Биотехнология иммуномагнитных сорбентов для онкологии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Голенкина, Екатерина Александровна

• Голенкина, Екатерина Александровна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Голенкина, Екатерина Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность.

Цель исследования.

Задачи исследования.

Научная новизна.

Научно-практическая значимость.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Теоретические основы создания корпускулярных магнитоуправляемых 12 сорбентов.

1.2. Применение метода иммуномагнитной сепарации в научно- 22 исследовательской и клинической практике.

1.2.1. Выделение субпопуляций лимфоцитов и других видов клеток для 22 последующего изучения их морфологии и функций в культурах in vitro.

1.2.2. Иммуномагнитная селекция минорных клеточных популяций.

1.2.3. Комбинирование иммуномагнитной сепарации с другими методами молекулярной и клеточной биологии.

1.2.3.1. ИМС как дополнение иммунофлуоресцентного метода.

1.2.3.2. Иммуномагнитная сепарация образцов для последующего анализа методом полимеразной цепной реакции и другими методами молекулярной генетики.

1.2.3.3. Новый ускоренный метод селекции и клонирования гибридом-продуцентов 3 3 моноклоналъных антител с исполъзовнием иммуномагнитных сорбентов.

1.2.4. Иммуномагнитные сорбенты в онкологии.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Синтез магнитных полистироловых микросфер (МПМ).

2.1.1. Получение коллоида магнетита.

2.1.2. Получение магнитных микросфер на основе мономеров и магнетита.

2.1.3. Получение магнитных микросфер с поверхностными карбоксильными группами на основе мономеров, сополимера (малеинового ангидрида) и магнетита.

2.2. Исследование физико-химических свойств магнитных полистироловых микросфер.

2.2.1. Измерение магнитных свойств МПМ.

2.2.2. Структурный анализ МПМ на основе мономеров и магнетита методом инфракрасной спектроскопии.

2.2.3. Определение диаметров и характера распределения МПМ по размерам.

2.3. Получение иммуномагнитных конъюгатов.

2.3.1. Получение препаратов очищенных моноклональных антител (МКА).

2.3.1.1. Выделение иммуноглобулинов путем осаждения сульфатом аммония.

2.3.1.2. Выделение иммуноглобулинов методом аффинной хроматографии на колонке с протеином А на сефарозе CL-4B.

2.3.2. Активирование поверхностных гидроксильных групп МПМ/?-Ts-Cl.

2.3.3. Конъюгирование иммуноглобулинов с МПМ.

2.3.3.1. Получение иммуномагнитных конъюгатов путем пассивной адсорбции и с помощью ковалентного связывания после активацииp-Ts-Cl.

2.3.3.2. Получение иммуномагнитных конъюгатов МКА с карбоксилированными магнитными микросферами.

2.3.3.3. Количественное определение содержания МКА в растворах методом простой радиальной иммунодиффузии.

2.3.4. Иммуномагнитная сепарация.

2.3.4.1. Выделение мононуклеарных клеток периферической крови.

2.3.4.2. Иммунофлуоресцентный анализ.

Непрямой метод иммуноресцентного анализа.

Прямой метод иммуноресцентного анализа.

2.3.4.3. Иммуномагнитная селекция клеток.

2.3.4.4. Оценка выживаемости клеток после обработки разными концентрациями химопапаина с помощью МТТ-теста.

Проведение исследования.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование физико-химических свойств магнитных полистироловых микросфер.

3.2. Получение иммуномагнитных коньюгатов.

3.2.1. Оптимизация условий ковалентного связывания IgG с магнитными микросферами, активированными j?-TsCl.

3.2.2. Получение иммуномагнитных конъюгатов, различающихся механизмом иммобилизации моноклональных антител.

3.2.3. Создание иммуномагнитных сорбентов путем ковалентного связывания 77 МКА с магнитными микросферами, активированными p-TsCl.

3.3. Иммуномагнитная сепарация гемопоэтических клеток человека.

3.3.1. Оценка влияния сорбционной емкости иммуномагнитных конъюгатов на эффективность селекции клеток.

3.3.1.1. Негативная селекция Т-лимфоцитов.

3.3.1.2. Негативная селекция В-лимфоцитов.

