Биологические свойства штамма "Шеба" вируса панлейкопении кошек, выделенного на территории Российской Федерации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Киселев Алексей Максимович

• Киселев Алексей Максимович
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Киселев Алексей Максимович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика болезни

1.2 Характеристика вируса панлейкопении кошек

1.3 Эпизоотология

1.4 Методы диагностики панлейкопении кошек

1.5 Профилактика панлейкопении кошек

1.6 Заключение по обзору литературы

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы и методы исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Выделение вируса панлейкопении кошек в культуре клеток

3.2 Филогенетическая принадлежность изолятов «Шеба» и «Фрейя» вируса панлейкопении кошек

3.3 Биологические свойства штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек

3.3.1 Культуральные свойства изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек

3.3.2 Инактивация изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек

3.3.3 Антигенные свойства изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек

3.3.4 Депонирование изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек в качестве производственно-контрольного штамма

3.4 Определение оптимальных способов очистки и режимов концентрирования штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек

3.5 Оптимизация получения гипериммунных сывороток с высоким титром вирусспецифических антител к вирусу панлейкопении кошек

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

4.1 Итоги исследований

4.2 Практические предложения

4.3 Перспективы дальнейшей разработки

5. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Приложение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биологические свойства штамма "Шеба" вируса панлейкопении кошек, выделенного на территории Российской Федерации»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. На сегодняшний день домашние кошки составляют самую многочисленную группу животных-компаньонов, количество которых постоянно увеличивается [30]. Так, с 2015 года в России количество домашних кошек оценивалось в 29 млн особей, а к 2018 году выросло до 33,7 млн. Позже, в 2020 году были представлены данные о 43,7 млн кошек, а к 2023 году было сообщено о 49,2 млн кошек [39, 44]. В Российской Федерации также отмечают рост доли заводчиков, занимающихся племенным разведением [46].

По результатам эпизоотологических исследований в отдельных городах Российской Федерации отмечено увеличение случаев заражения кошек возбудителями инфекционных болезней, среди которых панлейкопения занимает одно из лидирующих мест. Несмотря на снижение заболеваемости и смертности от панлейкопении кошек (ПЛК) во всем мире, начиная с 1964 года, благодаря разработке и дальнейшему использованию инактивированных и аттенуированных вакцин, данную болезнь по-прежнему ежегодно регистрируют в России и других странах [6, 37, 46, 49, 52, 147, 149]. Международная ветеринарная ассоциация мелких домашних животных (the World Small Animal Veterinary Association, WSAVA) включает панлейкопению совместно с калицивирозом и инфекционным ринотрахеитом в число болезней кошек, против которых необходимо проводить вакцинацию вне зависимости от эпизоотической ситуации [106].

Распространению возбудителя ПЛК способствует высокая устойчивость в окружающей среде, недостаточный охват вакцинацией и бесконтрольное размножение животных, восприимчивых к вирусу панлейкопении кошек (ВПЛК). Кроме того, существует риск заноса инфекционного агента в зоопарки, где содержатся исчезающие виды кошачьих, питомники, где выращиваются редкие породы кошек, и в звероводческие хозяйства [83, 94, 135, 162, 166].

Стоит отметить, что у близкородственного парвовируса собак второго типа высокий темп мутаций, сопоставимый с РНК-содержащими вирусами. ВПЛК в отличии от него эволюционирует сравнительно медленней за счет случайного

генетического дрейфа [108]. Однако в 2021 году на территории Китая выделены новые штаммы ВПЛК, входящие в группу G1 (первую геногруппу) и проявляющие более высокую вирулентность, а также устойчивость к существующим вакцинам по сравнению с генетическими вариантами второй геногруппы (G2) [75]. Вышеуказанное демонстрирует необходимость усовершенствования средств специфической профилактики и изучения циркуляции генетических вариантов ВПЛК на территории Российской Федерации. В этом направлении важным условием является адаптация методов диагностики ВПЛК к современным лабораторным условиям, выделение актуальных изолятов и изучение их биологических свойств.

Степень разработанности проблемы. В иностранных публикациях представлены материалы по распространению возбудителя болезни, изучению клинических признаков и патологоанатомической картины, описаны случаи заболевания панлейкопенией у нехарактерных животных и результаты филогенетического исследования. Детально представлены морфологические, культуральные и молекулярно-генетические свойства ВПЛК. Так, ключевыми специалистами в области изучения ПЛК являются: Parrish C.R., Greene C.E., Truyen U., Cotmore S.F. и многие другие [99, 105, 112, 135]. Результаты их работы легли в основу обзоров, учебных изданий и пособий по изучаемой болезни.

Основоположниками изучения болезней кошек вирусной этиологии, включая и панлейкопению, в России являются канд. ветеринар. наук Сулимов А.А., д-р ветеринар. наук Селиванов А.В., д-р ветеринар. наук Уласов В.И. (1981 г.). Они изучали биологические свойства ВПЛК, методы диагностики и профилактики болезни, а также разработали способ получения иммуноглобулина для профилактики и лечения ПЛК [33, 36]. До 2022 г. опубликован ряд отечественных работ, касающихся эпизоотологических аспектов болезни. В работах Белявцевой Е.А., Осадчей М.А., Тарасова Д.А., Чумаченко Б.В. и Смирнова М.В. описываются заболеваемость кошек панлейкопенией в конкретных районах/регионах, сезонность и факторы риска распространения болезни [5, 23, 40, 43, 45]. Масштабные работы по изучению патоморфологии и патогенеза при данной

болезни опубликованы Чупраковой Н.Н. с соавт. лишь в 1997-1998 годах [46]. Мальцевой Б.М. с соавт. (2000 г.) изучены культуральные свойства пяти гемагглютинирующих изолятов ВПЛК, выделенных из биологического материала от котят с клиническими признаками острого течения болезни [24]. Отечественные научные работы, посвященные изучению биологических свойств изолятов ВПЛК, с 2000 г. отсутствуют в открытой печати.

Цель и задачи. Целью диссертационной работы являлось изучение биологических свойств изолята вируса панлейкопении кошек, выделенного на территории Российской Федерации, которое направлено на получение производственно-контрольного штамма, актуального для разработки профилактических и диагностических средств.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Оптимизировать метод выделения изолятов вируса панлейкопении кошек из биологического материала в культуре клеток;

2) Выделить изоляты вируса панлейкопении кошек на территории Российской Федерации и определить их филогенетическую принадлежность;

3) Оценить культуральные и антигенные свойства изолята вируса панлейкопении кошек (кандидата в производственно-контрольный штамм);

4) Определить условия инактивации вируса панлейкопении кошек;

5) Оптимизировать способы очистки и режимы концентрирования вируса панлейкопении кошек;

6) Получить гипериммунные сыворотки, характеризующиеся высоким титром антител к вирусу панлейкопении кошек.

Научная новизна результатов. Впервые с 2000 г. на территории Российской Федерации выделены из биологического материала и охарактеризованы изоляты вируса панлейкопении кошек («Шеба» - г. Владимир, 2021 г.; «Фрейя» - г. Москва, 2024 г.).

Впервые установлена филогенетическая принадлежность изолятов вируса панлейкопении кошек, выделенных на территории Российской Федерации, к уникальному кластеру внутри первой геногруппы (G1).

Установлено, что изолят «Шеба» отличается по своим культуральным свойствам (митотическая активность при конфлюэнтности клеток 50-80% перевиваемой линии почки кошки Крэнделла-Риса (CRFK) является наиболее подходящей для максимального накопления вируса) по сравнению с изолятами вируса панлейкопении кошек, выделенными в России до 2000 г., для которых характерен высокий титр накопления при инфицировании суспензии клеточной линии почки кошки (KF-91).

Впервые в Российской Федерации получен производственно-контрольный штамм «Шеба» вируса панлейкопении кошек, относящийся к первой геногруппе и актуальный для производства диагностических биопрепаратов и инактивированных вакцин.

Оптимизирован метод очистки и концентрирования вируса панлейкопении кошек.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Доказано, что на территории Российской Федерации циркулирует ВПЛК, принадлежащий к первой геногруппе (G1). Зарегистрированы нуклеотидные и аминокислотные замены, дифференцирующие российские изоляты ВПЛК в уникальный филогенетический кластер.

Штамм «Шеба» ВПЛК депонирован в качестве производственно-контрольного во Всероссийскую государственную коллекцию экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №455-деп/23-5-ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и паспортизирован (приложения 1 и 2). Разработан и утвержден стандарт ФГБУ «ВНИИЗЖ» «Штамм «Шеба» вируса панлейкопении кошек производственный и контрольный. Методы изготовления и контроля посевных материалов (СТО 00495527-0438-2021)» (приложение 3). Получены в соавторстве: патент RU2806604C1 на «Штамм Шеба вируса Carnivore protoparvovirus 1 панлейкопении

кошек для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики панлейкопении кошек» (приложение 4); патент RU2827230C1 «Ассоциированная вакцина против панлейкопении, калицивироза, вирусного ринотрахеита и бешенства кошек» (приложение 5).

Разработаны, обсуждены на ученом совете и утверждены директором ФГБУ «ВНИИЗЖ» пять методических рекомендаций: «Методические рекомендации по определению гемагглютинирующей активности вируса панлейкопении кошек микрометодом в РГА» (протокол № 04 от 12.04.2023 г.) (приложение 6); «Методические рекомендации по выявлению антител к вирусу панлейкопении кошек в реакции торможения гемагглютинации» (протокол № 06 от 17.08.2023 г.) (приложение 7); «Методические рекомендации по выделению вируса панлейкопении кошек в культуре клеток» (протокол № 06 от 16.10.2024 г.) (приложение 8); «Методические рекомендации по получению гипериммунной сыворотки к вирусу панлейкопении кошек для использования в диагностических целях» (протокол № 07 от 29.11.2024 г.) (приложение 9); «Методические рекомендации по очистке и концентрированию вируса панлейкопении кошек» (протокол № 08 от 25.12.2024 г.) (приложение 10).

Методология и методы исследования. В ходе исследований использованы вирусологические (вирусовыделение, культивирование и титрование вируса (реакция гемагглютинации (РГА), молекулярно-генетические (полимеразная цепная реакция (ПЦР), секвенирование, филогенетический анализ), серологические (реакция торможения гемагглютинации (РТГА), иммунологические (оценка антигенных свойств вируса на лабораторных животных), препаративные (очистка и концентрирование вируса) и статистические методы исследований. Исследования выполнены в лаборатории профилактики болезней мелких домашних животных ФГБУ «ВНИИЗЖ» с 2021 по 2024 гг.

