Экспериментальное исследование клеточных механизмов кроветворения в онтогенезе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, доктор биологических наук Домарацкая, Елена Ивановна

  • Домарацкая, Елена Ивановна
  • доктор биологических наукдоктор биологических наук
  • 2004, Москва
  • Специальность ВАК РФ03.00.25
  • Количество страниц 242
Домарацкая, Елена Ивановна. Экспериментальное исследование клеточных механизмов кроветворения в онтогенезе: дис. доктор биологических наук: 03.00.25 - Гистология, цитология, клеточная биология. Москва. 2004. 242 с.

Оглавление диссертации доктор биологических наук Домарацкая, Елена Ивановна

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

1. ОБЪЕКТ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2. ПОЛУЧЕНИЕ ЗАРОДЫШЕЙ МЫШЕЙ.

3. РЕНТГЕНОВСКОЕ ОБЛУЧЕНИЕ.

4. ГАММА-ОБЛУЧЕНИЕ.

5. ТРАНСПЛАНТАЦИЯ КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ И КРОВЕТВОРНЫЕ КОЛОНИИ В СЕЛЕЗЕНКЕ.

6. ОПРЕДЕЛЕНИЕ САМООБНОВЛЕНИЯ КОЕ-С.

7. Н3-ТИМИДИНОВОЕ И Н3-УРИДИНОВОЕ «САМОУБИЙСТВО».

8. ОКСИМОЧЕВИНОВОЕ «САМОУБИЙСТВО».

9. ОБРАБОТКА АНТИБИОТИКАМИ.

10. ОБРАБОТКА 5-ФТОРУРАЦИЛОМ (5-ФУ).

11. ОБРАБОТКА ДИПИНОМ.

12. АНЕМИЯ.

13. ЭКТОПИЧЕСКАЯ ТРАНСПЛАНТАЦИЯ.

14. КУЛЬТИВИРОВАНИЕ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА.

15. ПОЛУЧЕНИЕ КРОЛИЧЬЕЙ АНТИСЫВОРОТКИ К ГОЛОВНОМУ МОЗГУ МЫШИ (КАСММ) И ЭКСПОЗИЦИЯ С НЕЙ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТОК.

16. ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ И ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК.

2. ПРОЛИФЕРАТИВНЫЙ СТАТУС КРОВЕТВОРНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК.

2.1. Исследование кроветворных стволовых клеток с помощью мультипараметрического анализа.

2.2. Содержание РНК.

2.3. Фенотипические различия покоящихся и пролиферирующих КСК.

2.4. Положение КСК в клеточном цикле и способность к репопуляции.

2.5. Исследование пролиферативной активности КСК с помощью цитотоксических препаратов.

2. 6. Сочетанный эффект цитотоксических препаратов и цитокинов.

2.7. Кинетика клеточного цикла КСК.

3. РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ, ОБРАЗУЮЩИЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КОЛОНИИ В СЕЛЕЗЕНКЕ (КОЕ-С).

3.1. Метод селезеночных колоний и его применение для исследования популяции родоначальных клеток.

3.2. Фенотипическая характеристика КОЕ-С.

3.3. Сравнительная характеристика КОЕ-С, образующих ранние и поздние селезеночные колонии.

3.3.1. Экспрессия антигенов клеточной поверхности.

3.3.2. Пролиферативный статус КОЕ-С и регуляция их пролиферации.

3.3.3. Чувствительность к цитотоксическим агентам.

3.4. Положение КОЕ-С в гистогенетическом ряду кроветворных клеток.

4. КРОВЕТВОРНОЕ МИКРООКРУЖЕНИЕ И ГЕМОПОЭЗ.

4.1. Характеристика кроветворного микроокружения и его регуляторной функции.

4.2. Мезенхимные (стромальные) стволовые клетки.

4.2.1. Фенотипическая и функциональная характеристика мезенхимных (стромальных) стволовых клеток.

4.2.2. КОЕ-Ф - стромальная стволовая клетка.

4.2.3. Эктопическая трансплантация костного мозга в виде фрагмента.

4.2.4. Гистогенетические отношения МСК и КСК.

4.2.5. МСК и мезенхимные сосудистые гладкомышечные клетки (МСГК).

5. КРОВЕТВОРНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ В ПРЕНАТАЛЬНОМ РАЗВИТИИ.

5.1. Происхождение КСК в эмбриональном развитии млекопитающих.

5.2. Печень как основной кроветворный орган в пренатальном онтогенезе.

5.2.1. Развитие кроветворения в печени.

5.2.2. Кроветворное микроокружение эмбриональной печени и миграция кроветворных клеток в кроветворные органы в пренатальном развитии.

5.2.3. Характеристика КСК из фетальной печени.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

1. РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ (КОЕ-С) В ПРЕ - И ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ МЫШИ.

1.1. Характеристика популяции КОЕ-С печени зародыша мыши.

1.1.1. Гетерогенность селезеночных колоний, образуемых клоногенными кроветворными клетками эмбриональной печени.

1.1.2. Морфологическое типирование колоний через 7 и 11 суток после трансплантации кроветворных клеток эмбриональной печени.

1.1.3. Характеристика свойств различных категорий эмбриональных кроветворных клеток, образующих колонии в селезенке.

1.2. Структура популяции клоногенных кроветворных клеток в пре - и постнатальном онтогенезе.

1.2.1. КОЕ-С, образующие крупные селезеночные колонии.

1.2.2. КОЕ-С-эп, ответственные за образование мелких селезеночных колоний.

1.2.3. Сравнительная характеристика КОЕ-С из разных кроветворных источников и происхождение КОЕ-С в печени в постнатальном онтогенезе.

1.3. Родоначальные кроветворные и стромальные клетки печени зародыша при эктопической трансплантации.

1.3.1. Кроветворные клоногенные клетки (КОЕ-С) печени зародышей мыши при кратковременном культивировании in vivo.

1.3.2. Дифференцировочные потенции мезенхимы печени зародышей мышей.

2. ИССЛЕДОВАНИЕ СИНТЕЗА РНК В РОДОНАЧАЛЬНЫХ КРОВЕТВОРНЫХ КЛЕТКАХ КОСТНОГО МОЗГА.

2.1. Синтез РНК в популяции КОЕ-С костного мозга интактных животных.

2.1.1. Пролиферативная активность КОЕ-С.

2.1.2. Действие ингибиторов ДНК-зависимого синтеза РНК — антибиотиков сиби-ромицина и актиномицина Д на КОЕ-С.

2.1.3. Действие радиотоксических доз ЗН- уридина на КОЕ-С.

2.1.4. Синтез РНК в КОЕ-С на разных этапах выделения кроветворных клеток ех vivo.

