поражение суставов, особенно рук и иногда лодыжек, колен и запястья, схожее с ревматоидным артритом. Однако артропатии, ассоциированные с B19V, исчезают через несколько недель, и даже при дальнейшем проявлении симптомов в течение нескольких месяцев или лет не происходит разрушения суставов [213]. Артропатии, вероятно, также иммунологически опосредованы, так как начало их проявлений совпадает с появлением циркулирующих антител. Также существует предположение, что развитие артропатий может быть связано с развитием аутоиммунных реакций, вызванных эритровирусом В19, которые проявляются в виде формирования антифосфолипидных антител, выявляемых в большом количестве у людей с парвовирусной инфекцией [51, 189].

Парвовирусная инфекция во время беременности. Открытие B19V, как этиологического агента неиммунных водянок плода, инициировало начало исследований о возможной роли этого вируса в патологии беременности. Было показано, что парвовирус связан с врожденными анемиями, самопроизвольными абортами, мертворождением [20, 108]. Первичная парвовирусная инфекция была выявлена у 1-5% беременных, с последующей трансплацентарной передачей в 24-33% случаев. Риск развития водянки плода после инфицирования, по разным данным, составляет до 24%, но в соответствии с недавно проведенными исследованиями частота случаев, возможно, существенно ниже: от 1,0 до 1,6%. Неиммунные водянки плода встречаются довольно редко (1:3000), из них 15-20% вызваны эритровирусом В19 [79].

Неврологические заболевания. Выявлено небольшое количество случаев неврологических симптомов, ассоциированных с эритемой инфекционной [16, 17, 37]. Специфические антитела и ДНК вируса были обнаружены в крови и цереброспинальной жидкости при энцефалопатиях и асептических менингитах. Механизм неврологических проявлений неизвестен, но предполагается, что он иммунологически опосредован, т.е. связан с формированием и накоплением иммунных комплексов [79, 80].

Миокардиты. Клинически значимые миокардиты были диагностированы у небольшого количества детей и взрослых. Выделение специфической ДНК из ядра миоцитов продемонстрировало тропизм В19У к клеткам сердца [29, 81].

Гепатиты. Несмотря на то, что описаны случаи выявления ДНК эритровируса в гепатоцитах и возникновения фульминантных гепатитов при парвовирусной инфекции, дискуссии о роли В19У в развитии заболеваний печени продолжаются [12, 193].

1.4.2 Парвовирусная инфекция у лиц с иммуннодефицитными состояниями и гематологическими заболеванями

Кратковременный апластический криз (первое заболевание, ассоциированное с В19У) был описан у пациентов с гемолитической анемией. Временная супрессия эритропоэза наблюдается при всех проявлениях парвовирусной инфекции, но при этом уровень гемоглобина остается стабильным [213]. Апластический криз характеризуется развитием тяжелой анемии, вызванной резким снижением продукции эритроцитов и усилением их деструкции на фоне таких заболеваний, как дефицит железа, врожденная анемия, талассемия, сфероцитоз, ферментные патологии, серповидноклеточная анемия, малярия, хроническая аутоиммунная анемия. В 70-80% случаев апластический криз вызван эритровирусом В19 [92].

Персистентная парвовирусная инфекция. Основа развития персистентной парвовирусной инфекции - дефекты в продукции иммуноглобулинов, которые

характеризуются отсутствием формирования протективных антивирусных антител или присутствием IgM и IgG с низкой аффинностью [97]. При отсутствии антивирусного иммунитета не наблюдается клинических признаков «пятой болезни», так как комплекс «антиген-антитело» не формируется, при этом виремия может наблюдаться от 10 месяцев до 5 лет [70, 156]. В таких случаях инфицирование может проявляться в виде парциальной аплазии эритроцитов, которая характеризуется резким подавлением продукции эритроцитов, приводя к развитию хронической анемии. Предрасполагающими условиями для ее возникновения при парвовирусной инфекции являются лимфотическая лейкемия, острая миелоидная лейкемия, лимфобластомная лимфома, ВИЧ-инфекция, трансплантация костного мозга и других органов, стероидная и химиотерапия, дефектный антительный ответ и другие [213].

Тем не менее, персистентная инфекция может развиваться и у здоровых лиц, таких как доноры крови. В данном случае персистенция не связана с нарушениями в иммунной системе, а имеет иной механизм. Способность эритровируса сохраняться в разных тканях организма формирует «депозит ДНК B19V», который может являться источником персистентной репликации [92]. Кроме того, важную роль могут играть мутации вируса, ведущие к изменению антигенных эпитопов, вследствие чего антитела не могут связываться с вирусом [184].

1.5 Диагностика парвовирусной инфекции

B19V можно обнаружить при электронной микроскопии, но основными методами диагностики парвовирусной инфекции являются иммуноферментный анализ (ИФА) для выявления специфических антител к структурным и неструктрурным белкам вируса, полимеразная цепная реакция (ПЦР) или прямая гибридизация для обнаружения вирусного генома.

Гибридизация применяется или в слот-блот или в дот-блот формате с использованием в качестве зонда для связывания ДНК в клинических пробах

полноразмерного вирусного генома, меченного Р, дигоксигенином или биотином. Из-за невысокой чувствительности данного метода (~105 копий/мл) низкие уровни вирусной нагрузки не могут быть выявлены [24, 60, 96].

ПЦР имеет существенно более высокую чувствительность, позволяя обнаружить вирусную ДНК не только в сыворотке крови, но и в тканях. ДНК эритровируса В19 может выявляться длительный период времени в сыворотке крови, синовиальных мембранах, костном мозге даже у здоровых людей [93, 105, 121]. Поэтому присутствие низких уровней ДНК не может служить маркером острой парвовирусной инфекции. ПЦР является диагностическим инструментом для идентификации возможных новых изолятов эритровируса [51]. Однако генетическая вариабельность В19У создает определенные проблемы для молекулярной диагностики заболеваний, вызванных эритровирусами генотипов 2 и 3. Это связано с тем, что многие коммерческие тест-системы направлены на выявление В19У генотипа 1, поэтому возможно получение ложноотрицательных результатов из-за различия между праймерами и ДНК-мишенями [79].

Несмотря на то, что анализ, основанный на выявлении ДНК, является важным для диагностики инфекции у людей с иммуносупрессией (в отсутствии антительного ответа) и кратковременным апластическим кризом (перед появлением антител), диагностика эритемы инфекционной и артропатий, индуцированных эритровирусом В19, основана на выявлении специфических антител.

Серологические исследования показали, что, несмотря на генетическое разнообразие, эритровирусы человека принадлежат к одному серотипу, поэтому иммуноферментный анализ способен выявлять антитела к В19У 1-3 генотипов [32, 170].

Так как вирус не может эффективно реплицироваться в культуре клеток, для диагностики антител используют вирусные капсиды, выделенные из сыворотки крови с высоким титром, или антигены В19У, экспрессированные в

бактериях и клеточных линиях [31, 55, 182]. В основном для получения VP1 и VP2 антигенов, применяемых для производства иммуноферментных тест-систем, используют линии клеток насекомых с рекомбинантным бакуловирусом. Этот рекомбинантный антиген неинфекционен, а при серологических исследованиях дает такие же результаты, как при использовании нативного вируса [9, 183].

Прямой иммуноферментный анализ для выявления IgM предназначен для диагностики текущей инфекции. Тесты, использующие непрямой метод для выявления IgM, менее значимы из-за снижения чувствительности и специфичности [39, 67, 181]. В противоположность, для детекции IgG можно использовать как прямой, так и непрямой методы ИФА. IgG появляются спустя две недели после инфицирования и сохраняются всю жизнь, хотя уровень IgG может со временем снижаться. Выявление этих антител не является важным для диагностики острой инфекции, за исключением пациентов с отклонениями в иммунной системе, у которых антитела класса М могут не продуцироваться [15,76].

Диагностическая значимость выявления антител к NS1 остается дискуссионной [25, 26].

1.6 Эпидемиология и трансмиссия

Парвовирусная инфекция широко распространена. Антитела к B19V выявляются у 2-15% детей в возрасте от 1 года до 5 лет, у 15-60% - в возрасте от 6 до 19 лет, у 30-60% взрослого населения и свыше 80% - в возрасте старше 75 лет [79, 145, 187]. Таким образом, количество серопозитивных лиц увеличивается с возрастом. Однако основным источником распространения инфекции являются дети [51].

Пик случаев эритемы инфекционной приходится на последние месяцы зимы и раннюю весну. Эпидемический подъем происходит раз в 3-4 года и сопровождается увеличением количества детей с эритемой инфекционной или

случаев кратковременного апластического криза [79, 214]. При эпидемической вспышке 10% случаев эритемы или вызванного B19V апластического криза наблюдается у детей младше 5 лет, в 70% случаев - у детей от 5 до 15 лет и у 20% подростков старше 15 лет [23].

Доступные данные указывают на географическое распределение циркуляции штаммов эритровируса В19 разных генотипов. Доминирование B19V генотипа 1 было выявлено при эпидемиологических исследованиях в Великобритании, Дании, Финляндии, Южной Африке, Бразилии [32, 53, 75, 97].

ДНК B19V генотипа 2 была идентифицирована в образцах тканях от пациентов из некоторых европейских стран (Германии, Италии, Финляндии), США и Бразилии [43, 185, 190]. В Центральной и Северной Европе ДНК B19V генотипа 2 наиболее часто встречается в тканях людей пожилого возраста. Этот факт указывает на то, что вирусы 2-го генотипа циркулировали в этом регионе до 70-х годов прошлого столетия, после чего B19V генотипа 2 были вытеснены из циркуляции штаммами эритровируса В19 генотипа 1 и в последующем появляются лишь спорадически. Недавно B19V 2-го генотипа был обнаружен у 11-летнего пациента из Южной Африки, не являющегося реципиентом крови и её компонентов, что предполагает продолжающуюся циркуляцию штаммов эритровируса В19 генотипа 2 на этой территории [74].