Положения, выносимые на защиту:

- предложено использование образцов мозжечка, тонкой кишки, содержимого толстой кишки и фекалий в качестве биологического материала для выделения вируса панлейкопении кошек в культуре клеток;

- усовершенствована схема пробоподготовки биологического материала методом очистки хлороформом или фреоном-113, что увеличивает титр вируса в подготовленном образце, использующемся для выделения вируса панлейкопении кошек в клеточной линии CRFK;

- установлено, что перевиваемая линия СЯБК и субкультура почки кошки (ПК) являются оптимальными биологическими моделями для выделения и культивирования вируса панлейкопении кошек;

- оптимизированы параметры инактивации изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек аминоэтилэтиленимином;

- по результатам исследования культуральных, антигенных и молекулярно-генетических свойств изолят «Шеба» вируса панлейкопении кошек депонирован в ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» в качестве производственно-контрольного штамма;

- применение комплексного способа химической очистки и ультрацентрифугирования вируссодержащей культуральной суспензии способствует получению высококонцентрированного препарата вируса панлейкопении кошек;

- получены гипериммунные сыворотки морских свинок и кроликов с титром вирусспецифических антител к вирусу панлейкопении кошек 16,56±0,44 и 14,23±0,28 ^2, соответственно.

Личный вклад соискателя. Основной объем представленных в диссертации экспериментальных исследований и анализ полученных результатов выполнен автором самостоятельно. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю канд. ветеринар. наук Галкиной Т.С., д-ру биол. наук Доронину М.И., канд. ветеринар. наук Щербинину С.В., Шотину А.Р., Баборенко Е.П., мл. научн. сотр. Чернышеву Р.С., коллективам лаборатории профилактики болезней мелких домашних животных и сектора культур клеток, за консультативную помощь и содействие при выполнении отдельных этапов работы.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности проведенных исследований подтверждена валидационными и комиссионными испытаниями, статистической обработкой данных. Основные положения

диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях методической комиссии и Учёного совета ФГБУ «ВНИИЗЖ» в период с 2022 по 2024 гг., на двух научно-практических конференциях «Ветеринария, зоотехния, биотехнология и продовольственная безопасность - науке и практике АПК» (г. Москва, 8 февраля 2024 г.) и «Эффективные методы диагностики и борьбы с инфекционными и инвазивными заболеваниями животных» (Республика Таджикистан, 24 мая 2024 г.).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано семь научных работ, из них четыре - в рецензируемых научных изданиях (журналы «Ветеринарная патология», «Ветеринария сегодня», «Ветеринария»), в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук по специальности 4.2.3 «Инфекционные болезни и иммунология животных», и два патента Российской Федерации на изобретение (патенты RU2806604C1 «Штамм Шеба вируса Carnivore protoparvovirus 1 панлейкопении кошек для изготовления биопрепаратов для диагностики и специфической профилактики панлейкопении кошек» и RU2827230C1 «Ассоциированная вакцина против панлейкопении, калицивироза, вирусного ринотрахеита и бешенства кошек»).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах компьютерного текста и включает следующие разделы: обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований и их обсуждение, заключение, список сокращений, список литературы, который состоит из 168 источников, из них 118 иностранных. Работа иллюстрирована 29 таблицами, 9 рисунками. В приложении отражены копии титульных листов документов, которые подтверждают достоверность полученных данных.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общая характеристика болезни

Панлейкопения кошек - это высококонтагиозная болезнь представителей семейства кошачьих (сем. Felidae), характеризующаяся у новорожденных котят высокой летальностью (до 90%) со сверхострым течением и неврологическими расстройствами. У котят более старшего возраста развиваются панлейкопения, в том числе нейтропения из-за инфекции костного мозга и лимфатической ткани, а также диарея из-за поражения энтероцитов. Вирусная природа ПЛК установлена J. Verge с соавт. в 1928 г. [168].

Помимо кошек к ПЛК восприимчивы енотовые (сем. Procyonidae) и куньи (сем. Mustelidae) [137]. Геном ВПЛК обнаружен также в фекалиях и тонкой кишке медоеда (Mellivora capensis), содержащегося в неволе гепарда (Acinonyx jubatus) и свободноживущей африканской дикой кошки (Felis lybica) [103]. В 2008 г. в Китайском Центре экспериментальных животных вирус был выделен от 500 макак (Macaca mulatta) с геморрагическим энтеритом [113]. В 2022 году в центре исследования дикой природы Индии случай ПЛК диагностировали у 9-месячного леопарда (Pantherapardus) - исчезающего вида кошачьих, доставленного из центра лечения транзитных животных. Последовательность генома выделенного вируса на 99,14% была схожа с выделенным парвовирусом от енотовых [126]. В 2019 году на территории Таиланда зарегистрирован первый случай заражения вирусом ВПЛК полосатого линзанга (Prionodon linsang). Аминокислотный анализ структурного антигена VP2 показал более 98% гомологии при сравнении с последовательностями штаммов ВПЛК, полученных из базы данных GenBank. Изолят тесно связан со штаммами из Японии, Южной Кореи и Китая [96]. В 2020 году на территории Китая (г. Чэнду) от гигантской панды, у которой наблюдали диарею и рвоту, выделили ВПЛК в перевиваемой культуре клеток почки кошки. Филогенетическое исследование установило, что выделенный изолят pFPV-SC относился к кладе A, в которую входят генетические варианты ВПЛК,

зарегистрированные в Китае, Корее, Японии и Италии. Авторами исследования выдвинуто предположение о межвидовой передаче, так как уникальную аминокислотную замену His234 в структурном антигене VP2 pFPV-SC также ранее установили в штамме ВПЛК, выделенном от леопарда [73].

Животные-вирусоносители способны выделять ВПЛК с рвотными массами и фекалиями в высоких титрах (до 109 ТЦД50 на грамм фекалий) [94]. Инфицирование вирусом происходит преимущественно непрямым контактным путем через контаминированные объекты. Кроме того, существует вертикальный путь передачи, при этом инфицирование может привести к абортам, мумификации плода и мертворождению. Инкубационный период составляет от двух до 14 дней, и после появления первых клинических признаков при сверхостром течении болезни может наступить летальный исход спустя 24-48 часов [118]. ПЛК регистрируют в основном у котят, достигших трехмесячного возраста и заразившихся после снижения протективного уровня колостральных антител [22]. Передача между домашними и дикими восприимчивыми животными может осуществляться через факторы передачи возбудителя ПЛК (фомиты) на большие расстояния [63].

Воротами инфекции для ВПЛК выступают нёбно-глоточные миндалины, из которых вирус попадает в кровяное русло и наступает виремия. Затем вирус локализуется и репродуцируется в кишечных криптах (из-за высокой митотической активности клеток), что приводит к геморрагическому энтериту и диарее. Лимфоидная ткань также является мишенью ВПЛК, что приводит к панцитопении (менее 4000 клеток/мкл). На более поздних стадиях болезни можно наблюдать восстановление числа лейкоцитов. В некоторых случаях также может отмечаться иктеричность [118].

Клинические признаки болезни характеризуются лихорадкой, угнетением, атаксией, анорексией, слепотой, рвотой и диареей [74, 95, 121, 113]. Развитие клинической картины напрямую зависит от возраста. Так, у новорожденных животных вирус репродуцируется в различных малодифференцированных тканях с высокой митотической активностью и часто вызывает дисплазию сетчатки и

гипоплазию мозжечка, что приводит к слепоте и атаксии. У животных более старшего возраста репродукция ВПЛК ограничивается лимфоидной тканью и клетками тонкой кишки, вызывая панлейкопению и диарею [140]. Стоит отметить, что у новорожденных животных зачастую не наблюдаются признаки диареи, что может быть связано с невысокой митотической активностью клеток эпителия кишки в начале жизни, но инфицирование плодов и новорожденных обычно приводит к летальному исходу или к необратимым повреждениям систем органов [109].

При вскрытии котят и взрослых кошек патологоанатомическая картина может сопровождаться геморрагическим энтеритом с петехиальными кровоизлияниями в серозной оболочке тонкой кишки. Поражения наиболее выражены в тощей и подвздошной кишках. Часто встречается утолщение стенок кишки на фоне отека и геморрагическое воспаление мезентериальных лимфатических узлов [86, 141]. Гистологические изменения в тонкой кишке включают некроз и потерю архитектуры крипт. Также обнаруживаются последствия вторичной бактериальной инфекции. При внутриутробных инфекциях ВПЛК оказывает тератогенное действие. На последних стадиях развития плода вирус поражает митотически активные ткани головного мозга и глаз. Это приводит к гипоплазии мозжечка, гидроцефалии, и дисплазии сетчатки [60, 67]. До 1964 года в качестве основных методов постановки диагноза «панлейкопения» использовали клинические и патологоанатомические исследования [101].

Лечение больных панлейкопенией животных представляет собой, в первую очередь, трансфузионную терапию с восполнением электролитов. Поскольку нарушенная архитектура крипт кишки способствует бактериемии, а нарастающая нейтропения усугубляет данный процесс зачастую до сепсиса, необходима антибактериальная терапия препаратами широкого спектра действия, в особенности, против грамотрицательных и анаэробных бактерий. Предпочтительна легкоусвояемая диета, кормление не должно быть прекращено. Кишечные паразитозы являются распространенным сопутствующими факторами ПЛК, поэтому своевременная диагностика (копролярво- и копроовоскопия) и

лечение кошек антигельминтными препаратами являются важными терапевтическими мероприятиями [65, 99, 118].

1.2 Характеристика вируса панлейкопении кошек

По данным Международного комитета по таксономии вирусов возбудитель ПЛК относится к реалму Monodnaviria, царству Shotokuvirae, типу Cossaviricota, классу Quintoviricetes, отряду Piccovirales, семейству Parvoviridae, роду Protoparvovirus, виду Protoparvovirus carnivoran 1 [25]. ВПЛК - небольшой (20-25 нм) безоболочечный вирус с икосаэдрическим типом симметрии [50].

Геном ВПЛК представляет собой одноцепочечную ДНК, состоящую из 4,55,5 тысяч пар нуклеотидов, которая разделена на две открытые рамки считывания, кодирующие структурные (VP1 и VP2) и неструктурные белки (NS1 и NS2) [83, 138]. Фланкирующие концы генома также образуют палиндромную «шпильку» -комплементарную структуру, состоящую из инвертированных концевых повторов (ITR) [84, 112]. Капсид состоит из 60 капсомеров, из которых 5-6 являются VP1, а 54-55 - VP2. Антиген VP2 определяет диапазон восприимчивых животных к вирусу [83, 138]. Его N-концевые участки окружают каждую из 12 вершин капсида и образуют пятиконечную пору, которая также служит для сайтспецифического инкапсидирования [71, 72, 158]. Каждая такая пора является вершиной треугольной области (каньона), в которую входят углубления (ямки) и шипы (приподнятые области высотой 22 А) [77]. Данная треугольная область является вариабельным активным центром контакта с трансферриновым рецептором (TfR) (рисунок 1) [59].