2.1.5. Колониеобразующая активность КОЕ-С после экспозиции с актиномицином Д в дозе 0,04 мкг/мл/г, блокирующей синтез рибосомальной РНК.

2.1.6. Специфичность действия низких доз актиномицина Д.

2.2. Синтез рРНК в родоначальных кроветворных клетках (КОЕ-С) при экспериментально вызванной анемии.

3. АНАЛИЗ НЕКОТОРЫХ ЭТАПОВ КРОВЕТВОРНОГО И СТРОМАЛЬНОГО РЯДОВ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ С ПОМОЩЬЮ ЦИТОТОКСИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ.

3.1. Динамика содержание КОЕ-С в костном мозге и селезенке после однократного введения дипина.

3.2. Повреждение клеток стромы 5-фторурацилом и дипином и регенерация кроветворной ткани.

4. ВЛИЯНИЕ ФАКТОРОВ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА НА РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ КЛЕТКИ МЛЕКОПИТАЮЩИХ.

4.1. Содержание КОЕ-С в кроветворных органах половозрелых животных.

4.2. Динамика возрастных изменений содержания КОЕ-С в кроветворных органах крыс, экспонированных на борту биоспутника в плодном периоде развития.

5. ВЛИЯНИЕ НЕПРЕРЫВНОГО ГАММА- ОБЛУЧЕНИЯ В НИЗКИХ ДОЗАХ НА РОДОНАЧАЛЬНЫЕ КРОВЕТВОРНЫЕ (КОЕ-С) И СТРОМАЛЬНЫЕ (КОЕ-Ф) КЛЕТКИ.

5.1. Содержание кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С) в костном мозге.

5.2. Содержание родоначальных стромальных клеток (КОЕ-Ф) в костном мозге.

5.3. Величина эктопических трансплантатов.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Гистология, цитология, клеточная биология», 03.00.25 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспериментальное исследование клеточных механизмов кроветворения в онтогенезе»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема клеточной дифференцировки является крайне актуальной для современной биологии и медицины. Интерес к ней специалистов разнообразного профиля (молекулярных биологов, генетиков, цитологов, биологов развития, и т.п.) резко возрос в связи с последними успехами в изучении эмбриональных и тканеспецифи-ческих стволовых клеток и не в последнюю очередь связан с поиском методов клеточной терапии для восстановления поврежденных органов и тканей.

Кроветворная ткань представляет собой уникальную и наиболее экспериментально продвинутую модель для изучения механизмов дифференцировки и регенерации. Для нее характерно многообразие клеточных форм, различающихся по степени зрелости и специфике обменных процессов, а также линий (ростков) дифференцировки (эритроидная, гра-нулоцитарная, моноцитарная, мегакариоцитарная, лимфоидная). Клеточную основу, обеспечивающую восстановление зрелых клеток крови и кроветворной ткани в целом после естественной гибели терминально дифференцированных клеток, в ходе патологических процессов или действия различных повреждающих агентов, составляют кроветворные стволовые клетки (КСК). Основные их свойства - способность к самоподцержанию и по-липотентность. Благодаря самоподцержанию КСК, возникнув в эмбриогенезе, не исчезают из кроветворной ткани и служат источником пополнения зрелых клеток на протяжении жизни организма. Полипотентность, т.е. способность давать потомство клеток, дифференцирующихся по многим направлениям, обеспечивает многообразие форменных элементов крови. Другое отличительное свойство кроветворной ткани — способность менять место локализации. Перемещение кроветворной ткани происходит в эмбриональном развитии, когда циркулирующие клетки репопулируют (заселяют) закладки кроветворных органов, а также в экспериментальных условиях и патологии при формировании эктопических очагов гемопоэза. Непременным условием нормально протекающего кроветворения является взаимодействие кроветворных стволовых и родоначальных клеток с клетками стромы, составляющими основу так называемого кроветворного микроокружения (КМО) (Старостин, 1986). Распознавание и удержание кроветворных клеток, их миграция осуществляется клетками КМО при участии молекул клеточной адгезии. Клетки КМО обеспечивают не только пространственную организацию кроветворных органов, но, контактируя с кроветворными клетками, выделяют и аккумулируют разнообразные факторы роста, регулирующие процессы пролиферации и дифференцировку КСК.

Исследования последнего десятилетия показали, что популяция КСК гетерогенна и включает два подотдела (компартмента) клеток, различающихся по фенотипу (антигенным характеристикам), продолжительности жизни, способности к дифференцировке и степени самообновления (Morrison, Weissman, 1994; Randal, Weissman, 1998; Kondo et al., 2003). Первый компартмент составляют КСК с неопределенно длительным самоподцер-жанием; второй — КСК, самоподдерживающиеся не более 3-6 недель. Мультипотентные (родоначальные) клетки входят в компартмент, который следует в диффероне за стволовым, и не обладают экстенсивным самоподдержанием. Часть мультипотентных клеток (общие миелоидные предшественники) дифференцируются в эритроидном, мегакариоци-тарном и миелоидном направлениях, способны образовывать в селезенке облученного животного клоны кроветворных клеток (колонии), различимые визуально, и представляют собой так называемые колониеобразующие единицы селезенки — КОЕ-С, давшие название методу их количественного учета in vivo. Хотя КОЕ-С не идентичны КСК, метод селезеночных колоний, используется для анализа КСК и в настоящее время. Его модификация, предложенная японскими исследователями, позволила продемонстрировать, что истинные КСК также способны формировать визуально различимые кроветворные клоны-колонии в селезенке в более поздние сроки по сравнению с мультипотентными предшественниками (Liang et al., 1999; Ikehara, 2000; Yang et al., 2002). Таким образом, метод селезеночных колоний остается адекватной моделью исследования клоногенных кроветворных клеток разной степени зрелости и в зависимости от срока наблюдения позволяет вести дифференцированный учет как родоначальных клеток, так и КСК.

Принципиальная организация кроветворного дифферона, как последовательного ряда клеточных форм со специфическими для каждой потенциями к дифференцировке и размножению, не вызывает сомнений. Однако к началу нашего исследования были неясны некоторые вопросы организации компартмента родоначальных клеток, свойства отдельных их категорий, их цитофизиологические особенности, а также изменения, которые происходят в популяции КОЕ-С в индивидуальном развитии.

