Действие дефензина α-1 человека на трипомастиготы и амастиготы Trypanosoma cruzi in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Клещенко, Юлия Евгеньевна

• Клещенко, Юлия Евгеньевна
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Клещенко, Юлия Евгеньевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Морфология и жизненный цикл Trypanosoma cruzi.

1.2. Т. cruzi и болезнь Шагаса.

1.3. Защитные реакции человека на инфицирование Т. cruzi и противодействие возбудителя иммунному ответу.

1.4. Дефензины млекопитающих как один из факторов врожденного иммунитета.

1.5. Активность а-дефензинов против микроорганизмов (антибактериальная, антивирусная, антипротозойная).

1.6. Структура и механизмы действия а - дефензинов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Штаммы Т. cruzi, линии перевиваемых и культивируемых клеток млекопитающих, сыворотки.

2.2. Пептиды.

2.3. Изучение действия дефензина а-1 человека на жизнеспособность

Т. cruzi in vitro.

2.4. Деполяризация цитоплазматических мембран Т. cruzi для изучения взаимодействия с ними дефензина а-1.

2.5. Электронная микроскопия.

2.6. Анализ фрагментации ДНК Т. cruzi, вызванной действием дефензина а-1.

2.7. Анализ деполяризации плазматических мембран Т. cruzi, вызванной действием дефензина а-1.

2.8. Анализ инвазивности Т. cruzi для клеток HeLa.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность.

Т. cruzi in vitro

3.1.1. Действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность

Т. cruzi in vitro в культуральной среде.

3.1.2. Действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность

Т. cruzi in vitro в крови мыши.

3.2. Действие дефензина а-1 на ультраструктуру Т. cruzi.

3.2.1. Ультраструктурные изменения мембран трппомастигот Т. cruzi под действием дефензина а-1.

3.2.2. Формирование мембранных нор под действием дефензина ау триномастигот Т. cruzi.

3.2.3. Изменения внутриклеточных ультраструктур трипомастигот

Т. cruzi под действием дефензина а-1.

3.2.4. Распределение дефензина а-1 в клетках трипомастигот

Т. cruzi.

3.3. Фрагментация ДНК трипомастигот Т. cruzi, вызванная действием дефензина а-1.

3.4. Действие дефензина а-1 на инвазивную активность трипомастигот Т. cruzi для клеток HeLa.

3.5. Деполяризация плазматических мембран трипомастигот

Т. cruzi под действием дефензина а-1.

3.6. Обсуждение результатов исследований.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Действие дефензина α-1 человека на трипомастиготы и амастиготы Trypanosoma cruzi in vitro»

Актуальность проблемы

Trypanosoma cruzi — паразитический жгутиковый одноклеточный организм рода Trypanosoma, семейства Trypanosomatidae, отряда Kinetoplastida, класса Zooflagellata, типа Sarcomastigophora. Т. cruzi является возбудителем американского трипаносомоза (болезнь Шагаса), распространенного преимущественно в Южной и Центральной Америке, где в некоторых очагах может поражать до 70-90% населения. Заражение человека происходит в основном трансмиссивно с участием клопов семейства Rediiviidae (70 видов), но возможно также при гемотрансфузии, трансплацентарно или с молоком матери (Nickerson Р., et al., 1989). В последнем случае эта проблема актуальна для США, поскольку большое количество иммигрантов из Латинской Америки проживают в США и могут стать источником инфекции (Kirchhoff L.V., 1989). Американский Красный Крест недавно начал проверять банки крови на присутствие Trypanosoma cruzi (McCarthy М., 2003; Tobler L.H., et al., 2007). На сегодня описано несколько клинически выраженных случаев болезни Шагаса местного происхождения в Техасе и Калифорнии. В природе резервуарами Т. cruzi выступают до 200 видов диких и домашних млекопитающих, поддерживающих естественные, в том числе и синантропные очаги инфекции.

Местом паразитирования и размножения Т. cruzi в организме позвоночного хозяина служат клетки мононуклеарных фагоцитов, мигрирующие в ткани различных органов. Наиболее часто и тяжело поражаются сердце, гладкая и скелетная мускулатура, а также нервная система и другие органы.

Внутриклеточное размножение Т. cruzi обеспечивает паразиту неуязвимость для циркулирующих в крови факторов защиты хозяина. Применяемые при болезни Шагаса в настоящее время лекарственные препараты - бензнидазол и нифуртимокс, эффективны лишь в острой фазе заболевания и не могут быть использованы при хронической его форме, обладая высокой токсичностью и приводя к ряду побочных эффектов. Названные терапевтические средства далеки от совершенства, чем и объясняется необходимость поиска новых подходов к созданию средств борьбы с данной протозойной инфекцией.

Одним из перспективных направлений исследований в этой области является изучение иммунитета и путей стимулирования иммунного ответа организма хозяина при болезни Шагаса. Особую группу эффекторных молекул системы врожденного иммунитета представляют дефензины — пептиды, которые характеризуются широким спектром антимикробной и антивирусной активности (Madison M.N., Kleshchenko Y.Y. et al., 2007). До настоящего времени действие дефензинов на Т. cruzi не изучалось.