B19V генотипа 3 эндемично встречаются в Западной Африке, а также спорадически выявляются во Франции, в центральном регионе Бразилии, Нигерии, Буркина-Фасо, Болгарии, Греции [32, 53, 97, 127, 157, 185]. Единичные случаи парвовирусной инфекции, вызванной штаммами эритровируса 3-го генотипа, были идентифицированы в Великобритании и США [49, 59, 190]. Предполагается, что B19V 3-го генотипа распространяются из Африки, и их выявление среди европейцев связано с существенным притоком эмигрантов из западно-африканского региона [33, 157].

Парвовирусная инфекция передается воздушно-капельным путем, однако существует трансмиссия B19V парентеральным путем при введении

инфицированных компонентов и препаратов крови и вертикальным - от матери к плоду. ДНК B19V выявляется в респираторных секретах в период виремии, предполагая передачу вируса воздушно-капельным путем. Вертикальная передача встречается во время беременности, являясь следствием первичной материнской инфекции [79]. Описаны случаи нозокомиальной трансмиссии среди сотрудников лаборатории при работе с нативным вирусом [117, 118]. B19V может также передаваться при трансплантации органов, особенно костного мозга [163].

Зафиксированы высокая частота сероконверсии и значительное число случаев симптоматического заболевания, вызванного введением крови и ее дериватов, содержащих B19V [53, 65, 148, 149, 171, 195, 203]. Такой путь трансмиссии B19V связан с двумя основными вирусными характеристиками: бессимптомная персистентная инфекция и пролонгированная репликация (до нескольких лет) после первичного заражения [67, 154]. Исследования, проведенные в США, документально доказали, что частота передачи эритровируса при трансфузии составляет 0,12% [146]. Однако выявление вирусной ДНК в крови реципиентов не всегда позволяет однозначно говорить о передаче B19V через трансфузии из-за способности вируса к реактивации у людей с иммунодефицитными состояниями [139].

1.7 Парвовирус В19 и безопасность препаратов крови 1.7.1 Распространенность парвовируса В19 среди доноров

Риск передачи B19V посредством гемотрансфузий или при введении контаминированных продуктов и препаратов крови зависит от распространенности вируса среди доноров.

При серологических исследованиях было выявлено, что в крови более чем 50% доноров присутствуют антитела к B19V. Этот показатель немного отличается между европейскими странами [145, 219].

Существует риск получения крови от донора, находящегося в острой фазе первичной парвовирусной инфекции. В этот период концентрация вируса в крови наиболее высокая (свыше 1013 вирусных частиц/мл). Частота обнаружения ДНК B19V с высокой концентрацией в крови доноров составляет, по разным данным, от 1:3000 до 1:50000, в зависимости от эпидемиологической ситуации в регионе [10, 64, 84, 119, 154].

При появлении гуморального иммунного ответа, вирусная нагрузка в крови быстро снижается до менее 106 копий/мл, при этом ДНК B19V в низких концентрациях может выявлять в течение нескольких месяцев после инфицирования. При исследовании доноров Японии вирусная репликация наблюдалась более трех лет [155]. Анализ, проведенный в Германии и Австрии в период с 2004 по 2006 гг., показал, что количество донаций с низким титром (менее 105 копий/мл) составляет 261,5 : 100000 донаций в год [35].

Опубликовано много работ по оценке распространенности эритровируса В19 среди доноров в разных странах. Результаты этих исследований представлены в таблице 1.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Филатова, Екатерина Викторовна

ВЫВОДЫ

1. Частота выявления ДНК парвовируса В19 среди доноров составила 1,0%. Концентрация вирусного генома в образцах сыворотки крови находилась в

3 6 диапазоне от 1,0x10 до 1,0x10 копий/мл.

2. Антитела класса G к парвовирусу В19 выявлены в 29,7% и 100,0% случаев среди ДНК-негативных и ДНК-позитивных доноров, соответственно. Частота обнаружения вирусспецифических антител класса М среди ДНК-позитивных доноров составила 10,0%.

3. Установлены нуклеотидные последовательности фрагмента NSl/VPlu области генома восьми штаммов парвовируса В19. Показана принадлежность исследуемых штаммов к генотипу 1 субтипу 1а. Выявлено существование двух групп внутри генотипа 1а на основе анализа нуклеотидных последовательностей. Анализ аминокислотных последовательностей показал формирование трех филогенетических линий.

4. Определена частота контаминации парвовирусом В19 производственных пулов плазмы для фракционирования, которая составила 79,5%, при этом содержание вирусного генома превышало уровень инфекционности в 36,6% случаев.

5. Проведен анализ динамики изменения содержания ДНК парвовируса В19 по стадиям технологического процесса. Уровень редукции при получении препаратов альбумина и иммуноглобулина составил (6,36±0,17) logio и (6,98±0,17) logio, соответственно.

6. Доказана безопасность в отношении парвовируса В19 препаратов «Альбумин, раствор для инфузий 10%» и «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутривенного введения», выпускаемых на филиале ФГУП «НПО «Микроген» в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио». Исследование производственных серий показало отсутствие в препаратах генетических маркеров парвовируса В19. Уровень вирусспецифических антител в препаратах иммуноглобулина составил (77,9±33,6) МЕ/мл.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лечебные препараты альбумина и иммуноглобулина, так же как и другие препараты, получаемые из плазмы крови, могут быть потенциально опасны в отношении передачи возбудителей инфекционных заболеваний, поэтому их производство требует комплексного подхода для предотвращения контаминации патогенами конечного продукта. Несмотря на успехи, достигнутые в области повышения вирусной безопасности лечебных препаратов из плазмы крови в отношении вирусов гепатитов В, С и ВИЧ, всё большую озабоченность производителей вызывают так называемые «неактуальные» гемотрансмиссивные агенты, одним из которых является парвовирус В19 (семейство Рап>оутс1ае, род ЕгуЖгоуггш).

В19У является этиологическим агентом парвовирусной инфекции, характеризующейся разнообразными клиническими проявлениями: от бессимптомного течения до тяжелых анемий и мертворождения. Тропность вируса к эритроидным клеткам предусматривает его передачу через кровь, её компоненты и препараты, полученные из плазмы крови. Для снижения риска инфицирования парвовирусом В19 реципиентов препаратов крови зарубежными производителями была разработана многогранная стратегия безопасности, включающая в себя идентификацию групп риска, тестирование донорской крови и валидацию вирусинактивирующих технологий.

В России данная проблема пока остается вне поля зрения отечественных производителей. Цель настоящей работы заключалась в комплексном исследовании парвовируса В19 при оценке безопасности препаратов альбумина и иммуноглобулина, получаемых из плазмы крови доноров.

Риск получения препаратов крови, контаминарованных В19У, зависит от распространенности данного патогена среди доноров. Поэтому на первом этапе работы была определена частота выявления генетических и серологических маркеров В19У среди доноров. Было исследовано 1000 образцов сыворотки крови, полученных с Нижегородской областной станции переливания крови им.

Н.Я. Климовой. Тестирование на выявление ДНК B19V проводили методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.

Основываясь на данных зарубежной литературы, указывающей на генетическое разнообразие исследуемого вируса и неспособность некоторых коммерческих тест-систем выявлять B19V 2-го и 3-го генотипов, нами была проведена апробация набора реагентов для обнаружения ДНК B19V «АмплиСенс Parvovirus B19-FL» с помощью Международной референс-панели ВОЗ, включающей ДНК B19V 1-3 генотипов. Было продемонстрировано, что используемая тест-система способна идентифицировать эритровирусы всех известных генотипов и может быть использована для решения поставленных задач.

Сыворотки крови доноров тестировали в формате минипулов. Было сформировано 100 минипулов, включающих в себя 10 образцов каждый. Выявлено 10 позитивных минипулов, каждый из которых содержал по одному положительному образцу. В ДНК-позитивных пробах была определена

3 6 концентрация вирусного генома, которая варьировала от 1,0x10 до 1,0x10 копий/мл. Таким образом, в проведенном нами исследовании частота выявления ДНК B19V среди доноров составила 1,0%, что коррелировало с результатами, описанными в зарубежной литературе.

Важную роль в предотвращении гемотрансмиссивного инфицирования эритровирусом В19 играют специфические антитела, обладающие выраженной нейтрализующей активностью. IgG к B19V могут содержаться не только в крови реципиента, но и в крови донора. В связи с этим в исследуемых образцах было определено наличие и количественное содержание вирусспецифических антител классов G и М к B19V. Установлено, что IgG к B19V присутствовали в 29,7%) проб, не содержащих ДНК B19V. Специфические IgM, указывающие на острую фазу инфекции, в представленной группе не обнаружены. Во всех образцах, содержащих ДНК B19V, были выявлены IgG к В19У, при этом в одной пробе идентифицированы также и IgM, что коррелировало с более высоким уровнем вирусной нагрузки.

В серопозитивных образцах, не содержащих и содержащих ДНК B19V, была определена концентрация IgG к B19V, которая составила 27,5 МЕ/мл (95% CI (19,6-35,4) ME/мл) и 107,3 МЕ/мл (95% CI (55,7-158,9) МЕ/мл), соответственно. Уровень IgG в ДНК-негативной группе был достоверно ниже, чем в ДНК-позитивной (р<0,0001). При последующем анализе было выявлено, что у 70% ДНК-позитивных образцов уровень вирусной нагрузки не превышал 1,0x104 копий/мл, при этом концентрация протективных антител лежала в диапазоне 64,7±17,5 МЕ/мл, что является оптимальным соотношением, способным предотвратить гемотрансмиссивное инфицирование.

Следующий этап работы был направлен на установление генотипа и филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генома штаммов B19V, выделенных из образцов сыворотки крови доноров. Из-за недостаточного количества материала в двух пробах, генотип B19V определен для 8 из 10 штаммов.