Прижизненное наблюдение кроветворных клонов-колоний в селезенке, образованных костномозговыми КОЕ-С показало, что колониеобразование является динамическим процессом появления и исчезновения клонов, образуемых клоногенными клетками, различающимися по степени зрелости и времени формирования клона (Magli et al., 1982; Priestley, Wolf, 1985; Molineux et al., 1986; Wolf, Priestley, 1986). Было обнаружено, что у половозрелых животных популяция КОЕ-С костного мозга гетерогенна, и в зависимости от срока регистрации колоний можно анализировать категории более «молодых» и более «старых» КОЕ-С (Magli et al., 1982). К началу нашего исследования немногочисленные 8 факты указывали на то, что эмбриональная кроветворная ткань отличается по содержанию клоногенных клеток от костного мозга взрослых животных (Micklem, 1972, Gaidul et al., 1984). Однако данные о составе популяции эмбриональных КОЕ-С были весьма скудны и касались, в основном, печени зародышей одного срока развития (Metcalf et al., 1983; Johnson, Nicola, 1984; Gaidul et al., 1986). Наиболее полный труд Меткалфа и Мура, посвященный эмбриональным аспектам кроветворения, был создан, когда КОЕ-С рассматривались как однородная популяция клеток (Metcalf, Moore, 1971). Поэтому весьма актуальным представляется детальное исследование изменений в составе родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах в разные сроки пренатального онтогенеза, завершающиеся формированием дефинитивной кроветворной ткани. В постнатальном периоде, однако, в печени - органе, утратившим кроветворную функцию, Хрущовым с соавторами были описаны КОЕ-С и получены данные, что по некоторым характеристикам КОЕ-С печени половозрелых животных близки таковым из периферической крови (Хрущов и др., 1977; Старостин, 1986). Окончательный ответ на этот вопрос могло дать сравнительное исследование цитофизиологических характеристик индивидуальных КОЕ-С из различных кроветворных источников.

Как известно, одним из важных показателей клеточной активности является интенсивность синтеза РНК, меняющаяся в зависимости от стадии дифференцировки клетки, потребностей в белковом синтезе, фазы митотического цикла и т.д. В норме КСК и КОЕ-С представляют собой покоящиеся популяции клеток (Hodgson, Bradley, 1979; van Zant, 1984; Lerner, Harrison, 1990; Berardi et al., 1995; Ross et al., 1982; Morrison et al., 1997). Предполагалось, что синтез РНК в митотически инертных КОЕ-С, находится на достаточно низком уровне и для вступления в пролиферацию необходима его активация. Однако эта цитофизиологическая особенность КОЕ-С оставалась практически не изученной, и ее исследование нуждалось в новых подходах, поскольку традиционная радиоавтография не может быть использована для анализа клоногенных кроветворных клеток, не имеющих характерных морфологических признаков в отличие от дифференцированных клеток таких, например, как малые лимфоциты.

Костный мозг половозрелых животных является источником наряду с КСК и других стволовых клеток, в частности мезенхимных (стромальных), которые тестируются in vitro по образованию колоний фибробластоподобных клеток (КОЕ-Ф) и обладают, как и кроветворные клетки, определенной иерархической организацией (Owen, 1988). В прена-тальном и раннем постнатальном развитии стволовые клетки стромы выявлены в печени и селезенке, причем их численность, оцененная по числу формируемых ими колоний in vitro, соответствует гемопоэтической активности кроветворного органа (Van Den Heuvel et 9 al., 1987). Другой методический прием - эктопическая пересадка — позволяет вывить ме-зеихимные стволовые клетки функционально по их способности к дифференцировке в несколько типов стромальных клеток и формированию КМО, поддерживающего гемопоэз. Этот метод может быть с успехом использован для определения дифференцировочных потенций мезенхимных клеток, имеющихся в печени зародыша.

В рамках общей проблемы стволовых клеток и их роли в восстановлении кроветворной ткани значительный интерес представляет исследование, помимо кроветворных, также и стволовых клеток стромы, которые также являются мишенью для различного рода повреждающих факторов. Проблема резистентности (или напротив) чувствительности к тому или иному повреждающему фактору и репаративных потенций кроветворной и соединительной тканей, в целом, не теряет своей актуальности и является основополагающей не только для экспериментальной биологии, но и практической медицины. Так, например, успех терапии злокачественных заболеваний крови определяется правильным выбором лекарственного препарата, введением его в чувствительной фазе клеточного цикла, учетом избирательности его действия на те или иные категории клеток. Знание цитофи-зиологических особенностей КСК, структуры их популяции, антигенных характеристик, пролиферативного статуса, времени обновления и т.д. позволяет выбрать стратегию применения тех или иных цитостатических веществ таким образом, чтобы сочетать максимальную чувствительность к препарату дефектных клеток с максимальной сохранностью стволовых элементов. Не менее остро проблема КСК стоит при трансплантации кроветворных клеток реципиенту с иммунодефицитом, разрушенной (поврежденной) облучением или токсическими агентами кроветворной тканью, поскольку положительный эффект трансплантации зависит от качества трансплантируемого материала, т.е. от присутствия в инокулуме достаточного числа клоногенных клеток, обладающих потенциями стволовых. Именно донорские КСК, репопулируя кроветворные органы, обеспечивают восстановление гемопоэза. Исследование дифференцировочных и пролиферативных потенций кроветворных и стромальных СК после действия тех или иных неблагоприятных факторов позволяет оценить полноту репаративной регенерации кроветворной ткани.

Помимо практического применения цитотоксические препараты могут использоваться в качестве адекватного инструмента для изучения иерархической организации клеточных популяций. Экспериментальное удаление клеток определенной стадии дифферен-цировки позволяет не только определить их роль в восстановлении ткани, но и установить положение той или иной клеточной категории в диффероне. Учитывая специфику действия таких цитотоксических препаратов как 5-фторурацил и дипин, представляется весьма продуктивным использовать их для определения принадлежности исследуемых клеток к

10 той или иной стадии развития, их места в ряду кроветворной дифференцировки, а также участия в регенераторном процессе.

Еще одной фундаментальной и практически значимой проблемой, связанной с функционированием кроветворной ткани, является адаптация организма к несвойственной ему среде обитания. Способность быстро отвечать на функциональные запросы, изменения окружающей среды, стрессовые и экстремальные воздействия позволяют считать кроветворную и соединительную ткани уникальными объектами и адекватными тест-системами и для изучения различных внешних воздействий. В частности, нормальное функционирование кроветворной системы является одним из непременных условий космических полетов. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют, что пребывание в космическом полете вызывает изменения в периферической крови у человека и млекопитающих (Berry, 1970; Газенко и др., 1974; Johnson et al., 1975; Leon et al., 1978, 1980; Илюхин, Бурковская 1981; Udden et al., 1995). Некоторые изменения, зарегистрированные в наиболее зрелом, периферическом, звене кроветворной системы могут быть вторичными и являться результатом более глубоких процессов, происходящих в кроветворной системе под влиянием факторов космического полета. Поэтому актуальность приобретают исследования других отделов кроветворного дифферона и, в первую очередь, отделов стволовых и родоначальных клеток, обеспечивающих обновление кроветворной ткани и поддержание кроветворения на постоянном уровне. Модельные эксперименты на лабораторных животных дают уникальную возможность на обширном и однородном материале получить максимально полную картину изменений в кроветворной системе, связанных с действием факторов полета. В экспериментах на биоспутниках серии «Космос», выполненных нами совместно с учеными Чехословацкой академии наук, было оценено влияние космического полета на стволовые кроветворные клетки млекопитающих (крыс) и плодов, развитие которых частично проходило в условиях полета.