Цель исследования

Целью настоящего диссертационного исследования является изучение действия дефензина а-1 человека на Т. cruzi in vitro.

Задачи исследования

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

1. Изучить действие дефензина а-1 человека на жизнеспособность трипомастигот и амастигот Т. cruzi при вариациях дозы и времени инкубации двухкомпонентных систем в опытах in vitro.

2. Изучить инвазивную активность трипомастигот, предварительно подвергнутых действию дефензина а-1 в опытах ш vitro.

3. Установить ультраструктурные изменения, возникающие у Т. cruzi под действием дефензина а-1 человека.

Научная новизна работы

Впервые показано, что дефензин а-1 человека обладает трипаноцидной активностью по отношению к Т. cruzi в опытах in vitro. Определены концентрационные и временные характеристики действия препарата.

Описаны поэтапные изменения клеточных структур, приводящие к гибели паразита. Охарактеризован механизм взаимодействия дефензина а-1 и клеточной мембраны трипаносом с образованием пор и последующей перестройкой всех внутриклеточных мембран, сопровождающейся разрушением клеточных органелл, а также фрагментацией ДНК паразита.

Практическая значимость работы

Дефензины представляют собой биополимеры животного происхождения. В результате исследований установлена токсичность дефензина а-1 против Т. спт, а также охарактеризован механизм токсичного действия. Получены оригинальные данные, раскрывающие физиологические механизмы резистентности макроорганизма к инфекции Т. сгигг. Факт микробицидного действия дефензина а-1 открывает возможности для поиска более эффективных терапевтических агентов при лечении болезни Шагаса.

Существует также проблема безопасности банков донорской крови, в которой могут оказаться патогенные трипомастиготы Т. сгт1. Использование дефензина а-1 в пределах физиологических концентраций может позволить элиминировать Т. спш и устранить риск заражения этими паразитами при переливании донорской крови.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Дефензин а-1 человека обладает трипаноцидной активностью против трипомастиготных и амастиготных форм Т. спш. Степень микробицидного действия природного биополимера предопределена дозой и временем инкубации компонентов в двухмодульной системе.

2. Установлен молекулярный механизм трипаноцидного эффекта. Электронно-микроскопические исследования показали характерную морфологию трипомастигот при воздействии дефензина а-1 человека, а также позволили определить встраивание последнего в клеточную мембрану паразитического простейшего и образование мембранных пор. Ультраструктурные изменения и фрагментация ДНК, вызванные действием дефензина а-1 человека, имеют общие черты с клеточным апоптозом.

Апробация работы

Диссертация выполнена в соответствии с научным направлением базовой кафедры микробиологии и вирусологии медицинского факультета Российского университета дружбы народов и кафедры микробиологии и иммунологии Медицинского колледжа имени Мехарри (г. Нэшвилл, Теннесси, США). Результаты исследований и основные положения диссертации доложены и обсуждены на конференции кафедры микробиологии и вирусологии РУДН (20 ноября 2009 г.), на международной конференции «55th Annual Meeting of the American Society of Tropical Medicine and Hygiene» (Atlanta, GA, 12-16 ноября 2006 г.), на минисимпозиуме «Minisymposium Regulation of Mucosal Inflammatory Responses. Annual Meeting of the American Society of Investigative Pathologists, Experimental Biology» (Washington, DC, с 28 апреля по 2 мая 2007 г.), на научной конференции «94th Annual Meeting of the American Association of Immunologists» (Miami Beach, Florida, 18-22 мая, 2007 г.), на международной конференции «56th Annual Meeting of the American Society of Tropical Medicine and Hygiene» (Philadelphia, Pennsylvania, 4-8 ноября 2007 г.), и на минисимпозиуме «Minisymposium Regulation of Mucosal Inflammatory Responses. Annual Meeting of the American Society of Investigative Pathologists, Experimental Biology» (San Diego, California, 5-9 апреля 2008 г.)

Публикации

По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, 1 из них - в издании, входящем в рекомендованный ВАК список.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, экспериментальной части с обсуждением результатов, заключения, выводов и списка литературы (183 источника). Работа изложена на 97 страницах, содержит 16 рисунков и 0 таблиц. Список литературы содержит 183 работы: 4 российских, 179 зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Клещенко, Юлия Евгеньевна

выводы

1. Дефензин а-1 человека обладает трипаноцидными свойствами против трипомастиготных и амастиготных форм Т. cruzi in vitro.

2. Дефензин а-1 вызывает образование пор и нарушения в клеточных мембранах Т. cruzi.

3. Действие дефензина а-1 приводит к нарушениям внутриклеточных ультраструктур и гибели трипомастигот Т. cruzi.

4. Дефензин а-1 вызывает фрагментацию ДНК ядра и кинетопласта трипомастигот

Т. cruzi.