3.3.2. Селекция клеток с использованием иммуномагнитных конъюгатов, различающихся механизмом связывания МКА.

3.3.3. Селекция клеток с использованием иммуномагнитных конъюгатов, полученных путем ковалентного связывания МКА с магнитными микросферами, активированнымиp-Ts-Cl.

3.3.4. Ферментативное отщепление клеток позитивной фракции от частиц сорбента.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биотехнология иммуномагнитных сорбентов для онкологии»

Актуальность

Одним из направлений повышения эффективности терапии злокачественных новообразований является поиск путей преодоления побочных эффектов, связанных с отсутствием строгой избирательности действия противоопухолевых препаратов. Использование этих препаратов в высоких дозах не только позволяет остановить прогрессию опухоли, но и вызывает значительную регрессию новообразования, а также предотвращает возможность развития рецидивов заболевания. Однако цитотоксичность, которая обуславливает противоопухолевое действие подавляющего большинства химиотерапевтических средств, применяемых в онкологии, одновременно является и основным ограничением их применения. Терапия мощными цитостатиками не может проходить бесследно для нормальных клеток организма. Наиболее серьезные осложнения связаны с гибелью стволовых гемопоэтических клеток костного мозга, приводящей к нарушению естественных процессов обновления крови, анемии, прогрессирующей потере иммунитета.

Эффективным подходом к преодолению данного естественного ограничения терапии цитотоксическими агентами является трансплантация аллогенных или аутологичных клеток периферической крови или костного мозга. При этом, однако, проведению аутологичной трансплантации, вследствие высокой вероятности наличия в костном мозге и кровотоке опухолевых клеток, сопутствует риск рецидивов основного заболевания. Пересадка аллогенных гемопоэтических клеток может сопровождаться развитием реакции «трансплантат-против-хозяина» (РТПХ).

Одно из возможных решений перечисленных проблем заключается в предварительной сепарация трансплантатов, целью которой может являться удаление нежелательных клеток (опухолевых, аллореактивных) или выделение из исходно гетерогенного материала определенных типов клеток.

Среди многочисленных методов направленного разделения клеток наиболее эффективным является иммуномагнитная сепарация (ИМС). Этот подход основан на одновременном использовании строгой избирательности взаимодействия моноклональных антител с антигенными детерминантами клеток-мишеней и магнитоуправляемости корпускулярных носителей -магнитных микросфер.

От других способов селекции биологического материала технологию ИМС выгодно отличает уникальное сочетание специфичности и чувствительности с высокой скоростью разделения исходных клеток. Эти качества обеспечивают преимущественное использование именно иммуномагнитной сепарации для предтрансплантационной обработки гемопоэтических клеток.

Данные научных исследований и результаты клинических испытаний, проведенных за рубежом, свидетельствуют об эффективности использования позитивной иммуномагнитной селекции при изоляции стволовых кроветворных клеток для дальнейшего культивирования и манипуляций in vitro и, что особенно важно, для дальнейшей трансплантации онкологическим больным. Магнитоуправляемые сорбенты широко используются для полной или частичной деплеции Т-лимфоцитов из костного мозга и периферической крови доноров, а также для удаления опухолевых клеток из аутологичных трансплантатов. Вместе с тем, на сегодняшний день нет единого мнения относительно характеристик сорбента, сепарирующих устройств и условий осуществления селекции. Хотя преимущества метода ИМС делают его использование наиболее предпочтительным, прочное внедрение метода в научно-исследовательскую и клиническую практику все еще требует решения ряда вопросов. Дальнейшее развитие и широкое использование этого перспективного подхода в нашей стране ограничивается высокой стоимостью расходных материалов и сепарирующих устройств зарубежных фирм-производителей. Таким образом, создание на основе отечественных материалов и оборудования системы иммуномагнитной сепарации и внедрение ее в практику являются очень актуальными задачами.

Цель исследования

Целью данного исследования явилось создание системы иммуномагнитной сепарации, обеспечивающей возможность эффективного разделения гемопоэтических клеток человека.

Задачи исследования

1. Разработать комплекс аналитических методов исследования и стандартизации магнитных микроносителей и иммуномагнитных сорбентов.

2. Получить опытную партию магнетитовых полистироловых микросфер (МПМ) и охарактеризовать их физико-химические свойства.

