Двухфазная полимерная система ПЭГ-декстран и механизмы её взаимодействия с везикулярными компонентами плазмы крови тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Слюсаренко Мария Александровна

• Слюсаренко Мария Александровна
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Слюсаренко Мария Александровна

Список сокращений

Введение

Глава 1. Литературный обзор

1.1. Двухфазные полимерные системы

1.2. Основные теоретические модели описания фракционирования веществ двухфазными полимерными системами

1.1.1. Полиэтиленгликоль

1.1.2. Декстран

1.3. Внеклеточные нановезикулы и их роль в жидкостной биопсии

Глава 2. Описание экспериментальных методов

2.1. Динамическое рассеяние света

2.2. Метод анализа траекторий наночастиц (АТН)

2.3. Спектрофотометрия

2.4. Рамановское рассеяние света

2.5. Атомно-силовая микроскопия (АСМ)

2.6. Просвечивающая электронная криомикрокопия (крио-ПЭМ)

2.7. Статическое рассеяние света

2.8. Вискозиметрия

2.9. Проточная цитометрия, дот-блоттинг и анализ белков методом Брэдфорда

Глава 3. Механизмы взаимодействия двухфазной полимерной системы ПЭГ-декстран с компонентами плазмы крови

3.1. Гидродинамические свойства ПЭГ и декстрана

3.2. Оптимизация ДПС ПЭГ-декстран для выделения везикул плазмы

3.3. Изучение комплексообразования между ПЭГ и компонентами плазмы методом ДРС

3.4. Изучение комплексообразования между декстраном и компонентами плазмы методом ДРС

3.5. Анализ свойств частиц нижней фазы плазмы крови при применении ДПС

3.6. Выводы главы

Заключение главы

Глава 4. Практическое применение выделенных ВНВ для анализа состава их поверхностных белков

4.1. Изучение изменения спектров поглощения и распределений по размерам наночастиц золота при их модификации

4.2. Изучение комплексообразования между Ли-НЧ-СБ63 и ВНВ методами ДРС и спектрофотометрии

4.3. Пример использования системы в решении клинической задачи по мониторингу эффективности мониторинга лечения лимфомы Ходжкина

4.4. Выводы главы

Выводы

Основное содержание диссертации отражено в следующих публикациях:

Благодарности

Список литературы

Список сокращений

Аи - НЧ - наночастицы золота

Аи - НЧ - А - наночастицы золота, модифицированные аптамером

Аи - НЧ - СБ63/СБ30 - наночастицы золота, модифицированные аптамером к белку

СБ63/СБ30

АСМ - атомно-силовая микроскопия АТН - анализ траекторий наночастиц БСА - бычий сывороточный альбумин ВНВ - внеклеточные нановезикулы ВФ 1, 2 - верхняя фаза 1, 2 ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДПС - двухфазная полимерная система ДРС - динамическое рассеяние света ММ - молекулярная масса НЧ - наночастицы

Крио-ПЭМ - криогенная просвечивающая электронная микроскопия

КР - комбинационное рассеяние света

ЛХ - лимфома Ходжкина

ОР - очищающий раствор

ПЗС - прибор с зарядовой связью

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

ПЭТ-КТ - позитронно-эмиссионная томография, совмещенная с компьютерной томографией

СРС - статическое рассеяние света

ТМБ - тетраметилбензидин

УЦ - ультрацентрифугирование

ФМ - фермент-миметическая активность

ФСБ - фосфатно - солевой буфер

ХТ - химиотерапия

ЭМ - электронная микроскопия

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Двухфазная полимерная система ПЭГ-декстран и механизмы её взаимодействия с везикулярными компонентами плазмы крови»

Введение

Диссертационная работа посвящена изучению двухфазной полимерной системы на основе декстрана и полиэтиленгликоля и механизмов ее взаимодействия с везикулярными объектами в многокомпонентных биологических жидкостях с целью их выделения.

Двухфазные полимерные системы (ДПС) представляют собой объединение в одном растворителе двух термодинамически несовместимых полимеров. Применение таких систем для фракционирования или очистки не связано с большими расходами, если их фазовое расслоение наблюдается в области малых концентраций полимеров. Направленный подбор параметров ДПС позволяет сконцентрировать выделяемое вещество в верхней или нижней фазе системы, либо на межфазной границе. Однако формирование фазы, обогащенной выделяемым объектом, зависит от многих факторов, в том числе от параметров ДПС, к которым, в первую очередь, относятся молекулярная масса (ММ), количественное соотношение и концентрация полимеров в растворе. В настоящее время применение ДПС для выделения/разделения наноразмерных био-объектов ограничено недостаточным пониманием этих процессов, если это не аффинное взаимодействие, что вызывает необходимость длительного экспериментального подбора оптимальных параметров ДПС и условий её использования. Отсутствие понимания механизмов взаимодействия компонентов ДПС с объектами разделения в критических или близким к ним условиям является основным препятствием для применения ДПС не только в лабораторных масштабах, поэтому изучение ДПС и закономерностей их функционирования актуально и обладает высокой практической значимостью.

Особой актуальностью обладает изучение ДПС, которые можно применять для аналитических целей в медицине. Именно такой системой является ДПС полиэтиленгликоль-декстран (ПЭГ-декстран), состоящая из биосовместимых, нетоксичных и коммерчески доступных полимеров. Несмотря на то, что в литературе имеются публикации об успешном применении этой ДПС для разделения биообъектов [1-6], до настоящего времени не существует критериев, на которые можно было бы опереться при выборе таких важных параметров ДПС как ММ составляющих её полимеров или их количественное соотношение. То же относится и к выбору условий применения системы ПЭГ-декстран для выделения биообъектов: температуры, рН, ионной силы и состава низкомолекулярных ионов.

Изучение ДПС, которые можно применять для аналитических целей в медицине, особенно актуально. Именно такой системой является ДПС полиэтиленгликоль-декстран (ПЭГ-декстран), состоящая из биосовместимых, нетоксичных и коммерчески доступных полимеров. Компоненты этой ДПС относятся к разным классам: ПЭГ - линейный

синтетический полимер, декстран - полисахарид, преимущественно а(1^6) полиглюкан. Несмотря на то, что в литературе имеются публикации об успешном применении этой ДПС для разделения био-объектов, до настоящего времени не существует критериев, на которые можно было бы опереться при выборе параметров ДПС. То же относится и к выбору условий применения системы ПЭГ-декстран для выделения био-объектов: температуры, рН, ионной силы и состава низкомолекулярных ионов.

Данная работа посвящена изучению взаимодействия ДПС ПЭГ-декстран с компонентами плазмы крови человека в условиях близости к бимодали системы. Плазма крови млекопитающих - многокомпонентная биологическая жидкость, содержащая протеины, нуклеиновые кислоты, внеклеточные везикулы, липиды, витамины и другие компоненты (например, глюкозу, соли и т.д.). Плазма представляет собой универсальный объект для изучения механизмов взаимодействия ДПС ПЭГ-декстран с разными по строению биологическими микро- и нанообъектами, отличающимися по своим физическим и биохимическим свойствам. Внеклеточные наноразмерные везикулы (ВНВ) плазмы, как и более крупные по размеру везикулы, состоят из мембранной оболочки с расположенными на её поверхности определенными наборами белков, зависящих от состава продуцировавших их клеток, а также внутреннего наполнения белками, липидами и нуклеиновыми кислотами. Основная функция ВНВ в организме связана с осуществлением межклеточного обмена [7]. Термин ВНВ в работе используется для везикул с размерами от 30 до 150 нм. ВНВ таких размеров имеют высокий диагностический потенциал в онкологии, который пока не реализован в связи с отсутствием надежных методов их выделения и анализа, что свидетельствует о практической значимости данной работы. Для выделения ВНВ из плазмы в настоящее время используют либо многоэтапное ультрацентрифугирование, либо специальное хроматографическое разделение, что трудоёмко и достаточно дорого. Явление экстрагирования ВНВ из плазмы крови с помощью ДПС детально не изучалось.

Актуальность данного исследования связана с изучением физических свойств двухфазной полимерной системы ПЭГ-декстран, механизмов её взаимодействия с биообъектами многокомпонентных сред и конкретизацией выбора её параметров для выделения ВНВ. Предлагаемая в работе методика выделения ВНВ плазмы, а также анализа поверхностных белков имеют практическую значимость для реализации новых возможностей в ранней диагностике онкологических заболеваний. Данная работа посвящена изучению взаимодействия ДПС ПЭГ-декстран с компонентами плазмы крови человека в условиях близости к бимодали системы. Плазма крови млекопитающих -биологическая жидкость, содержащая протеины, нуклеиновые кислоты, внеклеточные

везикулы, липиды, витамины и другие компоненты (например, глюкозу, соли и т.д.). Плазма представляет собой универсальный объект для изучения механизмов взаимодействия ДПС ПЭГ-декстран с разными по строению биологическими микро- и нанообъектами, отличающимися по своим физическим и биохимическим свойствам. Внеклеточные наноразмерные везикулы (ВНВ) плазмы, как и более крупные по размеру везикулы, состоят из мембранной оболочки с расположенным на её поверхности набором белков, зависящим от состава продуцировавших их клеток, а также внутреннего наполнения белками, липидами и нуклеиновыми кислотами. Основная функция ВНВ в организме связана с осуществлением межклеточного обмена. Термин ВНВ в работе используется для везикул с размерами от 30 до 150 нм. ВНВ таких размеров имеют высокий диагностический потенциал в онкологии, который пока не реализован в связи с отсутствием надежных методов их выделения и анализа, что свидетельствует о практической значимости данной работы. Для выделения ВНВ из плазмы в настоящее время используют либо многоэтапное ультрацентрифугирование, либо специальное хроматографическое разделение, что трудоёмко и достаточно дорого. Явление экстрагирования ВНВ из плазмы крови с помощью ДПС детально не изучалось.

Актуальность данного исследования связана не только с изучением физических свойств двухфазной полимерной системы ПЭГ-декстран при её взаимодействии с биообъектами многокомпонентной среды, но и с конкретизацией выбора её параметров для выделения ВНВ плазы. Предлагаемая в работе методика выделения ВНВ, а также методика анализа поверхностных белков имеют практическую значимость для реализации новых возможностей в ранней диагностике онкологических заболеваний.

Цель работы состояла в анализе гидродинамических свойств компонентов двухфазной полимерной системы (ДПС) декстран-полиэтиленгликоль, использовании её для экстрагирования внеклеточных нановезикул (ВНВ) плазмы и определении критериев выбора параметров ДПС для выделения везикулярных объектов, не основанных на аффинных принципах.

В работе были использованы методы динамического рассеяния света в растворах, анализ траекторий наночастиц (АТН), спектрофотометрия, криоэлектронная микроскопия, рамановская спектроскопия, статическое рассеяние света, денситометрия, вискозиметрия, проточная цитометрия, дот-блоттинг. Основные выводы работы базируются на изучении комплексообразования биообъектов с полимерами ДПС путем анализа распределений размеров частиц в растворах. Детали взаимодействия исследованы спектральными методами.

Задачами работы были:

1. Определение молекулярной массы (ММ), гидродинамических и конформационных характеристик образцов декстрана и полиэтиленгликоля (ПЭГ) в фосфатно-солевом буферном растворителе;

2. Определение наиболее эффективных условий выделения внеклеточных нановезикул (ВНВ) из плазмы крови путем анализа распределений частиц по размерам при её фракционировании с помощью двухфазных систем (ДПС), составленных из декстрана и ПЭГ различной ММ при вариации концентрации полимеров;

3. Изучение механизмов взаимодействия компонентов ДПС с компонентами плазмы крови спектральными методами и методом АТН;

4. Определение критериев выбора параметров ДПС для выделения ВНВ и других биообъектов на основе гидродинамических параметров;

5. Исследование диагностического потенциала ВНВ с помощью модифицированных аптамером наночастиц в качестве тест-систем для обнаружения и анализа внеклеточных везикул.

Научная новизна работы состоит в следующем:

1. Для концентрирования везикулярных объектов заданных размеров, не взаимодействующих аффинно с компонентами ДПС ПЭГ-декстран, имеет значение соотношение гидродинамических объемов компонентов ДПС. Этот параметр предложен в качестве критерия выбора состава ДПС для выделения ВНВ из плазмы крови;

2. Равенство величин характеристической вязкости компонентов ДПС в водной среде также есть гидродинамический критерий для выделения биообъектов, не взаимодействующих аффинно с компонентами ДПС;

3. Система ПЭГ-20 кДа/ декстран-500 кДа обладает высокой эффективностью для выделения ВНВ;

4. Циркулирующие в плазме крови ВНВ размером ~50 нм, выделенные с помощью ДПС ПЭГ-декстран, можно использовать для анализа их поверхностных белков, что было продемонстрировано применением тест-системы на основе модифицированных аптамерами наночастиц золота в рамках решения конкретной клинической задачи.