5. Дефензин а-1 ограничивает инвазивные свойства Т. cruzi.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе представлены исследования по действию дефензина а-1 человека на Т. cruzi in vitro. Показано, что трипаноцидный эффект пептида связан с образованием мембранных пор, нарушениями цитоплазматической мембраны и внутриклеточных органелл, а также фрагментацией геномной ДНК паразита. Таким образом, установлено, что дефензин а-1 человека является важным компонентом неспецифической защиты клеток хозяина от заражения Т. cruzi. Чувствительность кровяных трипомастиготных форм Т. cruzi к дефензину а-1 человека может послужить основой для новых подходов к поиску средств профилактики и лечения американского трипаносомоза и предполагает возможность использования его также для нейтрализации Т. cruzi в образцах готовой продукции, хранящихся в банках крови.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Клещенко, Юлия Евгеньевна, 2010 год

1. Каллиникова В.Д. 2004. Тула: Гриф и К. Противоопухолевые свойства жгутикового простейшего Trypanosoma cruzi. 280 с.

2. Каллиникова В. Д., Соколова Н.М. Противораковые свойства паразитического жгутикового простейшего Trypanosoma cruzi Chagas, 1909. //Вестн. Моск. Ун-та.- Сер. 16. Биология. - 1966 - № 2.- С.28-34.

3. Карпенко Л.П., Яшина Н.В. Методические указания к лабораторным занятиям по теме «Микробиологическая диагностика протозойных инфекций», 2004. //М., РУДН. 47 С.

4. Клюева Н.Г., Роскин Г.И. Биотерапия злокачественных опухолей. // М.: Изд-во Институтата вакцин и сывороток, 1957.-247 с.

5. Aarbiou J., Rabe K.F., and Hiemstra P.S. Role of defensins in inflammatory lung disease. // Ann. Med. 2002. - Vol. 34. - P. 96-101.

6. Abrahamsohn I.A., and Coffman R.L. Trypanosoma cruzi: IL-10, TNF, IFN-gamma, and IL-12 regulate innate and acquired immunity to infection. // Exp. Parasitol. 1996. - Vol. 84. - P. 231-244.

7. Aley S.B., Zimmerman M., Hetsko M., Selsted M.E., and Gillin F.D. Killing of Giardia lamblia by cryptdins and cationic neutrophil peptides. // Infect. Immun.1994. Vol. 62. - P. 5397-5403.

8. Ashitani J., Mukae H., Nakazato M., Ihi T., Mashimoto H., Kadota J., Kohno S., and Matsukura S. Elevated concentrations of defensins in bronchoalveolar lavage fluid in diffuse panbronchiolitis. // Eur. Respir. J. 1998. - Vol. 11. - P. 104-111.

9. Bastos K.R., Barboza R., Sardinha L., Russo M., Alvarez J.M., and Lima M.R. Role of endogenous IFN-gamma in macrophage programming induced by IL-12 and IL-18. // J. Interferon Cytokine Res. 2007. - Vol. 27. - P. 399-410.

10. Bergeron M., and Olivier M. Trypanosoma cruzi-mediated IFN-gamma-inducible nitric oxide output in macrophages is regulated by iNOS mRNA stability. // J. Immunol. 2006. - Vol. 177. - P. 6271-6280.

11. Bhatia V. and Nisha Jain Garg. Previously Unrecognized Vaccine Candidates Control Trypanosoma cruzi Infection and Immunopathlogy in Mice. // Clin. Vaccine Immunol.-2008.-Vol.15. 8.-P. 1158-1164.

12. Bogdan C., and Rôllinghoff M. How do protozoan parasites survive inside macrophages? // Parasitai. Today 1999. - Vol. 15. - P. 22-28.

13. Brogden K.A. Antimicrobial peptides: pore formers or metabolic inhibitors in bacteria? // Nat. Rev. Microbiol. 2005. - Vol. 3. - P. 238-250.

14. Bronner C., and Landry Y. The use of the potential-sensitive fluorescent probe bisoxonol in mast cells. // Biochim. Biophys. Acta. 1991. - Vol. 1070. - P. 321331.

15. Castro J.A., de Mecca M.M., and Bartel L.C. Toxic side effects of drugs used to treat Chagas' disease (American trypanosomiasis). // Hum. Exp. Toxicol. 2006. -Vol. 225.-P. 471-479.

16. Chang T.L. Vargas J.Jr., DelPortillo A., and Klotman M.E. Dual role of alpha-defensin-1 in anti-HIV-1 innate immunity. // J. Clin. Invest. 2005. - Vol. 115.-P. 765-773.

17. Chen K., Huang J., Gong W., Iribarren P., Dunlop N.M., and Wang J.M. Toll-like receptors in inflammation, infection and cancer. // Int. Immunopharmacol. 2007. -Vol. 7.-P. 1271-1285.

18. Coutinho C.M., Cavalcanti G.H., van Leuven F., and Araújo-Jorge T.C. Alpha-2-macroglobulin binds to the surface of Trypanosoma cruzi. // Parasitol Res. -1997.-Vol. 83.-P. 144-150.

19. Cunha-Neto E., Bilate A.M., Hyland K.V., Fonseca S.G., Kalil J., Engman D.M. Induction of cardiac autoimmunity in Chagas heart disease: a case for molecular mimicry. // Autoimmunity. 2006. - Vol. 39. - P. 41-54.

20. Daher K.A., Selsted M.E., Lehrer R.I. Direct inactivation of viruses by human granulocyte defensins. // J. Virol. 1986. - Vol. 60. - P. 1068-1074.// J. Virol. -1986. - Vol. 60. - P. 1068-1074.