3. Выявить оптимальную технологию создания иммуномагнитных сорбентов на основе синтезированных микроносителей и моноклональных антител.

4. Создать панель иммуноспецифических магнитоуправляемых конъюгатов для направленного разделения гемопоэтических клеток человека.

5. Оценить эффективность селекции гемопоэтических клеток человека с использованием полученных конъюгатов.

Научная новизна

1. Получены экспериментальные подтверждения соответствия магнитных свойств синтезированных магнетитовых полистироловых микросфер всем требованиям, предъявляемым к магнитоуправляемым микроносителям для создания биомагнитных сорбентов.

2. Выявлены оптимальные условия иммобилизации векторных молекул на поверхности магнитных микросфер. Продемонстрирована возможность получения иммуномагнитных конъюгатов путем пассивной адсорбции и с помощью ковалентного связывания моноклональных антител с магнитным носителем.

3. Показано, что наиболее оптимальным подходом к созданию иммуномагнитных конъюгатов является ковалентное присоединение моноклональных антител к поверхностным гидроксильным группам, активированным избытком р-толуолсульфонилхлорида.

4. Получены иммуномагнитные сорбенты на основе магнитных микроносителей и моноклональных антител против мембранных антигенов лимфоцитов человека CD3, CD4, CD8, CD20 и CD34. Экспериментально показано, что использование созданных конъюгатов обеспечивает высокую эффективность иммуномагнитного разделения гемопоэтических клеток человека.

5. Разработан комплекс физико-химических методов, адаптированных в соответствии с особенностями используемого материала, который позволяет осуществлять качественный и количественный контроль за свойствами иммуномагнитных конъюгатов на каждом этапе получения.

Научно-практическая значимость

Предполагаемое клиническое применение полученных сорбентов, в первую очередь, связано с сепарацией клеток костного мозга, предназначенного для трансплантации онкологическим больным.

Экспериментально показанная эффективность сепарации CD34+-клеток с помощью МПМ-1СО-115 открывает перспективу дальнейшего применения этого конъюгата для получения чистых популяций стволовых кроветворных клеток методом позитивной селекции. Негативная иммуномагнитная селекция с использованием ИМС на основе МКА ICO-90, ICO-31, ICO-86 и 1СЮ-180 может быть использована для элиминации опухолевых клеток из костного мозга больных Т- и В-клеточными лимфомами перед аутологичной трансплантацией. Иммуномагнитное истощение Т-клеточной популяции донорского костного мозга может стать способом предотвращения развития реакции "трансплантат-против-хозяина". Созданные сорбенты могут использоваться и при получении дендритных клеток для создания противоопухолевых вакцин.

Предлагаемый комплекс аналитических методов, модифицированных с учетом специфики исследуемого материала, и определенные оптимальные физико-химические критерии могут стать основой для стандартизации биомагнитных сорбентов.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Голенкина, Екатерина Александровна

ВЫВОДЫ:

1. Разработана технология синтеза магнитных микросфер диаметром от 0,2 до 1,5 мкм. Получены опытные партии гомогенных по размерам микросфер с высоким намагничением насыщения (30 кА/м) и незначительным остаточным магнетизмом (1,5 кА/м).

2. Выявлены частичная гидрофобность поверхности и наличие связанных гидроксильных групп для МПМ на основе стирола, дивинилбензола и магнетита. Это делает возможным иммобилизацию моноклональных антител как путем пассивной адсорбции, так и с помощью ковалентного связывания.

3. Величина сорбционной емкости и стабильность иммуномагнитных конъюгатов зависят от механизма иммобилизации МКА на поверхности магнитного носителя. Наиболее эффективным способом получения иммуномагнитных сорбентов является ковалентное связывание МКА с поверхностными ОН-группами, активированными избытком р-Ts-Cl.

4. Определены оптимальные условия ковалентного связывания МКА с магнитным носителем: инкубация в течение 48 ч в фосфатно-солевом буферном растворе (рН 7,4) при 4 °С с постоянным перемешиванием.

5. Создана панель иммуномагнитных сорбентов для направленного разделения гемопоэтических клеток человека по мембранным антигенам CD3, CD4, CD8, CD20 и CD34 (ИМК-1СО-90, ИМК-1СО-86, ИМК-1СО-31, ИМК-ICO-180 и ИМК-1СО-115).