На рисунке 1 изображена карта связывания апикального домена TfR c аминокислотной последовательностью каньона и шипов VP2 ВПЛК [59]. Абортивная инфекция может наступить вследствие недостаточного количества TfR, необходимого для образования клатриновой ямки, поскольку вирус проникает в клетку посредством клатрин-опосредованного эндоцитоза [7, 66, 133]. Феномен отсутствия заражения при недостаточном контакте VP2-TfR также описан в опыте in vitro c заражением ВПЛК культуры клеток CHO-TRVb с дефицитом TfR [68].

Ф

Рисунок 1. Вариабельная треугольная область капсида ВПЛК, ответственная за связывание трансферринового рецептора клетки-мишени [59]

Для репликации геномной нуклеиновой кислоты ВПЛК использует в репродукционном цикле ДНК-полимеразы ядра клетки-мишени, которые образуются во время S-фазы митоза, обеспечивающей синтез интермедиатной двухцепочечной ДНК [97]. Данный процесс также невозможен без циклина А и ядерного антигена пролиферирующих клеток, которые экспрессируются исключительно в S-фазу клеточного деления. [85]. Вследствие этого вирус репродуцируется в активно делящихся лимфоидных клетках, энтероцитах и эмбриональных тканях естественно-восприимчивых животных. ВПЛК обнаруживают в костном мозге, тимусе, мозжечке, кишечнике, селезенке, почках и фекалиях [99]. Успешное выделение ВПЛК в культуре клеток кошачьего происхождения произошло в 1964 году [64]. C того момента для выделения и культивирования ВПЛК применяли первично-трипсинизированные культуры клеток почки кошки (ПК), селезенки кошки (СК) и перевиваемые клеточные линии

Т-лимфобластоидных клеток, полученных из мононуклеарных клеток крови кошки (MYA-1), эмбриона кошки (Femb и СС81), зародыша кошки (Fcwf-4), почки новорожденного сирийского хомячка (BHK-21), фибросаркомы собаки (A72), селезенки кошки (FS), кошачьей почки Крэнделла-Риса (CRFK) и почки кошки (F81, ПК-91, KF-91), почки собаки Мадина-Дарби (MDCK) и собачьей почки (DK), почки зеленой мартышки (Vero) [24, 113, 114, 159]. Отмечено, что культивирование вируса может сопровождаться слабым, нерегулярным и временным (около трех суток, после чего изменения постепенно исчезают) цитопатическим действием (ЦПД) с длительным сроком накопления в культуре клеток (до семи суток) [101, 161]. В исследовании A. Flagstad (1975 г.) заключил, что из-за характера репродукционного цикла ВПЛК, ограниченного S-фазой митоза, при инфицировании культуры клеток кошачьего происхождения с высокой митотической активностью вирус накапливается в наибольшем титре. При высоком митотическом индексе количество инфицированных клеток, определяемых по ядерным тельцам включений, значительно превышает неинфицированные [97, 101].

Protoparvovirus carnivoran 1 также составляют близкородственные парвовирус собак второго типа (Сanine Parvovirus 2 - CPV-2), вирус энтерита норок (Mink Enteritis Virus - MEV) и парвовирус енотов (Raccoon Parvovirus - RaPV) [85, 137]. Имеются данные, свидетельствующие о том, что первоначальный парвовирус собак второго типа, выделенный в культуре клеток в конце 1970-х годов, произошел от ВПЛК (гомология геномов составляет 98%) или от их общего предка, и дал начало антигенным вариантам 2a, 2b и 2c вследствие несинонимичных мутаций, которые привели к изменению 6-7 аминокислот в мажорном капсидном белке VP2 [58, 129, 136, 139, 160]. По данным Truyen U. и Parrish C. R. (1992 г.), домашние собаки в отличии от диких и домашних кошек, енотов и норок, не восприимчивы к ВПЛК, поскольку вирус не способен связаться с TfR клеток-мишеней псовых [164]. Hueffer K. с соавт. (2003 г.) установили, что при экспериментальном заражении собак ВПЛК не проявляется клиническая картина ПЛК, а вирус мог ограничено репродуцировался только в лимфоидных тканях

(тимус, костный мозг) [163]. Парвовирус собак второго типа, в свою очередь, изначально не мог репродуцироваться в клетках кошек, но в ходе эволюции его антигенные варианты 2а, 2Ь и 2с восстановили способность заражать представителей семейства кошачьих [128]. Из-за этого панлейкопению у кошек может вызывать не только ВПЛК (в 90-95% случаев), но и парвовирус собак типов 2а, 2Ь и 2с (менее 10% случаев) [88].

В XX веке у ВПЛК и парвовируса собак второго типа определили способность агглютинировать эритроциты определенных видов животных [55, 62, 110]. За данную способность ответственен антиген УР2 [87]. Согласно результатам исследований, проведённых в Японии в 1975 и 1987 годах, при постановке РГА с ВПЛК и эритроцитами африканской зеленой мартышки, гуся, морской свинки, крысы, землеройки, хомяка, мыши, кролика, кошки, собаки, курицы, овцы, козы, коровы и лошади выявлена низкая гемагглютинирующая активность вируса или её полное отсутствие. Однако при аналогичных условиях проведения реакции с эритроцитами свиньи отмечен наибольший титр гемагглютинирующих единиц [69, 104]. В исследовании МогаШоп А. и МогаШоп R. (1982 г.) выявлена корреляция между гемагглютинирующей активностью ВПЛК и кислотно-щелочным балансом буферного раствора, который должен иметь значение рН 6,6-6,8 [127]. Также гемагглютинирующая активность вируса имеет сильную зависимость от температурного режима инкубации, который должен составлять 5±3°С. При инкубации с более высокой температурой (при 20°С и 37°С) специфическая агглютинация эритроцитов не наступает [69, 104]. Помимо установления диапазона восприимчивых хозяев и способности к гемагглютинации антиген УР2 ВПЛК ещё ответственен за индуцирование вируснейтрализующих антител (ВНА) [87]. Титр антител к антигену УР2 у кошек определяет степень защиты от ПЛК, поэтому снижение протективного уровня, составляющего 5,32-6,32 создает угрозу для заражения возбудителем болезни [3, 99].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Киселев Алексей Максимович, 2025 год

Ш1К - - - - -

PK-15 - - - - -

Москва-1 ПК н.и. н.и. н.и. н.и. н.и.

CRFK 3,00±0,00 1,33±0,50 - - -

MDCK - - - - -

Vero-76 - - - - -

Ш1К - - - - -

PK-15 - - - - -

Москва-2 (изолят «Фрейя») ПК н.и. н.и. н.и. н.и. н.и.

CRFK 4,77±0,44 5,11±0,33 6,00±0,00 6,11±0,33 6,00±0,00

MDCK - - - - -

Vero-76 - - - - -

Ш1К - - - - -

PK-15 - - - - -

Владимир-1(изолят «Шеба») ПК 6,77±0,44 7,77±0,44 8,22±0,44 8,11±0,33 8,22±0,44

CRFK 8,33±0,50 8,77±0,44 10,11±0,33 10,00±0,00 10,11±0,33

MDCK - - - - -

Vero-76 - - - - -

Ш1К 3,11±0,33 2,77±0,44 1,00±0,00 - -

PK-15 - - - - -

Примечание: mean - среднее значение; SD - стандартное отклонение; н.и. - не исследовалось; «-» - не обнаружено

Из пяти образцов выделили два изолята ВПЛК в культуре клеток CRFK, которым присвоены названия «Шеба» (ранее - Владимир-1) и «Фрейя» (ранее -

Москва-2). Следует также отметить, что полученные изоляты ВПЛК не показали видимого ЦПД, поэтому определяли их гемагглютинирующую активность. Определение титра вируса методом РГА проводили на протяжении всего периода культивирования с кратностью один раз в сутки. Заморозку ВСМ осуществляли после 96-120 часов культивирования, когда титр накопления вируса достигал плато и оставался на одном уровне не менее 24 часов. У других образцов при культивировании также не регистрировали видимое ЦПД и отмечали снижение гемагглютинирующей активности (вплоть до её отсутствия) в культуральной суспензии после каждого пассажа в РГА.

Таким образом, оптимальной биологической системой для выделения ВПЛК является перевиваемая линия CRFK, поскольку с третьего пассажа у изолятов «Шеба» и «Фрейя» достигнута репродукционная стабильность (у каждого изолята различия между их значениями гемагглютинирующей активности с третьего по пятый пассажи статистически незначимы (р>0,05). На примере культивирования изолята «Шеба» также показана высокая чувствительность к субкультуре ПК (гемагглютинирующая активность составил не менее 6,77±0,44 ^2/0,1 см3), однако получение субкультур является трудоемким процессом из-за постоянной потребности в донорах органов.

Чтобы оценить валидность предложенного метода для получения новых изолятов вируса ВПЛК в диагностических и исследовательских целях, его подвергли проверке по следующим параметрам: правильность, специфичность, чувствительность и прецизионность (сходимость и воспроизводимость).

Для определения правильности анализировали положительные (содержащие ВПЛК) и отрицательный (не содержащий ВПЛК) исследуемые образцы в трех повторностях. Результаты представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Правильность метода по выделению вируса панлейкопении кошек в

культуре клеток

№ п/п Название исследуемого образца Ожидаемый результат Полученный результат в трех повторностях

1 2 3

1 Биологический материал (тонкая кишка), содержащий ВПЛК («Шеба») выделен выделен выделен выделен

2 Неинфицированная культура клеток СЯГХ не выделен не выделен не выделен не выделен

3 Биологический материал (мозжечок), содержащий ВПЛК («Фрейя») выделен выделен выделен выделен

Для всех образцов получен результат, совпадающий с ожидаемым. Результаты валидационных испытаний по определению чувствительности и специфичности, подтверждаемые методами РГА и ПЦР, представлены в таблицах 6 и 7.

Таблица 6 - Специфичность метода по выделению вируса панлейкопении кошек в

культуре клеток

(ПЦР, п=1) (РГА, п=1)

№ п/п Название исследуемого образца Ожидаемый результат Полученный результат Подтверждение (СГТ)

ПЦР-РВ (О) РГА (^2/0,1 см3)

1 Неинфицированная культура клеток сягх не выделен не выделен отрицательно (н.о.) отрицательно (н.о.)

2 Биологический материал (тонкая кишка) от кошки, свободной от ВПЛК не выделен не выделен отрицательно (н.о.) отрицательно (н.о.)

