Фенотипический и генетический анализ вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae 0139 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Осин, Александр Владимирович

• Осин, Александр Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Осин, Александр Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Генетические и биохимические особенности штаммов

V. с1го1егае 0139 различной вирулентности.

1.2. Горизонтальный перенос основных генов вирулентности и его роль в формировании вирулентных штаммов холерного вибриона.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Питательные среды и реактивы.

2.3. Методы.

2.3.1. Получение мутантов с помощью индуцированного мутагенеза и определение их питательных потребностей и способности к продукции гемолизина и капсулы.

2.3.2. Конъюгационные скрещивания.

2.3.3. Определение чувствительности культур к холерным фагам.

2.3.4. Определение продукции маннозо-чувствительных гемагглютинирующих пил ей адгезии (МЧПА).

2.3.5. Определение подвижности.

2.3.6. Электронно-микроскопический анализ холерных вибрионов.

2.3.7. Определение продукции фосфолипазы и гемагглюти-нин/протеазы и гемолизина.

2.3.8. Изучение плазмидного состава штаммов V. ско1егае 0139.

2.3.9. Полимеразная цепная реакция.

2.3.10. Определение продукции холерного токсина.

2.3.11. Определение вирулентности.

2.3.12. Электрофоретический анализ белков.

2.3.13. Выделение фаговой ДНК.

2.3.14. Гибридизация по Саузерну и риботипирование.

ГЛАВА 3. ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ШТАММОВ V. СНО

ЬЕЯАЕ 0139 РАЗЛИЧНОЙ ВИРУЛЕНТНОСТИ.

3.1. Определение продукции капсулы и 0139 антигена у штаммов V. с1ю1егае 0139.

3.2. Сравнительный анализ питательных потребностей, подвижности, продукции пилей адгезии и устойчивости к антибиотикам У.сИо1егае 0139 у штаммов с различной вирулентностью.

3.3. Сравнительный анализ белков внешней мембраны, продукции ферментов патогенности (протеазы, фосфолипазы) и гемолизина у штаммов V с!ю1егае 0139, выделенных из разных источников.

ГЛАВА 4. СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ГЕНОМА ВИРУЛЕНТНЫХ И АВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ V. CHOLERAE 0139.

4.1. Изучение структурной организации участков хромосомы вирулентных штаммов 0139 серогруппы V. cholerae Р16064 и Р16131, содержащих гены ctxAB, кодирующих биосинтез холерного токсина.

4.2. Генное зондирование штаммов V. cholerae 0139 для выявления в их хромосоме структурных и регуляторных генов вирулентности, а также инсерционной последовательности RS1 и генома умеренного фага 139.

4.3. Сравнительный ПЦР-анализ структуры генома вирулентных и авирулентных штаммов V. cholerae серогруппы 0139.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИОБРЕТЕНИЯ АВИРУ-ЛЕНТНЫМИ ШТАММАМИ V. CHOLERAE 0139 ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ ОТ ВИРУЛЕНТНЫХ ШТАММОВ.

5.1. Особенности наследования и экспрессии в клетках ави-рулентного штамма V. cholerae 0139 рекомбинантной плазмиды с генами холерного токсина.

5.2. Обмен хромосомными генами между вирулентными и

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ ctxAB - гены, кодирующие биосинтез холерного токсина асе - ген, кодирующий биосинтез дополнительного холерного токzot - ген, кодирующий синтез токсина зонального поглощения tcpA - ген, кодирующий синтез основной субъединицы токсинкорегулируемых пилей адгезии toxR - глобальный регуляторный ген rtxA - ген, кодирующий синтез токсина RTX холерного вибриона attRS - участок хромосомы, в который внедряется фаг СТХф hapA - ген, кодирующий синтез растворимой гемагглютинин/протеазы toxT - регуляторный ген

RS1 - повторяющая последовательность, фланкирующая фаг СТХф

16Sh23S - гены рРНК, входящие в ггл-оперон ггп - кластер генов, ответственных за биосинтез рРНК

СТХф - умеренный нитевидный бактериофаг, несущий гены холерного токсина

УР1ф - умеренный нитевидный бактериофаг, несущий «остров патогенности»

CTXclasi4p - СТХ профаг V. cholerae classica

СТХЕТф - СТХ профаг V. cholerae eltor

СТХса1сф - СТХ профаг V. cholerae 0139, выделенных в Калькутте в 1997 г.