6. Эффективность негативной селекции гетерогенных клеточных популяций составляет 95 - 98 % при использовании иммуномагнитных конъюгатов на основе МКА ICO-86, ICO-31, КЮ-180 и ICO-115, и 72 % для ИМК-1СО-90. Для удаления антиген-позитивных клеток температура инкубации клеток с сорбентом составляет 13 °С при селекции по мембранным антигенам CD4 и CD8, 4 °С при деплеции СЭЗ+-клеток.

Высокое качество разделения по антигенам CD20 и CD34 показано для всех экспериментальных температурных режимов (4 °С, 13 °С и 22 °С).

7. Экспериментально показано, что применение модифицированного метода ИМС с использованием конъюгата магнитных микросфер с антивидовыми антителами позволяет увеличить эффективность деплеции Т-лимфоцитов до 87 %.

8. Разработан комплекс аналитических методов и выявлены оптимальные фихико-химические характеристики магнитных микроносителей и иммуномагнитных конъюгатов. Эти характеристики могут быть использованы при создании фармстатьи на иммуномагнитные сорбенты для клинического применения.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Голенкина, Екатерина Александровна, 2003 год

1. Барышников А.Ю., Тоневицкий А.Г. / Моноклональные антитела в лаборатории и клинике. // М. 1997.

2. Воюцкий С.С. / Курс коллоидной химии. // М.: «Химия». 1975. - 412 -414.

3. Заботина Т.Н. / Получение и характеристика моноклональных антител против субпопуляций Т-лимфоцитов человека. // Дисс. канд. биол. наук. М. - 1993.

4. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот Э., Джонс К. / Справочник биохимика. // М.: «Мир». 1991. - С. 464 - 465.

5. Иммунологические методы. / Под ред. Г. Фримеля, Пер. с нем. А.П. Тарасова. М.: «Медицина». - 1987. - С. 73 - 88.

6. Иоффе Б.В., Костиков P.P., Разин В.В. / Физические методы определения строения органических соединений. // М.: «Высшая школа». 1984. - С. 8-21.

7. Матрица иммуносорбента. / Патент РФ № 2140084. Приоритет от 12.01.98г.

8. Мошечков Н.Г., Махлин Р.С., Барышников А.Ю., Блохин Д.Ю., Голенкна Е.А., Иванов П.К., Филиппов В.И., Ершов О.Л. / Создание магнитного сепаратора МСК-1 и иммуномагнитного сорбента для лечения онкологических и других заболеваний. //

9. Розенцвейг Р. / Феррогидродинамика. М.: «Мир». - 1989. - С. 17-19.

10. Anderson G., Jenkinson E.J., Moor N.C., Owen J.J.T. / MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus. // Nature. 1993. - Vol. 362. - P. 70 - 73.

11. Anderson G., Owen J.J.T., Moor N.C., Jenkinson E.J. / Characteristics of an in vitro system of thymocyte positive selection. // J. Immunol. 1994. - Vol. 153.-P. 1915- 1920.

12. Bale M.D., Danielson S.J., Daiss J.L., Goppert K.E., Sutton R.C. I Influence of copolymer composition on protein adsorption and structural rearrangement at the polymer surface. // Journal of Colloid and interface science. 1989. -Vol. 132.-P. 176- 187.

13. Bangs Laboratories, Inc. / TechNote 201 "Working with microspheres." -2002.

14. Bangs Laboratories, Inc. / TechNote 204 "Adsorbtion to microspheres." -2002. кислотность буфера при пассивной адсорбции

15. Bangs Laboratories, Inc. / TechNote 205 "Covalent coupling." 2002.

16. Beatty P.G., Kollman C., Howe C.W. / Unrelated-donor marrow transplants: the experience of the National Marrow Donor Program. // Clin. Transpl. -1995.-P. 271 -277.

17. Bojum A. / Separation of lymphocytes by centrifugation // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1968. - № 21. - Suppl. 97. - P. 77 - 81.

18. Cantarero L.A., Butler J.E., Osborne J.W. / The adsorptive characteristics of proteins for polystyrene and their significance in solid-phase immunoassays. // Analytical Biochemistry. 1980. - Vol. 105. - P. 375 - 382.