3 Биологический материал (мозжечок) от кошки, свободной от ВПЛК не выделен не выделен отрицательно (н.о.) отрицательно (н.о.)

4 Биологический материал (фекалии) от кошки, свободной от ВПЛК не выделен не выделен отрицательно (н.о.) отрицательно (н.о.)

Примечание: СГТ- средний геометрический титр (пять пассажей); н.о. - не обнаружено

Таблица 7 - Чувствительность метода по выделению вируса панлейкопении

кошек в культуре клеток

(ПЦР, п=3) (РГА, п=9)

№ п/п Название Ожидаемый результат Полученный результат Подтверждение (СГТ)

исследуемого образца ПЦР-РВ (О) РГА (^2/0,1 см3)

1 Биологический материал (тонкая кишка), содержащий ВПЛК («Шеба») выделен выделен положительно (17,83±1,50) положительно (9,49±0,89)

Биологический

2 материал (мозжечок), содержащий ВПЛК («Фрейя») выделен выделен положительно (20,89±1,18) положительно (5,67±0,56)

Примечание: СГТ- средний геометрический титр (пять пассажей)

Специфичность метода доказана на основании полученных отрицательных результатов при выделении ВПЛК из образцов, в которых не присутствовал вирус. При определении чувствительности из заведомо положительных образцов получилось выделить ВПЛК из каждого. Достоверность подтвердили методами ПЦР-РВ и РГА.

Результаты валидационных испытаний по определению промежуточной прецизионности в условиях сходимости (повторяемости) метода по выделению ВПЛК в культуре клеток представлены в таблице 8.

Таблица 8 - Промежуточная прецизионность в условиях сходимости (повторяемости) метода по выделению вируса панлейкопении кошек в культуре

клеток (оператор № 1)

(РГА, п=9)

№ п/п Название образца Ожидаемый результат Полученный резу вирусовыделения (^2/0,1 повторности) ьтат см3) (СГТ) (3

1 2 3

1 Биологический материал (тонкая кишка), содержащий ВПЛК («Шеба») выделен выделен (9,47±0,90) выделен (9,46±0,85) выделен (9,49±0,89)

2 Биологический материал (мозжечок), содержащий ВПЛК («Фрейя») выделен выделен (5,60±0,61) выделен (5,69±0,58) выделен (5,67±0,56)

3 Неинфицированная культура клеток СЯРК не выделен не выделен (н.о.) не выделен (н.о.) не выделен (н.о.)

Результаты исследования положительных и отрицательных образцов в трех повторностях, выполненных в одних и тех же условиях измерения (оборудование, оператор, лаборатория) в течение одного промежутка времени полностью совпадали с ожидаемым результатом (результаты, полученные в трех повторностях, статистически незначимы (р>0,05).

Результаты валидационных испытаний по определению промежуточной прецизионности в условиях воспроизводимости метода по выделению ВПЛК в культуре клеток представлены в таблицах 9 и 10.

Таблица 9 - Промежуточная прецизионность в условиях воспроизводимости метода по выделению вируса панлейкопении кошек в культуре клеток (оператор

№ 1)

(РГА, п=9)

№ п/п Название образца Ожидаемый результат Полученный результат вирусовыделения (^2/0,1 см3) (СГТ) (3 повторности)

1 2 3

1 Биологический материал (тонкая кишка), содержащий ВПЛК («Шеба») выделен выделен (9,47±0,90) выделен (9,46±0,85) выделен (9,49±0,89)

2 Биологический материал (мозжечок), содержащий ВПЛК («Фрейя») выделен выделен (5,60±0,61) выделен (5,69±0,58) выделен (5,67±0,56)

3 Неинфицированная культура клеток СЯГХ не выделен не выделен (н.о.) не выделен (н.о.) не выделен (н.о.)

Примечание: СГТ- средний геометрический титр (пять пассажей); н.о. - не обнаружено

Таблица 10 - Промежуточная прецизионность в условиях воспроизводимости метода по выделению вируса панлейкопении кошек в культуре клеток (оператор

№ 2)

(РГА, п=9)

№ п/п Название образца Ожидаемый результат Полученный результат вирусовыделения (^2/0,1 см3) (СГТ) (3 повторности)

1 2 3

1 Биологический материал (тонкая кишка), содержащий ВПЛК («Шеба») выделен выделен (9,46±0,85) выделен (9,44±0,85) выделен (9,46±0,99)

2 Биологический материал (мозжечок), содержащий ВПЛК («Фрейя») выделен выделен (5,71±0,50) выделен (5,67±0,60) выделен (5,69±0,43)

3 Неинфицированная культура клеток СЯГХ не выделен не выделен (н.о.) не выделен (н.о.) не выделен (н.о.)

Результаты исследования положительных и отрицательных образцов в трех повторностях, выполненных в одних и тех же условиях измерения (оборудование и лаборатория) кроме фактора субъективности (метод воспроизведен двумя операторами), полностью совпадали с ожидаемым результатом (результаты, полученные в трех повторностях двумя операторами, статистически незначимы (p>0,05).

В соответствии с данными валидационных исследований установлено, что метод выделения ВПЛК в культуре клеток CRFK подходит для научно-исследовательских лабораторий и учреждений, занимающихся изготовлением иммунобиологических препаратов.

3.2 Филогенетическая принадлежность изолятов «Шеба» и «Фрейя» вируса

панлейкопении кошек

В настоящее время на территории европейских и азиатских стран регистрируют две геногруппы ВПЛК (G1 и G2). Геногруппа G2 включает аттенуированные (вакцинные) штаммы («PLI-IV», «Purevax», «Felocell») и вирулентные изоляты, выделенные в США («FPV-4 USA 1964», «CU-4»), Австралии («193/70»), Великобритании («97 11 06»), Аргентине («ARG08 07»), Японии («TU12»), Португалии («PT 210 13»), Китайской Народной Республике («BJ-03/16 2017»). К геногруппе G1 относятся высоковирулентные штаммы, зарегистрированные в евразийских странах (в Китайской Народной Республике, Южной Корее, Вьетнаме, Германии, Португалии, Италии, Венгрии, Великобритании) [75]. Генотипирование осуществляют на основе последовательностей наиболее вариабельного гена белка VP2. Однако дополнительно для этих целей возможно исследование полноразмерных последовательностей генома ВПЛК или других генов (VP1, NS1) [125]. Циркуляция генетических вариантов ВПЛК в Российской Федерации неизвестна. В связи с этим проведена филогенетическая идентификация и установлено родство изолятов «Шеба» и «Фрейя» ВПЛК при сравнительном анализе последовательностей гена, кодирующего антиген VP2 (рисунок 6).

Рисунок 6. Филогенетическое родство изолятов «Шеба» и «Фрейя»

Примечание: G1 - первая геногруппа (показана оранжевым цветом); G2 - вторая геногруппа (показана светло-зелёным цветом); vaccine strains - вакцинные штаммы; исследуемые изоляты показаны |

Как показано на дендрограмме (рисунок 6), изоляты «Шеба» и «Фрейя» относятся к первой геногруппе (G1). Кроме того, генетический вариант ВПЛК, изолированного на территории России, с высоким индексом достоверности (бутстреп-поддержка=96) составляет уникальный кластер внутри G1. Увеличенная длина ветви изолята «Фрейя» по сравнению с изолятом «Шеба» указывает на наличие дополнительных замен, что согласуется со временем выделения вируса («Шеба» выделен в 2021 г., а «Фрейя» - в 2024 г.).

Далее выполнили сравнительный анализ нуклеотидной и аминокислотной изменчивости гена белка VP2 у изолятов «Шеба» и «Фрейя» со штаммами и

изолятами ВПЛК, последовательности которых импортированы из GenBank (Таблица 11). В качестве референтного штамма использовали наиболее ранний известный предок всех существующих изолятов ВПЛК - FPV-4 USA 1964, принадлежащий второй геногруппе (G2, номер доступа EU659112).

Таблица 11 - Влияние однонуклеотидного полиморфизма на изменение

аминокислотного состава белка VP2 у изолятов «Шеба» и «Фрейя»

Нуклеотидная позиция (FPV-4 USA 1964) Нуклеотидная замена Аминокислотная позиция в белке VP2 Аминокислотные изменения Встречаемость

2786 T -> A 91 A -> S Представители G1

2816 С -> T 101 I -> T Представители G1

3752 A -> T 413 D -> V «Шеба», «Фрейя»

3771 C -> T 419 N=N «Шеба»

3979 G -> T 489 V -> F «Фрейя»

4022 C -> T 503 A -> V «Фрейя»

4035 G -> A 507 Т=Т Представители G1

4086 T -> C 524 Y=Y Представители G1

4124 С -> T 537 A -> V «Фрейя»

4133 G -> T 540 R -> I «Фрейя»

4180 G -> T 556 D -> I «Фрейя»

По результатам сравнения нуклеотидных последовательностей выявлено 11 замен (шесть транзиций (замена пуринового основания на пуриновое или пиримидинового на пиримидиновое) и пять трансверсий (замена пуринового основания на пиримидиновое и наоборот) в гене VP2 у изолятов «Шеба» и «Фрейя» относительно референтного штамма FPV-4 USA 1964, семь из которых являлись уникальными для российских изолятов. Три замены наблюдались у обоих российских изолятов, однако одна замена была специфична только для «Шеба», а пять замен - исключительно для «Фрейя». Анализ аминокислотных последовательностей позволил выявить три синонимичные и восемь несинонимичных мутаций. Важно отметить, что, как и высоковирулентные штаммы геногруппы G1, изоляты «Шеба» и «Фрейя» содержат аминокислоту серин (S) в позиции 91 области LOOP1. При этом значительные изменения в аминокислотных последовательностях белка VP2 изолятов «Шеба» и «Фрейя»

(однонуклеотидные инсерции или делеции, приводящие к сдвигу рамки считывания) не зарегистрированы.

По данным Xie Q. с соавт. (2024 г.), замена в аминокислоте 91 области LOOP1 белка VP2, считавшейся ранее высококонсервативной по результатам исследования Parker J. S. и Parrish C. R. (1997 г.), ответственна за более высокую вирулентность ВПЛК [75, 134]. В связи с тем, что изоляты «Шеба» и «Фрейя» ВПЛК, выделенные в Российской Федерации относятся к уникальному кластеру внутри G1, а большинство вакцин против ПЛК включают вакцинные штаммы, составляющие кластер внутри G2, уровень защиты кошек от заражения может быть снижен.