Одним из наиболее значимых для кроветворной системы и постоянных космических факторов, помимо микрогравитации, является ионизирующее космическое излучение. Однако его влияние на кроветворную и соединительную ткани до настоящего времени остается практически не изученным. Следует подчеркнуть, что исследование подобного рода выходит за рамки космической программы и имеет медико-биологический, в том числе и экологический, аспект, поскольку у- облучение малой интенсивности является одним из компонентов радиоактивного природного фона, под воздействием которого живые организмы находятся в наземных условиях (Гусаров, Иванов, 2001; Кузин, 2002).

Из сказанного следует, что для понимания закономерностей клеточной дифференцировки весьма актуально проведение многоплановых исследований кроветворной и со

11 единительной тканей, включающих характеристику составляющих их клеточных популяций, детализацию дифферона в пре - и постнатальном развитии, участие отдельных субпопуляций в регенераторном ответе на разнообразные внешние воздействия. Результаты подобных исследований позволят дать более точную картину гистогенеза кроветворной и соединительной тканей.

Цели и задачи исследования. Основной целью работы явилось исследование:

- структурной (иерархической) организации некоторых этапов кроветворного и стромаль-ного дифферонов в индивидуальном развитии млекопитающих (мышей);

- влияния воздействий различной химической и физической природы на родоначальные кроветворные и стромальные клетки.

Конкретными задачами работы были следующие:

1. Исследование состава популяции родоначальных кроветворных клеток - КОЕ-С - и свойств отдельных их категорий на разных сроках пре - и постнатального развития.

2. Характеристика уровня синтеза РНК в популяции КОЕ-С.

3. Исследование чувствительности отдельных категорий КОЕ-С зародышей и взрослых животных к цитотоксическим препаратам (5-фторурацилу и дипину).

4. Исследование чувствительности родоначальных стромальных клеток (КОЕ-Ф) к действию цитотоксических препаратов (5-фторурацилу и дипину).

5. Характеристика потенций к дифференцировке мезенхимы печени в зависимости от уровня ее гемопоэтической активности.

6. Исследование влияния факторов космического полета на родоначальные кроветворные клетки в плодном периоде развития и постнатальном онтогенезе млекопитающих (крыс).

7. Изучение влияния непрерывного у- облучения в низких дозах на родоначальные кроветворные и стромальные клетки.

Научная новизна исследования. В ходе работы получены новые данные об иерархической организации кроветворного дифферона в пре - и постнатальном онтогенезе, цитофи-зиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток, об участии отдельных их категорий в репаративном процессе и реакции на различные воздействия.

1. Впервые в кроветворной ткани зародышей мыши и особей раннего постнатального периода выявлены клоногенные клетки, отсутствующие в дефинитивной кроветворной ткани и образующие в селезенке мелкие колонии недифференцированных клеток в поздние после трансплантации сроки. Охарактеризованы свойства новой категории кло-ногенных клеток, названных по месту их обнаружения - эмбриональной печени - КОЕ-С

12 эп. Показано, что КОЕ-С-эп находятся вне пролиферативного цикла, не самоподдерживаются, резистентны к 5-фторурацилу и кроличьей антисыворотке к головному мозгу мыши и на основании математического анализа их распределения могут быть причислены к стадии дифференцировки, предшествующей КОЕ-С - пре-КОЕ-С.

2. Получены данные об особенностях состава компартмента родоначальных клеток (КОЕ-С) в кроветворных органах (желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге) на разных этапах онтогенеза. Они касаются соотношения разных типов клоногенных клеток (КОЕ-С-эп, КОЕ-С-7, КОЕ-С-11), пролиферативного статуса и т.д. и отражают функциональное состояние кроветворной системы, свойственное тому или иному этапу индивидуального развития особи.

3. Установлено, что КОЕ-С-11, присутствующие в печени в постнатальном онтогенезе, представляют собой более зрелые клетки по сравнению с КОЕ-С-11 из костного мозга половозрелых животных или печени зародышей, и идентичными КОЕ-С-11 из периферической крови. Таким образом, очевидно, КОЕ-С поступают в печень из циркуляции и не являются «дремлющими» эмбриональными.

4. Исследован синтез РНК в морфологически неидентифицируемых родоначальных клетках, как один из важнейших показателей их готовности к вступлению в митоз и коло-ниеобразованию. Установлено, что популяция КОЕ-С характеризуется интенсивным синтезом РНК и способностью к его быстрой активации, что свидетельствует о соответствия состояния пролиферативного покоя КОЕ-С Gi- периоду клеточного цикла. В стационарных условиях популяция КОЕ-С гетерогенна по содержанию рРНК и содержит клетки, как с относительно низким, так и высоким уровнем синтеза рРНК. Обнаружена стимуляция колониеобразования под влиянием актиномицина Д в дозах, подавляющих синтез рРНК.

5. Выявлено, что однократное введение алкилирующего препарата дипина вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, проявляющееся в периодических (синусоидальных) изменениях содержания кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11) в костном мозге и селезенке. Происходящие на протяжении жизни мыши периодические спады и подъемы численности КОЕ-С - транзиторной популяции клеток - дают основание заключить, что, во-первых, КСК, которые их генерируют, неоднородны по чувствительности к дипину, во-вторых, дифференцировка КСК осуществляется на основе клональной сукцессии

6. В популяции стромальных клеток костного мозга выделены категории клеток, различающихся по устойчивости к цитотоксическим препаратам (5-фторурацилу и дипину) и участию в регенерации эктопических трансплантатов. Наиболее чувствительные к

13 дипину и резистентные к 5-фторурацилу клетки обладают высокими репаративными потенциями и, очевидно, могут быть отнесены к стволовым клеткам стромы.

7. Впервые показано, что мезенхима печени зародышей в период активного кроветворения обладает широкими дифференцировочными потенциями. При трансплантации печени 14-суточных зародышей мыши под капсулу почки или в подкожную соединительную ткань половозрелых реципиентов происходит последовательное новообразование гиалинового хряща, кости и кроветворных очагов.

8. Впервые установлено снижение уровня миелопоэза у крыс после кратковременного космического полета, выражающееся в значительном сокращении численности кроветворных родоначальных клеток (КОЕ-С). Впервые также исследовано содержание КОЕ-С в кроветворных органах в пре- и раннем постнатальном развитии после экспозиции на борту биоспутника в плодном периоде.