Практическая значимость работы связана с определением критериев выбора параметров ДПС ПЭГ-декстран для фракционирования с ее помощью везикулярных объектов, изучением процессов седиментации, агрегации и комплексообразования в полимерной системе ПЭГ-декстран при смешении с компонентами плазмы крови, а также с изучением

тест-систем для ВНВ на основе модифицированных наночастиц золота. Получен патент на метод выделения ВНВ «Способ выделения экзосом из плазмы крови» номер: RU2741776C1. А также подготовлены материалы для патента и получена приоритетная справка для метода анализа белковых маркеров ВНВ в плазме крови для мониторинга эффективности лечения лимфомы Ходжкина, номер справки: 2021123297/14. Результаты работы также представляют интерес с точки зрения фундаментальных исследований свойств ДПС и их взаимодействия с биополимерными объектами, они могут быть включены в базовые курсы университетов по специальности «Высокомолекулярные соединения» и курсы, посвященные биомедицинскому применению полимеров. На защиту выносятся следующие положения:

1) Для эффективного выделения с помощью ДПС ПЭГ-декстран биообъектов, которые не образуют комплексов с полимерами ДПС, помимо термодинамических, важными критериями выбора параметров ДПС являются гидродинамические характеристики компонентов ДПС: характеристическая вязкость, гидродинамический объем и размер, гидродинамическая плотность (плотность в растворе);

2) Критерий близости величины характеристической вязкости компонентов ДПС в водном растворителе, позволяет отделять более крупные по размеру, чем полимеры ДПС, везикулярные частицы за счет их вытеснения и осаждения под действием силы тяжести;

3) Молекулярная масса ПЭГ в составе ДПС является важным фактором, который способствует сосредоточению белков плазмы в верхней фазе за счет их комплексации с ПЭГ, что в итоге приводит к концентрированию ВНВ в нижней фазе системы после её разделения;

4) Декстран инертен по отношению к белкам плазмы и ВНВ и играет роль наполнителя, регулирующего вязкость системы плазма-ДПС и параметр Пекле, отвечающий за равновесие частиц разного размера, взвешенных в растворе;

5) ДПС ПЭГ-декстран позволяет выделять ВНВ плазмы крови с большой эффективностью, что выражается в высокой концентрации выделяемых нановезикул (~ 21011 частиц/мл из 1,5 мл плазмы) и остаточными количествами декстрана и ПЭГ, не детектируемыми Рамановской спектроскопией;

6) Модифицированные аптамерами наночастицы золота являются эффективным инструментом анализа поверхностных белков ВНВ, выделенных из плазмы крови.

Апробация работы: Основные результаты работы докладывались и обсуждались на 7 российских и международных конференциях.

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в рецензируемых зарубежных журналах, индексируемых в базах Web of Science и Scopus, и получено два патента.

Личный вклад автора заключался в планировании экспериментальных работ, подготовке растворителей, полимерных растворов, и биологических объектов, проведении исследований методами вискозиметрии, динамического рассеяния света, денситометрии, абсорбционной спектроскопии, криоэлектронной микроскопии, анализа траекторий наночастиц, дот-блоттинга, проточной цитометрии, обработке данных динамического светорассеяния, а также в подготовке статей к публикации и подготовке докладов по результатам исследований.

Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, литературного обзора (глава 1), описания методов исследования (глава 2), двух разделов (главы 3 и 4), где обсуждаются результаты исследований, выводов и списка использованной литературы (140 наименований). Работа изложена на 118 страницах, содержит 59 рисунков и 6 таблиц.

Глава 1. Литературный обзор

Во введении уже было сказано, что фазовое расслоение является особенностью физических свойств полимер-полимерных систем, применяемых для выделения биологических объектов из смесей. Рассмотрим некоторые примеры применения двухфазных полимерных систем и теоретические принципы их описания.

1.1. Двухфазные полимерные системы

Впервые разделение полимерных смесей в растворе на две фазы было показано для природных полимеров - агара и желатина [8]. Позднее была показана возможность использования этого феномена для выделения компонентов биологических жидкостей и решения задач аналитической химии [9]. Впоследствии были описаны возможности разделения биологических молекул в двухфазных водных растворах за счет межмолекулярных взаимодействий различной природы: ван-дер-ваальсовых, электростатических и гидрофобных [10].

В растворах двух термодинамически несовместимых полимеров в одном растворителе в определенном диапазоне концентраций возможно фазовое расслоение даже при их низких концентрациях.

Для описания данного явления используют фазовые диаграммы, которые отражают концентрационные области сосуществования и разделения смеси полимеров на несколько полимерных фаз. Иллюстрация такой фазовой диаграммы представлена на рисунке 1.2.1. Согласно этой диаграмме, чем больше концентрация полимера нижней фазы, тем больше объем этой фазы

Концентрация полимера в нижней фа»е

Рисунок 1.2.1. Пример фазовой диаграммы для двухфазной полимерной системы [11].

Это явление объясняется энтропийным эффектом, но лишь частично. Свободная энергия смешения Д^ связана с энтальпией смешения ДЯси энтропией смешения АБс уравнением

Энтропия смешения двух полимеров всегда ниже в сравнении с энтропией смешения того же количества их мономерных звеньев [12, 13]. Таким образом, даже малое положительное значение энтальпии смешения является достаточным для предотвращения смешивания. Для выполнения такого условия достаточно небольшого различия между двумя полимерными соединениями. Причем, чем выше ММ полимеров, тем при более низких концентрациях может происходить фазовое расслоение.

1.2. Основные теоретические модели описания фракционирования веществ двухфазными полимерными системами

Для теоретического описания функции двухфазных систем как разделителя принято использовать коэффициент разделения низкомолекулярного вещества в системе, равный отношению концентраций разделяемого вещества в первой и второй фазах, которые формирует каждый из компонентов в растворе. Брёнстед отметил, что чем выше молекулярная масса разделяемого вещества (при условии сохранности остальных факторов), тем более выражено будет проходить концентрирование вещества в одной фазе

где с1 и с2 - концентрация разделяемого вещества в верхней и нижней фазах, соответственно, M - молекулярная масса фракционируемого вещества, а - константа, характерная для пары - двухфазная система/ разделяемое вещество, R - универсальная

газовая константа, T - температура

= ДЯс-Д5(

с

с

(111)

[14]:

(12.2)

Эксперименты по фракционированию макромолекул подтвердили теорию Брёнстеда. Данная концепция пригодна и для описания фракционирования крупных частиц, в том числе частиц с размерами порядка клеточных. Молекулярную массу в формуле (1.2.2) можно заменить на площадь поверхности частиц. Для фракционирования белков двухфазная система должная быть выбрана такой, которая давала бы коэффициент разделения порядка единицы, а для клеток такой коэффициент должен быть либо нулём, либо бесконечностью. Для абсолютного разделения двух типов частиц в двухфазной системе требуется, чтобы коэффициенты а формуле (1.2.2) имели противоположные знаки. При распределении веществ между фазами также может наблюдаться адсорбция вещества в интерфазе. Теоретическое описание этого явления было дано Квинке [15] и Де Корде [16], а экспериментальное исследование было проведено Гофманом и Рейндерсом на порошках нерастворимых неорганических солей в системах вода - органический растворитель [17]. В основе теории лежат понятия поверхностной свободной энергии в единице площади частицы в первой фазе 71, в интерфазе 712 и во второй фазе 72. Пренебрегая гравитацией, если разность энергий 71 -72 больше 712, то частицы будут концентрироваться во второй фазе, если 72 -71 > 712, то частицы будут в первой фазе, а если 71 -72 <712, то частицы будут адсорбироваться в интерфазе. Если в рассмотрение добавить гравитацию и рассматривать частицы более плотные, чем фазы, то частицы будут устремляться вниз под действием силы, зависящей от размера и плотности частицы, а также плотности двух фаз. В случае, когда силу тяжести компенсирует вертикальная составляющая силы, зависящей от 712 и ширины интерфазы, частицы остаются в интерфазе.

Согласно теории Альбертсона [18] выделены пять типов движущих факторов для фракционирования вещества в ДПС: (1) размер, т.е. когда частицы разделяют по размеру или площади поверхности; (2) электрохимический; (3) гидрофобные взаимодействия; (4) биоспецифическая аффиность; (5) конформационные взаимодействий и остальных факторов, учитывающихся коэффициентом. Так как при разделении каждый тип взаимодействия вносит вклад, возникает суперпозиция действующих факторов, влияющих на результат фракционирования частиц с помощью двухфазных систем. Такое состояние можно описать уравнением [18]:

1п(^размерный} + ^(^электрохимический^) + 1п(^гидрофобный ) + Ц^аффинный) + 1п(^конформационный} + 1п(^гидрофобный )+ ВД) (1.2.3)

В своей теории Альбертссон показал влияние ММ полимеров ДПС на размер осаждаемых частиц, что открыло возможность фракционирования белков по размеру [19]. Связь коэффициента распределения системы К с молекулярной массой выделяемых частиц Альбертссон получил в виде следующего уравнения [18]:

-1ое(Ю = аМ2/3 , (1.2.4)

где а - коэффициент, зависящий от концентрации полимера, M - молекулярная масса

осаждаемого белка

Согласно Йохансону [20] коэффициент разделения можно представить в виде суммы двух компонентов зависящих от: (1) относительной сольватации разделяемых частиц в фазах, учитывающий концентрацию и молекулярную массу полимеров, (2) от заряда частиц (зависящим от pH среды) и взаимодействия частиц с двумя фазами (зависящим от ионной силы). Также Йохансон утверждает, что соединения с более низкими ММ, которые растворимы в обеих частях ДПС, распределяются между фазами более равномерно.

Кабезас [21] рассмотрел более пяти термодинамических моделей и применил подход статистической термодинамики для описания процессов, происходящих при фракционировании частиц в двухфазных системах. Наиболее успешной оказалась модель, использующая вириальное разложение уравнения состояния (через осмотическое давление). Эта модель была изучена и другими авторами, которые применили теорию Эдмонда и Огстона и предложили следующее уравнение для коэффициента разделения [22]:

1п(Ю = ^([/\]верх - Иниз) - М^верх - ^]низ) + (1.2.5)

где K - константа разделения, - концентрация 1-ого полимера в верхней и нижней фазах 1;2); Aij -второй вириальный коэффициент; zi- заряд 1-ого полимера, V -электрический потенциал, F-константа Фарадея

Даймонд и Хсу предложили подход, в основе которого лежит теория Флори и Хаггинса [4]. Им удалось получить эмпирическое выражение для системы ПЭГ/декстран для разделения низко - и высокомолекулярных белков.

1пСЮ

Ыверх- н

= Л+Ь([/\]верх- Иниз), (12.6)

где Pl - концентрация ПЭГ в фазе, A - коэффициент, учитывающий ММ полимеров и белков; заряд белков, взаимодействие белков с водой, полимерами и другими молекулами белков; pH; электростатическую разницу между двумя фазами; тип соли и концентрацию, Ь - коэффициент, учитывающий ММ и заряд белков; взаимодействие полимер-вода; разницу электростатического потенциала между фазами и типа соли и её концентрации

Теория Даймонда и Хсу [4] нашла хорошее соответствие с экспериментальными данными. Формула 1.2.6 справедлива лишь для промежуточного диапазона разности концентраций полимеров между фазами, так как при в критической точке концентрации ПЭГ в верхней и нижней фазах становятся равными, и их разница стремится к нулю.

На результат фракционирования частиц/биообъектов в двухфазных системах влияет ММ используемых полимеров, pH, ионная сила, заряд, температура и межфазовое поверхностное натяжение.

Процессы конвекции и седиментации играют важную роль при фазовом разделении. Для описания процессов седиментации частиц в растворе в обычном поле тяжести можно использовать параметр Пекле, переложенный для диффузионных и седиментационных процессов [23]. В изначальном варианте теории Пекле данный параметр является критерием подобия, характеризующий соотношения между конвективными и молекулярными (диффузионными) процессами переноса тепла в потоке жидкости [24]. Чем больше этот параметр, тем конвекционные процессы сильнее преобладают над диффузионными [25]. Например, в работе [26] показано влияние вязкости системы на стабильность эмульсии, что косвенно указывает на возможную взаимосвязи стабильности частиц в растворителе и вязкости этого растворителя. Для описания зависимости скорости осаждения равных по размеру твердых сфер от их объемной доли существует уравнение Бэтчелора для области разбавленных растворов 1.2.7 [27]:

и = У0(1-6,550+..) , (1.2.7)

где U - скорость седиментации, У0 = /9^ - скорость осаждения согласно закону

Стокса для частиц в бесконечном разбавлении, Др - разница плотности частиц и растворителя, д - ускорение свободного падения, ^ - вязкость растворителя, ф -

объёмная доля частиц Экспериментальное подтверждение зависимости 1.2.7 было сделано для полистирольных частиц в органическом растворителе и представлено уравнением 1.2.8 [28]:

и = Уо(1-^01/3+..), (1.2.8)

где k ~ 2,8, U - скорость седиментации, Uo - скорость осаждения согласно закону Стокса,

ф - объёмная доля частиц Изменение в концентрационной зависимости скорости седиментации авторы [28] объясняют появлением кулоновского взаимодействия между заряженными частицами. Частицы стараются находится в максимально отдаленных позициях от других частиц тем самым образуя некий порядок в системе. Если рассмотреть систему с упорядоченными сферами в растворе, то зависимость 1.2.7. примет вид

и = У0(1 -£01/2+..) , (1.2.9)

где £ - константа, зависящая от кристаллической структуры, U - скорость седиментации, и - скорость осаждения согласно закону Стокса, ф - объёмная доля частиц

Изменение зависимости 1.2.7 в уравнениях 1.2.8 и 1.2.9 при возникновении упорядочивания авторы [28] объясняют «выключением» Броуновского движения.