3.3 Биологические свойства штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек

Изучение биологических свойств изолята «Шеба» ВПЛК проводили с 2021 г. При этом выделение в культуре клеток и принадлежность изолята «Фрейя» к тому же уникальному для Российской Федерации кластеру установили в 2024 г. Эти данные позволили полностью обосновать предыдущие исследования по изучению изолята «Шеба» ВПЛК и его депонирование в качестве производственно-контрольного штамма в ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ для изготовления актуальных средств диагностики и специфической профилактики панлейкопении кошек. Поскольку изолят «Фрейя» характеризовался более низким титром накопления в культуре клеток CRFK («Фрейя»: до 6,11±0,33 log2/0,1 см3; «Шеба»: до 10,11±0,33 log2/0,1 см3) (p<0,05) и близким филогенетическим родством, в контексте данной работы было допустимо основывать последующие эксперименты на изоляте «Шеба».

3.3.1 Культуральные свойства изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек

В настоящее время эффективной мерой профилактики панлейкопении кошек является иммунизация животных вакцинами, создание которых основывается на получении сырья путем культивирования вируса в культуре клеток [65]. Поскольку репродукционный цикл ВПЛК ограничен S-фазой митоза, перед разработчиками

таких вакцин ставится задача по оптимизации условий культивирования производственного штамма вируса в пермиссивных клеточных линиях с целью его накопления в максимальных титрах.

В результате исследований по определению подходящей биологической системы для выделения ВПЛК установлено, что для его культивирования пермиссивными клеточными линиями являются субкультура ПК и перевиваемая культура CRFK (глава диссертационной работы 3.1). В процессе вирусовыделения получили изолят «Шеба» ВПЛК, характеризующийся высоким титром накопления в чувствительной культуре клеток CRFK. Титр достигал 10,11±0,33 ^2/0,1 см3 (по данным РГА), демонстрируя «эффект плато» с третьего по пятый пассажи при репродукции в клеточной линии (рисунок 7). Вследствие стабильной динамики накопления вируса в перевиваемой культуре клеток CRFK было принято решение использовать данную биологическую модель для дальнейших исследований культуральных свойств изолята «Шеба» ВПЛК.

Рисунок 7. Динамика накопления изолята «Шеба» ВПЛК в культуре клеток CRFK

Важно отметить, что для репликации геномной нуклеиновой кислоты ВПЛК использует в репродукционном цикле ДНК-полимеразы ядра клетки-мишени, образующиеся во время S-фазы митоза и обеспечивающие синтез интермедиатной двухцепочечной ДНК, необходимой для дальнейшего самовоспроизведения ВПЛК [97]. Основной целью изучения культуральных свойств стала оптимизация условий

культивирования, направленная на получение материала с высоким титром ВПЛК, подходящего для производства вакцин и гипериммунизации лабораторных животных. Для этого определяли множественность заражения, время и условия культивирования ВПЛК в культуре клеток CRFK, влияние степени конфлюэнтности клеток и способа заражения на динамику репродукции.

Для увеличения титра накопления изолята «Шеба» ВПЛК важной стадией являлось определение множественности заражения (MOI). С этой целью применяли различные заражающие дозы вируса на клетку (MOI: 0,00064; 0,00128; 0,00256; 0,00512; 0,01024; 0,02048 ГАЕ/кл). Так как изолят «Шеба» не демонстрировал видимых цитопатических изменений в культуре клеток, то у вируса определяли гемагглютинирующую активность в РГА каждые 24 часа после заражения до достижения «эффекта плато». Результаты представлены в таблице 12.

Таблица 12 - Влияние множественности заражения культуры клеток CRFK на

накопление изолята «Шеба» ВПЛК

(n=9)

MOI, ГАЕ/кл Суммарное количество клеток, x106 Время культивирования, ч Гемагглютинирующая активность вируса, log2/0,1 см3 (mean ± SD)

0,00064 1,0±0,3 144 6,77±0,44

0,00128 144 8,33±0,50

0,00256 120 9,88±0,33

0,00512 120 11,33±0,50

0,01024 96 11,77±0,44

0,02048 96 10,66±0,50

Примечание: mean - среднее значение; SD - стандартное отклонение

По результатам полученных данных, представленных в таблице 12, минимальной дозой заражения, позволяющей изоляту «Шеба» ВПЛК достигнуть наиболее высокого титра за 96 часов в культуральной суспензии, является MOI = 0,01024 ГАЕ/кл. Важно отметить, что при заражении дозами 0,000640, 0,001280, 0,00256 ГАЕ/кл также происходило накопление ВПЛК, но с более низкой гемагглютинирующей активностью (p<0,05). Сравнение титров накопления вируса в культуре клеток CRFK при множественности заражения 0,01024 ГАЕ/кл (по данным РГА титр накопления составил 11,33±0,50 log2/0,1 см3) и 0,00512 ГАЕ/кл

(по данным РГА титр накопления составил 11,77±0,44 ^2/0,1 см3) показало, что различие являлось статистически незначимым ф>0,05). В связи с этим в качестве основной дозы заражения определили 0,01024 ГАЕ/кл из-за меньшего срока накопления вируса (96 часов), который является более предпочтительным периодом при создании вакцин или диагностических препаратов. При заражении 0,02048 ГАЕ/кл накопление изолята «Шеба» достигало также максимального значения на 96 час культивирования, но с меньшей гемагглютинирующей активностью, составляющей 10,66±0,50 ^2/0,1 см3 ф<0,05), что, по-видимому, связано с ускоренным «эффектом подавления хозяина» (истощением ресурсов клеток-мишеней и замедлением репродукционного цикла вируса).

Затем оценивали динамику накопления изолята «Шеба» при разном времени культивирования (12 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч, 120 ч). Доза заражения составляла 0,01024 ГАЕ/кл. Результаты исследования представлены на рисунке 8.

, 14,00

л '

и

^

я 12,00

(•Л "

10,00

а

л н и о я

я

£ с 8,00

«

5 2

Л О

з 1 6,00

2 а

®

с/ 6*1

я .2 4,00 я '

я н 2 ч

и

и «

2,00

<и

0,00

^ 12 ч 24 ч 48 ч 72 ч 96 ч 120 ч

Рисунок 8. Динамика накопления изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек при разных сроках культивирования в культуре клеток CRFK

Данные, отраженные на рисунке 8, демонстрируют, что минимальное время культивирования, при котором вирус достигал наибольшего титра, составляет 96 ч ф<0,05). Активная динамика накопления ВПЛК в культуре клеток CRFK наблюдалась на протяжении 96 часов. Увеличение времени культивирования

свыше 96 часов приводило к уменьшению титра вируса в культуральной суспензии (р<0,05).

Последним этапом изучения культуральных свойств изолята «Шеба» ВПЛК стала оценка влияния различных способов заражения и разной степени конфлюэнтности клеток на накопление вируса. Для этого проводили инфицирование культуры клеток CRFK в виде суспензии, монослоя, сформированного на 50-80%, и полностью конфлюэнтного монослоя вирусом с дозой заражения 0,01024 ГАЕ/кл. Время культивирования составляло 96 часов. Заражение клеточной линии CRFK осуществляли различными способами. Результаты представлены в таблице 13.

Таблица 13 - Влияние способа заражения и степени конфлюэнтности клеток на

накопление изолята «Шеба» ВПЛК в культуре клеток CRFK

(n=9)

Способ заражения Конфлюэнтность клеток Гемагглютинирующая активность вируса, log2/0,1 см3 (mean ± SD)

Без адсорбции Суспензия -

С адсорбцией Монослой (сформированный на 50-80%) 12,33±0,50

Без адсорбции Монослой (сформированный на 50-80%) 10,33±0,50

С адсорбцией Полностью сформированный монослой 10,22±0,44

Без адсорбции Полностью сформированный монослой 7,77±0,44

Примечание: mean - среднее значение; SD - стандартное отклонение

Как показано в таблице 13, наличие предварительной адсорбции при заражении изолятом «Шеба» ВПЛК линии СЯБК позволило получить более высокий титр накопления вируса. При отсутствии адсорбции вируса титр был ниже на 2,00-3,00 ^2/0,1 см3 (по данным РГА) или, как в случае инфицирования суспензии клеток СЯБК, не регистрировался в РГА. Самый высокий титр накопления изолята фиксировали при культивировании в субконфлюэнтном монослое CRFK, сформированном на 50-80%. В исследовании Мальцевой Б.М. с соавт. (2000 г.) отмечено, что штамм «Ганнибал» и изоляты ВПЛК, выделенные на территории России, накапливаются в максимальном титре при заражении суспензии клеток кошачьего происхождения (КБ-91) [24]. Однако изолят «Шеба»

отличался по своим культуральным свойствам, и митотическая активность при конфлюэнтности клеток 50-80% CRFK является наиболее подходящей для накопления изолята «Шеба» ВПЛК в перевиваемой клеточной линии.

Таким образом, минимальной дозой заражения для получения максимального титра вируса в культуральной суспензии за 96 часов является 0,01024 ГАЕ/кл. Оценка влияния различных способов заражения показала, что титр вируса, регистрируемый методом РГА, при предварительном контакте вируса с клетками выше примерно на 2,00-3,00 ^2/0,1 см3, чем без адсорбции. Самый высокий титр накопления изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек (до 12,33±0,50 ^2/0,1 см3) был достигнут при культивировании в субконфлюэнтном монослое CRFK, сформированном на 50-80%.

3.3.2 Инактивация изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек

Перед изучением антигенных свойств изолята «Шеба» ВПЛК важным предшествующим этапом стала оптимизация условий его инактивации, состоящая из определения минимальной концентрации инактивирующего химического соединения, установления оптимальных параметров инкубации и времени инактивации, которые должны обеспечить у парвовируса кошек полною утрату инфекционной активности, сохранив при этом его антигенную структуру.

Отмечено, что для инактивации ВПЛК используют препараты формальдегида [8]. Однако в настоящее время для парвовирусов свиней и собак также применяют производные азиридинов в определённых концентрациях, позволяющих достигнуть высокой скорости инактивации вирусного генома и существенного отсутствия влияния на антигенную структуру вируса [12, 31, 9]. Поэтому в рамках оптимизации условий инактивации изолята «Шеба» ВПЛК было принято решение использовать в качестве инактиванта аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ).

В начале исследования образцы очищенного фреоном-113 культурального ВСМ изолята «Шеба» с гемагглютинирующей активностью 12,00±0,00 ^2/0,1 см3 подвергли инактивации АЭЭИ с pH 7,2-7,4 путем его внесения в различных

концентрациях действующего вещества, составляющих 0,01%, 0,05%, 0,1%, 0,15%, 0,2%. После внесения каждый образец ВСМ с определённым процентом инактиванта инкубировали при 37°С в течение 4, 8, 16, 24 и 48 часов. С момента окончания инкубации во все образцы вносили 2 М раствора тиосульфата натрия с целью нейтрализации АЭЭИ. Далее полученные суспензии охлаждали до 5±3°С и затем оценивали их гемагглютинирующую активность в РГА. Полноту инактивации образцов ВСМ проверяли путем серии трех «слепых» пассажей в культуре клеток CRFK. Результаты представлены в таблице 14.