Для решения поставленной задачи был выбран NSl/VPlu участок ДНК B19V, который является наиболее подходящим для анализа, так как включает генетическую информацию о 3-х вирусных протеинах: NS1, 7,5 kDa-протеин и YP1, охватывающих два основных нейтрализующих эпитопа, и обладает существенной дивергенцией между штаммами B19V 1-3 генотипов. Были подобраны праймеры, фланкирующие NSl/VPlu область генома эритровируса В19. Выбранный участок ДНК B19V амплифицировали в «nested» варианте ПЦР. Нуклеотидные последовательности полученного фрагмента NSl/VPlu области ДНК B19V размером 692 п.н, установленные методом частичного секвенирования генома, использовали для определения генотипа B19V с помощью онлайн-сервиса BLAST по уровню гомологии с нуклеотидными последовательностями близкородственных штаммов. Было продемонстрировано, что все выявленные изоляты B19V относились к генотипу 1 субтипу 1а. На основе филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей NSl/VPlu области генома было показано разделение исследуемых штаммов на две группы внутри генотипа 1а и выявлено формирование трех филогенетических линий при сравнении аминокислотных последовательностей.

Установленные нуклеотидные последовательности фрагментов NSl/VPlu области генома B19V были депонированы в международной базе данных GenBank под номерами JQ518457-JQ518464, что позволило расширить базу данных нуклеотидных последовательностей штаммов эритровируса В19, циркулирующих на территории Российской Федерации.

Полученные результаты по определению частоты выявления генетических маркеров ДНК B19V в крови доноров свидетельствуют о возможности попадания вируса в стартовые пулы плазмы, формирование которых из нескольких сотен-тысяч донаций является одним из основных этапов промышленного получения препаратов альбумина и иммуноглобулина. Нами была поставлена задача, которая заключалась в определении частоты контаминации производственных пулов плазмы для фракционирования парвовирусом В19.

Было проанализировано 117 образцов котловых загрузок трех отечественных производителей препаратов крови. ДНК B19V обнаружена в 79,5% случаев. Последующая количественная оценка показала, что 36,6% производственных пулов содержали вирусный геном в концентрации, превышающей уровень инфекционности B19V, равный 104 копий/мл. Было установлено, что среди ДНК-позитивных пулов в 9,7% случаев концентрация

6 8 ДНК B19V составляла более 1,0x10 копий/мл, а в 5,4% случаев - более 1,0x10 копий/мл.

Известно, что присутствие вируснейтрализующих антител способно существенно снизить инфектогенность плазмы. Исследуемые производственные пулы были протестированы на наличие IgG к B19V. В серопозитивных образцах было определено количественное содержание вирусспецифических антител.

Среди образцов производственных пулов, не содержащих вирусную ДНК, были выявлены в 29,2% случаев, что согласуется с полученными нами данными о частоте обнаружения антител к В19У среди ДНК-негативных доноров, которая составила 29,1%. Учитывая относительно низкое содержание ДО к В19У в данной группе доноров (27,5 МЕ/мл (95% С1 (19,6-35,4)) МЕ/мл), пулирование плазмы могло привести к снижению концентрации специфических антител до неопределяемого уровня.

Производственные пулы плазмы для фракционирования, контаминированные В19У, были разделены на две группы в зависимости от концентрации вирусного генома в пуле. Каждую группу исследовали отдельно на содержание серологических маркеров. В образцах котловых загрузок с концентрацией ДНК В19У, не превышающей уровень инфекционности (104 копий/мл), 1§С к В19У выявлялись в 54,2% случаев, в то время как в пулах с содержанием вирусного генома более 104 копий/мл серопозитивность по составила 32,4%.

При определении количественного содержания антител, как в ДНК-негативных, так и в ДНК-позитивных производственных загрузках, было установлено, что средний уровень в серопозитивных пулах был примерно одинаковым и составил 8,3 МЕ/мл (95% С1 (7,5-20,0) МЕ/мл).

Анализ производственных загрузок, контаминированных В19У, показал, что в 53,8% случаев к В19У не выявлялись. Возможно, это связано с тем, что антитела к В19У, обладающие нейтрализующей активностью, находятся в составе иммунных комплексов и не могут быть выявлены методом ИФА. Однако присутствие свободных антител в ДНК-позитивных пулах не обязательно говорит о полной нейтрализации вируса и не гарантирует получение препаратов крови безопасных в отношении В19У.

Таким образом, на данном этапе работы было установлено, что частота контаминации производственных пулов В19У составила 79,5%, при этом концентрация вирусного генома превышала уровень инфекционности в 36,6% случаев, что предполагает возможность попадания вируса в конечный продукт.

Процесс спиртового фракционирования является одним из основных этапов, обеспечивающих вирусную редукцию. Кроме того, современные технологии получения препаратов из плазмы крови доноров включают в себя стадии, направленные на инактивацию и/или элиминацию патогенов.

Для оценки влияния технологических воздействий на вирусную нагрузку при получении препаратов альбумина и иммуноглобулина было проведено модельное фракционирование пулов плазмы, содержащих ДНК В19У (п=20), по модифицированному методу Кона-Онкли в лабораторных условиях с использованием этанола в качестве фракционирующего агента.

Исходная концентрация вирусной ДНК в модельных пулах составляла в среднем (8,31±0,17) 1о§ю копий/мл. В процессе фракционирования плазмы с помощью этанола наблюдалось распределение вируса между фракциями. Так на стадии отделения глобулинов от альбумина средняя концентрация ДНК В19У в осадке А (фракция И+Ш) и центрифугате А (фракция У), полученных в процессе центрифугирования, составила (8,49±0,34) к^ю копий/г и (4,55±0,22) копий/мл, соответственно. При формировании осадка А1 концентрация ДНК В19У существенно не изменилась и составила (8,43±0,35) 1о£ю копий/г. На последующих стадиях фракционирования, было выявлено, что в осадке Б (фракция III) содержание ДНК В19У равнялось (8,60±0,26) к^ю копий/г, в то время как в осадке В (фракция ^в) концентрация ДНК В19У заметно снизилась и составила (4,36±0,26) 1о§10 копий/г.

Постоянное изменение объема или массы получаемых фракций за счет их разбавления или концентрирования в процессе фракционирования не позволяло адекватно оценить вирусную редукцию, которая может быть обеспечена той или иной стадией. В связи с этим нами был определен уровень вирусной нагрузки в каждой исследуемой фракции с учетом объема или массы материала и оценена динамика его изменения по стадиям технологического процесса.

Было продемонстрировано, что фактор вирусной редукции для центрифугата А, являющегося целевой фракцией для производства альбумина, составил (3,52±0,30) 1о§ю, в то время как редуцирующий фактор для осадка А, полученного на этой же стадии, не превышал (1,19±0,39) к^ш

Формирование осадка А1 также не привело к снижению вирусной нагрузки. Однако на заключительной стадии выделения (получение осадка В) редуцирующий фактор увеличился и составил (4,30±0,22)

При получении фракции очищенного ^С (от исходного сырья до осадка В) суммарный фактор вирусной редукции составил (5,69±0,23) к^ю.

Моделирование технологического процесса получения альбумина и иммуноглобулина методом спиртового фракционирования продемонстрировало переход В19У в твердые фракции. Осаждение вируса могло произойти в составе комплексов «антиген-антитело», формирующихся в случае присутствия в пулах плазмы вируснейтрализующих антител, однако уровень антител может быть недостаточным для полной нейтрализации.

Установлено, что спиртовое фракционирование способно обеспечить снижение уровня вирусной нагрузки, но при отсутствии дополнительных стадий, направленных на инактивацию и/или удаление патогенов, не гарантирует безопасность препаратов.

При исследовании образцов фракции ^О после обработки гидроокисью алюминия и инкубации при низком значении рН (4,4 - 4,8) в течение 48 ч при 37°С было выявлено снижение вирусной нагрузки до недетектируемого методом ПЦР уровня. Полученные результаты указывали на эффективность совокупности данных стадий в обеспечении редукции В19У, что согласуется с работами зарубежных авторов.

Суммарный фактор вирусной редукции В19У, определенный в нашем исследовании при получении препарата иммуноглобулина, составил (6,98±0,17) 1оею.

При тестировании методом ПЦР образцов препарата альбумина после инкубации при 60°С в течение 10 ч ДНК В19У не была обнаружена. Применение пастеризации привело к снижению вирусной нагрузки на данном этапе по отношению к стадии получения центрифугата А, при этом редуцирующий фактор составил (2,84±0,22) к^ю.

Суммарный фактор редукции В19У от исходной плазмы до конечного продукта при получении альбумина достиг (6,36±0,17) к^ю.

С помощью модельного фракционирования пулов плазмы, контаминированных парвовирусом В19, по модифицированному методу Кона-Онкли в присутствии дополнительных стадий вирусной инактивации и элиминации были получены препараты альбумина и иммуноглобулина, не содержащие ДНК В19V.

Для подтверждения эффективности используемой технологии в обеспечении безопасности в отношении В19У препаратов альбумина и иммуноглобулина, получаемых из плазмы крови доноров с помощью спиртового фракционирования, нами были исследованы методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени производственные серии препарата «Альбумин, раствор для' инфузий 10%» (п=82) и препарата «Иммуноглобулин человека нормальный, раствор для внутривенного введения» (п=142), выпущенные на предприятии в период с 2008 по 2010 гг. Несмотря на высокую частоту контаминации производственных загрузок плазмы для фракционирования, определенную в настоящем исследовании (79,5%), препаратов, содержащих ДНК В19У, не было выявлено.

При изучении препаратов ИГВВ был дополнительно оценен уровень антител к В19У, обладающих выраженными протективными свойствами. Все исследуемые партии ИГВВ содержали ^О к В19У, концентрация которых варьировала от 23 до 162 МЕ/мл, при этом средний уровень вирусспецифических антител составил (77,9±33,6) МЕ/мл. Отмечено значительное увеличение концентрации вирусспецифических антител в готовых препаратах ИГВВ по сравнению с исходной плазмой, в которой средний уровень составлял 8,3 МЕ/мл (95% С1 (7,5-20,0) МЕ/мл). Вероятно, это связано с распадом иммунных комплексов и концентрированием в процессе спиртового фракционирования.

Способ получения альбумина и ИГВВ из плазмы крови доноров, применяемый на филиале ФГУП «НПО «Микроген» Минздрава. России в г. Нижний Новгород «Нижегородское предприятие по производству бактерийных препаратов «ИмБио», гарантирует безопасность в отношении В19У данных препаратов.