Параметр Пекле для седиментационных и диффузионных процессов можно представить в виде отношения У0 и коэффициента диффузии из уравнения Стокса-

Эйнштейна £0 = [23]: 0 бл-^к 1 -1

Ре = Д— , (1.2.10)

о0

где Pe - параметр Пекле, R - радиус частиц, кь - константа Больцмана, ^ - вязкость

растворителя, Т - температура

Также данный параметр можно выразить как произведение чисел Рейнольдса йе и Шмидта 5с [29]:

Ре = Де^5с , (1.2.11)

Параметры, Ре и 5с, выражаются через параметры системы следующим образом [30]:

Яе = 5с = — , (1.2.12)

Чо Р'О 4 7

где Ре - число Рейнольдса, 5с - число Шмидта, - вязкость растворителя, Б -коэффициент поступательной диффузии, I - средний линейный размер, р - плотность растворителя, и - скорость седиментации частиц

Принимая во внимание соотношения 1.2.11 и 1.2.12, параметр Пекле можно записать в следующем виде:

п г-р-и ^о г п ьи г л о 1 ->\

Ре = —-----— , (1.2.13)

рО /0 КГ ' 4 7

где йе - число Рейнольдса, 5с - число Шмидта, - вязкость растворителя, Б -коэффициент поступательной диффузии, / - средний линейный размер, р - плотность растворителя, и - скорость седиментации частиц

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Слюсаренко Мария Александровна, 2022 год

Список литературы

1. Zaslavsky B.Y. Partitioning in aqueous two-phase systems as a method of estimation of the relative hydrophobicity of solutes / Zaslavsky B.Y., Borovskaya A.A., Gulaeva N.D., Miheeva L.M. // Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions - 1991. - Т. 87 - № 1 - С.137-140.

2. Johansson H.O. Thermoseparating water/polymer system: A novel one-polymer aqueous two-phase system for protein purification / Johansson H.O., Persson J., Tjerneld F. // Biotechnology and Bioengineering - 1999. - Т. 66 - № 4 - С.247-257.

3. Asenjo J.A. Aqueous two-phase systems for protein separation: A perspective // J. Chromatogr. A. - 2011. - Т. 1218. - № 49. - 8826-8835с.

4. Diamond A.D. Correlation of protein partitioning in aqueous polymer two-phase systems / Diamond A.D., Hsu J.T. // Journal of Chromatography A - 1990. - Т. 513 - № C - С.137-143.

5. Hachem F. Hydrophobic partitioning of proteins in aqueous two-phase systems / Hachem F., Andrews B.A., Asenjo J.A. // Enzyme and Microbial Technology - 1996. - Т. 19 - № 7 - С.507-517.

6. Lira R.B. Selective Partitioning of (Biomacro)molecules in the Crowded Environment of Double-Hydrophilic Block Copolymers / Lira R.B., Willersinn J., Schmidt B.V.K.J., Dimova R. // Macromolecules - 2020.

7. Tkach M. Communication by extracellular vesicles: where we are and where we need to go / Tkach M., Thery C. // Cell - 2016. - Т. 164 - № 6 - С.1226-1232.

8. Albertsson P.A. Fractionation of particles and macromolecules in aqueous two-phase systems / Albertsson P.A. // Biochemical Pharmacology - 1961. - Т. 5 - № 4 - С.351-358.

9. Zaslavsky B.Y. Bioanalytical Applications of Partitioning in Aqueous Polymer Two-Phase Systems / Zaslavsky B.Y. // Analytical Chemistry - 1992. - Т. 64 - № 15.

10. Hatti-Kaul R. Aqueous Two-Phase Systems: a General Overview / Hatti-Kaul R. // Molecular Biotechnology - 2001. - Т. 19 - № 3 - С.269-278.

11. Iqbal M. Aqueous two-phase system (ATPS): an overview and advances in its applications // Biol. Proced. Online. - 2016. - Т. 18. - № 1. - 1-18с.

12. Ландау Л.Д.Курс теоретической физики. Статистическая физика (часть1) / Л. Д. Ландау, Е. М. Лифшиц - Москва: Наука, 1976.- 616c.

13. Цветков В.Н.Структура макромолекул в растворах / В. Н. Цветков, В. Е. Эскин, С. Я. Френкель - Наука, 1964.- 720c.

14. Principles of Laboratory Animal Science, Revised Edition - 1st Edition [Электронный ресурс]. URL: https://www.elsevier.com/books/principles-of-laboratory-animal-science-revised-

edition/van-zutphen/978-0-444-50612-2 (accessed: 21.10.2019).

15. Quincke G. Ueber den Randwinkel und die Ausbreitung von Flüssigkeiten auf festen Körpern / Quincke G. // Annalen der Physik - 1877. - T. 238 - № 10 - C.145-194.

16. Bringmann J. Partition of dipeptides in aqueous polymer two-phase systems as a function of pH in the presence of salts / Bringmann J., Keil B., Pfennig A. // Fluid Phase Equilibria - 1994. -T. 101 - № C - C.211-225.

17. Albertsson P.-Ä. Particle fractionation in liquid two-phase systems The composition of some phase systems and the behaviour of some model particles in them application to the isolation of cell walls from microorganisms / Albertsson P.-Ä. // Biochimica et Biophysica Acta - 1958. - T. 27 - C.378-395.

18. Grilo A.L. Partitioning in Aqueous Two-Phase Systems: Fundamentals, Applications and Trends / Grilo A.L., Aires-Barros M.R., Azevedo A.M. // Separation and Purification Reviews -2016. - T. 45 - № 1 - C.68-80.

19. Albertsson P.-Ä. Aqueous Biphasic Systems. Properties and Applications in Bioseparation Boston, MA: Springer US, 1995. - 21-30c.

20. Johansson G. Partitioning procedures and techniques: Small molecules and macromolecules / Johansson G. // Methods in Enzymology - 1994. - T. 228 - C.28-42.

21. Serum Exosomes Derived from Irritable Bowel Syndrome Patient Increase Cell Permeability via Regulating miR-148b-5p/RGS2 Signaling in Human Colonic Epithelium Cells / // Gastroenterology Research and Practice.

22. King R.S. Molecular thermodynamics of aqueous two-phase systems for bioseparations / King R.S., Blanch H.W., Prausnitz J.M. // AIChE Journal - 1988. - T. 34 - № 10 - C.1585-1594.

23. Benes K. Sedimentation, Péclet number, and hydrodynamic screening / Benes K., Tong P., Ackerson B.J. // Physical Review E - 2007. - T. 76 - № 5 - C.056302.

24. Microfluidics: Modelling, Mechanics and Mathematics / - Elsevier, 2017.

25. Patankar S. V.Numerical Heat Transfer and Fluid Flow / S. V. Patankar - Boca Raton: CRC Press, 1980.- 214c.

26. Tesch S. Influence of increasing viscosity of the aqueous phase on the short-term stability of protein stabilized emulsions / Tesch S., Schubert H. // Journal of Food Engineering - 2002. - T. 52 - № 3 - C.305-312.

27. Batchelor G.K. Sedimentation in a dilute dispersion of spheres / Batchelor G.K. // Journal of Fluid Mechanics - 1972. - T. 52 - № 2 - C.245-268.

28. Thies-Weesie D.M.E. Nonanalytical concentration dependence of sedimentation of charged silica spheres in an organic solvent: Experiments and calculations / Thies-Weesie D.M.E., Philipse A.P., Nägele G., Mandl B., Klein R. // Journal of Colloid And Interface Science - 1995.

29. Transport Processes in Microfluidic Applications Elsevier, 2018. - 529-546с.

30. Rapp B E. Fluids Elsevier, 2017. - 243-263с.

31. Цветков В.Н.Жесткоцепные полимерные молекулы / В. Н. Цветков - Ленинград: Наука, 1986.- 380c.

32. Ландау Л.Д.Курс теоретической физики. Гидродинамика / Л. Д. Ландау, Е. М. Лифшиц / под ред. Наука. — Москва, 1986. Вып. 3-е издани- 736c.

33. Shin H. High-yield isolation of extracellular vesicles using aqueous two-phase system / Shin H., Han C., Labuz J.M., Kim J., Kim J., Cho S., Gho Y.S., Takayama S., Park J. // Scientific Reports - 2015. - Т. 5 - № 1 - С.13103.

34. Shin H. Aqueous two-phase system to isolate extracellular vesicles from urine for prostate cancer diagnosis / Shin H., Park Y.H., Kim Y.-G., Lee J.Y., Park J. // PLOS ONE - 2018. - Т. 13

- № 3 - Ce0194818.

35. Penczek S. Ring-opening polymerization / Penczek S., Pretula J., Slomkowski S. // Chemistry Teacher International - 2021. - Т. 3 - № 2 - С.33-57.

36. Herzberger J. Polymerization of Ethylene Oxide, Propylene Oxide, and Other Alkylene Oxides: Synthesis, Novel Polymer Architectures, and Bioconjugation / Herzberger J., Niederer K., Pohlit H., Seiwert J., Worm M., Wurm F.R., Frey H. // Chemical Reviews - 2016. - Т. 116 - № 4

- С.2170-2243.

37. Özdemir C. Solubility profiles of poly(ethylene glycol)/solvent systems, I: Qualitative comparison of solubility parameter approaches / Özdemir C., Güner A. // European Polymer Journal - 2007. - Т. 43 - № 7 - С.3068-3093.

38. Alconcel S.N.S. FDA-approved poly(ethylene glycol)-protein conjugate drugs / Alconcel S.N.S., Baas A.S., Maynard H.D. // Polymer Chemistry - 2011. - Т. 2 - № 7 - С.1442.

39. Taché S. Polyethylene glycol, unique among laxatives, suppresses aberrant crypt foci, by elimination of cells / Taché S., Parnaud G., Beek E. Van, Corpet D.E. // Scandinavian Journal of Gastroenterology - 2006. - Т. 41 - № 6 - С.730-736.

40. Jang H.-J. Safety Evaluation of Polyethylene Glycol (PEG) Compounds for Cosmetic Use / Jang H.-J., Shin C.Y., Kim K.-B. // Toxicological Research - 2015. - Т. 31 - № 2 - С.105-136.

41. D'souza A.A. Polyethylene glycol (PEG): a versatile polymer for pharmaceutical applications / D'souza A.A., Shegokar R. // Expert Opinion on Drug Delivery - 2016. - Т. 13 - № 9 - С.1257-1275.

42. Engebretson B. Long-Term In Vivo Effect of Peg Bone Tissue Engineering Scaffolds / Engebretson B., Sikavitsas V.I. // Journal of Long-Term Effects of Medical Implants - 2012. - Т. 22 - № 3 - С.211-218.

43. Kolate A. PEG — A versatile conjugating ligand for drugs and drug delivery systems / Kolate

A., Baradia D., Patil S., Vhora I., Kore G., Misra A. // Journal of Controlled Release - 2014. - T. 192 - C.67-81.

44. Cheng C. Polyethylene glycol and divalent salt-induced DNA reentrant condensation revealed by single molecule measurements / Cheng C., Jia J.-L., Ran S.-Y. // Soft Matter - 2015. - T. 11 -№ 19 - C.3927-3935.

45. McPherson A. Crystallization of proteins from polyethylene glycol / McPherson A. // The Journal of biological chemistry - 1976. - T. 251 - № 20 - C.6300-3.

46. Mi Y. Cryoprotection mechanisms of polyethylene glycols on lactate dehydrogenase during freeze-thawing / Mi Y., Wood G., Thoma L. // The AAPS Journal - 2004. - T. 6 - № 3 - C.45-54.

47. R. C. PEGylated Adenovirus for Targeted Gene Therapy Totowa, NJ: Humana Press, 2008. -133-160c.

48. Reverberi R. Factors affecting the antigen-antibody reaction. / Reverberi R., Reverberi L. // Blood transfusion = Trasfusione del sangue - 2007. - T. 5 - № 4 - C.227-40.

49. Bittner G. Application and implications of polyethylene glycol-fusion as a novel technology to repair injured spinal cords / Bittner G., Rokkappanavar K., Peduzzi J. // Neural Regeneration Research - 2015. - T. 10 - № 9 - C.1406.