Таблица 14 - Кинетика инактивации изолята «Шеба» вируса панлейкопении

кошек при 37 °С

(n=9)

Параметры Гемагглютинирующая активность вируса после инактивации, log2/0,1 см3 (mean ± SD) Гема акт log2/C гглютинирующая ивность вируса, ,1 см3 (mean ± SD)

Концентрация АЭЭИ, % Время инкубации, ч 1 пассаж 2 пассаж 3 пассаж

0,01 4 12,00±0,00 9,33±0,50 10,22±0,44 11,22±0,44

8 12,00±0,00 9,22±0,44 10,11±0,33 11,00±0,00

16 12,00±0,00 9,22±0,44 10,11±0,33 10,88±0,33

24 12,00±0,00 9,11±0,33 9,33±0,50 9,11±0,33

48 12,00±0,00 9,00±0,00 9,11±0,33 8,88±0,33

0,05 4 12,00±0,00 9,11±0,33 9,22±0,44 10,22±0,44

8 12,00±0,00 9,22±0,44 9,11±0,33 9,11±0,33

16 12,00±0,00 9,11±0,33 9,11±0,33 8,88±0,33

24 12,00±0,00 8,88±0,33 5,88±0,33 5,77±0,44

48 11,88±0,33 8,11±0,33 6,33±0,50 5,77±0,44

0,1 4 12,00±0,00 9,11±0,33 7,88±0,33 7,77±0,44

8 12,00±0,00 9,00±0,00 7,33±0,50 5,66±0,50

16 11,88±0,33 8,77±0,44 4,77±0,44 4,33±0,50

24 11,77±0,44 - - -

48 11,11±0,33 - - -

0,15 4 11,77±0,44 8,22±0,44 8,11±0,33 7,88±0,33

8 11,66±0,50 7,00±0,00 6,77±0,44 4,77±0,44

16 10,33±0,50 4,33±0,50 - -

24 10,11±0,33 - - -

48 9,88±0,33 - - -

0,2 4 10,88±0,33 7,22±0,44 7,11±0,33 7,00±0,00

8 10,11±0,33 5,00±0,00 4,33±0,50 2,33±0,50

16 9,88±0,33 2,11±0,33 - -

24 9,22±0,44 - - -

48 8,77±0,44 - - -

Примечание: mean - среднее значение; SD - стандартное отклонение; «-» - не обнаружено

По данным, представленным в таблице 14, экспозиция вируссодержащей суспензии изолята «Шеба» с концентрацией 0,1% АЭЭИ от исходного объема при температуре 37° в течение 24 часов существенно не влияет на антигенную структуру парвовируса кошек (титр составил 11,77±0,44 log2/0,1 см3 (по данным РГА) после инактивации (р>0,05). Концентрация АЭЭИ 0,1% (24 ч) обеспечивает полную инактивацию ВПЛК, так как на протяжении трех «слепых» пассажей в культуре клеток CRFK отсутствовала агглютинации эритроцитов (по данным РГА) (р<0,05). При меньшем времени экспозиции с инактивантом (концентрации: 0,1% при 4, 8 и 16 часах; 0,15% при 4, 8 и 16 часах; 0,2% при 4, 8 и 16 часах) или более низком показателе концентрации АЭЭИ (0,01% и 0,05%) в ВСМ отмечали агглютинацию эритроцитов в РГА. Повышение концентрации инактиванта в ВСМ (у 0,15% только при 16, 24, 48 часах) приводило к значительному уменьшению гемагглютинирующей активности изолята «Шеба» (р<0,05), что может свидетельствовать о влиянии на антигенную структуру ВПЛК [12, 31, 9].

С целью оценки влияния инактиванта на антигенную структуру изолята «Шеба» ВПЛК сравнительно определяли антигенную активность ВСМ, инактивированного АЭЭИ в концентрациях 0,1% (экспозиция - 24 часа), 0,15% (экспозиция - 16 часов) и 0,2% (экспозиция - 16 часов) на лабораторных животных. Для этого были сформированы три экспериментальные и одна контрольная группы кроликов по пять голов в каждой. Животным экспериментальных групп вводили однократно инактивированный материал изолята «Шеба» ВПЛК подкожно в дозе 1,0 см3. Первой группе инокулировали ВСМ, инактивированный 0,1% АЭЭИ в течение 24 часов, второй группе - ВСМ, инактивированный 0,15% АЭЭИ в течение 16 часов, третьей группе - ВСМ, инактивированный 0,2% АЭЭИ в течение 16 часов. Четвертой контрольной группе вводили 1,0 см3 питательной среды ПСС. Титр антител к антигену ВПЛК в сыворотках крови кроликов определяли в РТГА до введения и спустя 21 сутки. Результаты исследования представлены в таблице 15.

Таблица 15 - Динамика сероконверсии к изоляту «Шеба» ВПЛК у кроликов

(по данным РТГА)

(кролики, п=5) (повторности, п=3)

Группа животных Титр антител (по данным РТГА), 1о*2 (СГТ)

До иммунизации 21 сутки (после иммунизации)

Экспериментальная № 1 (0,1% АЭЭИ) - 7,88±0,63

Экспериментальная № 2 (0,15% АЭЭИ) - 5,94±0,82

Экспериментальная № 3 (0,2% АЭЭИ) - 5,70±0,50

Контрольная - -

Примечание: СГТ- средний геометрический титр

По результатам исследования антигенной активности изолята «Шеба» ВПЛК, инактивированного различными концентрациями АЭЭИ, самый высокий прирост вирусспецифических антител после 21 суток отмечен у экспериментальной группы кроликов № 1 (7,88±0,63 ^2) (таблица 15). У других экспериментальных групп прирост антител был значительно ниже по сравнению с первой группой (р<0,05) (№ 2 - 5,94±0,82 №2 3 - 5,70±0,50 ^2). У контрольной группы кроликов антитела к ВПЛК не регистрировали.

Проведенные исследования позволили определить, что АЭЭИ в концентрации 0,1% от исходного объема ВСМ при температуре 37° в течение 24 часов обеспечивает полную инактивацию парвовируса кошек и существенно не влияет на антигенную структуру изолята «Шеба» ВПЛК.

3.3.3 Антигенные свойства изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек Адаптация метода определения антител к вирусу панлейкопении кошек в сыворотке крови животных к современным лабораторным условиям.

Определение наиболее приемлемого серологического метода исследования, который позволит выявлять антитела к ВПЛК, его адаптация к современным лабораторным условиям также стали ключевыми задачами перед началом изучения антигенных свойств инактивированного изолята «Шеба».

Одними из первых серологических методов, которые применяли для диагностики ПЛК, являются РТГА и РН. Данные реакции позволяют определять

титр протективного уровня вирусспецифических антител, демонстрирующего степень защиты восприимчивых животных от заражения ВПЛК [99, 105]. Несмотря на то, что РТГА и РН в настоящее время редко применяют для лабораторной диагностики ПЛК, данные реакции остаются эталонными методами выявления вирусспецифических антител при оценке антигенной активности вакцин (или исследуемых вирусов) в научно-исследовательских лабораториях и учреждениях, занимающихся изготовлением иммунобиологических препаратов, благодаря высокой чувствительности [2, 56, 102, 124,]. Поскольку изолят «Шеба» ВПЛК не демонстрировал видимого цитопатического действия при культивировании в CRFK наиболее подходящим методом стала РТГА, сущность которой заключается в выявлении торможения гемагглютинирующей активности ВПЛК благодаря сывороткам крови животных, содержащим специфические антитела к парвовирусу кошек.

В исследованиях 1975 и 1987 гг. определено, что для проведения РГА с ВПЛК оптимальный температурный режим инкубации составляет 5±3°C, а эритроциты свиньи обладают наибольшей чувствительностью к вирусу [69, 104]. Moraillon A. и Moraillon R. (1982 г.) выявили прямую зависимость гемагглютинирующей активности ВПЛК от pH буферного раствора, который должен иметь значение pH 6,6-6,8 [127]. Адаптация метода РТГА, позволяющего выявлять специфические антитела к ВПЛК, к современным лабораторным условиям осуществлялась на основании вышеописанных данных и методах серологического исследования парвовируса кошек, описанных Johnson R. H., Mochizuki M. и соавт., Soma T. и соавт. [56, 79, 116]. По результатам проведенных опытов метод был успешно адаптирован.

Для подтверждения чувствительности метода РТГА определяли наличие колостральных антител к ВПЛК в сыворотке крови котят и вирусспецифических антител в сыворотке крови восприимчивых (кошек) и лабораторных (кроликов) животных, вакцинированных против панлейкопении кошек. Данные исследований сывороток крови котят представлены в таблице 16.

Таблица 16 - Результаты определения титра антител к вирусу FPV в сыворотках

крови животных

(п=1)

№ п/п Характеристика сывороток, взятых от животных Титр антител (по данным РТГА), ^2

1 сыворотка новорожденного котенка № 1 8,32

2 сыворотка новорожденного котенка №2 11,32

3 сыворотка новорожденного котенка №3 9,32

4 сыворотка новорожденного котенка №4 9,32

5 сыворотка новорожденного котенка №5 9,32

6 сыворотка котенка № 1 через 21 сутки после вакцинации 11,32

7 сыворотка котенка №2 через 21 сутки после вакцинации 9,32

8 сыворотка котенка №3 через 21 сутки после вакцинации 9,32

9 сыворотка котенка №4 через 21 сутки после вакцинации 11,32

10 сыворотка котенка № 1 через 35 сутки после вакцинации 12,32

11 сыворотка котенка №2 через 35 сутки после вакцинации 12,32

12 сыворотка котенка №3 через 35 сутки после вакцинации 13,32

13 сыворотка котенка №4 через 35 сутки после вакцинации 12,32

14 сыворотка кролика № 1 через 21 сутки после вакцинации 10,32

15 сыворотка кролика №2 через 21 сутки после вакцинации 9,32

Также для подтверждения соответствия установленным целям и требованиям РТГА проверяли на валидность по показателям: правильность, специфичность и прецизионность (сходимость и воспроизводимость).

Для определения правильности анализировали положительные (со специфическими антителами к ВПЛК) и отрицательные (без специфических антител к ВПЛК) сыворотки с известным статусом, идентифицированные в ИФА. В результате проверки показателя правильности полученные результаты (таблица 17) совпали со статусами сывороток. Таким образом рассчитанная правильность валидируемого метода соответствовала установленным значениям.