Однако существующие различия в методах производства, в параметрах процесса и в составе композиционных материалов, используемых в качестве белковых протекторов, не позволяют экстраполировать полученные нами данные на технологии получения препаратов крови, применяемые на других предприятиях. Поэтому для подтверждения безопасности в отношении В19У конкретного производства препаратов альбумина и иммуноглобулина необходима валидация процесса, в ходе которой будут оценены эффективность элиминации и инактивации вируса на основных технологических этапах.

Результаты, полученные в настоящей работе, позволяют сказать, что для обеспечения вирусной безопасности препаратов иммуноглобулина и альбумина в отношении парвовируса В19 необходимо выполнение несколько условий, включая: разработку нормативных актов, регламентирующих процедуру скрининга доноров на маркеры парвовируса В19, и организацию скриниговых исследований доноров; определение алгоритма входного контроля плазмы для фракционирования на маркеры B19V на предприятиях по производству препаратов крови; использование для получения препаратов крови технологий, обеспечивающих эффективную элиминацию и инактивацию вирусов в процессе производства; валидацию производственных процессов получения препаратов крови с оценкой уровня редукции патогенов на основных технологических стадиях.

96

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Филатова, Екатерина Викторовна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Анастасиев, В. В. Иммуноглобулин для внутривенного введения / В. В. Анастасиев. - Нижний Новгород : НГМА, 2000. - 168 с.

2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц ; под ред. Н. Е. Бузикашвили, Д. В. Самойлова ; пер. с англ. Ю. А. Данилова. - М. : Практика, 1998.-459 с.

3. Зубкова, Н. В. Сольвент-детергентный метод инактивации вирусов в технологии производства иммуноглобулинов / Н. В. Зубкова (обзор литературы) // Гематология и трансфузиология. - 2010. - №2. - С. 39 - 44.

4. Левин, И. Служба крови и препараты плазмы: (междунар. аналит. обзор). / И. Левин, В. М. Русанов. - М : Медпрактика - М, 2007. - 316 с.

5. Молекулярная эпидемиология парвовирусной инфекции в Республике Беларусь / М. А. Ермолович [и др.] // Вопр. вирусол. - 2010. - № 2. - С. 26 - 31.

6. Оприщенко, С. А. Лечебные препараты крови в современной медицине / С. А. Оприщенко, В. В. Захаров, В. М. Русанов. - М. : Медпрактика - М, 2011. -328 с.

7. Русанов, В. М. Лечебные препараты крови / В. М. Русанов, И. Левин. - М. : Медпрактика, 2004. - 284 с.

8. Русанов, В. М. Фракционирование белков плазмы в производстве препаратов крови / В. М. Русанов, Л. И. Скобелев. - Москва : Медицина, 1983. - 224 с.

9. A genetically engineered cell line that produces empty capsid of В19 (human) parvovirus / S. Kajigaya [et al.] // PNAS - 1989. - Vol. 86, N 19 - P. 7601 - 7605.

10. A linked donor-recipient study to evaluate parvovirus В19 transmission by blood component transfusion / S. H. Kleiman [et al.] // Blood. - 2009. - Vol. 114, N 17.-P. 3677-3683.

11. A murine monoclonal IgM antibody specific for blood group P antigen (globoside) / A. E. von der Borne [et al.] // Br. J. Haematol. - 1986. - Vol. 63, N 1. -P. 35 -46.

12. A new parvovirus genotype persistent in human skin / K. Hokynar [et al.] // J. Virol. - 2002. - Vol. 302, N 2. - P. 224 - 228.

13. A putative nucleoside triphosphate-binding domain in the nonstructural protein of B19 parvovirus is required for cytotoxicity / M. Momoeda [et al.] // J. Virol. -1994. - Vol. 68, N 12. - P. 8443 - 8446.

14. A viral phospholipase A2 is required for parvovirus infectivity / Z. Zadori [et al.] // Dev. Cell. - 2001. - Vol. 1, N 2. - P. 291 - 302.

15. Accurate serodiagnosis of B19 parvovirus infections by measurement of IgG avidity / M. Soderlund [et al.]. // J. Infect. Dis. - 1995. - Vol. 171,N3.-P. 710713.

16. Acute encephalopathy with human parvovirus B19 infection in hereditary spherocytosis / K. Oshima [et al.] // Pediatr. Infect. Dis. J. - 2008. - Vol. 27, N 7. -P. 651 -652.

17. Acute encephalopathy with parvovirus B19 infection in sickle cell disease / S. Bakhshi [et al.] // Arch. Dis. Child. - 2002. - Vol. 87, N 6. - P. 541 - 542.

18. Advances in human B19 erythrovirus biology / A. Servant-Delmas [et al.] // J. Virol. - 2010. - Vol. 84, N 19. - P. 9658 - 9665.

19. Albumin batches and B19 parvovirus DNA / J. J. Lefrere [et al.] // Transfusion. - 1995.-Vol. 35, N5.-P. 389-391. '

20. Al-Khan, A. Parvovirus B-19 Infection During Pregnancy / A. Al-Khan, A. Caligiuri, J. Apuzzio // Infect Dis Obstet Gynecol. - 2003. - Vol. 11, N 3. - P. 175 -179.

21. Analysis of B19 virus contamination in plasma pools for manufacturing by using a competitive polymerase chain reaction assay / G. Gallinella [et al.] // Vox Sang. - 2002. - Vol. 83, N 4. - P. 324 -331.

22. Analysis of nucleotide sequences of human parvovirus B19 genome reveals two different modes of evolution, a gradual alteration and a sudden replacement: a retrospective study in Sapporo, Japan, from 1980 to 2008 / M. Suzuki [et al.] // J. Virol. - 2009. - Vol. 83, N21.-P. 10975- 10980.

23. Anderson, L. J. Role of parvovirus B19 in human disease / L. J. Anderson // Pediatr. Infect. Dis. J. - 1987. - Vol. 6, N 8. - P. 711 - 718.

24. Anderson, M. J. Diagnosis of human parvovirus infection by dot-blot hybridization using cloned viral DNA / M. J. Anderson, S. E. Jones, A. C. Minson // J. Med. Virol. - 1985. - Vol. 15, N 2. - P. 163 - 172.

25. Antibodies to parvovirus B19 NS-1 protein in infected individuals / A. von Podlotzki [et al.] // J. Gen. Virol. - 1995. - Vol. 76, N 3. - P. 519 - 527.

26. Antibodies to the nonstructural protein of parvovirus B19 in persistently infected patients: implication for pathogenesis / A. von Podlotzki [et al.] // J. Infect. Dis. - 1995. - Vol. 172, N 5. - P. 1356 - 1359.

27. Antiphospholipid antibodies in pediatric and adult patients with rheumatic disease are associated with parvovirus B19 infection / P. von Landenberg [et al.] // Arthritis. Rheum. - 2003. - Vol. 48, N 7. - P. 1939 - 1947.

28. Apoptosis of liver-derived cells induced by parvovirus B19 nonstructural protein / B. D. Poole [et al.] // J. Virol. - 2006. - Vol. 80, N 8. - P. 4114 - 4121.

29. Association of parvovirus B19 genome in children with myocarditis and cardiac allograft rejection / K. O. Schowengerdt [et al.] // Circulation. - 1997. - Vol. 96,N 10.-P. 3549-3554.

30. Baylis, S. A. Evaluation of different assays for the detection of parvovirus B19 DNA in human plasma / S. A. Baylis, N. Shah, P. D. Minor // J. Virol. Methods. -2004. - Vol.121, N 1. - P. 7 - 16.

31. Beard, C. Transient expression of B19 parvovirus gene products in COS-7 cells transfected with B19-SV40 hybrid vectors / C. Beard, J. St. Amand, C. R. Astell //Virology. - 1989.-Vol. 172, N2.-P. 659-664.

32. Biological and immunological relations among human parvovirus B19 genotypes 1 to 3 / A. Ekman [et al.] // J. Virol. - 2007. - Vol. 81, N 13. - P. 6927 -6935.

33. Bioportfolio: lifelong persistence of variant and prototypic erythrovirus DNA genomes in human tissue / P. Norja [et al.] // PNAS. - 2006. - Vol. 103, N 19. - P. 7450-7453.

34. Block to the production of full-length B19 virus transcripts by internal polyadenylation is overcome by replication of the viral genome / W. Guan [et al.] // J. Virol. - 2008. - Vol. 82, N 20. - P. 9951 - 9963.

35. Blood donor screening for parvovirus B19 in Germany and Austria / M. Schmidt [et al.] // Transfusion. - 2007. - Vol. 47, N 10. - P. 1775 - 1782.

36. Bonsch, C. Interaction of parvovirus B19 with human erythrocytes alters virus structure and cell membrane integrity / C. Bonsch, C. Kempf, C. Ros // J. Virol. -2008.-Vol. 82, N23.-P. 11784- 11791.

37. Breese, C. Encephalopathy with erythema infectiosum / C. Breese, F. A. Horner // Am. J. Dis. Child. - 1977. - Vol. 131, N 1. - P. 65 - 67.

38. Brown, K. E. Erythrocyte P antigen: cellular receptor for B19 parvovirus / K. E. Brown, S. M. Anderson, N. S. Young // Science. - 1993. - Vol. 262, N 5130. - P. 114-117.

39. Bruu, A. L. Evaluation of five commercial tests for detection of immunoglobulin M antibodies to human parvovirus B19 / A. L. Bruu, S. A. Nordbo // J. Clin. Microbiol. - 1995. - Vol. 33, N 5. - P. 1363 - 1365.

40. Caul, E. O. Intrauterine infection with human parvovirus B19: a light and electron microscopy study / E. O. Caul, M. J. Usher, P. A. Burton // J. Med. Virol. -1988. - Vol. 24, N 1. - P. 55 - 66.

41. Caution in evaluation of removal of virus by filtration: misinterpretation due to detection of viral genome fragments by PCR / M. Tsujikawa [et al.] // J. Virol. Methods.-2011.-Vol. 178, N 1 - 2.-P. 39-43.