21. De Miranda-Santos I.K., and Campos-Neto A. Receptor for immunoglobulin Fc on pathogenic but not on nonpathogenic protozoa of the Trypanosomatidae. // J. Exp. Med.-1981.-Vol. 154.-P. 1732-1742.

22. De Sousa M.A. Morphobiological characterization of Trypanosoma cruzi Chagas, 1909 and its distinction from other trypanosomes. // Mem. Inst. Oswaldo Cruz. -1999. Vol. 94. - Suppl. 1. - P. 205-210.

23. De Souza E.M., Menna-Barreto R., Araujo-Jorge T.C., Kumar A., Hu Q., Boykin D.W., and Soeiro M.N. Antiparasitic activity of aromatic diamidines is related to apoptosis-like death in Trypanosoma cruzi. II Parasitology. 2006. - Vol. 133. -P. 75-79.

24. De Souza W. A short review on the morphology of Trypanosoma cruzi: from 1909-1999. // Mem. Inst. Oswaldo. Cruz. 1999. - Vol. 94. - Suppl. 1. - P. 1736.

25. Debrabant A., Lee N., Bertholet S., Duncan R., and Nakhasi H.L. Programmed cell death in trypanosomatids and other unicellular organisms. // Int. J. Parasitol. -2003.-Vol. 33.-P. 257-267.

26. Deschesnes R.G., Huot J., Valerie K., and Landry J. Involvement of p38 in apoptosis-associated membrane blebbing and nuclear condensation. // Mol. Biol. Cell.-2001.-Vol. 12.-P. 1569-1582.

27. Duszenko M., Figarella K., Macleod E.T., and Welburn S.C. Death of a trypanosome: a selfish altruism. // Trends Parasitol. 2006. - Vol. 22. - P. 536542.

28. Eisenhauer P.B., Harwig S.S.L., and Lehrer R.I. Cryptdins: antimicrobial defensins of the murine small intestine. // Infect. Immun. 1992. - Vol. 60. - P. 3556-3565.

29. Freedman J.C., and Novak T.S. Optical measurement of membrane potencial in cells, organelles, and vesicles. // Metods Enzymol. — 1989. Vol. 172. - P. 102122.

30. Freire-de-Lima C.G., Nunes M.P., Corte-Real S., Soares M.P., Previato J.O., Mendonca-Previato LZ., and DosReis G.A. Proapoptotic activity of a

31. Trypanosoma cruzi ceramides-containing glycolipid turned on in host macrophages by IFN-gamma. // J. Immunol. 1998. - Vol. 161. - P. 4909-4916.

32. Ganz T. Extracellular release of antimicrobial defensins by human polymorphonuclear leukocytes. // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55. - P. 568-571.

33. Ganz T. Biosynthesis of defensins and other antimicrobial peptides. // Ciba Found. Symp.- 1994. Vol. 186.-P. 62-71.

34. Ganz T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. // Nat. Rev. Immunol. -2003. Vol. 3. - P. 710-720.

35. Ganz T., and Lehrer R.I. Defensins. // Curr. Opin. Immunol. 1994. - Vol. 6. - P. 584-589.

36. Ganz T., Selsted M.E., Szklarek D., Harwig S.S.L., Daher K., Bainton D.F., and Lehrer R.I. Defensins. Natural peptide antibiotics of human neutrophils. // J. Clin. Investig. -1985. Vol. 76. - P. 1427-1435.

37. Garg N., and Bhatia V. Current status and future prospects for a vaccine against American trypanosomiasis. // Exp. Rev. Vaccines 2005. - Vol. 4. - P. 867-880.

38. Ghosh D., Porter E., Shen B., Lee S.K., Wilk D., Drazba J., Yadav S.P., Crabb J.W., Ganz T., Bevins C.L. Paneth cell trypsin is the processing enzyme or human defensin-5. // Nat. Immunol. 2002. - Vol. 3. - P. 583-590.

39. Hashimoto M., Nakajima-Shimada J., Ishidoh K., and Aoki T. Gene expression profiles in response to Fas stimulation in Trypanosoma cruzi-infected host cells. // Int. J. Parasitol. 2005. - Vol. 35. - P. 1587-1594.

40. Hehl A.B., Regos A., Schraner E., and Schneider A. Bax function in the absence of mitochondria in the primitive protozoan Giardia lamblia. II PLoS ONE. 2007. -Vol. 2.-P. e488.

41. Heibein J.A., Barry M., Motyka B., and Bleackley R.C. Granzyme B-induced loss of mitochondrial inner membrane potential (Delta Psi m) and cytochrome c release are caspase independent. // J. Immunol. — 1999. Vol. 163. - P. 46834693.

42. Hill C.P., Yee J., Selsted M.E., Eisenberg D. Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimmer: mechanisms of membrane permeabilization. // Science. -1991.-Vol. 251.-P. 1481-1485.

43. Hoare C.A. The trypanosomes of mammals. A Zoological Monograph. // Blackwell Scientific Publications Oxford, U.K. 1972. P. 1-749.

44. Hoff R., Teixeira R.S., Carvalho J.S., and Mott K.E. Trypanosoma cruzi in the cerebrospinal fluid during the acute stage of Chagas' disease. // N. Engl. J. Med. -1978. Vol. 298. -P. 604-606.