19. Clivin C.I., Strauss L.C., Fackler M.J., Trischmann T.M., Willey J.M., Loken M.R. / Positive stem cell selection basic science. // Prog. Clin. Biol. Res. -1990. - Vol. 333. - P. 387 - 401.

20. Conrad-Lapostolle V., Bordenave L., Baquey C. / Optimization of use of UEA-1 magnetic beads for endothelial cell isolation. // Cell Biol. Toxicol. -1996.-Vol. 12.-№4.-P. 189-197.

21. Douglas A.S., Monteith C.A. / Improvements to immunoassays by use of covalent binding assay plates. // Clin. Chem. 1994. - Vol. 40. - № 9. - P. 1833- 1837.

22. Forus A., Hoifodt H.K., Overli G.E., Myklebost O., Fodstad O. / Sensitive fluorescent in situ hybridisation method for the characterisation of breast cancer cells in bone marrow aspirates. // Mol. Pathol. 1999. - Vol. 52. - № 2.-P. 68-74.

23. Gibbs J., Brown C., Root D., Lawton L. / ELISA optimization. // Workshop Notes from AACC Northern California Regional Meeting, Napa, Sep. 1991.

24. Gomez D.E., Hartzler J.L., Corbitt R.H., Nason A.M., Thorgeirsson U.P. / Immunomagnetic separation as a final purification step of liver endothelial cells. // In Vitro Cell Dev. Biol. Anim. 1993. - Vol. 29. - № 6. - P. 451 -455.

25. Guesdon J.L., Avrameas S. / Magnetic solid-phase enzyme immunoassay. // Immunochemistry. 1977. - Vol. 14. - P. 443.

26. Guesdon J.L., Avrameas S. / Magnetic solid-phase enzyme immunoassay for the quantitation of antigens and antibodies: application to human immunoglobulin E. // Methods Enzymol. 1981. - Vol. 73. - P. 471 - 482.

27. Horton J.K., Evans O.M., Swarm K., Swinburn S. / A new and rapid method for the selection and cloning of antigen-specific hybridomas with magnetic microspheres. // J. Immunol. Meth. 1989. - Vol. 124. - P. 225 - 230.

28. Irsch J., Hunzelmann N., Tesch H., Merk H., Maggi E., Rufflli A., Radbruch A. / Isolation and characterization of allergen-binding cells from normal and allergic donors. // Immunotech. 1995. - Vol. 1. - № 2. - P. 115 - 125.

29. Karlsson S., Correll P.H., Xu L. / Gene transfer and bone marrow transplantation with special reference to Gaucher's disease. // Bone Marrow Transplant. 1993. - Vol. 11.- Suppl. 1. - P. 124 - 127.

30. Kawaguchi H., Sakamoto K., Ohtsuka Y., Ohtake Т., Sekiguchi H., Iri H. / Fundamental study on latex reagents for agglutination tests. // Biomaterials. -1989. Vol. 10. - P. 225 - 229.

31. Kemshead J.T., Treleaven J.G., Gibson F.M., Ugelstad J., Rembaum A., Philip T. / Monoclonal antibodies and magnetic microspheres used for the depletion of malignant cells from bone marrow. // Prog. Clin. Biol. Res. -1985. Vol. 175. - P. 413 - 423.

32. Kernan N.A., Bartsch G., Ash R.C., Beatty P.G., Champlin R., Filipovich A., Gajewski J., Hansen J.A., Henslee-Downey J., McCullough J., McGlave P.,

33. Perkins H.A., Phillips G.L., Sanders J., Stroncek D., Thomas E.D., Blume K.G., / Analysis of 462 transplantations from unrelated donors facilitated by the National Marrow Donor Program. // N. Engl. J. Med. 1993. - Vol. 328. -P. 593-602.

34. Khosravi M. / Application of the biotin-(strept)avidin system in immunochemical techniques. // Clinical ligand assay society annual meeting. -1995.

35. Lea Т., Smeland E., Funderud S., Vartdal F., Davies C., Beiske K, Ugelstag J. / Characterization of human mononuclear cells after positive selection with immunomagnetic particles. // Scand. J. Immunol. 1986. - Vol. 23. — № 4. -P. 509-519.