42. Characteristics and taxonomy of Parvoviridae / G. Siegl [et al.] // Intervirology.

- 1985. - Vol. 23, N 2. - P. 61 - 73.

43. Characterization of parvovirus B19 genotype 2 in KU812Ep6 cells / J. Bliimel [et al.] // J. Virol. - 2005. - Vol. 79, N 22. - P. 14197 - 14206.

44. Christensen, J. A novel cellular site-specific DNA-binding protein cooperates with the viral NS1 polypeptide to initiate parvovirus DNA replication / J. Christensen, S. F. Cotmore, P. Tattersall // J. Virol. - 1997. - Vol. 71, N 2. - P. 1405

- 1416.

45. Christensen, J. Minute virus of mice transcriptional activator protein NS1 bind directly to the transactivation region of the viral P38 promoter in a strictly ATP-dependent manner / J. Christensen, S. F. Cotmore, P. Tattersall // J. Virol. - 1995. -Vol. 69, N9.-P. 5422-5430.

46. Chronic parvovirus B19 infection induces the production of anti-virus antibody with autoantigen binding properties / C. Lunardi [et al.] // Eur. J. Immunol. - 1998. -Vol. 28, N3.-P. 936-948.

47. Clinical manifestation of human parvovirus B19 in adults / A. D. Woolf [et al.] // Arch. Intern. Med. - 1989. - Vol. 149, N 5. - P. 1153 - 1156.

48. Cloning of the human parvovirus B19 genome and structural analysis of its palindromic termini / V. Deiss [et al.] // Virology. - 1990. - Vol. 175, N 1. - P. 247 -254.

49. Cohen, B. J. Genetic variants of parvovirus B19 identified in the United Kingdom: implications for diagnostic testing / B.J. Cohen, J. Gandhi, J. P. Clewley // J. Clin. Virol. - 2006. - Vol. 36, N 2. - P. 152 - 155.

50. Collaborative study to establish a World Health Organization International genotype panel for parvovirus B19 DNA nucleic acid amplification technology (NAT)-based assays / S. A. Baylis [et al.] // Vox Sang. - 2012. - Vol. 102, N 3. - P. 204-211.

51. Corcoran, A. Advances in the biology, diagnosis and host-pathogen interactions of parvovirus B19 / A. Corcoran, S. Doyle // J. Med. Microbiol. - 2004. -Vol. 53, N6.-P. 459-475.

52. Cryo-electron microscopy studies of empty capsids of human parvovirus B19 complexed with its cellular receptor / P. R. Chipman [et al.] // PNAS. - 1996. - Vol. 93, N 15.-P. 7502-7506.

53. Detection and differentiation of human parvovirus variants by commercial quantitative real-time PCR tests / K. Hokynar [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2004. -Vol. 42, N5.-P. 2013-2019

54. Detection of an erythrovirus sequence distinct from B19 in a child with acute anemia / Q. T. Nguyen [et al.] // Lancet. - 1998. - Vol. 352, N 9139. - P. 1524

55. Detection of antibodies and antigens of human parvovirus B19 by enzyme-linked immunosorbent assay / L. J. Anderson [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1986. -Vol. 24,N4.-P. 522-526.

56. Detection of parvovirus B19 in donated blood: a model system for screening by polymerase chain reaction / F. McOmish [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1993. - Vol. 31,N2.-P. 323-328.

57. Different susceptibility of B19 virus and mice minute virus to low pH treatment / N. Boschetti [et al.] // Transfusion. - 2004. - Vol. 44, N 7. - P. 1079 -1086.

58. Direct demonstration of the human parvovirus in erythroid progenitor cells infected in vitro / N. Young [et al.] // J. Clin. Investig. - 1984. - Vol. 74, N 6. - P. 2024 - 2032.

59. Discovery and analysis of a novel parvovirus B19 genotype 3 isolate in the United States / L. A. Rinckel [et al.] // Transfusion. - 2009. - Vol. 49, N 7. - P. 1488 - 1492.

60. Dot blot hybridization assay of B19 virus DNA in clinical specimens / J. Mori [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1989. - Vol. 27, N 3. - P. 459 - 464.

61. Doyle, S. The immune response to parvovirus B19 exposure in previously seronegative and seropositive individuals / S. Doyle, A. Corcoran // J. Infect. Dis. -2006.-Vol. 194, N2.-P. 154- 158.

62. Effectiveness of nanofiltration in removing small non-enveloped viruses from three different plasma-derived products / M. C. Menconi [et al.] // Transfus. Med. -2009.-Vol. 19, N4.-P. 213-217.

63. Electron microscopic estimation of removal of parvovirus B19 (HB19V) by nanofiltration with a novel filter membrane / K. Yamaguchi [et al.] // J. Membrane Science. - 2007. - Vol. 298, N 1 - 2. - P. 99 - 109.

64. Epidemiology of high-level parvovirus B19 viraemia among Dutch blood donors, 2003-2009 / K. Kooistra [et al.] // Vox Sang. - 2011. - Vol. 100, N 3. - P. 261 -266.

65. Erythroid crisis caused by parvovirus B19 transmitted via red blood cell transfusion / Y. Tsukada [et al.] // Intern. Med. - 2011. - Vol. 50, N 20. - P. 2379 -2382.

66. Evaluation of the virus-elimination efficacy of nanofiltration (Viresolve NFP) for the parvovirus B19 and hepatitis A virus / D. J. Oh [et al.] // Korean J. Lab. Med. - 2010. - Vol. 30, N 1. - P. 45 - 50.

67. Evidence for persistence of human parvovirus B19 DNA in bone marrow / P. Cassinotti [et al.] // J. Med. Virol. - 1997. - Vol. 53, N 3. - P. 229 - 232.

68. Experimental parvoviral infection in humans / M. J. Anderson [et al.] // J. Infect. Dis. - 1985. - Vol. 152, N 2. - P. 257 - 265.

69. False-negative serology in patient with acute parvovirus B19 infection / S. Bredl [et al.] // J. Clin. Virol. - 2011. - Vol. 51, N 2. - P. 115 - 120.

70. Fattet, S. Persistent human parvovirus B19 infection in children under maintenance chemotherapy for acute lymphocytic leukemia / S. Fattet, P. Cassinotti, M. B. Popovic // J. Pediiat. Hematol. One. - 2004. - Vol. 26, N 8. - P. 497 - 503.

71. First continuous propagation of B19 parvovirus in a cell line / S. Shimomura [et al.] // Blood. -1992. -Vol. 79, N 1.-P. 18 - 24.

72. Genetic diversity of human parvovirus B19: sequence analysis of the VP1/VP2 gene from multiple isolates / D. D. Erdman [et al.] // J. Gen. Virol. - 1996. - Vol. 77, N 11.-P. 2767-2774.

73. Genetic diversity within human erythroviruses: identification of three genotypes / A. Servant [et al.] // J. Virol. - 2002. - Vol. 76, N 18. - P. 9124 - 9134.

74. Genetic variants of human parvovirus B19 in South Africa: cocirculation of three genotypes and indentification of a novel subtype of genotype 1 / C. Corcoran [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48, N 1. - P. 137 - 142.

75. Genotyping of human parvovirus B19 among Brazilian patients with hemoglobinopathies / S. N. Slavov [et al.] // Can. J. Microbiol. - 2012. - Vol. 58, N 2.-P. 200-205.

76. Gray, J. J. Detection of human parvovirus B19-specific IgM and IgG antibodies using a recombinant viral VP1 antigen expressed in insect cells and

estimation of time of infection by testing for antibody avidity / J. J. Gray, B. J. Cohen, U. Desselberger // J. Virol. Methods. - 1993. - Vol. 44, N 1. - P. 11 - 23.

77. Groeneveld, K. Blood products and parvovirus B19 / K. Groeneveld, J. van der Noordaa // Neth. J. Med.-2003.-Vol. 61, N5.-P. 154- 156.

78. Heat sensitivity of human parvovirus B19 / M. Yunoki [et al.] // Vox Sang. -2003. - Vol. 84, N 3. - P. 164 - 169.

79. Heegaard, E. D. Human parvovirus B19 / E. D. Heegaard, K. E. Brown // Clin. Microbiol. Rev. - 2002. - Vol. 15, N 3. - P. 485 - 505.

80. Heegaard, E. D. Parvovirus B19 infection associated with encephalitis in a patient suffering from malignant lymphoma / E. D. Heegaard, N. A. Peterslund, A. Hornsleth // Scand. J. Infect. Dis. - 1995. - Vol. 27, N 6. - P. 631 - 633.

81. High prevalence of human parvovirus B19 DNA in myocardial autopsy samples from subjects without myocarditis or dilative cardiomyopathy / T. Schenk [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, N 1. - P. 106 - 110.

82. Higher prevalence of parvovirus B19 in Belgian as compared to Tunisian blood donors: differential implications for prevention of transfusional transmission / M. Letaief [et al.] // Transfus. Sci. - 1997. - Vol. 18, N 4. - P. 523 - 530.

83. High-sensitivity PCR detection of parvovirus B19 in plasma / P. Daly [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40, N 6. - P. 1958 - 1962.

84. High-titer screening PCR: a successful strategy for reducing the parvovirus B19 load in plasma pools for fractionation / T. Weimer [et al.] // Transfusion. - 2001. - Vol. 41, N 12.-P. 1500- 1504.

85. Horowitz, B. Estimating the pathogen safety of manufactured human plasma products: application to fibrin sealants and to thrombin / B. Horowitz, M. Busch // Transfusion. - 2008. - Vol. 48, N 8. - P. 1739 - 1753.

86. Human parvovirus arthropathy / D. G. White [et al.] // Lancet. - 1985. - Vol. 1, N8426.-P. 419-421.

87. Human parvovirus B19 in clotting factor concentrates: B19 DNA detection by the nested polymerase chain reaction / K. Zakrzewska [et al.] // Br. J. Haematol. -1992. - Vol. 81, N 3. - P. 407 - 412.