45. Hörne R.W., Bangham A.D., and Whittaker V.P. Negatively stained lipoprotein membranes. // Nature. 1963. - Vol. 200. - P. 1340.

46. Huttner K.M., Bevins C.L. Antimicrobial peptides as mediators of epithelial host defense. // Pediatr. Res. 1999. - Vol. 45. - P. 785-794.

47. Ihi T., Nakazato M., Mukae H., and Matsukura S. Elevated concentrations of human neutrophil peptides in plasma, blood, and body fluids from patients with infections. // Clin. Infect. Dis. 1997. - Vol. 25. - P. 1134-1140.

48. Jacobs T., Bruhn H., Gaworski L., Fleischer B., and Leippe M. NK-lysin and its shortened analog NK-2 exhibit potent activities against Trypanosoma cruzi. II Antimicrob. Agents Chemother. 2003. - Vol. 47. - P. 607-613.

49. Kagan B.L., Selsted M.E., Ganz T., and Lehrer R.I. Antimicrobial defensin peptides form voltage-dependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - P. 210-214.

50. Kierszenbaum F. Chagas' disease and the autoimmunity hypothesis. // Clin. Microbiol. Rev. 1999. - Vol. 12. - P. 210-223.

51. Kierszenbaum F. Where do we stand on the autoimmunity hypothesis of Chagas disease?//Trends Parasitol.-2005. Vol. 21.-P. 513-516.

52. Kleshchenko Y.Y., Moody T.N., Furtak V.A., Ochieng J., Lima M.F., and Villalta F. Human galectin-3 promotes Trypanosoma cruzi adhesion to human coronary artery smooth muscle cells. // Infect. Immun. 2004. - Vol. 72. - P. 6717-6721.

53. Kirchhoff L.V. Is Trypanosoma cruzi a new threat to our blood supply? // Ann. Intern. Med. 1989. - Vol. 111. - P. 773-775.

54. Klotman M.E., and Chang T.L. Defensins in innate antiviral immunity. // Nat. Rev. Immunol. 2006. - Vol. 6. - P. 447-456.

55. Kumar S., and Tarleton R.L. The relative contribution of antibody production and CD8+ T cell function to immune control of Trypanosoma cruzi. II Parasite Immunol. 1998. - Vol. 20. - P. 207-216.

56. La Flamme A.C., Kahn S.J., Rudensky A.Y., and Van Voorhis W.C. Trypanosoma cruzi- infected macrophages are defective in major histocompatibility complex class II antigen presentation. // Eur. J. Immunol. -1997. Vol. 27. - P. 3085-3094.

57. Lam D., Levraud J.P., Luciani M.F., and Golstein P. Autophagic or necrotic cell death in the absence of caspase and bcl-2 family members. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2007. - Vol. 363. - P. 536-541.

58. Leguizamon M.S., Campetella O.E., González Cappa S.M., and Frasch A.C. Mice infected with Trypanosoma cruzi produce antibodies against the enzymatic domain of trans-sialidase that inhibit its activity. // Infect. Immun. 1994. - Vol. 62.-P. 3441-3446.

59. Lehrer R.I. Multispecific myeloid defensins. // Curr. Opin. Hematol. 2007. -Vol. 14.-P. 16-21.

60. Lehrer R.L, Barton A., Daher K.A., Harwig S.S., Ganz T., and Selsted M.E. Interaction of human defensins with Escherichia coli: Mechanism of bactericidal activity. // J. Clin Invest. 1989. - Vol. 84. - P. 553-561.

61. Lehrer R.I., and Ganz T. Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes. // Ciba Found Symp. 1992. - Vol. 171. - P. 276-290.

62. Lehrer R.I., Lichtenstein A.K., and Ganz T. Defensins: antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells. // Annu. Rev. Immunol. 1993. - Vol. 11. -P. 105-128.

63. Lieke T., Graefe S.E., Klauenberg U., Fleischer B., and Jacobs T. NK cells contribute to the control of Trypanosoma cruzi infection by killing free parasites by perforin-independent mechanisms. // Infec. Immune. 2004. - Vol. 72. - P. 6817-6825.

64. Lieke T., Steeg C., Graefe S.E., Fleischer B., and Jacobs T. Interaction of natural killer cells with Trypanosoma cruzi-infected fibroblasts. // Clin. Exp. Immunol. — 2006. Vol. 145. - P. 357-364.

65. Lima M.F., and Kierszenbaum F. Lactoferrin effects on phagocytic cell function. I. Increased uptake and killing of an intracellular parasite by murine macrophages and human monocytes.//J. Immunol. 1985.-Vol. 134.-P. 4176-4183.

66. Lima M.F., Beltz L.A., and Kierszenbaum F. Trypanosoma cruzi: a specific surface marker for the amastigote form. // J. Protozool. 1988. - Vol. 35. - P. 108-110.

67. Lima M.F., and Villalta F. Trypanosoma cruzi trypomastigote clones differentially express a cell adhesion molecule. // Mol. Biochem. Parasitol. -1989.-Vol. 33.-P. 159-170.