36. Leivestag Т., Gaudernack G., Ugelstag J., Thorsby E. / Positive selection of activated T cells of the T8 (CD8) subtype by immunomagnetic separation. // Tissue Antigenes. 1986. - Vol. 28. - № 1. - P. 46 - 52.

37. Marsh J.C., Sutherland D.R., Davidson J., Mellors A., Keating A. / Retention of progenitor cell function in CD34+ cells purified using a novel O-sialoglycoprotease. // Leukemia. 1992. - Vol. 6. - № 9. - P. 926 - 934.

38. McNiece I., Briddell R., Stoney G., Kern В., Zilm K., Recktenwald D., Miltenyi S. / Large-scale isolation of CD34+ cells using the Amgen cell selection device results in high levels of purity and recovery. // J. Hematother. 1997.-Vol. 6.-№ l.-P. 5- 11.

39. Mellors A., Sutherland D.R. / Tools to cleave glycoproteins. // Trends Biotechnol.-1994.-Vol. 12.-№ l.-P. 15 18.

40. Miltenyi S., Muller W., Weichel W., Radbruch A. / High gradient magnetic cell separation with MACS. // Cytometry. 1990. - Vol. 11. - № 2. - P. 231 -238.

41. Molday R.S., MacKenzie D. / Immunospecific ferromagnetic iron-dextran reagents for the labeling and magnetic separation of cells. // J. Immunol. Meth. 1982 - Vol. 52. - № 3. - P. 353 - 367.

42. Molday R.S., Molday L.L. / Separation of cells labeled with immunospheric iron dextran microspheres using high gradient magnetic chromatography. // FEBS Lett. 1984 -Vol. 170. - № 2. - P. 323 - 328.

43. Mori M., Graves M., Milford E.L., Beatty P.G. / Computer program to predict likelihood of finding and HLA-matched donor: methodology, validation, and application. // Biol. Blood Marrow Transplant. 1996. - Vol. 2. - № 3. - P. 134- 144.

44. Olsvik O., Popovic Т., Skjerve E., Cudjoe K.S., Homes E., Ugelstad J., Uhlen M. / Magnetic separation techniques in diagnostic microbiology. // Clin. Microbiol. Rev. 1994. - Vol. 7. - P. 43 - 54.

45. Ossendorp F.A., Bruning P.F., Van den Brink J.A., De Boer M. / Efficient selection of high-affinity B-cell hybridomas using antigen-coated magnetic beads. // J. Immunol. Meth. 1989. - Vol. 120. - № 2. - P. 191 - 200.

46. Owen C.S., Moor E. / High gradient magnetic separation of rosette-forming cells. // Cell Biophys. 1981. - Vol. 3. - № 2. - P 141 - 153.

47. Partington K.M., Jenkinson E.J., Anderson G. / A novel method of cell separation based on dual parameter immunomagnetic cell selection. // J. Immunol. Meth. 1999. - Vol. 223. - № 2. - P. 195 - 205.

48. Paulke B.R., Buske N., Wimoto-Mosbach S. / Synthesis studies on paramagnetic polystyrene latex particles. // Scientific and Clinical Applications of Magnetic Carries. Plenum Press. New York. -1997. P. 69 -78.

49. Paulus U., Dreger P., Viehmann K., Neunoff N., Schmitz N. / Purging peripheral blood progenitor cell grafts from lymphoma cells: quantitative comparison of immunomagnetic CD34+ selection systems. // Stem Cells. -1997.-Vol. 15.-P. 297-304.

50. Pickl W.F., Majdic O., Kohl P., Stockl J., Riedl E. / Molecular and functional characteristics of dendritic cells generated from highly purified CD 14+ peripheral blood monocytes. // J. Immunol. 1996. - Vol. 157. - P. 3850 -3859.

51. Porter J., Robinson J., Pickup R., Edwards C. / An evaluation of lectin-mediated magnetic bead cell sorting for the targeted separation of enteric bacteria. // J. Appl. Microbiol. 1998. - Vol. 84. - № 5. - P. 722 - 732.

52. Reynolds C.P., Black A.T., Woody J.N. / Sensitive method for detecting viable cells seeded into bone marrow. // Cancer Research. 1986. - Vol. 46. -№ 11.-P. 5878-5881.