88. Human parvovirus В19 infection and autoimmunity / C. Lunardi [et al.] // Autoimmun. Rev. - 2008. - Vol .8, N 2. - P. 116 - 120.

89. Human parvovirus В19 infection in hemophiliacs first infused two high-purity, virally attenuated factor VIII concentrates / A. Azzi [et al.] // Am. J. Hematol. - 1992. -Vol. 39,N3.-P. 228-230.

90. Human parvovirus В19 specific IgG, IgA, and IgM antibodies and DNA in serum specimens from persons with erythema infectiosum / D. D. Erdman [et al.] // J. Med. Virol. - 1991. - Vol.35, N 2. - P. 3523 - 3524.

91. Human parvovirus В19 surveillance in patients with rash and fever from Belarus / M. A. Yermalovich [et al.] // J. Med. Virol. - 2012. - Vol. 84, N 6. - P. 973 -978.

92. Human parvovirus В19: general considerations and impact on patients with sickle-cell disease and thalassemia and on blood transfusions / S. N. Slavov [et al.] // FEMS Immunol. Med. Microbiol. - 2011. - Vol. 62, N 3. - P. 247 - 262.

93. Human parvovirus В19: prevalence of viral DNA in volunteer blood donors and clinical outcomes of transfusion recipients / J. Jordan [et al.] // Vox Sang. - 1998. -Vol. 75, N2.-P. 97- 102.

94. Human parvovirus infection in hemophiliacs first infused with clotting factor concentrates / O. Bartolomei Corci [et al.] // J. Med. Virol. - 1988. - Vol. 25, N 2. -P. 165- 170.

95. Human parvovirus-associated arthritis: a clinical and laboratory description / D. M. Reid [et al.] // Lancet. - 1985. - Vol. 1, N 8426. - P. 422 - 425

96. Identification and characterization of a second novel human erythrovirus variant, A6 / Q. T. Nguyen [et al.] // Virology. - 2002. - V. 301, N 2 - P. 374 - 380.

97. Identification and characterization of persistent human erythrovirus infection in blood donor samples / D. Candotti [et al.] // J. Virol. - 2004. - Vol. 78, N 22. - P. 12169- 12178.

98. Identification and genetic diversity of two human parvovirus В19 genotype 3 subtypes / A. Parsyan [et al.] // J. Gen. Virol. - 2007. - Vol. 88, N 2. - P. 428 - 431.

99. Identification of the major structural and nonstructural proteins encoded by human parvovirus B19 and mapping of their genes by procaryotic expression of isolated genomic fragments / S. F. Cotmore [et al.] // J. Virol. - 1986. - Vol. 60, N 2. -P. 548-557.

100. Immune response to B19 parvovirus and an antibody defect in persistent viral infection / G. J. Kurtzman [et al.] // J. Clin. Investig. - 1989. - Vol. 84, N 4. - P. 1114-1123.

101. In vitro propagation of parvovirus B19 in primary foetal liver culture / K. E. Brown [et al.] // J. Gen. Virol. - 1991. - Vol. 72, N 3. - P. 741 - 745.

102. Inactivation and neutralization of parvovirus B19 genotype 3 / J. Blumel [et al.] // Transfusion. - 2012. - Vol. 52, N 7. - P. 1490 - 1497.

103. Inactivation of parvovirus B19 by liquid heating incorporated in the manufacturing process of human intravenous immunoglobulin preparation / M. Yunoki [et al.] // Br. J. Haematol. - 2005. - Vol. 128, N 3. - P. 401 - 404.

104. Inactivation of parvovirus B19 during pasteurization of human serum albumin / J. Blumel [et al.] // Transfusion. - 2002. - Vol.42, N 8. - P. 1011-1018.

105. Incidence of human parvovirus B19 DNA detection in blood donors / Y. Yoto [et al.] // Br. J. Haematol. - 1995. - Vol. 91, N 4. - P. 1017 - 1018.

106. Induction of antiphospholipid antibodies and antiphospholipid syndrome-like in naive mice with antibody against human parvovirus B19 VP1 unique region protein / B. S. Tzang [et al.] // Clin. Chim. Acta. - 2007. - Vol. 382, N 1 - 2. - P. 31 -36.

107. Infection of the erythroid cell line KU812Ep6 with human parvovirus B19 and application to titration of B19 infectivity / E. Miyagawa [et al.] // J. Virol. Methods. -1999. - Vol. 83, N 1 - 2. - P. 45 - 54.

108. Intrauterine parvovirus infection associated with hydrops fetalis / T. A. Brown [et al.] // Lancet. - 1984. - Vol. 324, N 8410. - P. 1033 - 1034

109. Investigation of the prevalence of human parvovirus B19 in Korean plasmapheresis donors / D. J. Oh [et al.] // Korean J. Lab. Med. - 2010. - Vol. 30, N l.-P. 58-64.

110. Joseph, P. R. Fifth disease: the frequency of joint involvement in adults / P.R. Joseph//N. Y. State J. Med. - 1986.-Vol. 86, N l.-P. 560-563

111. Kaufmann, B. The structure of human parvovirus В19 / В. Kaufmann, A. A. Simpson, M. G. Rossmann // PNAS. - 2004. - Vol. 101, N 32. -P. 11628 - 11633.

112. Kishore, J. Standardization of B19 IgG ELISA to study the seroepidemiology of parvovirus В19 in North Indian voluntary blood donors / J. Kishore, M. Srivastava, N. Choudhary // Asian J. Transfus. Sci. - 2010. - Vol. 4, N 2. - P. 86 - 90

113. Koduri, P. R. Novel cytomorphology of the giant proerythroblasts of parvovirus B19 infection / P. R. Koduri // Am. J. Hematol. - 1998. - Vol. 58, N 2. -P. 95 - 99.

114. Koenigbauer, U. F. Clinical illness due to parvovirus В19 infection after infusion of solvent/detergent-treated pooled plasma / U. F. Koenigbauer, T. Eastlund, J. W. Day // Transfusion. - 2000. - Vol. 40, N 10 - P. 1203 - 1206.

115. Koppelman, M. H. Real-time polymerase chain reaction detection of parvovirus В19 DNA in blood donations using a commercial and an in-house assay / M. H. Koppelman, P. van Swieten, H. T. Cuijpers // Transfusion. - 2011. - Vol. 51, N6.-P. 1346- 1354.

116. Ku80 autoantigen as a cellular coreceptor for human parvovirus В19 infection / Y. Munakata [et al.] // Blood. - 2005. - Vol. 106, N 10. - P. 3449 - 3456.

117. Laboratory infection with human parvovirus В19 / H. Shiraishi [et al.] // J. Infect. - 1991. - Vol. 22, N 3. - P. 308 - 310.

118. Laboratory infection with parvovirus B19 / B. J. Cohen [et al.] // J. Clin. Pathol. - 1988. - Vol. 41, N 9. - P. 1027 - 1028.

119. Large-scale screening for human parvovirus В19 DNA by PCR: application to the quality control of plasma for fractionation / J. T. Aubin [et al.] // Vox Sang. -2000.-Vol. 78, N l.-P. 7- 12

120. Laub, R. Parvoviruses and blood products / R. Laub, P. Strengers // Pathol. Biol. - 2002. - Vol. 50, N 5. - P. 339 - 348.

121. Lefrere, J. J. B19 parvovirus DNA in solvent/detergent-treated anti-haemophilia concentrates / J. J. Lefrere, M. Mariotti, M. Thauvin // Lancet. - 1994. -Vol.343, N8891.-P. 211-212.

122. Lefrere, J. J. Use of digoxigenin-labelled probes for the detection of B19 parvovirus DNA in batches of blood products / J. J. Lefrere, M. Mariotti // Cell. Mol. Biol. - 1995. - Vol. 41, N 7. - P. 985 - 988.

123. Lehman, H. W. Parvovirus B19 infection and autoimmune disease / H. W. Lehman, P. von Landerberg, S. Modrow // Autoimmun. Rev. - 2003. - Vol.2, N4-P. 218-223.

124. Matejtschuk, P. Production of human albumin solution: a continually developing colloid / P. Matejtschuk, C. H. Dash, E. W. Gascoigne // Br. J. Anaesth. -2000. - Vol. 85, N 6. - P. 887 - 895.

125. MEGA 5: Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods / K. Tamura [et al.] // Molecular Biology and Evolution. - 2011. - Vol. 28, N 10. - P. 2731 - 2739.

126. Molecular and functional analyses of a human parvovirus B19 infectious clone demonstrates essential roles for NS1, VP1 and the 11-kilodalton protein in virus replication and infectivity / N. Zhi [et al.] // J. Virol. - 2006. - Vol. 80, N 12. - P. 5941 -5950.

127. Molecular characterization of human erythrovirus B19 strains obtained from patients with several clinical presentations in the Amazon region of Brazil / R. B. Freitas [et al.] // J. Clin. Virol. - 2008. - Vol. 43, N 1. - P. 60 - 65.

128. Molecular characterization of human parvovirus B19 genotypes 2 and 3 / Z. Chen [et al.] // J. Virol. - 2009. - Vol. 394, N 2. - P. 276 - 285.

129. Molecular mechanism underlying B19 virus inactivation to other parvoviruses / B. Mani [et al.] // Transfusion. - 2007. - Vol. 47, N 10. - P. 1765 - 1774.

130. Molecular testing for detection of in vitro infectivity of plasma pools contaminated with B19 virus / F. Bonvicini [et al.] // J. Med. Virol. - 2004. - Vol. 74, N2.-P. 272-276.

131. Neutralization of human parvovirus B19 by plasma and intravenous immunoglobulins / J. Modrof [et al.] // Transfusion. - 2008. - Vol. 48, N 1. - P. 178 - 186.

132. Neutralizing linear epitopes of B19 parvovirus cluster in the unique and VP1-VP2 junction regions / T. Saikawa [et al.] // J. Virol. - 1993. - Vol. 67, N 7 - P. 3004

- 3009.

133. Novel human erythrovirus associated with transient aplastic anemia / Q. T. Nguyen [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 1999. - Vol. 37, N 8. - P. 2483 - 2487.