9. Впервые обнаружен феномен стимулирующего действия непрерывного у- облучения в малых дозах (радиационный гормезис) на стромальные родоначальные клетки костного мозга, который выражается в активации пролиферации, увеличении численности популяции КОЕ-Ф и усиление регенераторных потенций стромальных родоначальных клеток.

Теоретическая значимость работы. В данной работе проведено комплексное исследование родоначальных кроветворных и стромальных клеток, согласованная работа которых обеспечивает нормальное функционирование кроветворной ткани как единой системы.

В кроветворном ряду дифференцировки обнаружена ранее неописанная в литературе категория клоногенных кроветворных клеток, являющаяся стадией дифференцировки, предшествующей КОЕ-С, и характерная для кроветворной ткани пренатального и раннего постнатального периодов развития. Получены экспериментальные данные, объективно свидетельствующие в пользу концепции функционирования КСК на основе кло-нальной сукцессии. В стромальном диффероне выявлены категории клеток, различающихся по регенераторным потенциям и чувствительности к цитотоксическим агентам. Предложена гипотетическая модель стромального ряда дифференцировки.

Выявлено негативное воздействие факторов космического полета на миелопоэз, которое заключается в резком уменьшении численности родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах млекопитающих.

Обнаружен феномен радиационного гормезиса, проявляющийся в увеличении про-лиферативной активности и численности родоначальных клеток стромы, а также усиление их способности к регенерации. Установление этого факта кардинально меняет сложившееся представление о радиации в сверхмалых дозах, как незначимом для кроветворной и

14 соединительной тканях воздействии, и диктует необходимость расширения исследований в данном направлении.

Результаты углубляют и детализируют представления об организации стволового отдела, отдельных этапах дифференцировки кроветворных и стромальных клеток, цито-физиологических особенностях родоначальных кроветворных и стромальных клеток. Представленные в работе данные способствуют пониманию ведущей роли стволовых и родоначальных (мультипотентных) клеток в восстановительных процессах, связанных с действием разнообразных факторов. В практических целях кроветворную и стромальную ткани можно использовать как тест-системы для регистрации влияния разнообразных факторов внешней среды на организм животных и человека. Оценка резистентности клеточных популяций, входящих в их состав, позволяет определить репаративные возможности кроветворной и стромальной тканей, предвидеть и в перспективе предотвращать последствия неблагоприятных воздействий.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на следующих рабочих, Всесоюзных, Всероссийских и Международных конференциях, совещаниях и симпозиумах: 6-м Совещании европейской группы по изучению клеточной пролиферации (Москва, СССР, 1973), Республиканской конференции «Структурные и % функциональные изменения в клетках мезенхимы» (Киев, СССР, 1982), 5-м Ежегодном симпозиуме комиссии по гравитационной физиологии международного союза физиологических наук (Москва, СССР, 1983 г.), 17-м Совещании постоянно действующей рабочей группы соцстран по космической биологии и медицине программы «Интеркосмос» (Брно, Чехословакия, 1984 г.), 18-м Совещании постоянно действующей рабочей группы соцстран по космической биологии и медицине программы «Интеркосмос» (Гагра, СССР, 1985 г.), 7-м Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, СССР, 1986), Научной конференции «Методологические основы изучения и преподавания морфогенеза тканей и органов в адаптивных процессах» (Иркутск, СССР, 1987 г.), 1-й Республиканской научной конференции «Управление морфогенезом тканей и органов в процессе адаптации» (Иркутск, СССР, 1989 г.), Симпозиуме «Volga-Wilsede» (Москва, СССР, 1990), 33-м Международном конгрессе физиологических наук (Скт-Пб, Россия, 1997 г.), Международной конференции по регенерации (Кельн, Германия, 1997), Конференции «Клеточные и молекулярные аспекты регенерации и реконструкции тканей» (Москва, Россия, 1998 г.), 33-й Ассамблее COSPAR (Варшава, Польша, 2000), III Международном симпозиуме «Механизмы действия сверхмалых доз» (Москва, 2002), 34-й Ассамблее COSPAR (Хьюстон, США, 2002), 1-м съезде Общества клеточной биологии (С.-Пт., Россия, 2003 г.), 35-й Ассамблее COSPAR (Париж, Франция, 2004). Апробация диссертации проведена на семина

15 ре отдела цитологии и гистологии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 19 января 2004 года.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Похожие диссертационные работы по специальности «Гистология, цитология, клеточная биология», 03.00.25 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Домарацкая, Елена Ивановна

выводы

1. Выявлены отличия кроветворной ткани эмбрионального и раннего постнаталь-ного развития лабораторных мышей.

• Впервые в кроветворной ткани (желточном мешке, печени, селезенке и костном мозге) ранних этапов индивидуального развития (в пренатальном периоде и в первую неделю после рождения) обнаружена особая категория клоногенных кроветворных клеток - КОЕ-С-эп и охарактеризованы их свойства. КОЕ-С-эп образуют небольшие клоны клеток бластного типа, которые регистрируются на поверхности селезенки в поздние сроки после трансплантации (на 11 сутки). КОЕ-С-эп находятся вне пролифера-тивного цикла, резистентны к оксимочевине, 5-фторурацилу (5-ФУ) и к антисыворотке к головному мозгу мыши, что характеризует их как менее зрелые, по сравнению КОЕ-С, клетки. Математический анализ распределения числа мелких селезеночных колоний подтвердил, что клетки, ответственные за их образование - КОЕ-С-эп - представляют собой стадию дифференцировки, предшествующую КОЕ-С - пре-КОЕ-С.

• На разных этапах онтогенеза компартмент КОЕ-С характеризуется определенным соотношением входящих в него трех категорий клоногенных кроветворных клеток (КОЕ-С-7, КОЕ-С-11 и КОЕ-С-эп), что отражает функциональное состояние кроветворной системы, свойственное тому или иному периоду индивидуального развития особи.

2. Впервые показано, что мезенхима печени 14-суточных зародышей в период ее активного кроветворения обладает широкими дифференцировочными потенциями. При эктопической трансплантации половозрелым реципиентам среди мезенхимных клеток выявлены предшественники гиалинового хряща, кости и кроветворной стромы.

3. С помощью ретрансплантации индивидуальных селезеночных колоний показано, что КОЕ-С-11 из печени половозрелых животных по способности к самоподдержанию КОЕ-С-11 идентичны таковым из периферической крови, т.е. не являются исходно печеночными и, вероятнее всего, поступают в печень из циркуляции.