Ктг(з)

Тсг(з)

Отри и ОтрТ Сар*

Мо^ Н1у* РГА/П ХТ

ТКПА МЧПА РПИГ ПЦР

РВБ 808 п. н. т. п. н. кДа ТХУ

- резистентность (или чувствительность) к канамицину

- резистентность (или чувствительность) к тетрациклину

- резистентность (или чувствительность) к ампициллину

- белки - порины внешней мембраны V. скокгае

- штамм, продуцирующий или не продуцирующий полисаха-ридную капсулу

- подвижный или неподвижный штамм

- штамм, продуцирующий или не продуцирующий гемолизин

- растворимая гемагглютинин/протеаза

- холерный токсин

- липополисахарид

- токсин-корегулируемые пили адгезии

- маннозо-чувствительные пили адгезии

- радиальный пассивный иммунный гемолиз

- полимеразная цепная реакция

- Ы-метил-Ы'-нитро-Ь]-!Iитрозогуа!гадин

- фосфатный буфер

- додецилсульфат натрия

- пара нуклеотидов

- тысяча пар нуклеотидов

- килодальтоны

- трихлоруксусная кислота

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Фенотипический и генетический анализ вирулентных и авирулентных штаммов Vibrio cholerae 0139»

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. В 1992 году в Индии и Бангладеш возникла эпидемия холеры, впервые вызванная Vibrio cholerae не 01 серогруппы [Albert М. J. et al., 1993]. Возбудителем этой эпидемии был высоковирулентный штамм, принадлежавший к ранее неизвестной серогруппе 0139 - V. cholerae 0139 с синонимом Бенгал, и имеющий полисахаридную капсулу. Появление возбудителя холеры с новыми свойствами явилось важным событием в эволюции патогенных вибрионов. К настоящему времени установлено, что возникновение большинства клинических штаммов V. cholerae 0139, выделенных в 1992-1993 гг., связано со значительными перестройками в геноме возбудителя 7 00 пандемии холеры V. cholerae биовара эльтор, обусловленными делецией протяженного участка его первой хромосомы, содержащего гены 01 антигена, и приобретением нового «острова па-тогенности» размером около 40 т. п. н., в состав которого входят гены, кодирующие биосинтез 0139 антигена и полисахаридной капсулы. [Waldor М. К., Mekalanos J. J., 1994; Johnson J. A. et al, 1994; Sozhamannan S. et al., 1999; Li M. et al, 2002; Dziejman M. et al, 2002; Farfan M. et al, 2002].

Кроме того, в хромосоме бенгальских штаммов обнаружен новый генетический элемент размером 62 т. п. н., кодирующий резистентность к антибиотикам (сульфаметаксазолу, триметоприму и хлорамфениколу, а так же к низким концентрациям стрептомицина) и получивший обозначение SXT (от англ. sulfamethoxazole, trimethoprim) [Waldor М. К. et al, 1996; Hochhut В., Waldor M. К., 1999; HochhutB. et al, 2000].

Бенгальские штаммы содержат также в хромосоме умеренный фаг типа каппа, получивший обозначение К139 [Reidl J., Mekalanos J. J., 1995] или 139 [Смирнова H. И. с соавт., 1995, 1999; Щелканова Е. Ю., 1998; Ерошенко Г. А., Смирнова Н. И., 2002]. К настоящему времени показано, что фаг 139 вносит значительный вклад в изменчивость генома бенгальских штаммов. Более того, этот фаг содержит гены glo, кодирующие биосинтез неизвестного белка, который в 10 раз повышает вирулентность бенгальских штаммов при заражении ими мышей-сосунков [Reidl J., Mekalanos J. J., 1995].

Однако, несмотря на указанные различия в структуре генома между V. cholerae 0139 серогруппы и V. cholerae биовара эльтор, относящегося к 01 серогруппе, их хромосомы имеют большое сходство. У бенгальских штаммов, как и у штаммов V. cholerae биовара эльтор, ключевые гены вирулентности ctxAB и tcpA-F, кодирующие, соответственно, продукцию холерного токсина (XT) и основного фактора колонизации - токсин-корегулируемых пилей адгезии (ТКПА), размещены в геноме двух профагов СТХф и VPI(p, локализованных в определенных участках хромосомы [Waldor M. К., Mekalanos J. J., 1994; Waldor M. К. et al, 1997; Karaolis D. K. R. et al, 1998; Hase С. C., Mekalanos J. J., 1998; Behari J. et al, 2001; Farfan M. et al, 2002; Boyd E. F., Waldor M. K., 2002].