134. Novel transcription map for the B19 (human) pathogenic parvovirus / K. Ozawa [et al.] // J. Virol. - 1987. - Vol. 61, N 8. - P. 2395 - 2406.

135. NS1 protein of parvovirus B19 interacts directly with DNA sequences of the p6 promoter and with the cellular transcription factors Spl/Sp3 / U. Raab [et al.] // Virology. - 2002. - Vol. 293, N 1. - P. 86 - 93.

136. Nucleotide sequence and genome organization of human parvovirus B19 isolate from the serum of a child during aplastic crisis / R. O. Shade [et al.] // J. Virol.

- 1986. - Vol. 58, N 3. - P. 921 - 936.

137. Ozawa, K. Characterization of capsid and noncapsid proteins of B19 parvovirus propagated in human erythroid bone marrow cell cultures / K. Ozawa, N. Young // J. Virol. - 1987. - Vol. 61, N 7. - P. 2627 - 2630.

138. Ozawa, K. Productive infection by B19 parvovirus of human erythroid bone marrow cells in vitro / K. Ozawa, G. Kurtzman, N. Young // Blood. - 1987. - Vol. 70, N2.-P. 384-391.

139. Parsyan, A. Human erythrovirus B19 and blood transfusion - an update / A. Parsyan, D. Candotti // Transfus. Med. - 2007. - Vol. 17, N 4. - P. 263 - 279.

140. Parvovirus B19 among blood donors from three hospitals in Santiago, Chile / J. Levican [et al.] // Rev. Med. Chil. - 2011. - Vol. 139, N 2. - 143 - 149.

141. Parvovirus B19 DNA in Factor VIII concentrates: effects of manufacturing procedures and B19 screening by nucleic acid testing / Y. Geng [et al.] // Transfusion.

- 2007. - Vol. 47, N 5. - P. 883 - 889.

142. Parvovirus B19 DNA in plasma pools and plasma derivatives /1. Schmidt [et al.] // Vox Sang. - 2001. - Vol. 81, N 4. - P. 228 - 235.

143. Parvovirus B19 DNA is frequently present in recombinant coagulation factor VIII products / A. M. Eis-Hübinger [et al.] // Thromb. Haemost. - 1996. - Vol. 76, N 6.-P. 1120.

144. Parvovirus B19 genotypes 1 and 2 detection with real-time polymerase chain reaction assays / M. H. Koppelman [et al.] // Vox Sang. - 2007. - Vol. 93, N 3. - P. 208-215.

145. Parvovirus B19 infection in five European countries: seroepidemiology, force of infection and maternal risk of infection / J. Mossong [et al.] // Epidemiol. Infect. -2008. - Vol. 136, N 8. - P. 1059 - 1068.

146. Parvovirus B19 infection transmitted by transfusion of red blood cells confirmed by molecular analysis of linked donor and recipient samples / M. Y. Yu [et al.] // Transfusion. - 2010. - Vol. 50, N 8. - P. 1712 - 1721.

147. Parvovirus B19 nonstructural protein-induced damage of cellular DNA and resultant apoptosis / B. D. Poole [et al.] // Int. J. Med. Sei. - 2011. - Vol. 8, N 2. - P. 88-96.

148. Parvovirus B19 transmission by a heat-treated clotting factor concentrates / J. Blümel [et al.] // Transfusion. - 2002. - Vol. 42, N 11 - P. 1473 - 1481.

149. Parvovirus B19 transmission by a high-purityfactor VIII concentrate / C. G. Wu [et al.] // Transfusion. - 2005. - Vol. 45, N 6 - P. 1003 - 1010.

150. Parvovirus B19: implications for transfusion medicine. Summary of a workshop / K. E. Brown [et al.] // Transfusion. - 2001. - Vol. 41, N 1. - P. 130 -135.

151. Parvovirus B19-Revised / J. Blümel [et al.] // Transfus. Med. Hemother. -2010. - Vol. 37, N 6. - P. 339 - 350.

152. Parvovirus-like particles in human sera / Y. E. Cossart [et al.] // Lancet. -1975.-Vol. 1, N 7898. - P. 72-73.

153. Peptides derived from the unique region of В19 parvovirus minor capsid protein elicit neutralizing antibodies in rabbits / S. Anderson [et al.] // Virology. -1995. - Vol. 206, N 1. - P. 626 - 632.

154. Persistent В19 in immunocompetent individuals: implications for transfusion safety / J. J. Lefrere [et al.] // Blood. - 2005. - Vol. 106, N 8. - P. 2890 - 2895.

155. Persistent infection by human parvovirus В19 in qualified blood donors / H. Matsukura [et al.] // Transfusion. - 2008. - Vol. 48, N 5. - P. 1036 - 1037.

156. Persistent parvovirus infection / S. Kerr [et al.] // Lancet. - 1995. - Vol. 345, N 8957.-P. 1118.

157. Phylogenetic analysis of human parvovirus bl9 sequences from eleven different countries confirms the predominance of genotype 1 and suggests the spread of genotype 3b / J. M. Hubschen [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2009. - Vol. 47, N 11. -P. 3735 -3738.

158. Phylogenetic analysis of human parvovirus В19, indicating two subgroups of genotype 1 in Vietnamese patients / N. L. Toan [et al.] // J. Gen. Virol. - 2006. - Vol. 87, N 10.-P. 2941 -2949.

159. Prevalence and quantitation of parvovirus В19 DNA levels in blood donors with a sensitive polymerase chain reaction screening assay / S. H. Kleiman [et al.] // Transfusion. - 2007. - Vol. 47, N 10. - P. 1745 - 1750.

160. Prevalence of human erythrovirus В19 DNA in healthy Belgian blood donors and correlation with specific antibodies against structural and non-structural viral proteins /1. Thomas [et al.] // Vox Sang. - 2003. - Vol. 84, N 4. - P. 300 - 307.

161. Prevalence of nucleic acid sequences specific for human parvoviruses, hepatitis A and hepatitis E viruses in coagulation factor concentrates / S. Modrow [et al.] // Vox Sang.-2011.-Vol. 100, N4.-P. 351 -358.

162. Prevalence of parvovirus B19 and hepatitis A virus in Portuguese blood donors /1. Henriques [et al.] // Transfus. Apher. Sci. - 2005. - Vol. 33, N 3. - P. 305 - 309.

163. Prevalence of parvovirus В19 and parvovirus V9 DNA and antibodies in paired bone marrow and serum samples from healthy individuals / E. D. Heegaard [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2002. - Vol. 40, N 3. - P. 933 - 936.

164. Prevention of iatrogenic transmission of B19 infection: different approaches to detect, remove or inactivate virus contamination / F. Bonvicini [et al.] // Clin. Lab. -2006. - Vol. 52, N 5 - 6. - P. 263 - 268

165. Pure red-cell aplasia of 10 years' duration due to persistent parvovirus B19 infection and its cure with immunoglobulin therapy / G. J. Kurtzman [et al.] // N. Engl. J. Med. - 1989. - Vol. 321, N 8. - P. 519 - 523.

166. Purification and characterization of the major nonstructural protein (NS-1) of Aleutian mink disease parvovirus / J. Christensen [et al.] // J. Virol. - 1995. - Vol. 69, N3.-P. 1802- 1809.

167. Quantitative analysis of neutralizing immune responses to human parvovirus B19 using a novel reverse transcriptase-polymerase chain reaction-based assay / J. R. Bostic [et al.] // J. Infect. Dis. - 1999. - Vol. 179, N 3. - P. 619 - 626.

168. Quantitative real-time detection of parvovirus B19 DNA in plasma / M. H. Koppelman [et al.] // Transfusion. - 2004. -Vol. 44, N 1. - P. 97 - 103.

169. Rapid sequence change and geographical spread of human parvovirus B19: comparison of B19 virus evolution in acute and persistent infections / P. Norja [et al.] // J. Virol. - 2008. - Vol. 82, N 13. - P. 6427 - 6433.

170. Reactivity of genotype-specific recombinant proteins of human erythrovirus B19 with plasmas from areas where genotype 1 or 3 is endemic / A. Parsyan [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44, N 4. - P. 1367 - 1375.

171. Recipients potentially infected with parvovirus B19 by red blood cell products /M. K. Hourfar [etal.]//Transfusion.-2011.-Vol. 51,N l.-P. 129- 136.

172. Regulation of human B19 parvovirus promoter expression by hGABP (E4TF1) transcription factor /1. Vassias [et al.] // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273, N 14. - P. 8287-8293.

173. Removal of parvovirus B19 from hemoglobin solution by nanofiltration / K. Abe [et al.] // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. - 2000. - Vol. 28, N 5. -P. 375 -383.

174. Removal of small nonenveloped viruses by antibody-enhanced nanofiltration during the manufacture of plasma derivatives / T. R. Kreil [et al.] // Transfusion. -2006.-Vol. 46, N7.-P. 1143-1151.

175. Removal of small non-enveloped viruses by nanofiltration / T. Yokoyama [et al.] // Vox Sang. - 2004. - Vol. 86, N 4. - P. 225 - 229.

176. Resistance to parvovirus B19 infection due to lack of virus receptor (erythrocyte P antigen) / K. E. Brown [et al.] // N. Engl. J. Med. - 1994. - Vol. 330, N 17.-P. 1192- 1196.

177. Rollag, H. Viral safety of blood derivatives by immune neutralization / H. Rollag, B. G. Solheim, J. L. Svennevig // Vox Sang. - 1998. - Vol. 74, N 1. - P. 213 -217.

178. Ros, C. Conformational change in the VP 1-unique region of native human parvovirus B19 lead to exposure of internal sequences that play a role in virus neutralization and infectivity / C. Ros, M. Gerber, K. Kempf // J. Virol. - 2006. -Vol. 80, N 24. - P. 12017 - 12024.

179. Safety of blood products and B19 parvovirus / J. J. Lefrere [et al.] // Transfus. Clin. Biol. - 2006. - Vol. 13, N 4. - P. 235 - 241.