4. При анализе вступления родоначальных кроветворных клеток (КОЕ-С) костного мозга в клеточный цикл, проведенном с помощью ингибиторов ДНК-зависимого синтеза РНК и радиотоксических доз 3Н-уридина, выявлен интенсивный синтез РНК и способность к быстрой его активации у значительной части популяции КОЕ-С. Это подтверждает представление о том, что состояние пролиферативного покоя КОЕ-С соответствует Gi-периоду клеточного цикла.

5. При изучении синтеза рРНК в популяции КОЕ-С костного мозга интактных мышей и после стимуляции кроветворения кровопотерей установлено, что а) в стационарных условиях среди КОЕ-С имеются клетки, как синтезирующие, так и не синтезирующие рРНК, б) в популяции КОЕ-С, вступивших под воздействием кровопотери в пролиферацию, число клеток, синтезирующих рРНК, возрастает. В популяции КОЕ-С, сохранившей, несмотря на кровопотерю, состояние покоя, актиномицин Д в дозах, ингибирующих синтез рРНК, стимулирует колониеобразование.

6. Проведено сравнительное исследование цитотоксического действия 5-ФУ на способность различных категорий родоначальных кроветворных клеток (КОЕ-С-7, КОЕ-С-11, КОЕ-С-эп) из кроветворной ткани зародышей и половозрелых мышей к образованию кроветворных колоний. Показано, что целостность структурной организации кроветворной ткани повышает резистентность КОЕ-С-11 к цитотоксическому действию 5-ФУ. В условиях in vitro эмбриональные КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7 одинаково чувствительны к 5-фторурацилу и не отличаются по этой характеристике от соответствующих категорий КОЕ-С костного мозга. КОЕ-С-эп - устойчивы к действию 5-ФУ.

7. Изучено действие алкилирующего препарата дипина на родоначальные кроветворные клетки костного мозга и селезенки взрослых мышей. Установлено, что дипин вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, которое проявляется в периодических изменениях содержания КОЕ-С-11 и КОЕ-С-7 в костном мозге и селезенке. Происходящие на протяжении жизни мыши спады и подъемы численности КОЕ-С - транзиторной популяции клеток, дает основание заключить, что, во-первых, кроветворные стволовые клетки неоднородны по чувствительности к дипину, во-вторых, их дифференцировка осуществляется на основе клональной сукцессии.

8. Исследованы содержание КОЕ-Ф в костном мозге и регенераторные потенции костномозговой кроветворной стромы после воздействия 5-ФУ и дипина - препаратов, избирательно токсичных для клеток разной степени зрелости. На основании различий в чувствительности (устойчивости) стромальных клеток к 5-ФУ и дипину, а также в характере восстановления кроветворной ткани после удаления той или иной субпопуляции дана ци-тофизиологическая характеристика стромальных клеток, обладающих разными потенциями, и предложена гипотетическая модель гистогенетического ряда стромальных (мезенхимных) клеток.

9. Изучено влияние космического полета на кроветворную ткань млекопитающих (крыс). У взрослых животных обнаружено снижение уровня миелопоэза, что выражается в значительном сокращении численности родоначальных кроветворных клеток (КОЕ-С) в костном мозге и селезенке. Кратковременное пребывание в невесомости в плодном периоде развития (13-18 суток) не влияет существенно на возрастную динамику этих клеток в кроветворных органах в постнатальном развитии.

10. Исследовано влияние сверхмалых доз непрерывного у- облучения низкой интенсивности на родоначальные кроветворные и стромальные клетки костного мозга. Впервые обнаружен феномен стимулирующего действия у- облучения в малых дозах (мощность дозы — 0,15 сГр, суммарная доза - 1,5 сГр) на стромальные клетки, который выражается в повышении пролиферативной активности и увеличении численности КОЕ-Ф в костном мозге, а также в усилении регенераторных потенций стромы, что проявляется в увеличении размеров создаваемой de novo кроветворной территории. Родоначальные кроветворные клетки устойчивы к у- облучению в использованных дозах. Пролиферативная активность и содержание как более «молодых» (КОЕ-С-11), так и более «зрелых» (КОЕ-С-7) кроветворных клеток под влиянием облучения существенно не меняются.

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В проведенном экспериментальном исследовании получены новые сведения о ци-тофизиологических особенностях и структуре популяции родоначальных кроветворных клетках в индивидуальном развитии, а также реакции родоначальных кроветворных и стромальных клеток на воздействия химической и физической природы (антибиотики, ци-тотоксические препараты, микрогравитацию, радиацию).

Наше исследование объединяет несколько направлений, связанных общей проблемой дифференцировки родоначальных кроветворных и стромальных клеток.

1. Впервые проведено подробное исследование популяции родоначальных кроветворных клеток в кроветворных органах в пре- и постнатальном онтогенезе. В кроветворной ткани зародышей (желточном мешке, печени и селезенке) и животных первых дней жизни (селезенке и костном мозге), помимо известных категорий родоначальных кроветворных клеток - КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, характерных и для кроветворных органов половозрелых мышей, выявлен новый, не описанный ранее тип клеток - КОЕ-С-эп. Эти клетки образуют в селезенке мелкие колонии бластного типа в поздние сроки после трансплантации. В селезенке и костном мозге половозрелых животных КОЕ-С-эл практически отсутствуют. По своим свойствам КОЕ-С-эп относятся к стадии дифференцировки, предшествующей КОЕ-С. В отличие от эмбриональных КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11, они не пролифери-руют, устойчивы к 5-ФУ и антисыворотке против головного мозге мыши. Для КОЕ-С-эп характерна высокая вариабельность числа образуемых ими колоний по сравнению с колониями, формируемыми КОЕ-С-7 и КОЕ-С-11. С помощью методов математической статистики показано, что распределение числа мелких колоний, в отличие от крупных колоний, I не подчиняется закону Пуассона. Это позволило заключить, что крупные колонии образованы непосредственно КОЕ-С, тогда как мелкие колонии — за счет пролиферации клеток предыдущих стадий, т.е. пре-КОЕ-С. Расчеты показали, что концентрация пре-КОЕ-С в печени зародыша составляет 2,67 на 105 клеток, а среднее число КОЕ-С, образованных из одной пре-КОЕ-С - около 260.

Структура компартмента родоначальных клеток, т.е. относительное содержание КОЕ-С различных категорий в кроветворных органах, отражает функциональное состояние кроветворной ткани той или иной стадии развития и меняется в соответствии с потребностями организма. Так, например, в период интенсивного роста зародыша и, в связи с этим, большой потребности тканей и органов в кислороде, в популяции КОЕ-С-7 печени преобладают, ближайшие предшественники коммутированных к эритроидной дифференцировке БОЕ-Э и КОЕ-Э. Перемещение гемопоэза в костный мозг также сопровождается активацией эритропоэза. Когда формирование и рост кроветворной ткани (печени зародыша или костного мозга взрослого животного) заканчивается, в популяции возрастает относительное содержание более потентных КОЕ-С-11, а доля более дифференцированных КОЕ-С-7 уменьшается. Присутствие КОЕ-С-эп является отличительным свойством кроветворной ткани ранних этапов развития и, по всей видимости, КОЕ-С-эп представляют собой транзиторную популяцию клеток, исчезающую из кроветворных органов вскоре после рождения.