50. Li D. Study on Influence of Polyethylene Glycol on Dispersion of Pyrite Powder in Aqueous Solution / Li D., Yin Z.L., Chen Q.Y. // Advanced Materials Research - 2012. - T. 554-556 -C.349-352.

51. Broda M. Conservation of Waterlogged Wood—Past, Present and Future Perspectives / Broda M., Hill C.A.S. // Forests - 2021. - T. 12 - № 9 - C.1193.

52. Neely W.B. Dextran: Structure and Synthesis , 1961. - 341-369c.

53. Belder A.N. deDextran - handbook / A. N. de Belder - Uppsala: Amersham Biosciences, 2003.- 64c.

54. Armstrong J.K. The Hydrodynamic Radii of Macromolecules and Their Effect on Red Blood Cell Aggregation / Armstrong J.K., Wenby R.B., Meiselman H.J., Fisher T.C. // Biophysical Journal - 2004. - T. 87 - № 6 - C.4259-4270.

55. Virnik A.D. Dextran and Its Derivatives / Virnik A.D., Khomyakov K.P., Skokova I.F. // Russian Chemical Reviews - 1975. - T. 44 - № 7 - C.588-602.

56. Granath K.A. Solution properties of branched dextrans / Granath K.A. // Journal of Colloid Science - 1958. - T. 13 - № 4 - C.308-328.

57. Pavlov G.. Optical properties of dextran in solution and in films / Pavlov G.., Grishchenko A.., Rjumtsev E.., Yevlampieva N.. // Carbohydrate Polymers - 1999. - T. 38 - № 3 - C.267-271.

58. Masuelli M.A. Dextrans in Aqueous Solution. Experimental Review on Intrinsic Viscosity

Measurements and Temperature Effect / Masuelli M.A. // Journal of Polymer and Biopolymer Physics Chemistry - 2013. - T. 1 - № 1 - C.13-21.

59. Senti F.R. Viscosity, sedimentation, and light-scattering properties of fraction of an acid-hydrolyzed dextran / Senti F.R., Hellman N.N., Ludwig N.H., Babcock G.E., Tobin R., Glass C.A., Lamberts B.L. // Journal of Polymer Science - 1955. - T. 17 - № 86 - C.527-546.

60. Frank H.P. Zur Struktur der Dextrane / Frank H.P., Mark H. // Monatshefte f^r Chemie -1954. - T. 85 - № 2 - C.307-317.

61. Wales M. Intrinsic viscosity-molecular weight relationships for dextran / Wales M., Marshall P.A., Weissberg S.G. // Journal of Polymer Science - 1953. - T. 10 - № 2 - C.229-240.

62. Gekko K. Physicochemical studies of oligodextran. I. Molecular weight dependence of intrinsic viscosity, partial specific compressibility and hydrated water / Gekko K., Noguchi H. // Biopolymers - 1971. - T. 10 - № 9 - C.1513-1524.

63. Basedow A.M. Production, characterization, and solution properties of dextran fractions of narrow molecular weight distributions / Basedow A.M., Ebert K.H. // Journal of Polymer Science: Polymer Symposia - 1979. - T. 66 - № 1 - C.101-115.

64. Huang S. Preparation and drug delivery of dextran-drug complex / Huang S., Huang G. // Drug Delivery - 2019. - T. 26 - № 1 - C.252-261.

65. Jadhav S.B. Conjugation of a-amylase with dextran for enhanced stability: Process details, kinetics and structural analysis / Jadhav S.B., Singhal R.S. // Carbohydrate Polymers - 2012. - T. 90 - № 4 - C.1811-1817.

66. Won C.-Y. Dextran-estrone conjugate: synthesis and in vitro release study / Won C.-Y., Chu C.-C. // Carbohydrate Polymers - 1998. - T. 36 - № 4 - C.327-334.

67. Snapper C.M. Dextran-Conjugated Anti-Immunoglobulin Antibodies: A Powerful Tool for Studying B Cell Receptor-Mediated Signaling / Snapper C.M. // International Journal of Immunology and Immunotherapy - 2016. - T. 3 - № 2.

68. Ulbrich K. Targeted Drug Delivery with Polymers and Magnetic Nanoparticles: Covalent and Noncovalent Approaches, Release Control, and Clinical Studies / Ulbrich K., Hola K., Subr V., Bakandritsos A., Tucek J., Zboril R. // Chemical Reviews - 2016. - T. 116 - № 9 - C.5338-5431.

69. Janson J.-C. On the history of the development of Sephadex® / Janson J.-C. // Chromatographia - 1987. - T. 23 - № 5 - C.361-365.

70. Grönwall A. The Introduction of Dextran as a Plasma Substitute / Grönwall A., Ingelman B. // Vox Sanguinis - 1984. - T. 47 - № 1 - C.96-99.

71. Odavic R. Cryoprotection of human bone marrow committed stem cells (CFU-c) by dextran, glycerol and dimethyl sulfoxide / Odavic R., Blom J., Beck E.A., Bucher U. // Experientia - 1980. - T. 36 - № 9 - C.1122-1124.

72. MacLeod G.F. Dextran in local anaesthesia. / MacLeod G.F., Wyatt R. // Annals of the Royal College of Surgeons of England - 1981. - T. 63 - № 1 - C.60-1.

73. Levesque S.G. Macroporous interconnected dextran scaffolds of controlled porosity for tissue-engineering applications / Levesque S.G., Lim R.M., Shoichet M.S. // Biomaterials - 2005. - T. 26 - № 35 - C.7436-7446.

74. Gagarskaia I.A. The effects of crowding agents Dextran-70k and PEG-8k on actin structure and unfolding reaction / Gagarskaia I.A., Povarova O.I., Uversky V.N., Kuznetsova I.M., Turoverov K.K. // Journal of Molecular Structure - 2017. - T. 1140 - C.46-51.

75. Barie N. Covalent photolinker-mediated immobilization of an intermediate dextran layer to polymer-coated surfaces for biosensing applications / Barie N., Rapp M., Sigrist H., Ache H.J. // Biosensors and Bioelectronics - 1998. - T. 13 - № 7-8 - C.855-860.

76. Laroui H. Dextran Sodium Sulfate (DSS) Induces Colitis in Mice by Forming Nano-Lipocomplexes with Medium-Chain-Length Fatty Acids in the Colon / Laroui H., Ingersoll S.A., Liu H.C., Baker M.T., Ayyadurai S., Charania M.A., Laroui F., Yan Y., Sitaraman S. V., Merlin D. // PLoS ONE - 2012. - T. 7 - № 3 - C.e32084.

77. Kothari D. Dextran and Food Application Cham: Springer International Publishing, 2014. -1-16c.

78. Zhao C. Evaluation of a novel dextran-based flocculant on treatment of dye wastewater: Effect of kaolin particles / Zhao C., Zheng H., Sun Y., Zhang S., Liang J., Liu Y., An Y. // Science of The Total Environment - 2018. - T. 640-641 - C.243-254.

79. Ferlay J. Cancer statistics for the year 2020: An overview / Ferlay J., Colombet M., Soerjomataram I., Parkin D.M., Pineros M., Znaor A., Bray F. // International Journal of Cancer -2021. - T. 149 - № 4 - C.778-789.

80. Novick P. Secretion and cell-surface growth are blocked in a temperature-sensitive mutant of Saccharomyces cerevisiae / Novick P., Schekman R. // Proceedings of the National Academy of Sciences - 1979. - T. 76 - № 4 - C.1858-1862.

81. Balch W.E. Reconstitution of the transport of protein between successive compartments of the golgi measured by the coupled incorporation of N-acetylglucosamine / Balch W.E., Dunphy W.G., Braell W.A., Rothman J.E. // Cell - 1984. - T. 39 - № 2 - C.405-416.

82. Kaiser C.A. Distinct sets of SEC genes govern transport vesicle formation and fusion early in the secretory pathway / Kaiser C.A., Schekman R. // Cell - 1990. - T. 61 - № 4 - C.723-733.

83. Perin M.S. Phospholipid binding by a synaptic vesicle protein homologous to the regulatory region of protein kinase C / Perin M.S., Fried V.A., Mignery G.A., Jahn R., Sudhof T.C. // Nature - 1990. - T. 345 - № 6272 - C.260-263.

84. Sollner T. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion / Sollner T., Whiteheart

S.W., Brunner M., Erdjument-Bromage H., Geromanos S., Tempst P., Rothman J.E. // Nature -1993. - Т. 362 - № 6418 - С.318-324.

85. Hata Y. Synaptic vesicle fusion complex contains unc-18 homologue bound to syntaxin / Hata Y., Slaughter C.A., Sudhof T.C. // Nature - 1993. - Т. 366 - № 6453 - С.347-351.

86. Thery C. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids / Thery C., Amigorena S., Raposo G., Clayton A. // Current Protocols in Cell Biology - 2006. - Т. 30 - № 1 - С.3.22.1-3.22.29.

87. Livshits M.A. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol / Livshits M.A., Khomyakova E., Evtushenko E.G., Lazarev V.N., Kulemin N.A., Semina S.E., Generozov E. V., Govorun V.M. // Scientific Reports - 2015. - Т. 5 - № 1 - С.17319.

88. Zambalova E.A. Exosomal proteases in colorectal cancer / Zambalova E.A., Patysheva M.R., Dimcha A.A., Tamkovich S.N., Grigor'eva A.E., Kolegova E.S., Kondakova I. V., Afanas'ev S.G., Yunusova N. V. // Advances in molecular oncology - 2019. - Т. 5 - № 4 - С.117-126.

89. Gareev I.F. Extraction of exosomes from glioblastoma multiforme patients' blood plasma / Gareev I.F., Beylerli O.A., Zhao S., Yang G., Sun J., Beilerli A.T., Safin S.M. // Creative surgery and oncology - 2019. - Т. 9 - № 3 - С.234-238.

90. Graham J.M. Purification of a crude mitochondrial fraction by density-gradient centrifugation / Graham J.M. // Current Protocols in Cell Biology - 1999. - Т. 4 - № 1.

91. Fang X. Highly efficient exosome isolation and protein analysis by an integrated nanomaterial-based platform / Fang X., Duan Y., Adkins G.B., Pan S., Wang H., Liu Y., Zhong W. // Analytical Chemistry - 2018. - Т. 90 - № 4 - С.2787-2795.

92. Shtam T.A. Aggregation by lectins as an approach for exosome isolation from biological fluids: Validation for proteomic studies / Shtam T.A., Burdakov V.S., Landa S.B., Naryzhny S.N., Bairamukov V.Y., Malek A. V., Orlov Y.N., Filatov M. V. // Cell and Tissue Biology - 2017. -Т. 11 - № 2 - С.172-179.

93. Deregibus M.C. Charge-based precipitation of extracellular vesicles / Deregibus M.C., Figliolini F., D'antico S., Manzini P.M., Pasquino C., Lena M. De, Tetta C., Brizzi M.F., Camussi G. // International Journal of Molecular Medicine - 2016. - Т. 38 - № 5 - С.1359-1366.

94. Zhang K. Rapid capture and nondestructive release of extracellular vesicles using aptamer-based magnetic isolation / Zhang K., Yue Y., Wu S., Liu W., Shi J., Zhang Z. // ACS Sensors -209AD. - Т. 4 - № 5 - С.1245-1251.

95. Berne B.J.Dynamic light scattering : with applications to chemistry, biology, and physics / B. J. Berne, R. Pecora - Dover Publications, 2000.- 376c.

96. Dynals software [Электронный ресурс]. URL: https://www.photocor.ru/dynals (accessed:

12.05.2018).

97. Шмидт В.Оптическая спектроскопия для химиков и биологов / В. Шмидт - Москва: Техносфера, 2007.- 368c.

98. Parekh P. Biostable ssDNA aptamers specific for Hodgkin lymphoma / Parekh P., Kamble S., Zhao N., Zeng Z., Wen J., Yuan B., Zu Y. // Sensors (Switzerland) - 2013.

99. Parekh P. Immunotherapy of CD30-expressing lymphoma using a highly stable ssDNA aptamer / Parekh P., Kamble S., Zhao N., Zeng Z., Portier B.P., Zu Y. // Biomaterials - 2013.

100. Jones R.R. Raman Techniques: Fundamentals and Frontiers / Jones R.R., Hooper D.C., Zhang L., Wolverson D., Valev V.K. // Nanoscale Research Letters - 2019. - Т. 14 - № 1 - С.231.

101. Shin H. Correlation between cancerous exosomes and protein markers based on surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) and principal component analysis (PCA) / Shin H., Jeong H., Park J., Hong S., Choi Y. // ACS Sensors - 2018. - Т. 3 - № 12 - С.2637-2643.

102. Park J. Exosome classification by pattern analysis of surface-enhanced raman spectroscopy data for lung cancer diagnosis / Park J., Hwang M., Choi B., Jeong H., Jung J.H., Kim H.K., Hong S., Park J.H., Choi Y. // Analytical Chemistry - 2017. - Т. 89 - № 12 - С.6695-6701.