68. Madison M.N., Lima M.F., Kleshchenko Y.Y., Nde P.N., Simmons K.J., and

69. Villalta F. Mechanism of toxicity of human defensin a-1 against Trypanosomathcruzi. II Proceedings of the 13 International Congress of Immunology. 2007. -P. 447-451.

70. Mallow E.B., Harris A., Salzman N., Russell J.P., DeBerardinis R.J., Ruchelli E., Bevins C.L. Human enteric defensins. Gene structure and developmental expression. Hi. Biol. Chem. -1996. Vol. 271. - P. 4038-4045.

71. Mauel J. Intracellular survival of protozoan parasites with special reference to Leishmania spp., Toxoplasma gondii, and Trypanosoma cruzi. II Adv. Parasitol. -1996,-Vol. 38.-P. 1-51.

72. McCabe R., Meagher S., and Mullins B. Gamma interferon suppresses acute and chronic Trypanosoma cruzi infection in cyclosporine-treated mice. // 1991. Vol. 59.-P. 1633-1638.

73. McCabe R.E., Remington J.S., and Araujo F.G. Enhancement of resistance to Trypanosoma cruzi infection by recombinant interferon gamma. // In G. Byrne and J. Turco (ed). Interferon and nonviral pathogens. Marcel Dekker Inc., New York, 1988.-P. 203-216.

74. McCarthy M. American Red Cross to screen blood for Chagas' disease. // Lancet -2003.-Vol. 362.-P. 1988.

75. McGwire B.S., Olson C.L., Tack B.F., and Engman D.M. Killing of African trypanosomes by antimicrobial peptides. // J. infrct. Dis. 2003. - Vol. 188. - P. 146-152.

76. Ming M., Ewen M.E., and Pereira M.E. Trypanosome invasion of mammalian cells requires activation of TGF-beta signaling pathway. // Cell. 1995. - Vol. 82. - P. 287-296.

77. Nde P.N., Simmons K.J., Kleshchenko Y.Y., Pratap S., Lima M.F., and Villalta F. Silencing of the laminin gamma-1 gene blocks Trypanosoma cruzi infection. // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74. - P. 1643-1648.

78. Nicholls D.G. Simultaneous monitoring of ionophore- and inhibitor-mediated plasma and mitochondrial membrane potential changes in cultured neurons. // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281. - P. 14864-14874.

79. Nickerson P., Orr P., Schroeder M.L., Sekla L., and Johnston J.B. Transfusion-associated Trypanosoma cruzi infection in a non-endemic area. // Ann. Intern. Med.- 1989.-Vol. 111.-P. 851-853.

80. Norris K.A. Stable transfection of Trypanosoma cruzi epimastigotes with the trypomastigote-specific complement regulatory protein cDNA confers complement resistance. // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. - P. 2460-2465.

81. Nunes M.P., Andrade R.M., Lopes M.F., and Dos Reis G.A. Activation-induced T cell death exacerbates T. cruzi replication in macrophages cocultured with CD4+ T lymphocytes from infected hosts. // J. Immunol. 1998. - Vol. 160. - P. 13131319.

82. Panyutich A.V., Panyutich E.A., Krapivin V.A., Baturevich E.A., and Ganz T. Plasma defensin concentrations are elevated in patients with septicemia or bacterial meningitis. // J. Lab. Clin. Med. 1993. - Vol. 122. - P. 202-207.

83. Panyutich A.V., and Ganz T. Activated alpha 2-macroglobulin is a principal defensin-binding protein. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1991. - Vol. 5. - P. 101-106.

84. Panyutich A.V., Szold O., Poon P.H., Tseng Y., and Ganz T. Identification of defensin binding to CI complement. // FEBS Lett. 1994. -Vol. 356. - P. 169173.

85. Pardi A., Zhang X.L., Selsted M.E., Skalicky J.J., Yip P.F. NMR studies of defensin antimicrobial peptides. 2. Three dimensional structures of rabbit NP-2 and human HNP-1. // Biochem. 1992. - Vol. 31. - P. 11357-11364.

86. Pazgier M., Li X., Lu W., Lubkowski J. Human defensins: synthesis and structural properties. // Curr. Pharm. Des. 2007. - Vol. 13. - P. 3096-3118.

87. Petersen C.A., Krumholz K.A., Carmen J., Sinai A.P., and Burleigh B.A. Trypanosoma cruzi infection and nuclear factor kappa B activation prevent apoptosis in cardiac cells. // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74. - P. 1580-1587.

88. Piacenza L., Peluffo G., and Radi R. L-Arginine-dependent suppression of apoptosis in Trypanosoma cruzi: Contribution of the nitric oxide and polyamine pathways. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001. - Vol. 93. - P. 7301-7306.

89. Quayle A.J., Porter E., Nussbaum A.A., Wang Y.M., Brabec C., Yip K.P., and Mok S.C. Gene expression, immunolocalization, and secretion of human defensin-5 in human female reproductive tract. // Am. J. Pathol. 1998. - Vol. 152.-P. 1247-1258.