Одинакова также структура и функция всех изученных к этому времени генов «домашнего хозяйства» (или генов «housekeeping»), находящихся в основной части хромосом вибрионов эльтор и 0139 серогруппы. Таким образом, имеется достаточно полная информация о фенотипических и молекулярно-генетических особенностях, вирулентных штаммов возбудителя холеры новой 0139 серогруппы.

Иная ситуация сложилась в исследованиях, связанных с изучением нетокси-генных штаммов V. сИокгае 0139 серогруппы, выделенных из воды открытых водоемов на территории Российской Федерации в эпидемически благополучные по холере годы.

Первое сообщение о существовании таких вибрионов на территории России поступило в 1996 г., когда из реки Обь в Новосибирской области был выделен ави-рулентный штамм V. с ко 1е гае, агглютинирующийся поливалентной диагностической 0139-антисывороткой. Впоследствии было установлено, что штаммы с указанными свойствами могут обитать в воде открытых водоемов Московской и Ростовской областей, а также Республики Калмыкия [Ганин В. С. с соавт., 1997; Кюре-гян А. А. с соавт., 1999; Ломов Ю. М., с соавт., 2000; Подосинникова Л. С. с соавт., 2000; Кюрегян А. А. с соавт., 2000; Каляева Т. В. с соавт., 2000; Кругликов В. Д. с соавт., 2002; Кюрегян А. А. с соавт., 2002]. Вместе с тем, до начала нашей работы не было полной информации о фенотипических и генетических особенностях этих вибрионов в сравнении с вирулентными штаммами V. с1ю1егае 0139. Имелись лишь отрывочные сведения об отсутствии в их геноме структурного гена ахЛ, ответственного за биосинтез токсической А-субъединицы ХТ, и их неспособности вызывать холерогенный эффект у зараженных животных. Не было попыток изучить возможность приобретения этими вибрионами основных генов вирулентности с£сАВ и оценить эпидемиологические последствия этого события. До сих пор остается невыясненным происхождение «водных» вибрионов, а также наличие (или отсутствие) генетического сходства с вирулентными вибрионами той же серогруппы. Явная недостаточная изученность этой проблемы послужила нам основанием для проведения комплексного фенотипического и молекулярно-генетического сравнительного анализа вирулентных и авирулентных штаммов V. cholerae 0139. Проведение таких исследований позволит не только получить сведения о различных свойствах холерных вибрионов 0139 серогруппы, выделенных от больных и из внешней среды, но и дать более объективную оценку эпидзначимости авирулентных штаммов V. cholerae 0139, для которых водоемы на указанных территориях России оказались удобной экологической нишей.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ - выявление фенотипических и генетических особенностей штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы, выделенных от больных и из воды открытых водоемов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Провести сравнительный анализ различных фенотипических свойств вирулентных и авирулентных штаммов V. cholerae 0139.

2. Сопоставить молекулярно-генетические свойства штаммов V. cholerae 0139, полученных из различных источников, определив присутствие в их геноме структурных и регуляторных генов, связанных с вирулентностью, методами ДНК-ДНК гибридизации и полимеразной цепной реакции.

3. Изучить особенности экспрессии и наследования в клетках авирулентного штамма V. cholerae 0139 рекомбинантной плазмиды с генами холерного токсина.

4. Выяснить возможность переноса хромосомных генов в процессе конъюгации от вирулентных штаммов V. cholerae 0139 к авирулентным с целью определения их генетического родства.

5. Провести молекулярное типирование вирулентных и авирулентных штаммов V. cholerae 0139 с использованием молекулярных зондов, созданных на основе нуклеотидных последовательностей генов 16S и 23S рРНК.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. Впервые проведен комплексный анализ фенотипических свойств вибрионов 0139 серогруппы, выделенных на территории России из различных источников. Между вирулентными и авирулентными вибрионами этой серогруппы выявлены значительные отличия в продукции гемолизина, подвижности, способности образовывать маннозо-чувствительные гемагглютини-рующие пили адгезии, чувствительности к антибиотикам и биосинтезе белков внешней мембраны. Среди авирулентных обнаружены штаммы с повышенным уровнем биосинтеза 0139 антигена.