103. Семчиков Ю.Д.Высокомолекулярные соединения / Ю. Д. Семчиков - Москва: Издательский центр "Академия," 2005. Вып. 2-е издани- 368c.

104. Asenjo J.A. Aqueous two-phase systems for protein separation: A perspective // J. Chromatogr. A. - 2011. - Т. 1218. - № 49. - 8826-8835с.

105. Kim J. Isolation of High-Purity Extracellular Vesicles by Extracting Proteins Using Aqueous Two-Phase System / Kim J., Shin H., Kim J., Kim J., Park J. // PLOS ONE - 2015. - Т. 10 - № 6 - Ce0129760.

106. Diamond A.D. Fundamental studies of biomolecule partitioning in aqueous two-phase systems / Diamond A.D., Hsu J.T. // Biotechnology and Bioengineering - 1989. - Т. 34 - № 7 -С.1000-1014.

107. Masimov E.A. Viscometric Determination of the Conformations and Sizes of Polyethylene Glycol Macromolecules in Aqueous Solutions / Masimov E.A., Pashayev B.G., Gasanov G.S., Gadzhieva S.N. // Russian Journal of Physical Chemistry A - 2019. - Т. 93 - № 6 - С.1054-1058.

108. Kawaguchi S. Aqueous solution properties of oligo- and poly(ethylene oxide) by static light scattering and intrinsic viscosity / Kawaguchi S., Imai G., Suzuki J., Miyahara A., Kitano T., Ito K. // Polymer - 1997. - Т. 38 - № 12 - С.2885-2891.

109. Gray H.B. Sedimentation Coefficients of Linear and Cyclic Wormlike Coils with Excluded-Volume Effects / Gray H.B., Bloomfield V.A., Hearst J.E. // The Journal of Chemical Physics -1967. - Т. 46 - № 4 - С.1493-1498.

110. Pavlov G.M. Size and average density spectra of macromolecules obtained from

hydrodynamic data / Pavlov G.M. // The European Physical Journal E - 2007. - Т. 22 - № 2 -С.171-180.

111. Павлов Г.М. Амфифильные звездообразные щетки на основе блок-сополимеров -молекулярные мицеллы для доставки лекарственных средств. Гидродинамические исследования / Павлов Г.М., Окатова О.В., Губарев А.С., Knop K., Schubert U.S. // Высокомолекулярные соединения А - 2015. - Т. 57 - № 2 - С.112-119.

112. Slyusarenko M. Formation and Evaluation of a Two-Phase Polymer System in Human Plasma as a Method for Extracellular Nanovesicle Isolation. / Slyusarenko M., Nikiforova N., Sidina E., Nazarova I., Egorov V., Garmay Y., Merdalimova A., Yevlampieva N., Gorin D., Malek A. // Polymers - 2021. - Т. 13 - № 3 - С.458-472.

113. Diamond A.D. Phase diagrams for dextran-PEG aqueous two-phase systems at 22°C / Diamond A.D., Hsu J.T. // Biotechnology Techniques - 1989. - Т. 3 - № 2 - С.119-124.

114. Zaslavsky B.Y.Aqueous Two-Phase Partitioning - Physical Chemistry and Bioanalytical Applications / B. Y. Zaslavsky - New York: Wiley-Blackwell, 1994.- 711c.

115. Rocha M.V. Molecular features determining different partitioning patterns of papain and bromelain in aqueous two-phase systems / Rocha M.V., Nerli B.B. // International Journal of Biological Macromolecules - 2013. - Т. 61 - С.204-211.

116. Litmanovich E.A. The problem of bimodal distributions in dynamic light scattering: Theory and experiment / Litmanovich E.A., Ivleva E.M. // Polymer Science Series A - 2010. - Т. 52 - № 6 - С.671-678.

117. Takov K. Comparison of small extracellular vesicles isolated from plasma by ultracentrifugation or size-exclusion chromatography: yield, purity and functional potential / Takov K., Yellon D.M., Davidson S.M. // Journal of Extracellular Vesicles - 2019. - Т. 8 - № 1

- С.1560809.

118. Nikiforova N. CM-Dil Staining and SEC of Plasma as an Approach to Increase Sensitivity of Extracellular Nanovesicles Quantification by Bead-Assisted Flow Cytometry / Nikiforova N., Chumachenko M., Nazarova I., Zabegina L., Slyusarenko M., Sidina E., Malek A. // Membranes

- 2021. - Т. 11 - № 7 - С.526.

119. Sorop A. Plasma Small Extracellular Vesicles Derived miR-21-5p and miR-92a-3p as Potential Biomarkers for Hepatocellular Carcinoma Screening / Sorop A., Iacob R., Iacob S., Constantinescu D., Chitoiu L., Fertig T.E., Dinischiotu A., Chivu-Economescu M., Bacalbasa N., Savu L., Gheorghe L., Dima S., Popescu I. // Frontiers in Genetics - 2020. - Т. 11.

120. Emelyanov A. Cryo-electron microscopy of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid / Emelyanov A., Shtam T., Kamyshinsky R., Garaeva L., Verlov N., Miliukhina I., Kudrevatykh A., Gavrilov G., Zabrodskaya Y., Pchelina S., Konevega A. // PLOS ONE - 2020. - Т. 15 - № 1

- C.e0227949.

121. Konoshenko M. Total Blood Exosomes in Breast Cancer: Potential Role in Crucial Steps of Tumorigenesis / Konoshenko M., Sagaradze G., Orlova E., Shtam T., Proskura K., Kamyshinsky R., Yunusova N., Alexandrova A., Efimenko A., Tamkovich S. // International Journal of Molecular Sciences - 2020. - T. 21 - № 19 - C.7341.

122. Kadiu I. Biochemical and Biologic Characterization of Exosomes and Microvesicles as Facilitators of HIV-1 Infection in Macrophages / Kadiu I., Narayanasamy P., Dash P.K., Zhang W., Gendelman H E. // The Journal of Immunology - 2012. - T. 189 - № 2 - C.744-754.

123. Atkins C.G. Raman spectroscopy of blood and blood components / Atkins C.G., Buckley K., Blades M.W., Turner R.F.B. // Applied Spectroscopy - 2017. - T. 71 - № 5 - C.767-793.

124. Slyusarenko M. AuNP Aptasensor for Hodgkin Lymphoma Monitoring / Slyusarenko M., Shalaev S., Valitova A., Zabegina L., Nikiforova N., Nazarova I., Rudakovskaya P., Vorobiev M., Lezov A., Filatova L., Yevlampieva N., Gorin D., Krzhivitsky P., Malek A. // Biosensors - 2022.

- T. 12 - № 1 - C.23-42.

125. Lin W. Introduction: Nanoparticles in Medicine / Lin W. // Chemical Reviews - 2015. - T. 115 - № 19 - C.10407-10409.

126. Mitchell M.J. Engineering precision nanoparticles for drug delivery / Mitchell M.J., Billingsley M.M., Haley R.M., Wechsler M.E., Peppas N.A., Langer R. // Nature Reviews Drug Discovery - 2021. - T. 20 - № 2 - C.101-124.

127. Tsekhmistrenko S.I. Enzyme-like activity of nanomaterials / Tsekhmistrenko S.I., Bityutskyy V.S., Tsekhmistrenko O.S., Polishchuk V.M., Polishchuk S.A., Ponomarenko N. V., Melnychenko Y.O., Spivak M Y. // Regulatory Mechanisms in Biosystems - 2018. - T. 9 - № 3 - C.469-476.

128. Liu L. Nanomaterials-Based Colorimetric Immunoassays / Liu L., Hao Y., Deng D., Xia N. // Nanomaterials - 2019. - T. 9 - № 3 - C.316.

129. Liu X. Peroxidase-Like Activity of Smart Nanomaterials and Their Advanced Application in Colorimetric Glucose Biosensors / Liu X., Huang D., Lai C., Qin L., Zeng G., Xu P., Li B., Yi H., Zhang M. // Small - 2019. - T. 15 - № 17 - C.1900133.

130. Lakhin A. V. Aptamers: Problems, solutions and prospects // Acta Naturae. - 2013. - T. 5. -№ 19. - 34-43c.

131. Adachi Aptamers: A Review of Their Chemical Properties and Modifications for Therapeutic Application / Adachi, Nakamura // Molecules - 2019. - T. 24 - № 23 - C.4229.

132. Zhang Y. Recent Advances in Aptamer Discovery and Applications / Zhang Y., Lai B., Juhas M. // Molecules - 2019. - T. 24 - № 5 - C.941.

133. Hassani S. A sensitive aptamer-based biosensor for electrochemical quantification of PSA as a specific diagnostic marker of prostate cancer / Hassani S., Maghsoudi A.S., Akmal M.R.,

Rahmani S., Sarihi P., Ganjali M.R., Norouzi P., Abdollahi M. // Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences - 2020. - T. 23.

134. Li Q. Rapid and specific detection nanoplatform of serum exosomes for prostate cancer diagnosis / Li Q., Wang Y., Ling L., Qiao L., Chen H., Ding C., Yu S. // Microchimica Acta -2021. - T. 188 - № 8 - C.283.

135. Savory N. Selection of DNA aptamer against prostate specific antigen using a genetic algorithm and application to sensing / Savory N., Abe K., Sode K., Ikebukuro K. // Biosensors and Bioelectronics - 2010. - T. 26 - № 4.

136. Xia Y. A visible and colorimetric aptasensor based on DNA-capped single-walled carbon nanotubes for detection of exosomes / Xia Y., Liu M., Wang L., Yan A., He W., Chen M., Lan J., Xu J., Guan L., Chen J. // Biosensors and Bioelectronics - 2017. - T. 92 - C.8-15.

137. Zhu C. Recent advances of aptasensors for exosomes detection / Zhu C., Li L., Wang Z., Irfan M., Qu F. // Biosensors and Bioelectronics - 2020. - T. 160 - C.112213.

138. Barnett C.E. Some Applications of Wave-length Turbidimetry in the Infrared. / Barnett C.E. // The Journal of Physical Chemistry - 1942. - T. 46 - № 1 - C.69-75.

139. Connors J.M. Hodgkin lymphoma / Connors J.M., Cozen W., Steidl C., Carbone A., Hoppe R.T., Flechtner H.-H., Bartlett N.L. // Nature Reviews Disease Primers - 2020. - T. 6 - № 1 -C.61.

140. Demina E.A. Hodgkin's lymphoma / Demina E.A., Tumyan G.S., Moiseeva T.N., Mikhailova N.B., Myakova N. V., Rumyantsev A.G., Maschan A.A., Kaplanov K.D., Shmakov R.G., Falaleeva N.A., Ptushkin V. V., Osmanov E.A., Poddubnaya I. V., Baikov V. V., Kovrigina A.M., Konovalov D.M., Trofimova O.P., Sotnikov V.M., Ilin N. V., Vinogradova Y.N., Nechesnyuk A. V., Parkhomenko R.A., Stefanov D.N., Nevolsky A.A., Ivanov S.A., Khaylova Z. V. // Journal of Modern Oncology - 2020. - T. 22 - № 2 - C.6-33.