Таблица 17 - Определение правильности валидируемого метода по выявлению

антител к вирусу панлейкопении кошек в реакции торможения гемагглютинации

№ п/п Название сыворотки Известный статус сыворотки Качественная оценка результата в РТГА

1 2 3 4

1 Сыворотка новорожденного котенка № 1 Наличие антител к ВПЛК Положительный

2 Сыворотка новорожденного котенка № 2 Наличие антител к ВПЛК Положительный

1 2 3 4

3 Сыворотка новорожденного котенка № 3 Наличие антител к ВПЛК Положительный

4 Сыворотка новорожденного котенка № 4 Наличие антител к ВПЛК Положительный

5 Сыворотка новорожденного котенка № 5 Наличие антител к ВПЛК Положительный

6 Отрицательная сыворотка крови № 1 Отсутствие антител к ВПЛК Отрицательный

7 Отрицательная сыворотка крови № 2 Отсутствие антител к ВПЛК Отрицательный

8 Отрицательная сыворотка крови № 3 Отсутствие антител к ВПЛК Отрицательный

9 Отрицательная сыворотка крови № 4 Отсутствие антител к ВПЛК Отрицательный

10 Отрицательная сыворотка крови № 5 Отсутствие антител к ВПЛК Отрицательный

Специфичность метода по выявлению антител к ВПЛК в РТГА проверяли с

использованием гомологичных и гетерологичных сывороток: сыворотка крови кролика, иммунизированного штаммом «Перс» вируса калицивирозной инфекции кошек; сыворотка крови морской свинки, иммунизированной штаммом «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек; отрицательная сыворотка крови кролика к ВПЛК; положительная сыворотка крови кошек к ВПЛК. Результаты представлены в таблице 18.

Таблица 18 - Результаты выявления антител к вирусу панлейкопении кошек в гомологичных и гетерологичных сыворотках крови в реакции торможения гемагглютинации (определение специфичности)

(n=3)

№ Характеристика сыворотки Титр антител (по данным РТГА), log2 (mean ± SD) Качественная оценка результата в РТГА

1 Сыворотка крови кролика, иммунизированного штаммом «Перс» вируса калицивирозной инфекции кошек - Отрицательный

2 Сыворотка крови морской свинки, иммунизированной штаммом «Лавр» вируса инфекционного ринотрахеита кошек - Отрицательный

3 Отрицательная контрольная сыворотка крови - Отрицательный

4 Положительная кошачья сыворотка крови к ВПЛК 9,32±0,00 Положительный

Примечание: mean - среднее значение; SD - стандартное отклонение

В соответствии с результатами, представленными в таблице 18, специфичность метода составила 100% по показателю титра антител к ВПЛК.

При определении сходимости и воспроизводимости исследовали положительные и отрицательные сыворотки в восьми повторностях двумя разными исполнителями, в одних и тех же условиях измерения. Исследование сывороток проводилось на протяжении двух дней. Результаты испытаний представлены в таблице 19.

Таблица 19 - Результаты исследований положительных и отрицательных сывороток крови при определении титра антител к вирусу панлейкопении кошек в реакции торможения гемагглютинации (определение сходимости и

воспроизводимости)

Полученные результаты (1 сутки)

Повторности

Исполни тель Исследуемая сыворотка 1 2 3 4 5 6 7 8

Титр антител (по данным РТГА), ^2

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

№ 1 Сыворотка крови котенка № 2 через 21 сутки после вакцинации против ВПЛК 9,32 9,32 9,32 9,32 10,32 9,32 9,32 9,32

Отрицательная контрольная сыворотка крови кролика - - - - - - - -

№ 2 Сыворотка крови котенка №2 через 21 сутки после вакцинации против ВПЛК 10,32 9,32 9,32 9,32 9,32 9,32 9,32 9,32

Отрицательная контрольная сыворотка крови кролика - - - - - - - -

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Полученные результаты (2 сутки)

№ 1 Сыворотка крови котенка № 2 через 21 сутки после вакцинации против ВПЛК 9,32 10,32 9,32 9,32 9,32 9,32 9,32 9,32

Отрицательная контрольная сыворотка крови кролика - - - - - - - -

№ 2 Сыворотка крови котенка № 2 через 21 сутки после вакцинации против ВПЛК 9,32 9,32 9,32 9,32 9,32 9,32 9,32 9,32

Отрицательная контрольная сыворотка крови кролика - - - - - - - -

Сходимость и воспроизводимость метода совпали (результаты, полученные в восьми повторностях, статистически незначимы (р>0,05).

В соответствии с полученными результатами валидационных испытаний установлено, что адаптированный метод по выявлению антител к ВПЛК в РТГА приемлем в условиях научно-исследовательских лабораторий и учреждениях, занимающихся изготовлением иммунобиологических препаратов. Метод отвечал целям выявления антител к ВПЛК и оценке антигенной активности вакцин (или исследуемых вирусов).

Изучение антигенной активности изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек на лабораторных животных. Для исследования антигенных свойств проводили иммунизацию кроликов и котят инактивированным материалом изолята «Шеба» ВПЛК, смешанным с адъювантом. Перед инактивацией вируссодержащую суспензию освобождали от клеточного детрита в целях снижения реактогенности у животных при инокуляции антигена. Для этого его очищали фреоном-113. После химической очистки гемагглютинирующая активность изолята «Шеба» ВПЛК составила 10,11±0,33 ^2/0,1 см3. Далее ВСМ

был подвергнут инактивации АЭЭИ в концентрации 0,1% от общего объема суспензии при 37°С в течение 24 часов. Затем полученный материал сорбировали на 3%-ном геле гидроокиси алюминия (ГОА) в соотношении 9:1 от общего объема (10%). Важно подчеркнуть, что выбор ГОА обусловлен тем, что изолят «Шеба» являлся кандидатом в производственно-контрольный штамм, который должен обладать оптимальными биологическими свойствами для создания актуальных адъювантных инактивированных вакцин против ПЛК. Выбор ГОА, как адъюванта, позволяет усилить синтез вирусспецифических антител, что является ключевым фактором защиты от заражения ВПЛК. Во-вторых, ГОА в оптимальной концентрации также безопасен при введении целевым животным из-за низкой реактогенности [1, 8, 9, 41].

После сорбции на ГОА антиген проверяли на стерильность, которая в результате показала отсутствие бактериальной и грибковой контаминации. Для исследования антигенных свойств изолята «Шеба» ВПЛК на кроликах сформировали две группы. Первой, состоящей из пяти голов, вводили инактивированный материал, сорбированный на ГОА, подкожно в дозе 1,0 см3 двукратно с интервалом 21 сутки. Кроликам второй группы, сформированной в качестве контрольной и в которую входило пять голов, инъецировали 1,0 см3 питательной среды ПСС. Титр антител к антигену ВПЛК в сыворотках крови кроликов определяли в РТГА до введения и спустя 21 и 35 суток после иммунизации. Результаты исследования представлены в таблице 20.

Таблица 20 - Динамика сероконверсии к изоляту «Шеба» ВПЛК у кроликов (по

данным РТГА)

(кролики, п=5) (повторности, п=3)

Группа животных Титр антител (по данным РТГА), ^2 (СГТ)

До иммунизации 21 сутки (после иммунизации) Повторное введение антигена 35 сутки (после иммунизации)

Экспериментальная - 8,70±0,50 10,84±0,52

Контрольная - - -

Примечание: СГТ- средний геометрический титр

Результаты исследования антигенной активности изолята «Шеба» ВПЛК на кроликах, представленные в таблице 20, продемонстрировали высокие титры накопления антител к ВПЛК. При наличии бустерной иммунизации инактивированным материалом изолята «Шеба», сорбированном на ГОА, на 35 сутки титр вирусспецифических антител в сыворотке крови достигал статистически значимого показателя, составляющего 10,84±0,52 log2 (р<0,05). В течение всего периода исследования у контрольной группы кроликов антитела к ВПЛК не обнаруживали.

Также было сформировано две группы с котятами трехмесячного возраста (по пять котят в каждой). Животных первой группы иммунизировали инактивированным материалом изолята «Шеба», сорбированном на ГОА, подкожно в дозе 1,0 см3 двукратно с интервалом 21 сутки. Второй группе, как контрольной и состоящей из пяти голов, инокулировали 1,0 см3 питательной среды ПСС. Титр антител к антигену ВПЛК в сыворотках крови котят также определяли в РТГА до введения и спустя 21 и 35 суток после иммунизации. Результаты представлены в таблице 21.

Таблица 21 - Динамика сероконверсии к изоляту «Шеба» ВПЛК у кошек (по

данным РТГА)

(котята, п=5) (повторности, п=3)

Группа животных Титр антител (по данным РТГА), (СГТ)

До иммунизации 21 сутки (после иммунизации) Повторное введение антигена 35 сутки (после иммунизации)

Экспериментальная 5,77±0,52 9,51±0,41 12,11±0,41

Контрольная 5,50±0,41 4,17±0,35 3,75±0,52

Примечание: СГТ - средний геометрический титр; протективный уровень антител - > 5,326,32 [3, 99]

В соответствии с данными, указанными в таблице 21, у котят до введения инактивированного материала изолята «Шеба» присутствовали вирусспецифические антитела в сыворотке, что связано со сложностью приобретения кошек с серонегативным статусом к ПЛК на территории России [3]. Поэтому для оценки антигенных свойств изолята «Шеба» ВПЛК на котятах

провели анализ динамики прироста вирусспецифических антител после иммунизации. Результаты РТГА спустя 21 и 35 суток после иммунизации показали, что двукратное введение цельновирионного антигена ВПЛК с адъювантом индуцировало выработку антител выше протективного уровня в титре до 12,11±0,41 что свидетельствует о высокой антигенной активности вируса, сорбированного на ГОА [3, 99].

Изученные антигенные свойства изолята «Шеба» ВПЛК показали, что при двукратном введении антигена, сорбированного на ГОА, у кроликов после 35 суток титр вирусспецифических антител достигал 10,84±0,52 У кошек был отмечен прирост антител к ВПЛК выше протективного уровня после двукратной иммунизации, достигающий через 35 суток титра 12,11±0,41 В течение всего периода исследования у животных не отмечали признаки угнетения, повышение температуры или ухудшение аппетита. В месте введения инактивированного изолята «Шеба» ВПЛК или питательной среды ПСС не было выявлено видимой аллергической реакции и отёка.