90. Ramos E., Olivos-García A., Nequiz M., Saavedra E., Tello E., Saralegui A., Montfort I., and Pérez Tamayo R. Entamoeba histolytica: apoptosis induced in vitro by nitric oxide species. // Exp. Parasitol. 2007. - Vol. 116. - P. 257-265.

91. Reed S.G. In vivo administration of recombinant IFN-gamma induces macrophages activation, and prevents acute disease, immune suppression, and death in experimental Trypanosoma cruzi infections. // J. Immunol. 1988. - Vol. 140.-P. 4342-4347.

92. Reed S.G., Grabstein K.H., Pihl D.L., and Morrissey P.J. Recombinant granulocyte-macrophage colony-stimulating factor restores deficient immune responses in mice with chronic Trypanosoma cruzi infections. // Immunol. -1990.-Vol. 145.-P. 1564-1570.

93. Rebeiro-Gomes F.L., Silva M.T., and Dosreis G.A. Neutrophils, apoptosis and phagocytic clearance: an innate sequence of cellular responces regulating intramacrophagic parasite infections. // Parasitology — 2006. Vol. 132. - P. 6168.

94. Rosemberg S., Chaves C.J., Higuchi M.L., Lopes M.B., Castro H.L., and MachadoL.R. Fatal meningoencephalitis caused by reactivation of Trypanosoma cruzi infection in a patient with AIDS. // Neurology 1992. - Vol. 42. - P. 640642.

95. Salzman N.H., Ghosh D., Huttner K.M., Paterson Y., Bevins C.L. Protection against enteric salmonellosis in transgenic mice expressing a human intestinal defensin. //Nature. 2003. - Vol. 422. - P. 522-526.

96. Samejima K., and Earnshaw W.C. Trashing the genome: the roles of nucleases during apoptosis. // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2005. - Vol. 6. - P. 677-688.

97. Schenkman S., and Mortara R. HeLa cells extend and internalize pseudopodia during active invasion by Trypanosoma cruzi trypomastigote. // J. Cell Sci. -1992,-Vol. 101.-P. 895-905.

98. Schroder J.M., and Harder J. Human beta-defensin-2. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1999. - Vol. 31. - P. 645-651.

99. Selsted M. E., and Ouellette A.J. Mammalian defensins in the antimicrobial immune response. //Nat. Immunol. 2005. - Vol. 6. - P. 551-557.

100. Selsted M.E., Miller S.I., Henschen A.H., and Ouellette A.J. Enteric defensins: antibiotic peptide components of intestinal host defense. // J. Cell Biol. 1992. -Vol. 118.-P. 929-936.

101. Selsted M.E., and Harwig S.S. Determination of the disulfide array in the human defensin HNP-2: a covalenty cyclized peptide. // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264.-P. 4003-4007.

102. Severa M., and Fitzgerald K.A. TLR-mediated activation of type I IFN during antiviral immune responses: fighting the battle to win the war. // Curr. Top. Microbiol. Immunol.-2007.-Vol. 316.-P. 167-192.

103. Simmons K.J., Nde P.N., Kleshchenko Y.Y., Lima M.F., and Villalta F. Stable RNA interference of host thrombospondin-1 blocks Trypanosoma cruzi infection. // FEBS Lett. 2006. - Vol. 580. - P. 2365-2370.

104. Skalicky J.J., Selsted M.E., and Pardi A. Structure and dynamics of the neutrophil defensins NP-2, NP-5, and HNP-1: NMR studies of amide hydrogen exchange kinetics. // Proteins. -1994. Vol. 20. - P. 52-67.

105. Souto-Padron T. The surface charge of trypanosomatids. // An. Acad. Bras. Cienc.- 2002. Vol. 74. - P. 649-675.

106. Stempin C., Giordanengo L., Gea S., and Cerban F. Alternative activation and increase of Trypanosoma cruzi survival in murine macrophages stimulated by cruzipain, a parasite antigen. // J. Leukoc. Biol. — 2002. Vol. 72. - P. 727-734.

107. Sugiama T., Kobayashi M., Kawamura H., Li Q., and Puro D.G. Enhancement of P2X(7)-induced pore formation and apoptosis: an early effect of diabetes on the retinal microvasculature. // Investig. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004. - Vol. 45. - P. 1026-1032.

108. Szyk A., Wu Z., Tucker K., Yang D., Lu W., and Lubkowski J. Crystal structures of human alpha-defensins HNP4, HD5, and HD6. // Protein Sci. 2006. - Vol. 15.- P. 2749-2760.

109. Tanaka S., Edberg C.J., Winn C., Fassina G., and Kimberley R. FcIIIb allele-sensitive release of a-defensins: anti-neutrophil cytoplasmic antibody-induced release of chemotaxins.//J. Immunol.-2003.-Vol. 171.-P. 6090-6096.

110. Tang Y.Q., Yuan J., Osapay G., Osapay K., Tran D., Miller C.J., Ouellette A.J., and Selsted M.E. A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated defensins. // Science 1999 - Vol. 286. - P. 498502.

111. Tanowitz H.B., Kirchhoff L.V., Simon D., Morris S.A., Weiss L.M, and Wittner M. Chagas' disease. // Clin. Microbiol. 1992. - Rev. 5. - P. 400-419.