SAINT PETERSBURG STATE UNIVERSITY

Manuscript Copy

Slyusarenko Maria Alexandrovna

Biphasic PEG-dextran polymer system and its interaction mechanisms with vesicular

components of blood plasma

Scientific specialization 1.4.7. Macromolecular compounds

Thesis for the degree of candidate physical and mathematical sciences

Translation from Russian

Scientific supervisor: Candidate of physical and mathematical sciences Associate Professor N.P. Yevlampieva

St. Petersburg 2022

Table of Content

List of abbreviations..................................................................................................................116

Introduction...............................................................................................................................117

Chapter 1 Literature review.....................................................................................................122

1.1. Two-Phase Polymer Systems........................................................................................122

1.2. The main theoretical models for describing the fractionation of substances by two-phase polymer systems......................................................................................................................123

1.2.1. Polyethylene glycol....................................................................................................129

1.2.2. Dextran.......................................................................................................................130

1.3. Extracellular nanovesicles and their role in liquid biopsy............................................132

Chapter 2 Description of Experimental Methods...................................................................134

2.1. Dynamic Light Scattering.................................................................................................134

2.2. Nanoparticle tracking analysis (NTA)..............................................................................135

2.3. Spectrophotometry............................................................................................................137

2.4. Raman scattering of light..................................................................................................138

2.5. Atomic force microscopy (AFM).....................................................................................139

2.6. Transmission electron cryogenic microcopy (cryo-TEM)................................................140

2.7. Static light scattering........................................................................................................141

2.8. Viscometry........................................................................................................................142

2.9. Flow Cytometry, Dot Blot and Bradford Protein Analysis..............................................144

Chapter 3. Mechanisms of interaction between the two-phase polymer system PEG-dextran and blood plasma components .................................................................................................146

3.1. Hydrodynamic properties of PEG and dextran.................................................................146

3.2. Optimization of PEG-Dextran TTPS for Plasma Vesicle Isolation..................................156

3.3. Study of complexation between PEG and plasma components by DLS..........................172

3.4. Study of complexation between dextran and plasma components by DLS......................176

3.5. Analysis of the properties of particles of the lower phase of blood plasma when using TTPS 66..........................................................................................................................................................184

3.6. Chapter 3 Conclusions......................................................................................................190

Chapter 4 Practical application of isolated SEV for analysis of the composition of their surface proteins..........................................................................................................................192

4.1. Study of Changes in Absorption Spectra and Size Distributions of Gold Nanoparticles upon Their Modification..........................................................................................................193

4.2. Study of complex formation between Au -NP- CD 63 and SEV by DLS and spectrophotometry...................................................................................................................196

4.3. An example of using the system in solving a clinical problem of monitoring the effectiveness of monitoring the treatment of Hodgkin's lymphoma........................................200

4.4. Conclusions of chapter 4...............................................................................................206

Conclusions................................................................................................................................207

The main content of the dissertation is reflected in the following publications:.................208

Acknowledgments......................................................................................................................210

References...................................................................................................................................211

List of abbreviations

Au - NP - gold nanoparticles

Au - NP - A - gold nanoparticles modified with an aptamer

Au - NPs - CD63/CD30 - gold nanoparticles modified with an aptamer to the CD63/CD30 protein

AFM - atomic force microscopy NTA - nanoparticle trajectory analysis BSA - bovine serum albumin SEV - extracellular nanovesicles UP 1, 2 - upper phase 1, 2 LP1, 2 - lower phase 1, 2 DNA - deoxyribonucleic acid TTPS - two-phase polymer system DLS - dynamic light scattering MM - molecular weight NP - nanoparticles

Cryo-TEM - cryogenic transmission electron microscopy

Raman scattering of light

HL - Hodgkin's lymphoma

CS - cleaning solution

CCD - Charge Coupled Device

PEG - polyethylene glycol

TEM - transmission electron microscopy

PET-CT - positron emission tomography combined with computed tomography

SLS - static light scattering

TMB - tetramethylbenzidine

UC - ultracentrifugation

EMA - enzyme-mimetic activity

PBS - phosphate buffer saline

CT - chemotherapy

EM - electron microscopy

Introduction

The dissertation work is devoted to the study of a two-phase polymer system based on dextran and polyethylene glycol and the mechanisms of its interaction with vesicular objects in multicomponent biological fluids in order to isolate them.

Two-phase polymer systems (TTPS) are a combination of two thermodynamically incompatible polymers in one solvent. The use of such systems for fractionation or purification is not associated with high costs if their phase separation is observed in the region of low polymer concentrations. A directed selection of the TTPS parameters makes it possible to concentrate the released substance in the upper or lower phase of the system, or at the interface. However, the formation of a phase enriched in an isolated object depends on many factors, including the TTPS parameters, which primarily include the molecular mass (MM), quantitative ratio, and concentration of polymers in solution. At present, the use of TTPS for the isolation/separation of nanoscale bio-objects is limited by the insufficient understanding of these processes, if this is not an affine interaction, which necessitates a long-term experimental selection of the optimal parameters of the TTPS and the conditions for its use. The lack of understanding of the mechanisms of interaction between TTPS components and separation objects under critical or close to them conditions is the main obstacle to the use of TTPS not only on a laboratory scale, so the study of TTPS and the patterns of their functioning is relevant and has a high practical significance.

Of particular relevance is the study of TTPS, which can be used for analytical purposes in medicine. Such a system is TTPS polyethylene glycol-dextran (PEG-dextran), which consists of biocompatible, non-toxic and commercially available polymers. Despite the fact that there are publications in the literature on the successful application of this TTPS for the separation of biological objects [1-6], there are still no criteria that could be relied upon when choosing such important TTPS parameters as the MW of its constituent polymers or their quantitative ratio. The same applies to the choice of conditions for using the PEG-dextran system for the isolation of biological objects: temperature, pH, ionic strength, and composition of low molecular weight ions.

The study of TTPS, which can be used for analytical purposes in medicine, is especially relevant. Such a system is TTPS polyethylene glycol-dextran (PEG-dextran), which consists of biocompatible, non-toxic and commercially available polymers. The components of this TTPS belong to different classes: PEG is a linear synthetic polymer, dextran is a polysaccharide, predominantly a(1^6) polyglucan. Despite the fact that there are publications in the literature on the successful application of this TTPS for the separation of bio-objects, so far there are no criteria that could be relied upon when choosing the TTPS parameters. The same applies to the choice of

conditions for using the PEG-dextran system to isolate bio-objects: temperature, pH, ionic strength, and composition of low molecular weight ions.

This work is devoted to the study of the interaction of TTPS PEG-dextran with components of human blood plasma in conditions of proximity to the bimodal of the system. Mammalian blood plasma is a multicomponent biological fluid containing proteins, nucleic acids, extracellular vesicles, lipids, vitamins, and other components (eg, glucose, salts, etc.). Plasma is a universal object for studying the mechanisms of interaction of PEG-dextran TTPS with biological micro-and nano-objects of different structure, differing in their physical and biochemical properties. Extracellular nanosized plasma vesicles (SEV), like larger vesicles, consist of a membrane shell with certain sets of proteins located on its surface, depending on the composition of the cells that produced them, as well as internal filling with proteins, lipids, and nucleic acids. The main function of the SEV in the body is associated with the implementation of intercellular exchange [7]. The term SEV is used in this work for vesicles with sizes from 30 to 150 nm. SEV of such sizes have a high diagnostic potential in oncology, which has not yet been realized due to the lack of reliable methods for their isolation and analysis, which indicates the practical significance of this work. To isolate SEV from plasma, either multi-stage ultracentrifugation or special chromatographic separation is currently used, which is laborious and quite expensive. The phenomenon of SEV extraction from blood plasma using TTPS has not been studied in detail.

The relevance of this study is related to the study of the physical properties of the PEG-dextran two-phase polymer system, the mechanisms of its interaction with bioobjects of multicomponent media, and the specification of the choice of its parameters for the isolation of SEV. The method proposed in this work for the isolation of plasma SEV, as well as the analysis of surface proteins, are of practical importance for realizing new opportunities in the early diagnosis of oncological diseases. This work is devoted to the study of the interaction of TTPS PEG-dextran with components of human blood plasma in conditions of proximity to the bimodal of the system. Mammalian blood plasma is a biological fluid containing proteins, nucleic acids, extracellular vesicles, lipids, vitamins and other components (eg glucose, salts, etc.). Plasma is a universal object for studying the mechanisms of interaction of PEG-dextran TTPS with biological micro- and nano-objects of different structure, differing in their physical and biochemical properties. Extracellular nanosized plasma vesicles, like larger vesicles, consist of a membrane shell with a set of proteins located on its surface, depending on the composition of the cells that produced them, as well as internal filling with proteins, lipids, and nucleic acids. The main function of the SEV in the body is associated with the implementation of intercellular exchange. The term SEV is used in this work for vesicles with sizes from 30 to 150 nm. SEV of such sizes have a high diagnostic potential in oncology, which has not yet been realized due to the lack of reliable

methods for their isolation and analysis, which indicates the practical significance of this work. To isolate SEV from plasma, either multi-stage ultracentrifugation or special chromatographic separation is currently used, which is laborious and quite expensive. The phenomenon of SEV extraction from blood plasma using TTPS has not been studied in detail.

The relevance of this study is associated not only with the study of the physical properties of the two-phase polymer system PEG-dextran during its interaction with biological objects of a multicomponent environment, but also with the specification of the choice of its parameters for the isolation of the SEV plasma. The proposed method for the isolation of SEV, as well as the method for analyzing surface proteins, are of practical importance for realizing new opportunities in the early diagnosis of oncological diseases.

The aim of the work was to analyze the hydrodynamic properties of the components of the dextran-polyethylene glycol biphasic polymer system (TTPS), use it to extract extracellular plasma nanovesicles (ECVs), and determine the criteria for selecting the TTPS parameters for the isolation of vesicular objects that are not based on affinity principles.

The methods of dynamic light scattering in solutions, nanoparticle tracking analysis (NTA), spectrophotometry, cryoelectron microscopy, Raman spectroscopy, static light scattering, densitometry, viscometry, flow cytometry, dot blotting are used in the work. The main conclusions of the work are based on the study of the complexation of biological objects with TTPS polymers by analyzing the particle size distributions in solutions. The details of the interaction are studied by spectral methods. The tasks of the work were:

6. Determination of molecular mass (MM), hydrodynamic and conformational characteristics of dextran and polyethylene glycol (PEG) samples in phosphate-buffered saline;

7. Determination of the most effective conditions for the isolation of extracellular nanovesicles (SEV) from blood plasma by analyzing particle size distributions during its fractionation using two-phase systems (TTPS) composed of dextran and PEG of various MM with varying polymer concentrations;

8. Study of the mechanisms of interaction of TTPS components with blood plasma components by spectral methods and the ATN method;

9. Determination of criteria for selecting TTPS parameters for the allocation of SEV and other biological objects based on hydrodynamic parameters;

10. Investigation of the diagnostic potential of SEV using aptamer-modified nanoparticles as test systems for the detection and analysis of extracellular vesicles.

The scientific novelty of the work is as follows:

5. For the concentration of vesicular objects of given sizes that do not interact in affinity with the TTPS components of PEG-dextran, the ratio of the hydrodynamic volumes of the TTPS components is important. This parameter was proposed as a criterion for selecting the composition of TTPS for the isolation of SEV from blood plasma;

6. The equality of the values of intrinsic viscosity of the TTPS components in the aqueous environment is also a hydrodynamic criterion for identifying biological objects that do not interact affinely with the TTPS components;

7. The PEG-20 kDa/dextran-500 kDa system is highly efficient for isolating SEV;

8. Isolation of SEV ~50 nm in size from blood plasma by using TTPS PEG-dextran, can be used to analyze their surface proteins. This fact is demonstrated by using a test system based on aptamer-modified gold nanoparticles for solving the specific clinical problem.

Scientific and practical significance of the work is related to the determination of the criteria for selecting the parameters of PEG-dextran TTPS for fractionation of vesicular objects with its help, the study of the processes of sedimentation, aggregation and complexation in the PEG-dextran polymer system when mixed with blood plasma components, as well as the study of test systems for SEV based on modified gold nanoparticles. Received a patent for the method of isolation of SEV "Method for isolation of exosomes from blood plasma" number: RU2741776C1. Also, materials for a patent were prepared and a priority certificate was received for the method of analysis of SEV protein markers in blood plasma to monitor the effectiveness of the treatment of Hodgkin's lymphoma, reference number: 2021123297/14. The results of the work are also of interest from the point of view of fundamental research on the properties of TTPS and their interaction with biopolymer objects; they can be included in basic university courses in the specialty "High-molecular compounds" and courses on the biomedical application of polymers. The statements to be defended:

7) For efficient isolation of bioobjects that do not form complexes with TTPS polymers using TTPS, apart from thermodynamic ones, important criteria for selecting TTPS parameters are the hydrodynamic characteristics of TTPS components: intrinsic viscosity, hydrodynamic volume and size, hydrodynamic density (density in solution);

8) The criterion of similarity of the inherent viscosity of the TTPS components in an aqueous solvent makes it possible to separate vesicular particles larger in size than TTPS polymers due to their displacement and sedimentation under the action of gravity;

9) The molecular weight of PEG in TTPS is an important factor that contributes to the concentration of plasma proteins in the upper phase due to their complexation with PEG, which ultimately leads to the concentration of SEV in the lower phase of the system after its separation;

10) Dextran is inert with respect to plasma proteins and SEV and plays the role of a filler that regulates the viscosity of the plasma-TTPS system and the Peclet parameter, which is responsible for the balance of particles of different sizes suspended in solution;

11) TTPS PEG-dextran makes it possible to isolate SEV of blood plasma with high efficiency, which is expressed in a high concentration of released nanovesicles (~ 2-1011 particles / ml from 1.5 ml of plasma) and residual amounts of dextran and PEG, not detected by Raman spectroscopy;

12) Aptamer-modified gold nanoparticles are an effective tool for the analysis of surface SEV proteins isolated from blood plasma.

Approbation of the work: The main results of the work were reported and discussed at 7 Russian and international conferences.

Publications: Based on the materials of the dissertation, 2 articles were published in peer-reviewed foreign journals indexed in Web of Science and Scopus, and received two patents. The personal contribution of the author consisted in planning experimental work, preparing solvents, polymer solutions, and biological objects, conducting research using viscometry, dynamic light scattering, densitometry, absorption spectroscopy, cryogenic electron microscopy, nanoparticles tracking analysis, dot blotting, flow cytometry, dynamic light scattering, as well as in the preparation of articles for publication and the preparation of reports on the results of research.

Structure and scope of work: The dissertation consists of an introduction, a literature review (chapter 1), a description of research methods (chapter 2), two sections (chapters 3 and 4), where the results of research, conclusions and a list of references (140 titles) are discussed. The work is presented on 109 pages (in English), contains 59 figures and 6 tables.