Сохраняется ли популяция КОЕ-С в печени после перемещения гемопоэза в костный мозг? Сравнение КОЕ-С-11 из различных источников (костного мозга, периферической крови, печени зародышей и половозрелых животных), а также эксперименты по эктопической трансплантации печени дают отрицательный ответ на этот вопрос. Во-первых, уже в первые дни после рождения мезенхима печени утрачивает способность к созданию кроветворного микроокружения, эффективно поддерживающего кроветворение. Во-вторых, КОЕ-С-11 печени взрослых мышей по способности давать вторичные КОЕ-С соответствуют таковым из периферической крови. Таким образом, тестируемые в печени в постнатальный период КОЕ-С не могут быть признаны резидентными и, скорее всего, поступают в нее из циркуляции.

2. Изучены цитофизиологические особенности КОЕ-С - стадии дифференцировки, не идентифицируемой морфологически. Исследован синтез РНК, как одно из условий, необходимых для вступления в цикл покоящейся популяции КОЕ-С. Применив метод 3Н-уридинового «самоубийства» в сочетании с ингибиторами ДНК-зависимого синтеза РНК, мы оценили синтез РНК в КОЕ-С в зависимости от уровня пролиферативной активности и состояния кроветворения. Впервые КОЕ-С были охарактеризованы как неоднородная по уровню синтеза РНК (в том числе и рРНК) популяция. В ней содержатся клетки, интенсивно синтезирующие РНК, и клетки, способные быстро активировать этот синтез. Высокий уровень синтеза РНК и способность к быстрой его активации в покоящейся популяции КОЕ-С подтверждает представление о соответствии состояния покоя КОЕ-С Gi- периоду клеточного цикла.

Вступление КОЕ-С в пролиферацию под влиянием экспериментально вызванной анемии сопровождается активацией синтеза рРНК и, как следствие, значительным повышением доли КОЕ-С, чувствительных к актиномицину Д. В ряде случаев в кроветворной ткани, получившей сигнал к регенерации, КОЕ-С сохраняют состояние цитокинетическо-го покоя, но реагируют на актиномицин увеличением колониеобразования. Этот ответ на антибиотик-ингибитор синтеза РНК мы рассматриваем, как экспериментальную демонстрацию на примере КОЕ-С механизма, регулирующего численность клеток в популяции и защищающего ее от истощения при функциональном стрессе. Не исключено, что актиномицин Д выступает, как ингибитор синтеза РНК белков, блокирующих переход клетки из Gi в S-фазу (возможно, белка р53 и/или р21).

3. Другое направление нашей работы было посвящено исследованию некоторых этапов дифференцировки кроветворных и стромальных клеток. С этой целью мы использовали цитотоксические препараты, обладающие избирательным действием на клетки разной степени зрелости, а именно, 5-ФУ и дипин, поражающие соответственно более зрелые и более молодые клетки.

В стромальном ряду с помощью этого подхода выявлено несколько категорий клеток, различающихся по степени зрелости и участию в восстановлении кроветворной ткани костного мозга. Критерием дифференцировочных и регенераторных потенций стромальных клеток служило построение de novo полноценного кроветворного микроокружения, завершающегося образованием кроветворного органа.

Установлено, что стромальные клетки, ответственные за регенерацию трансплантата в полном объеме, чрезвычайно чувствительны к дипину, но относительно резистентны к 5-ФУ. Высокий репаративный потенциал позволяет отнести их к категории наиболее молодых мезенхимных (вероятнее всего, стволовых) клеток. Напротив, стромальные клетки с ограниченными репаративными потенциями устойчивы к дипину; они, хотя и создают кроветворную территорию, но не способны восстановить ее размер до контрольного уровня. Среди популяции стромальных клеток обнаружены клетки, участвующие в построении кроветворной территории в ранние сроки после трансплантации. Они чувствительны к 5-ФУ, однако, их отсутствие не влияет на восстановление трансплантата. Полученные результаты послужили основой для построения гипотетической модели гистогене-тического ряда мезенхимных клеток.

Весьма продуктивным оказалось исследование с помощью дипина кроветворного дифферона. Однократное воздействие дипином вызывает длительное нарушение стационарного состояния кроветворной ткани, что выражается в периодических спадах-подъемах численности исследованных категорий КОЕ-С в костном мозге и селезенке. Характер изменений содержания КОЕ-С, клеток с ограниченным самоподдержанием, свидетельствует о чрезвычайно высокой токсичности дипина в отношении наиболее молодых и потентных клеток кроветворного ряда и отражает клоногенную активность последовательно выходящих в дифференцировку выживших стволовых кроветворных клеток. Мы расцениваем подобную динамику численности КОЕ-С, как экспериментальное подтверждение того, что функционирование кроветворного дифферона осуществляется на основе клональной сукцессии.

4. Впервые в модельных экспериментах на млекопитающих оценено влияние факторов космического полета на морфологически неидентифицируемые кроветворные родо-начальные клетки. Показано, что краткосрочный космический полет приводит к достоверному уменьшению содержания КОЕ-С в кроветворных органах. В костном мозге это вызвано действием специфических, тогда как в селезенке - неспецифических факторов полета. Вместе с тем, кратковременная экспозиция в невесомости в плодном периоде не влияет существенно на возрастную динамику содержания КОЕ-С в кроветворных органах, свойственную животным, пренатальное развитие которых прошло в наземных условиях.

5. Установлено, что непрерывное у- облучение в низких дозах (мощность дозы 0,15 сГр/сут, суммарная доза - 1,5 сГр) обладает стимулирующим действием на стромальные родоначальные клетки (КОЕ-Ф). Оно проявляется в усилении пролиферативной активности и увеличении численности КОЕ-Ф в костном мозге. Регенераторная способность стромы костного мозга, оцененная методом эктопической трансплантации по размеру вновь создаваемой кроветворной территории, существенно увеличивается под влиянием непрерывного гамма-излучения низкой мощности. Поскольку за рост эктопических трансплантатов, как было показано в наших экспериментах с цитотоксическими препаратами дипином и 5-ФУ, ответственны, очевидно, стволовые клетки стромы, с большой долей уверенности можно утверждать, что мы обнаружили эффект радиационного гормезиса именно для этой популяции клеток. В отличие от стромальных, кроветворные родоначальные клетки не чувствительны к использованным дозам радиации: изменения числа КОЕ-С в S-фазе и их содержания в костном мозге не происходит.