53. Scheding S., Kratz-Albers K., Meister В., Brugger W., Kanz L. / Ex vivo expansion of hematopoietic progenitor cells for clinical use. // Semin. Hematol. 1998. - Vol. 35. - № 3. - P. 232 - 240.

54. Scheffold A., Miltenyi S., Radbruch A. / Magnetofluorescent liposomes for increased sensitivity of immunofluorescence. // Immunotech. 1995. - Vol. 1. - № 2 — P. 127- 137.

55. Sedgwick J.B., Shikama Y., Nagata M., Brener K., BusseW.W. / Effect of isolation protocol on eosinophil function: Percoll gradients versus immunomagnetic beads. // J. Immunol. Methods. 1996. - Vol. 198. - № 1. -P. 15-24.

56. Seeger R.C., Reynolds C.P., Vo D.D., Ugelstad J., Wells J. / Depletion of neuroblastoma cells from bone marrow with monoclonal antibodies and magnetic immunobeads. // Prog. Clin. Biol. Res. -1985. Vol. 175. - P. 443 -458.

57. Silvestri F., Banavali S., Savignato C., Preisler H.D., Baccarani M. / CD34+ cell selection: focus on immunomagnetic beads and chymopapain. // Int. J. Artif. Organs. 1993. - Vol. 16. - P. 96 - 101.

58. Silvestri F., Banavali S., Yin M., Gopal V., Savignato C., Baccarani M., Preisler H.D. / CD34-positive cell selection by immunomagnetic beads and chymopapain. // Haematologica. 1992. - Vol. 77. - № 4. - P. 307 -310.

59. Stroncek D., Bartsch G., Perkins H.A., Randall B.L., Hansen J.A., McCullough J. / The National Marrow Donor Program. // Transfusion. -1993. Vol. 33. - № 7. - P. 567 -577.

60. Switala-Zeliazkov M. / Radical copolymerization of maleic acid with styrene. // European Polymer Journal. 1999. - Vol. 35. - P. 83 - 88.

61. Tabbara I.A., Zimmerman K., Morgan C., Nahleh Z. / Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Complications and results. // Arch. Intern. Med. 2002 - Vol. 162. - P. 1558 - 1566.

62. Timmerman J.M., Levy R. / Dendritic cell vaccines for cancer immunotherapy. // Annu. Rev. Med. 1999. - Vol. 50. - P. 507 - 529.

63. Treleaven J.G., Gibson F.M., Ugelstad J., Rembaum A., Philip Т., Caine G.D., Kemshead J.T. / Removal of neuroblastoma cells from bone marrow with monoclonal antibodies conjugated to magnetic microspheres. // Lancet. -1984.-Vol. l.-P. 70-73.

64. Tsang S., Hayashi M., Zheng X., Campbell A., Schellenberg R.R. / Simplified purification of human basophils. // J. Immunol. Meth. 2000. - Vol. 233. - № 1-2.-P. 13-20.

65. Ugelstag J., Soderberg L., Berge A., Bergstrom J. / Monodisperse polymer particles a step forward for chromatography. // Nature. - 1983. - Vol. 303. -P. 95-96.

66. Vescio R., Berenson J. / Autologous transplantation. Purging and the impact of minimal residual disease. // Hematol. Oncol. Clin. North. Am. 1999. -Vol. 13.-№5.-P. 969-986.

67. Vogel W., Scheding S., Kanz L., Brugger W. / Clinical application of CD34+ peripheral blood progenitor cells. // Stem Cells. 2000. - Vol. 18. - P. 87 -92.

68. Ward M., Richardson C., Pioli P., Smith L., Podda S., Goff S., Hesdorffer C., Bank A. / Transfer and expression of the human multiple drug resistance gene in human CD34+ cells. // Blood. 1994. - Vol 84. - P. 1408 - 1414,

69. Wright A.P., Fitzgerald J.J., Colello R.J. / Rapid purification of glial cells using immunomagnetic separation. // J. Neurosci. Methods. 1997. - Vol. 74. -№ 1. - P. 37-44.

70. Wright D.J., Chapman P.A., Siddons C.A. / Immunomagnetic separation as a sensitive method for isolation Escherichia coli 0157 from food samples. // Epidemiol. Infect. 1994. - Vol. 113. - № l. - p. 31 - 39.