112. Tarleton R.L., Grusby M.J., and Zhang L. Increased susceptibility of Stat4-deficient and enhanced resistance in Stat6-deficient mice to infection with Trypanosoma cruzi.// J. Immunol. 2000. - Vol. 165.-P. 1520-1525.

113. Tomlinson S., Pontes de Carvalho L.C., Vandekerckhove F., and Nussensweig V. Role of sialic acid in the resistance of Trypanosoma cruzi trypomastigotes to complement. // J. Immunol. 1994. - Vol. 153. - P. 3141-3147.

114. Une C., Andersson J., and Orn A. Role of IFN-alpha/beta and IL-12 in the activation of natural killer cells and interferon-gamma production during experimental infection with Trypanosoma cruzi. II Clin. Exp. Immunol. 2003. — Vol. 134.-P. 195-201.

115. Valore E.V., Ganz T. Posttranslational processing of defensins in immture human myeloid cells. // Blood. 1992. - Vol. 79. - P. 1538-1544.

116. Van Wetering S., Mannesse-Lazeroms S.P., van Sterkenburg M.A., Daha M.R., Dijkman J.H., and Hiemstra P.S. Effect of defensins on interleukin-8 synthesis in airway epithelial cells. // Am. J. Physiol. 1997. - Vol. 272. - P. L888-L896.

117. Van Wetering S., Sterk P.J., Rabe K.F., and Hiemstra P.S. Defensins: key players or bystanders in infection, injury, and repair in the lung? // J. Allergy Cli. Immunol. 1999. - Vol. 104. - P. 1131-1138.

118. Van Zandbergen G., Solbach W., and Laskay T. Apoptosis driven infection. // Autoimmunity. 2007. - Vol. 40. - P. 349-352.

119. Vaux D.L., and Strasser A. The molecular biology of apoptosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996. - Vol. 93. - P. 2239-2244.

120. Villalta F., and Kierszenbaum F. Role of inflammatory cells in Chagas' disease. I. Uptake and mechanism of destruction of intracellular (amastigote) forms of Trypanosoma cruzi by human eosinophils. // J. Immunol. 1984. - Vol. 132. - P. 2053-2058.

121. Villalta F., and Kierszenbaum F. Effects of human colony-stimulating factor on the uptake and destruction of a pathogenic parasite (Trypanosoma cruzi) by human neutrophils. // J. Immunol. 1986. -Vol. 137. - P. 1703-1707.

122. Villalta F., Pankratz H.S., and Kierszenbaum F. Extracellular killing of Trypanosoma cruzi amastigotes by human eosinophils. // J. Protozool. 1987. -Vol. 34. - P. 285-290.

123. Weinberg A., Krisanaprakornkit S., and Dale B.A. Epithelial antimicrobial peptides: review and significance for oral applications. // Crit Rev. Oral Biol. Med. 1998. - Vol. 9. - P. 399-414.

124. Welburn S.C., Macleod E., Figarella K., and Duzensko M. Programmed cell death in African trypanosomes. // Parasitology. 2006. - Vol. 132. - P. S7-S18.

125. Wetering S.V., Mannesse-Lazeroms S.P.G., Dikjman J.H., and Hiemstra P.S. Effect of neutrophil serine proteinases and defensins on lung epithelial cells: modulation of cytotoxicity and 1L-8 production. // J. Leukoc. Biol. 1997. - Vol. 62.-P. 217-226.

126. Wilde C.G., Griffith J.E., Marra M.N., Snable J.L., Scott R.W. Purification and characterization of human neutrophil peptide 4, a novel member of the defensin family. // J. Biol. Chem. 1989. - Vol. 264. - P. 11200-11203.

127. Wimley W.C., Selsted M.E., and White S.H. Interactions between human defensins and lipid bilayers: evidence for formation of multemeric pores. // Protein Sci. 1994. - Vol. 3. - P. 1362-1373.

128. Xie C., Prahl A., Ericksen B., Wu Z., Zeng P., Li X., Lu W.Y., Lubkowski J., and Lu W. Reconstruction of the conserved beta-bulge in mammalian defensins using D-amino acids. // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 32921-32929.

129. Yang D., Biragyn A., Kwak L.W., and Oppenheim J.J. Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal. // Trends Immunol. 2002. - Vol. 23. - P. 291-296.

130. Yu J.J., Gaffen S.L. Interleukin-17: a novel inflammatory cytokine that bridges innate and adaptive immunity. // Front. Biosci. 2008. - Vol. 13. - P. 170-177.

131. Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. // Nature. 2002. -Vol. 415.-P. 389-395.

132. Zhang C., Xu Y., Gu J., and Schlossman S.F. A cell surface receptor defined by a mAb mediates a unique type of cell death similar to oncosis. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95. - P. 6290-6295.

133. Zhao C., Wang I., and Lehrer R.I. Widespread expression of beta-defensin hBD-1 in human secretory glands and epithelial cells. // FEBS Lett. 1996. -Vol. 396. -P.319-322.

134. Zimmermann G.R., Legault P., Selsted M.E., Pardi A. Solution structure of bovine neutrophil beta-defensin-2: the peptide fold of the beta-defesins is identical to that of the classical defensins. // Biochem. 1995. - Vol. 34. - P. 13663-13671.