3.3.4 Депонирование изолята «Шеба» вируса панлейкопении кошек в качестве производственно-контрольного штамма

Проведенные исследования биологических свойств изолята ВПЛК стали основанием для депонирования вируса в качестве производственно-контрольного штамма «Шеба» в ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» под регистрационным номером №455-деп/23-5-ГКШМ ФГБУ «ВНИИЗЖ» и паспортизирования (приложения 1, 2, 3). Штамм «Шеба» ВПЛК может быть использован для производства и контроля иммунобиологических препаратов, применяться в диагностических и исследовательских целях. Допустимый срок хранения штамма «Шеба» ВПЛК в виде вируссодержащей суспензии при температуре не выше минус 70±5°С составляет не менее 12 месяцев. В лиофилизированном состоянии при температуре не выше минус 45±5°С штамм может храниться неограниченно при условии, что его гемагглютинирующая активность, которую необходимо проверять с периодичностью один раз в пять лет, будет не ниже 7,0 ^2/0,1 см3.

3.4 Определение оптимальных способов очистки и режимов концентрирования штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек

Важным аспектом в создании инактивированных вакцин и получении гипериммунных сывороток является определение оптимальной иммунизирующей дозы (с адъювантом или без), способной вызвать у естественно-восприимчивых и лабораторных животных наибольшую выработку вирусспецифических антител [42]. Процесс культивирования штамма «Шеба» ВПЛК в культуре клеток CRFK отличался длительным периодом накопления вируса в культуре клеток (4-5 суток) и максимальным титром, составляющим 12,33±0,50 log2/0,1 см3 (по данным РГА). Наличие клеточного детрита после двукратной процедуры «замораживание-оттаивание» может привести к повышению реактогенности препарата при инокуляции антигена животным. Поэтому с целью получения очищенного препарата ВПЛК с более высокой гемагглютинирующей активностью была проведена оптимизация способов очистки и режимов концентрирования вируссодержащей суспензии.

В эксперименте использовали исходную вируссодержащую суспензию (до оптимизации условий культивирования) с гемагглютинирующей активностью вируса, составляющей 9,00±0,00 ^2/0,1 см3 (среднее значение титра накопления ВПЛК в культуре клеток CRFK). Для очистки культуральной вируссодержащей суспензии от балластных липидов использовали фреон-113 или хлороформ, которые доказали свою высокую эффективность в подготовке образцов биологического материала для последующего выделения ВПЛК в культуре клеток. В соответствии с этими экспериментальными данными ВСМ штамма «Шеба» также объединяли с фреоном-113 или хлороформом в соотношении 1:1 и инкубировали 15 минут при температуре 4°С. Для очистки ВСМ от клеточного детрита смесь центрифугировали в течение 30 минут при 3000 g, затем отбирали очищенный супернатант и использовали его для дальнейших исследований. Экспозиция ВСМ штамма «Шеба» в соотношении 1:1 с фреоном-113 или хлороформом при температуре 4°С в течение 15 минут, как и при подготовке образцов биологического материала, также способствовала увеличению титра

ВПЛК в подготовленной вируссодержащей культуральной суспензии. Гемагглютинирующая активность вируса с 9,00±0,00 log2/0,1 см3 увеличилась после очистки до 10,00±0,00 log2/0,1 см3 (таблица 22). Сравнительное использование фреона-113 и хлороформа показало идентичные результаты для осветления ВСМ.

После очистки вирус концентрировали двумя способами:

1) Методом осаждения 50%-ным ПЭГ-6000. Для этого к очищенному супернатанту объемом 50,0 см3 штамма «Шеба» с гемагглютинирующей активностью 10,00±0,00 ^2/0,1 см3 добавляли хлорид натрия до 0,5 М раствора и 50%-ный ПЭГ-6000 до конечной концентрации 12% с последующей экспозицией полученного материала в течение 20 часов при температуре 4°С. После окончания инкубации материал центрифугировали при 5000 g в течение двух часов.

2) Методом ультрацентрифугирования. Очищенный супернатант объемом 50,0 см3 штамма «Шеба» с гемагглютинирующей активностью 10,00±0,00 ^2/0,1 см3 центрифугировали при 70000 g с поддерживаемой температурой 4°С в течение трех часов.

После концентрирования вируса супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 1,0 см3 стерильного ЗБФР с рН 6,8. Результаты применения двух методов концентрирования представлены в таблице 22.

Таблица 22 - Гемагглютинирующая активность штамма «Шеба» вируса панлейкопении кошек при различных методах концентрирования

(п=9)

№ п/п Исследуемый материал Гемагглютинирующая активность, log2/0,1 см3 (mean ± SD)

1 Исходный ВСМ 9,00±0,00

2 ВСМ после очистки 10,00±0,00

3 ВСМ после очистки и концентрирования методом осаждения в 50% ПЭГ-6000 с экспозицией 20 часов при 4°С 15,66±0,50

4 ВСМ после очистки и концентрирования методом ультрацентрифугирования (при 70000 g с поддерживаемой температурой 4°С в течение 3 часов) 16,77±0,44

Примечание: mean - среднее значение; SD - стандартное отклонение

В соответствии с результатами, представленными в таблице 22, метод ультрацентрифугирования позволил получить препарат ВПЛК с гемагглютинирующей активностью 16,77±0,44 ^2/0,1 см3. При концентрировании методом осаждения в 50%-ном растворе ПЭГ-6000 с экспозицией 20 часов титр штамма «Шеба» был ниже (р<0,05) и составлял 15,66±0,50 ^2/0,1 см3 (по данным РГА). Таким образом, метод ультрацентрифугирования показал себя, как более эффективный способ концентрирования ВПЛК.

После концентрирования вируса оценивали степень очистки. Для этого использовали электрофорез в полиакриламидном геле. На рисунке 9 представлена электрофореграмма фракций белков ВПЛК: УР1 и УР2.

УР1 -УР2 -

- 250 кДа

- 100 кДа

- 75 кДа

50 кДа

1

2

3

Рисунок 9. Электрофореграмма белков вируса панлейкопении кошек

Примечание: 1 - Очищенный концентрированный препарат вируса; 2 - Очищенная суспензия культуры клеток CRFK после концентрирования (контроль); 3 - Маркер молекулярного веса белков

По данным проведенных исследований установили, что метод химической очистки культуральной суспензии, содержащей штамм «Шеба» ВПЛК,

хлороформом или фреоном-113 с последующим этапом ультрацентрифугирования при 70000 g с поддерживаемой температурой 4°С в течение трех часов позволяет получить концентрированный препарат вируса (с 9,00±0,00 до 16,77±0,44 ^2/0,1 см3) с высокой степенью очистки, подтвержденной электрофоретическим разделением белков УР1 и УР2 в полиакриламидном геле.

В целях подтверждения заявленным целям (применение очищенного концентрированного препарата ВПЛК для получения диагностикумов (антигена) и гипериммунных поливалентных сывороток животных) валидность заявленного метода подтверждали за счет проверки правильности, прецизионности (сходимости и воспроизводимости). Представленный метод не предусматривал оценки чувствительности и специфичности.

Правильность и прецизионность метода оценивали с использованием заведомо положительных и отрицательных образцов: 1) Положительный образец № 1, содержащий препарат штамма «Шеба» ВПЛК после очистки и концентрирования; 2) Положительный образец № 2, содержащий культуральный ВСМ штамма «Шеба»; 3) Отрицательный образец, содержащий штамм «Перс» вируса калицивирозной инфекции кошек (плацебо-проба № 1); 4) Отрицательный образец, представляющий собой суспензию культуры клеток CRFK после концентрирования (плацебо-проба № 2). Измерения проводили в РГА в трех повторностях. Для подтверждения валидационной характеристики «правильность» у положительного образца (препарат штамма «Шеба» ВПЛК после очистки и концентрирования) гемагглютинирующая активность должна была составлять не менее 16,00 ^2/0,1 см3 (таблица 22), а разброс значений при измерении плацебо не должен превышать ±1%. Результаты представлены в таблице 23.

Таблица 23 - Правильность метода по очистке и концентрированию вируса

панлейкопении кошек

№ п/п Наименование и маркировка образца Ожидаемый результат в РГА, ^2/0,1 см3 Гемагглютинирующая активность, ^2/0,1 см3

Повторности

1 2 3

1 Положительный образец № 1 >16,00 16,00 17,00 17,00

2 Положительный образец № 2 <16,00 9,00 9,00 9,00

3 Плацебо-проба № 1 - - - -

4 Плацебо-проба № 2 - - - -

Разброс значений при измерении плацебо равнялся нулю (не превышал ±1%), а гемагглютинирующая активность положительного образца № 1 (очищенного концентрированного препарата штамма «Шеба» ВПЛК) составила 16,67±0,58 ^2/0,1 см3, что позволило подтвердить характеристику «правильность» у заявленного метода.

Воспроизводимость определялась при оценке результатов испытаний образцов в условиях повторяемости, а показатель внутрилабораторной сходимости оценивался при анализе результатов, полученных разными сотрудниками лаборатории (таблица 24). Математическое различие полученных результатов рассчитывали по формулам (1), (2), (3):

~ _ £р£~*ср) (1)

" п-1 (1)

^ср п (2)

СУ _ X 100% (3)

у х 7

ср

где: Sr - среднее квадратичное отклонение;

СУ - коэффициент вариации;

Xt - результат отдельного определения;

Хср: - среднее арифметическое всех определений;

п - число определений.

Для подтверждения валидности метода показатель внутрилабораторной воспроизводимости результатов анализа не должен был превышать 20% (коэффициент вариации).

Положительный образец № 1: SI=(15-15)/3-1=0

Хср=15; Sr=0

СУ=0/15х100%=0%

0<20

Положительный образец № 2: Sr=(9-9)/3-1=0 Хср=9; Sr=0 СУ=0/9х100%=0% 0<20

Таблица 24 - Промежуточная прецизионность в условиях сходимости метода по очистке и концентрированию вируса панлейкопении кошек

Исследуемый образец Гемагглютинирующая активность, ^2/0,1 см3

1-й сотрудник 2-й сотрудник

П овторности П овторности

1 2 3 1 2 3

Положительный образец № 1 16,00 17,00 17,00 16,00 16,00 17,00

Положительный образец № 2 9,00 9,00 9,00 9,00 9,00 9,00

Плацебо-проба № 1 - - - - - -

Плацебо-проба № 2 - - - - - -

Результаты параллельных определений внутри серии, полученные в условиях воспроизводимости и сходимости, не превышали 20%, подтвердив характеристику «прецизионность» у заявленного метода.

После валидационных испытаний метод очистки и концентрирования ВПЛК за счет научно-производственной значимости был рекомендован в целях изготовления вакцины против ПЛК (при низком титре накопления вируса в культуре клеток), для получения гипериммунных сывороток и диагностикумов (антигена).

3.5 Оптимизация получения гипериммунных сывороток с высоким титром вирусспецифических антител к вирусу панлейкопении кошек