Chapter 1 Literature review

It was already mentioned in the introduction that phase separation is a feature of the physical properties of polymer-polymer systems used to isolate biological objects from mixtures. Let us consider some examples of the application of two-phase polymer systems and the theoretical principles of their description.

1.1.Two-Phase Polymer Systems

For the first time, the separation of polymer mixtures in solution into two phases was shown for natural polymers - agar and gelatin [8]. Later, the possibility of using this phenomenon to isolate the components of biological fluids and solve problems in analytical chemistry was shown [9]. Subsequently, the possibilities of separating biological molecules in two-phase aqueous solutions due to intermolecular interactions of various nature were described: van der Waals, electrostatic and hydrophobic [10].

In solutions of two thermodynamically incompatible polymers in one solvent in a certain range of concentrations, phase separation is possible even at low concentrations.

To describe this phenomenon, phase diagrams are used, which reflect the concentration regions of coexistence and separation of a mixture of polymers into several polymer phases. An illustration of such a phase diagram is shown in Figure 1.2.1. According to this diagram, the greater the concentration of the polymer of the lower phase, the greater the volume of this phase.

CI

AX

Polymer concentration at bottom phase

Figure 1.2.1. An example of a phase diagram for a two-phase polymer system [11].

This phenomenon is explained by the entropy effect, but only partially. The free energy of mixing AFc is related to the enthalpy of mixing AHcand the entropy of mixing ASc by the equation

The entropy of mixing of two polymers is always lower compared to the entropy of mixing of the same amount of their monomer units [12, 13]. Thus, even a small positive enthalpy of mixing is sufficient to prevent mixing. To fulfill this condition, a small difference between the two polymeric compounds is sufficient. Moreover, the higher the MM of polymers, the lower concentrations can lead to phase separation.

1.2. The main theoretical models for describing the fractionation of substances by two-phase polymer systems

For a theoretical description of the function of two-phase systems as a separator, it is customary to use the separation coefficient of a low molecular weight substance in the system, which is equal to the ratio of the concentrations of the substance to be separated in the first and second phases, which are formed by each of the components in the solution. Bronsted noted that the higher the molecular weight of the substance to be separated (provided that other factors are preserved), the more pronounced will be the concentration of the substance in one phase [14]:

where c1 and c2 are the concentrations of the substance to be separated in the upper and lower

phases, respectively, M is the molecular weight of the substance to be fractionated, a is a constant characteristic of the pair - two-phase system/separate substance, R is the universal gas

constant, T is the temperature

Experiments on the fractionation of macromolecules confirmed Bransted's theory. This concept is also suitable for describing the fractionation of large particles, including particles with sizes of the order of cellular ones. The molecular weight in formula (1.2.2) can be replaced by the surface area of the particles. For fractionation of proteins, a biphasic system must be chosen such that would give a separation factor of the order of unity, and for cells such a factor should be either zero or infinity. For the absolute separation of two types of particles in a two-phase system, it is

AFc = AHc- AS,

c

c

(111)

(12.2)

required that the coefficients a in formula (1.2.2) have opposite signs. During the distribution of substances between phases, adsorption of the substance in the interphase can also be observed. The theoretical description of this phenomenon was given by Quincke [15]and De Korda [16], and the experimental study was carried out by Hoffmann and Reinders on powders of insoluble inorganic salts in water-organic solvent systems [17]. The theory is based on the concepts of surface free energy per unit area of a particle in the first phase 71, in the interphase 712 and in the second phase 72 . Neglecting gravity, if the energy difference 71 -72 is greater than 712, then the particles will be concentrated in the second phase, if 72 -71 > 712, then the particles will be in the first phase, and if 71 -72 <712, then the particles will be adsorbed in the interphase. If we add gravity to the consideration and consider particles that are denser than phases, then the particles will rush down under the action of a force that depends on the size and density of the particle, as well as the density of the two phases. In the case when the force of gravity is compensated by the vertical component of the force, which depends on 7 12 and the width of the interphase, the particles remain in the interphase.

According to the Albertson theory [18] Five types of driving factors have been identified for the fractionation of matter in TTPS: (1) size, i.e. when the particles are separated by size or surface area; (2) electrochemical; (3) hydrophobic interactions; (4) biospecific affinity; (5) conformational interactions and other factors taken into account by the coefficient. Since each type of interaction makes a contribution during separation, a superposition of acting factors arises that influences the result of fractionation of particles using two-phase systems. Such a state can be described by the equation [18]:

ln(^) = \n(Ksize) + 1n(^elrctrochemical) + 1n(^hydrophobic) + 1n(^a//inity) +

1n(K0) (1.2.3)

In his theory, Albertsson showed the effect of the MM of TTPS polymers on the size of the deposited particles, which opened up the possibility of size fractionation of proteins [19]. Albertsson obtained the [18]:

-log(K) = aM2/3, (1.2.4)

where a is a coefficient depending on the polymer concentration, M is the molecular weight of

the precipitated protein

According to Johanson [20], the separation coefficient can be represented as the sum of two components depending on: (1) the relative solvation of the separated particles in phases, taking into account the concentration and molecular weight of polymers, (2) the particle charge (depending on the pH of the medium) and the interaction of particles with two phases (depending on ionic strength). Johanson also states that compounds with lower MW, which are soluble in both parts of the TTPS, are distributed between the phases more evenly.

Cabezas [21]considered more than five thermodynamic models and applied the approach of statistical thermodynamics to describe the processes occurring during particle fractionation in two-phase systems. The model using the virial expansion of the equation of state (in terms of osmotic pressure) turned out to be the most successful. This model was studied by other authors who applied the theory of Edmond and Ogston and proposed the following equation for the separation factor [22]:

/ \ / \ Z'FA^

ln(^) = Au[[Pi]up - [Pi]bottom) - ^2i([^2]up - [^bottom) + 'w , (12 5) where K is the separation constant, [ P i ] is the concentration of the i -th polymer in the upper and lower phases (i = 1;2); Aij is the second virial coefficient; z i is the charge of the i -th polymer, ¥is the electric potential, F is the Faraday constant

Diamond and Hsu proposed an approach based on the theory of Flory and Huggins [4]. They were able to derive an empirical expression for the PEG/dextran system for separating low and high molecular weight proteins.

ln(K)

= A + b([Pi]up - [Pi]bottom), (1.2.6)

[pl]up- [pl]bottom

where P1 is the PEG concentration in the phase, A is the coefficient that takes into account the MM of polymers and proteins; the charge of proteins, the interaction of proteins with water, polymers and other protein molecules; pH; electrostatic difference between two phases; salt type and concentration, b - coefficient taking into account MM and charge of proteins; polymer-water interaction; the difference in electrostatic potential between phases and the type of salt and its

concentration

The theory of Diamond and Hsu [4]found good agreement with experimental data. Formula 1.2.6 is valid only for the intermediate range of the polymer concentration difference between the

phases, since at the critical point, the PEG concentrations in the upper and lower phases become equal, and their difference tends to zero.

The result of fractionation of particles/biological objects in two-phase systems is affected by the MM of the polymers used, pH, ionic strength, charge, temperature, and interfacial surface tension.

The processes of convection and sedimentation play an important role in phase separation. To describe the processes of sedimentation of particles in a solution in a normal gravity field, one can use the Peclet parameter, transposed for diffusion and sedimentation processes [23]. In the original version of Peclet's theory, this parameter is a similarity criterion that characterizes the relationship between convective and molecular (diffusion) processes of heat transfer in a fluid flow [24]. The larger this parameter, the stronger convection processes prevail over diffusion ones [25]. For example, the work [26]shows the effect of the system viscosity on the emulsion stability, which indirectly indicates a possible relationship between the stability of particles in a solvent and the viscosity of this solvent. To describe the dependence of the rate of deposition of hard spheres of equal size on their volume fraction, there is the Batchelor equation for the region of dilute solutions 1.2.7 [27]:

U = U0(1-6,55<p+..), (1.2.7)

where U is the sedimentation rate,U0 = 2ApgR/9^ is the settling rate according to the Stokes law for particles in infinite dilution, Ap is the density difference between particles and solvent, gis the acceleration due to gravity, ^ is the viscosity of the solvent, 0 is the volume fraction of

particles

Experimental confirmation of dependence 1.2.7 was made for polystyrene particles in an organic solvent and is represented by equation 1.2.8 [28]:

U = U0(1-k<p1/3+..), (1.2.8)

where k ~ 2.8, U is the sedimentation rate, U 0 is the sedimentation rate according to the Stokes

law, 0 is the volume fraction of particles

In [28] authors explain the change in the concentration dependence of the sedimentation rate by the appearance of the Coulomb interaction between charged particles. Particles try to be in the most remote positions from other particles, thereby forming a certain order in the system. If we consider a system with ordered spheres in solution, then dependence 1.2.7. will take the form

U = U0(1-k$1/2+..), (1.2.9)

where k is a constant depending on the crystal structure, U is the sedimentation rate, Uo is the sedimentation rate according to the Stokes law, ^ is the volume fraction of particles

The change in dependence 1.2.7 in equations 1.2.8 and 1.2.9 when ordering occurs, the authors of

[28] explain the "switching off' of the Brownian motion.

The Peclet parameter for sedimentation and diffusion processes can be represented as a ratio

k t

U0 and diffusion coefficient from the Stokes-Einstein equation D0 = —- [23]:

6nn R

Pe = R—, (1.2.10)

Do

where Pe is the Peclet parameter, R is the particle radius, k b is the Boltzmann constant, n is the

viscosity of the solvent, T is the temperature

Also, this parameter can be expressed as a product of Reynolds numbers Re and Schmidt Sc [29]:

Pe = Re • Sc, (1.2.11)

The parameters, Reand Sc, are expressed in terms of the system parameters as follows [30]:

Re = IZHsc = (1.2.12)

% ' P-D' V 7

where Reis the Reynolds number, Scis the Schmidt number, n0 is the viscosity of the solvent, D is the coefficient of translational diffusion, l is the average linear size, pis the density of the

solvent, Uis the sedimentation rate of particles

Taking into account relations 1.2.11 and 1.2.12, the Peclet parameter can be written in the following form:

Pe = i2:H.:i<L=6nn0R-, (1.2.13)

n0 pD 10 KT V '

where Re is the Reynolds number, Scis the Schmidt number, n0is the viscosity of the solvent, D is the coefficient of translational diffusion, lis the average linear size, p is the density of the solvent, U is the sedimentation rate of particles

According to the Stokes law, the sedimentation rate of particles can be determined by expression 1.2.14 [31, 32]:

4 o

U = gVAp = g^R 'AP ~ (12 14)

6nnoR 6nnoR no '

where g is the gravitational acceleration, is Vthe volume of deposited particles, no is the viscosity of the solvent, Ap is the difference between the densities of the particles and the solvent, R is the radius of the deposited particles in the spherical approximation

Thus, according to relation 1.2.14, the particle settling rate is inversely proportional to the viscosity of the solvent, and proportional to the square of the radius of the deposited particles and the difference in particle and solvent densities. Therefore, changing the ratio of these parameters by adjusting the viscosity of the solvent leads to a change in the sedimentation rate for particles of different sizes. Which, in turn, upsets the balance between diffusion and sedimentation processes for particles. That is, the higher the Peclet parameter, the greater the influence of sedimentation processes.

The general recommendation, which can be singled out on the basis of theoretical and experimental literature data on the interaction of TTPS with a separable substance that is not based on affinity, is the following provision: the criterion for choosing TTPS for a specific purpose should be the inertness of TTPS polymers with respect to fractionated particles. In addition, parameters such as water content, ionic strength, osmotic pressure, fractionate solubility, denaturing effect, and the like must be adjusted. The interfacial tension must also be taken into account. Even if the fractionation is successful, expressed in the concentration of particles in one of the phases, undesirable phenomena may appear, such as stable complexation or precipitation of other substances during the separation of multicomponent systems in TTPS. Those. these are rather qualitative than quantitative recommendations, forcing to carry out numerous preliminary studies to select the TTPS parameters for solving a specific problem.

In this work, two-phase polymeric systems dextran - polyethylene glycol for blood plasma fractionation are studied in order to isolate such diagnostically significant objects as SEV (see subsection 1.2). The possibility of using the phenomenon of phase separation of a mixture of dextran and polyethylene glycol to isolate SEV was shown relatively recently [33, 34]. The authors [34]isolated extracellular vesicles from urine, as stated, with 100% efficiency, which means complete recovery of vesicles from the sample. In [17], a two-phase PEG system with an MW of

1.2.1. Polyethylene glycol

Polyethylene glycol (PEG) is a biocompatible, synthetic, hydrophilic polyester compound that has many applications, mainly in the medical and pharmaceutical industries, as well as in the chemical industry. The chemical structure of PEG is shown in Figure 1.2.2. Often it is given in the form of the formula H- (O-CH2-CH2) n-OH, where n is the degree of polymerization.