180. Saldanha, J. Detection of human parvovirus B19 DNA in plasma pools and blood products derived from these pools: implication for efficiency and consistency of removal of B19 DNA during manufacture / J. Saldanha, P. Minor // Br. J. Haematol. - 1996. - Vol. 93, N 3. - P. 714 - 719.

181. Schwarz, T. F. Comparison of seven commercial tests for the detection of parvovirus B19-specific IgM / T. F. Schwarz, G. Jager, S. Gilch // Zentralbl. Bakteriol. - 1997. - Vol. 285, N 4. - P. 525 - 530.

182. Screening of blood donors for human parvovirus B19 and characterization of the results / C. Wakamatsu [et al.] // Vox Sang. - 1999. - Vol. 76, N 1. - P. 14 - 21.

183. Self-assembled B19 parvovirus capsids, produced in a baculovirus system, are antigenically and immunogenically similar to native virions / S. Kajigaya [et al.] // PNAS.- 1991.-Vol. 88, N 11.-P. 4646-4650.

184. Sequence variability among different parvovirus B19 isolates / A. Hemauer [et al.] // J. Gen. Virol. - 1996. - V. 77, N 8. - P. 1781 - 1785.

185. Sequence variability of human erythrovirus present in bone marrow of Brazilian patients with various parvovirus B19-related hematological symptoms / S. Sanabani [et al.] // J. Clin. Microbiol. - 2006. - Vol. 44, N 2. - P. 604 - 606.

186. Seroprevalence of parvovirus B19 IgG among blood donors in Aden, Yemen and Alexandria, Egypt / D. A. Al-Danani [et al.] // J. Chin. Clin. Medicine. - 2008. -Vol. 3,N3.-P. 173- 176.

187. Seroprevalence of parvovirus B19 in the German population / C. Rohrer [et al.] //Epidemiol. Infect. - 2008. - Vol. 136,N11.-P. 1564- 1575.

188. Shier, M. K. Human parvovirus B19 in Saudi blood donors / M. K. Shier, M. Badr // Egypt. J. Med. Microbiol. - 2005. - Vol. 14, N 2. - P. 347 - 353.

189. Similarities of specificity and cofactor dependence in serum antiphospholipid antibodies from patients with human parvovirus B19 infection and from patients those with systemic lupus erythematosus / S. Loizou [et al.] // Arthritis Rheum. -1997.-Vol. 40, N1.-P. 103- 108.

190. Simultaneous persistence of multiple genome variants of human parvovirus B19 / B. Schneider [et al.] // J. Gen. Virol. - 2008. - Vol. 89, N 1. - P. 164 - 176.

191. Structure and mapping of the DNA of human parvovirus B19 / J. Mori [et al.] // J. Gen. Virol. - 1987. - Vol. 68, N 11. - P. 2797 - 2806.

192. Successful replication of parvovirus B19 in the human megakaryocyte leukemia cell line MB-02 / N. C. Munshi [et al.] // J. Virol. - 1993. - Vol. 67, N 1. -P. 562 - 566.

193. Sun, I. Acute fulminant hepatitis with bone marrow failure in an adult due to parvovirus B19 infection /1. Sun, J. C. Zhang // Hepatology. - 2012. - Vol. 55, N 1. -P. 329-330.

194. Susceptibility of human erythropoietic cells to B19 parvovirus in vitro increases with differentiation / T. Takahashi [et al.] // Blood. - 1990. - Vol. 75, N 3. -P. 603-610.

195. Symptomatic parvovirus В19 infection caused by blood component transfusion / M. Satake [et al.] // Transfusion. - 2011. - Vol. 51, N 9. - P. 1887 - 1895.

196. The association of VP1 unique region protein in acute parvovirus В19 infection and anti-phospholipid antibody production / B. S. Tzang [et al.] // Clin. Chim. Acta. -2007. - Vol. 378, N 1 - 2. - P. 59 - 65.

197. The genome of human parvovirus В19 can replicate in nonpermissive cells with the help of adenovirus genes and produces infectious virus / W. Guan [et al.] // J. Virol. -2009. - Vol. 83, N 18.-P. 9541 -9553.

198. The globoside receptor triggers structural changes in the В19 virus capsid that facilitate virus internalization / C. Bonsch [et al.] // J. Virol. - 2010. - Vol. 84, N 22. -P. 11737- 11746.

199. The prevalence of human parvovirus В19 DNA and antibodies in blood donors from four Chinese blood centers / L. Ke [et al.] // Transfusion. - 2011. - Vol. 51, N 9. -P. 1909- 1918.

200. The small 11 kDa nonstructural protein of human parvovirus B19 plays a key role in inducing apoptosis during infection of primary erythroid progenitor cells / A. Y, Chen [et al.] // Blood. - 2010. - Vol. 115, N 5. - P. 1070 - 1080.

201. The structure of human parvovirus В19 at 8 Á resolution / M. Agbandji [et al.] //Virology. - 1994.-Vol. 203, N 1.-P. 106-115.

202. The VP 1-unique region of parvovirus В19: amino acid variability and antigenic stability / S. Dorsch [et al.] // J. Gen. Virol. - 2001. - Vol. 82, N 1. - P. 191 - 199.

203. Transfusion-transmitted human parvovirus В19 infection in a thalassemic patient / A. Zanella [et al.] // Transfusion. - 1995. - Vol. 35, N 9. - P. 769 - 772.

204. Transmission of human parvovirus В19 by plasma derived factor VIII concentrates / Y. Laurian [et al.] // Nouv. Rev. Fr. Hematol. - 1994. - Vol. 36, N 6. -

P. 449-453.

205. Transmission of parvovirus В19 by coagulation factor concentrates exposed to 100 degrees С heat after lyophilization / E. Santagostino [et al.] // Transfusion. -1997. - Vol. 37, N 5. - P. 517 - 522.

206. Transmission of serum parvovirus-like virus by clotting-factor concentrates / P. P. Mortimer [et al.] // Lancet. - 1983. - Vol. 2, N 8348. - P. 482 - 484.

207. Variability of parvovirus В19 genotype 2 in plasma products with different compositions in the inactivation sensitivity by liquid-heating / M. Tsujikawa [et al.] // Vox Sang. - 2012. - Vol. 102, N 2. - P. 93 - 99.

208. Variability of parvovirus B19 to inactivation by liquid heating in plasma products / S. Hattori [et al.] // Vox Sang. - 2007. - Vol. 92, N 2. - P. 121 - 124.

209. Viral safety of Nanogam, a new 15 nm-flltred liquid immunoglobulin product / F. G. Terpstra [et al.] // Vox Sang. - 2006. - Vol. 90, N 1. - P. 21 - 32.

210. Viral safety of solvent/detergent-treated plasma / B. G. Solheim [et al.] // Transfusion. - 2000. - Vol. 40, N 1. - P. 84 - 90.

211. Weigel-Kelley, K. A. a5pi integrin as a cellular coreceptor for human parvovirus В19: requirement of functional activation of (31 integrin for viral entry / K. A. Weigel-Kelley, M. C. Yoder, A. Srivastava // Blood. - 2003. - Vol. 102, N 12. -P. 3927-3933.

212. Yee, Т. T. Life-threatening human parvovirus В19 infection in immunocompetent haemophilia / Т. T. Yee, C. A. Lee, K. J. Pasi // Lancet. - 1995. -Vol. 345, N 8952. - P.794 - 795.

213. Young, N. S. Parvovirus В19 / N. S. Young, К. E. Brown // N. Eng. J. Med. -2004. - Vol. 350, N 6. - P. 586 - 597.

214. Zaaijer, H. L., Parvovirus B19 viremia in Dutch blood donors / H. L. Zaaijer, M. H. G. M. Koppelman, C. P. Farrington // Epidemiol. Infect. - 2004. - Vol. 132, N 6.-P. 1161 - 1166.

215. Blood products advisory committee: nucleic acid testing of blood donors for human parvovirus В19 [Electronic resource] / Food and Drug Administration (FDA) - 1999. - Электрон. дан. - Режим доступа : // http ://www.fda.gov/ohrms/dockets/ac/99/transcpt/3548tl.rtf.

216. EMEA workshop on viral safety of plasma-derived medicinal products with particular focus on non-enveloped viruses [Electronic resource] / The European Agency for the Evaluation of Medicinal products. - 2001. - Электрон.дан. - Режим

доступа : // http://www.ema.europa.eu

/docs/en GB/document library/Report/2009/11/WC500015393.pdf

iL

217. European Pharmacopoeia [Electronic resource]. - 7 ed. - Электрон, дан. -Режим доступа : //http://www.edqm.eu/en/European-Pharmacopoeia-1401.html

218. Guidance for industry: Nucleic acid testing (NAT) to reduce the possible risk of human parvovirus В19 transmission by plasma-derivide products [Electronic resource] / Food and Drug Administration (FDA) - 2009. - Электрон, дан. - Режим доступа : // http://www.fda.gov/ BiologicBloodVaccines/GuidanceComplianceRegulatorylnformation/Guidances/defa ult.html

219. In-Process Control Measures for Management of Non-Chronic Diseases in Plasma Fractionation: Parvovirus В19 [Electronic resource] / Plasma Protein Therapeutics Association (PPTA). - 2002. - Электрон, дан. - Режим доступа : //

http://www.fda.gov/ohrms/dockets/_ac/02/briefing/3913bl Parvovirus%

2 OB 19%20 White%20Paper.pdf

220. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) [Electronic resource]. - 2011. - Электрон, дан. - Режим доступа : // http://www.ictvonline.org

221. Note for guidance on virus validation studies: the design, contribution and interpretation of studies validating the inactivation and removal of viruses [Electronic resource] / The European Agency for the Evaluation of Medicinal products (EMEA) // Committee for proprietary medicinal products (CPMP). - 1996. - Электрон.дан. -Режим доступа : // http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific guideline/2009/ 09/WC500003684.pdf

222. WHO guidelines on viral inactivation and removal procedure intended to assure the viral safety of human blood plasma products [Electronic resource] / WHO Technical Report, Series № 924. - 2004. - Электрон.дан. - Режим доступа : // http://www.who.int/bloodproducts/publications