Безусловно, накопление фундаментальных знаний в области биологии стволовых и родоначальных клеток мезенхимного и кроветворного рядов дифференцировки может служить основой для понимания закономерностей функционирования стволовых клеток иной тканеспецифической природы. Обнаружение феномена радиационного гормезиса открывает новые перспективы в исследовании мезенхимных клеток, имеющих разнообразную тканевую локализацию. Активация клеток, способных к миграции и обладающих гистогенетической пластичностью, может представлять серьезную медико-биологическую проблему. Наша работа открывает перспективы для этого направления исследований, которое потребует более детального изучения с помощью привлечения адекватных модельных систем и методов анализа, специфичных для клеток того или иного гистогенетиче-ского ряда.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Домарацкая, Елена Ивановна, 2004 год

1. Ахмадиева А.Х., Тяжелова В.Г. Изменение способности КОЕ-С образовывать макроколонии при длительном хроническом облучении. Радиобиология, 1989, т. 29, №. 2, стр. 211-214.

2. Бондаренко В.А., Митрикас В.Г., Цетлин В.В. Радиационная обстановка на ОК "Мир" на фазе минимума 22-го цикла солнечной активности (1994-1996 гг.). Авиакосм. биология и эколог, медицина. 2000, т. 34, №1, стр. 21-25.

3. Бутомо Н.В., Иванов В.Б. Некоторые характеристики стволовых кроветворных клеток мышей в фазе повышенной радиорезистентности после сублетального облучения. Радиобиология, 1989, т. 29, № 2, стр. 266- 268.

4. Газарян Л.Г., Шуппе Н.Г., Кульминская А.С. Синтез РНК в присутствии малых доз актиномицина. ДАН СССР, 1965, т. 160, № 6, стр. 1411-1413.

5. Газенко О.Г., Ильин Е.А., Парфенов Г.П. Биологические исследования в космосе (некоторые итоги и перспективы). Изв. АН СССР (серия биол.), 1974, № 4, стр. 461475.

6. Газенко О.Г., Генин A.M., Ильин Е.А. и др. Адаптация к невесомости и ее физиологические механизмы (по материалам экспериментов с животными на биологических спутниках Земли). Изв. АН СССР, серия биол., 1980, № 1, стр. 5-18.

7. Гаузе Г.Г., Дудник Ю.В., Долгилевич С.М. Подавление синтеза нуклеиновых кислот противоопухолевым антибиотиком сибиромицином. Антибиотики, 1972, т. 17, № 5, стр. 413-419.

8. Гусаров И.И., Иванов С.И. О защитных эффектах действия малых доз ионизирующего излучения. АНРИ, 2001, № 4 (27), стр. 8-17.

9. Декстер Т.М. Кроветворные ростовые факторы: их биологическое действие и возможности клинического использования. Онтогенез, 1991, т. 22, № 4, стр. 341-364.

10. Домарацкая Е.И., Мичурина Т.В., Никонова Т.А., Хрущов Н.Г. Влияние факторов космического полета на периферическую кровь тритона Pleurodeles waltlii. Изв. Академии наук, серия биологическая, 1994, № 4, стр. 644-649.

11. Дризе Н.И., Гуревич О. А., Удалов Г.А., Чертков И.Л. Иерархия ранних кроветворных предшественников: пре-КОЕ-С и родоначальная кроветворная клетка. Онтогенез, 1987, т. 18, № 1, стр. 42-50.

12. Дурнова Г.Н., Капланский А.С., Португалов В.В. Влияние 22-суточногокосмического полета на лимфоидные органы крыс. Косм. биол. и авиакосм. мед., 1977, т. 11, № 2, стр. 53-57.

13. Епихина С.Ю, Лациник Н.В. Пролиферативная активность стромальных клеток-предшественников костного мозга, обладающих клоногенными свойствами. Бюлл. эксперим. биол., 1976, № 1, с.55.

14. Зотин А.А. Иммунологические маркеры в исследованиях гистогенеза кроветворной ткани. Успехи совр. биол., 1985, т. 100, №4, стр. 145-159.

15. Зотин А.А., Домарацкая Е.И., Прянишникова О.Д. О существовании пре-КОЕ-С в печени зародышей мыши. Онтогенез, 1988, т. 19, стр. 21.

16. Илюхин А.В., Бурковская Т.Е. Цитокинетическая оценка эритропоэза при длительных орбитальных полетах. Косм. биол. и авиакосм, мед., 1981, т. 6, стр. 42-46.

17. Кейлис-Борок И.В., Лациник Н.В., Епихина С.Ю., Фриденштейн А.Я. Динамика образования колоний фибробластов в монослойных культурах костного мозга по данным включения 3Н-тимидина. Цитология, 1971, т. 13, стр. 1402-1411.

18. Кузин A.M. Роль природного радиоактивного фона и вторичного биогенного излучения в явлениях жизни. М, «Наука», 2002, 79 стр.

19. Лациник Н.В., Епихина С.Ю. Адгезивные свойства клеток кроветворной и лимфоид-ной ткани, образующих колонии фибробластов в монослойных культурах. Бюлл. эксперим. биол., 1973, № 12, стр. 86-90.

20. Лилли Р. Патогистологическая техника и практическая гистохимия. М., «МИР», 1969,645 стр.

21. Макеева В.Ф., Комолова Г.С., Серова Л.В. и др. Активность деполимераз ДНК в селезенке крыс после полета на спутнике «Космос-605». Космич. биол. авиакосм, мед., 1976, т. 17, №3, стр. 32-36.

22. Макеева В.Ф., Комолова Г.С., Егоров И.А. Биосинтез нуклеиновых кислот. В кн.: Онтогенез млекопитающих в невесомости. М. «Наука», 1988, стр. 51-53.

23. Малыжев В.А., Пелевина И.И., Афанасьев Г.Г. и др. Состояние иммунной системы при воздействии малых уровней ионизирующей радиации: исследования в 16-километровой зоне аварии на ЧАЭС. Радиац. биол. радиоэкол. 1993, т. 33, вып. 1(4), стр. 470-478.

24. Митрикас В.Г., Цетлин В.В. Проблемы обеспечения радиационного контроля на ОПС «МИР» в 22-м цикле солнечной активности. Косм, исслед. 2000, №2, стр. 113118.

25. Оганов В.С, Бакулин А.В., Ильин Е.А. и др. Структура и механические свойства костной ткани. В кн.: Онтогенез млекопитающих в невесомости. М., «Наука», 1988, стр.56-60.26.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.