PEG is a linear synthetic polymer. Its synthesis is carried out by polymerization of ethylene oxide with heterocycle opening [35]. This synthesis method makes it possible to obtain PEG with various molecular masses (MM) and molecular weight distributions. The commercial availability of PEG over a wide MW range makes it suitable for a variety of applications.

PEG is a non-toxic inert non-volatile compound, which explains the wide possibilities of using this polymer in medicine [36] It is odorless and colorless. In addition, it has high solubility in water and in organic solvents such as benzene, carbon tetrachloride and chloroform [37]. The number of its applications continues to grow [38].

In practical medicine, PEG is used as a component of laxatives [39], PEG is also used in many pharmaceutical creams, ointments and medical diluents [40]. Peptides, proteins or oligonucleotides are drug targets for various diseases. PEG can be used for bioconjugation to the target by binding to the target molecule to optimize the pharmacokinetic properties of the drug

PEG hydrogels are polymer networks that are created by crosslinking reactive PEG end groups, resulting in gels that are resistant to biodegradation and protein adhesion. These PEG properties are useful for both tissue engineering and targeted drug delivery [42, 43].

Protein analysis is another biomedical field in which PEG is used in several applications. PEG is used as a precipitant for DNA isolation [44]and also for cell crystallization, helping to reveal the atomic structure of proteins [45] PEG is used as a cryoprotectant for the storage of cellular enzymes [46]. In gene therapy, PEG is used to coat gene vectors [47]and form complexes with

n

Figure 1.2.2. Structural formula of polyethylene glycol

[41].

antigens and antibodies [48]. One of the latest studies in the field of PEG in medicine is the study of how PEG can be used for damage to the spinal cord and peripheral nerves, using it to fuse damaged axons [49]. PEG is also well known for its use as a binder and dispersant because it can improve particle separation and prevent sticking [50]. It is used in conservation tasks, as it is able to prevent and slow down damage and shrinkage of wood immersed in water [51].

The listed applications of PEG indicate that this synthetic polymer easily interacts with biological objects of various types, from individual molecules to cells. 1.2.2. Dextran

Unlike synthetic PEG, dextran is a natural polymer, a polysaccharide. Dextran, like PEG, has found wide application in medicine, pharmacology and many other branches of human activity. It is a branched polymer of glucose with an average chain mass of 3 to 20,000 kDa. The monomers of the main polymer chain are connected through an a-1,6 bond, and the side branch units are attached through a-1,3 bonds (Figure 1.2.3). The degree of branching is usually low and is on the order of 5%. Dextran is synthesized from sucrose by some acetic acid bacteria such as Leuconostoc mesenteroides and Streptococcus mutans [52].

Figure 1.2.3. Structural formula of dextran

The inherent viscosity of dextran in water varies from 0.1 to 0.7 cm 3 g at weight average molecular weights from 10 4 to 10 6 Da. The hydrodynamic radius in water in this range of molecular weights varies from 2.4 to 19.9 nm [53].

The degree of branching of dextran affects its hydrodynamic properties. For example, with an increase in the degree of branching from 5% to 30%, the exponent in the ICC equations for intrinsic viscosity decreases from 0.43 to 0.37 (Table 1). In [54[54, 55], a deviation from the theoretical dependences of the intrinsic viscosity behavior typical for polymers for polymers with high molecular masses (above 200 kDa) was noted, which is explained by the increased influence of the degree of branching on the hydrodynamic properties of dextran with an increase in their

molecular weight. The second virial coefficient A 2 decreases with an increase in the branching of the polymer chain, and with an increase in its MM [56]. For dextran with a degree of branching of 5% for samples with MM 50 kDa A2 = 6-10"7 dm3-mole/g2, with MM 300 kDa A2 = 2-10"7 dm3-mole/g2, s MM 500 kDa A2 = 1.5 • 10-7 dm3-mole/ g2. For dextran with a degree of branching of 30% for samples with MM 50 kDa A2 = 4-10 -7 dm3-mol/g2, with MM 300 kDa A2 = 1.2-10"7 dm 3-mol/g2 .

The value of the equilibrium rigidity for the linear sections of the dextran chain in aqueous solvents, according to the data of articles [54, 57]is about 1.3 nm, i.e. it is a flexible-chain polysaccharide whose conformational properties are easily explained by the mobility of the a 1 ^ 6 bonds of the main chain between glucapyranose cycles [57].

Table. 1 Makrk-Kuhn-Houwink ratios for dextran in aqueous solvents.

MKHS equation in PBS at 298K [54]

[n] = (1.4±0.2)-10 -3 M 0 45 ± 0 05

D = (8.9±0.9>10 -5 M -049±005

MKHS equations in water at 298K

[n] = (1.7±0.2>10 -1 M 042±004 [58]

[ n ] = (1.0±0.1)-10 -3 M 0 5±0 05 For a number of dextrans (with MM less than 100 kDa) [59]

[ n ] = (2.03±0.2>10 -3 M 043±004 [60]

[ n ] = (2.23±0.4>10 -3 M 043±004 (branching degree 5%) [ n ] = (3.5±0.4>10 -3 M 037±004 (branching degree 30%) [56]

[ n ] = (1.0±0.1>10 -3 M 05±0 05 (for MM in the range from 20 to 250 kDa) [61]

[ n ] = 1.040 -3 M 05 (for MM in the range from 17 to 170 kDa) [62]

[ n ] ~ M 068 (for unbranched dextran) [ n ] = 2.18-10 -3 M 0 43 (branching degree 5%) [ n ] = 4.4-10 -3 M 0 34 (branching degree 30%) [55]

[ n ] = 0.148- M 0 5 (for MM in the range from 2 to 500 kDa, at 293 K) [63]

Dextran, as a biocompatible polymer, is used for the conjugation of bioactive compounds such as drugs [64], enzymes [65], hormones [66]and antibodies [67]. Dextran modification is used to prolong the action of the active component, to increase stability, to improve the drug's targeting and to suppress the antigenicity of the protein part [68]. In 1959, by special chemical treatment aimed at the formation of cross-links between the polymer chains of dextrans, a gel was obtained - Sephadex, which is currently widely used in gel filtration [69]. Dextran is also used in the creation

of drugs for plasma replacement [70]. In addition to solving problems of isolating biological objects, dextran-70 (weight average molecular weight 70) is used for cryoprotection of human bone marrow stem cells [71]. Also, dextrans are used as adjuvants for the prolongation of local anesthesia [72]. Dextran is used in the development of scaffolds for tissue engineering [73]. In scientific research, dextran is used to mimic molecular crowding [74]. Dextran modifications are also used to create biosensors [75]and model preparations [76]. Dextran is also used in food technologies, for example, to increase the shelf life and freshness of bread [77]. It is also used as a flocculant for wastewater treatment [78].

Thus, both polymers that form the object of this study - a two-phase polymer system, as shown above on the example of multiple applications, are completely biocompatible, do not destroy biological objects during interaction.

1.3. Extracellular nanovesicles and their role in liquid biopsy.

The success of the treatment of oncological diseases, which occupies a leading position in the ranking of the causes of death of the Earth's population according to the World Health Organization, largely depends on the timely detection of the disease [79]. Most of them in the early stages go unnoticed by humans, and the symptoms of the disease appear only in the later stages, when modern medicine is no longer able to offer an effective treatment. Mortality rates from such diseases are still high. This problem can be solved by developing and implementing early diagnostic methods. One of the options for such a diagnosis is a liquid biopsy. The principle of the method is based on the detection of tumor biomolecules in the composition of biological fluids circulating in the body. The most convenient for analysis are blood and urine. There are four main assays on which a liquid biopsy can be based: circulating tumor cells, circulating free tumor DNA, circulating miRNA fraction, and circulating extracellular nanovesicle (SEV) fractions. The diagnostic value of SEV was discovered relatively recently. In 2013, the Nobel Prize was awarded for the discovery of the biological function of exosomes - extracellular nanovesicles involved in intercellular "communication", which consists in the exchange of biologically active molecules between cells [80-85]. Features of exosome biogenesis make them promising potential biomarkers of cancer. During the synthesis of nanovesicles, biomolecules are transferred from the cellular cytoplasm of the mother cell to the inner space and to the "surface" of vesicles, as well as proteins from the cell membrane are attached to the bilipid outer membrane. Such a transfer of unique sets of molecules from the mother cell to nanovesicles makes it possible to conduct an indirect analysis of the state of the cell based on the study of the nanovesicles generated by it. Despite the clarity of the problem, the practical implementation of its solution is nontrivial. There are two stumbling blocks - the difficulty of isolating nanovesicles from a biological fluid with a multicomponent

composition and the need to create physiological conditions to preserve the native state of vesicles or vesicular components for subsequent analysis. The latter circumstance severely limits the choice of analysis method.

Currently, there are several laboratory methods for isolating SEV from various biological fluids. They can be divided into two groups: allocation according to the physical (1) and chemical (2) features of the SEV. For example, in the first case, SEV is concentrated by sedimentation using ultracentrifugation [86, 87]or by ultrafiltration. There are various modifications/combinations of these technologies [88, 89]. Isolation of SEV based on microhydrodynamic effects, which determine the possibility of fractionation of nanoparticles in a stream [90]. In the second case, the release of vesicles is provided by more or less specific binding of the vesicular membrane components by various ligands: antibodies [91], lectins [92], protamines [93], aptamers [94], etc. This interaction leads either to "fixation" of the vesicles to the solid matrix, or to the formation of multivesicular complexes, which are precipitated by centrifugation. The first group of methods makes it possible to obtain sufficiently pure SEV preparations from blood plasma, but these methods are laborious and involve large losses of vesicles during isolation. The methods of the second group have one common drawback: no such vesicular marker is known that would be present only on vesicles and on all vesicles. This leads to the fact that SEV isolated by any of the affinity methods represent a separate fraction that cannot accurately reflect the qualitative and quantitative composition of the entire population of plasma vesicles. Thus, the existing technologies for isolating SEV from blood plasma have a number of disadvantages, as a result of which the results of subsequent analysis methods require careful interpretation.

Chapter 2 Description of Experimental Methods 2.1. Dynamic Light Scattering

In this work, dynamic light scattering (DLS) was used as one of the methods for determining the size of macromolecules and complexes under study [95]. This method allows one to determine the translational diffusion coefficient D of dispersed particles in a liquid. The method is implemented by analyzing the correlation function of scattered light intensity fluctuations.

For study, a monochromatic initial beam of laser light with intensity /, frequency m and wavelength Ao is used. Since the scattering objects in the solution (macromolecules) are moving, the light scattered at an angle 6 is already non-monochromatic, which should be taken into account when considering the intensity of the scattered light.

Measuring the autocorrelation function of scattered light g (i) (t) allows you to determine the diffusion coefficient:

f i y

g(I) (t) = (E(t)E(t + ts)) = limI — IJE(t)E(t + ts)dts, (2.1.1)

where E (t ) is the instantaneous electric field strength of the scattered light wave. The autocorrelation function g (1) and the diffusion coefficient D in the theory of dynamic light scattering are related by relation (2.1.2).

g (1)= exp(-q2 Dt), (2.1.2) where t - relaxation time is determined by the expression:

1 = Dtq2 (2.1.3)

T

Here q2

V^c J

fArnY . 2

sin

, is the scattering wave vector, n is the refractive index of the solvent.

V 2 j

In the course of experiments on the study of DLS, not g (1) (t), but g (2) (t) is measured - the autocorrelation function of the scattered light intensity.

The connection function g (2) (t) is related to the autocorrelation function g (1) (t) given by the Siegert relation:

'(2)(0 = 1 + k(g(\t)f, (2.1.5)

where k is the coherence factor [31]. DLS measurements were carried out on a Photocor Comple x dynamic light scattering setup at the resource center of St. Petersburg State University "Center for Diagnostics of Functional

Materials for Medicine, Pharmacology, and Nanoelectronics." The experiment was carried out using a laser with a wavelength of 654 nm and a power of 25 mW at scattering angles from 30° to 140° at a temperature of 298 K.

The processing of data obtained using the Photocor Complex spectrometer was carried out using the DYNALS program [96]This program processes the experimental data and automatically builds the best distribution. The relaxation time spectra obtained by recording scattered light at different angles were analyzed using DYNALS [96].

To determine the diffusion coefficient, according to relation (2.1.3), we studied the dependences of the reciprocal relaxation time 1/t on the square of the wave vector q2 for different concentrations. Each of the obtained dependences was approximated by a linear function. According to the approximation data, the diffusion coefficients D were obtained from the slopes of the straight lines, and, as a result, the concentration dependence D (c) was built, which, when extrapolated to c=0, made it possible to determine the values of D0 = lim D.

The hydrodynamic radii R h of particles in the studied solutions were estimated using the Stokes-Einstein relation (2.2.6) and experimentally determined translational diffusion coefficients D0. Such a definition of R h assumes that the shape of the particles is assumed to be spherical [95].

b-T

Rh = ———, (2.1.6)

h 6nr|oDo' V '