Показаны заметные различия в структуре геномов штаммов V. cholerae 0139 водного и клинического происхождения. Установлено, что, в отличие от вирулентных, геном штаммов V. cholerae 0139, выделенных из воды, не содержит генов ctxA, zot и асе, кодирующих биосинтез трех различных токсинов и входящих в состав умеренного фага СТХф. Кроме того, впервые определено отсутствие в их хромосоме ¿ztfRS-сайта, необходимого для внедрения фага СТХф в хромосому, а также окружающей этот фаг повторяющейся последовательности RS1. Показано также, что «водные» вибрионы лишены таких генов как tcpA, контролирующих продукцию основной субъединицы ключевого фактора колонизации, и toxT, регулирующего экспрессию важнейших генов вирулентности, которые у вирулентных штаммов локализованы в геноме профага УР1ф. Вместе с тем впервые обнаружено наличие в геноме авирулентных штаммов генов rtx и hapA, отвечающих, соответственно, за биосинтез токсина RTX и растворимой гемагглютинин/протеазы.

Впервые, в результате введения рекомбинантной плазмиды с клонированными генами ctxAB в клетки выделенных из воды штаммов V. cholerae 0139, установлено, что «водные» вибрионы приобретают способность продуцировать холерный токсин, но остаются авирулентными вследствие выявленной нами их слабой колонизирующей способности. Приоритетными являются данные об отсутствии значительного сходства в генетической организации между вирулентными и авирулентными штаммами V. cholerae 0139, которые получены при изучении возможности обмена генетической информации в процессе конъюгации между указанными вибрионами. Низкие частоты образования различных рекомбинантов, возникающих в результате гомологичной рекомбинации, свидетельствуют о наличие лишь незначительных областей гомологии в хромосомах клинических и «водных» вибрионов.

Впервые использован метод риботипирования для дифференциации штаммов V. cholerae 0139 с различной вирулентностью, выделенных в Российской Федерации. Показано, что штаммы, выделенные от больных и из внешней среды, не имеют близкого генетического родства.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам работы составлено методическое пособие «Идентификация штаммов Vibrio cholerae и определение их эпидемической значимости с помощью ПЦР-анализа четырех генов вирулентности ctxA, tcpA, toxR и hapA», которое одобрено Ученым Советом (протокол № 10 от 28 декабря 2001 г.) и утверждено зам. директора Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб».

Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" 6 сконструированных штаммов V. cholerae 0139 серогруппы: четыре ауксо-трофных штамма, несущих мутации в генах, контролирующих различные факторы роста, авирулентный штамм-суперпродуцент 0139 антигена, а также штамм, содержащий гены холерного токсина в составе рекомбинантной плазмиды. Указанные штаммы предназначены для использования их в фундаментальных и прикладных исследованиях.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Штаммы V. cholerae 0139 серогруппы, выделенные из воды открытых водоемов в эпидемически благополучный по холере период, имеют значительные фе-нотипические отличия от клинических штаммов той же серогруппы.

2. Геном авирулентных штаммов V. cholerae 0139 в отличие от клинических штаммов из 10 тестируемых генов не содержит 7 генов, связанных с вирулентностью (ctxA, zot, асе, rstC, о//RS, tcpA, toxT).

3. Вирулентные штаммы V. cholerae 0139, выделенные от больных на территории Российской Федерации, отличаются друг от друга по структурной организации их хромосомных областей, содержащих оперон ctxAB и повторяющуюся последовательность RS1, что указывает на нестабильность их геномов.

4. Авирулентные штаммы V. cholerae 0139 могут стать токсигенными в результате приобретения ими генов ctxAB в составе конъюгативных плазмид. Вместе с тем, вследствие слабой колонизирующей способности эти токсигенные штаммы остаются авирулентными для крольчат-сосунков.

5. Эффективный перенос хромосомных генов от вирулентных штаммов к ави-рулентным отсутствует, что указывает на невысокую степень гомологии их хромосом.

6. Результаты риботипирования вирулентных и авирулентных штаммов V. скокгае 0139 позволяют проводить их дифференциацию.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и представлены на юбилейной научной конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии», посвященной 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии (Обо-ленск, 1999); научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб»: «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2000, 2001, 2002); Проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (Ростов-на-Дону, 2000, 2002); Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» (Москва, 2002).

ПУБЛИКАЦИИ.По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 242 цитируемые работы, из них 167 зарубежных. Об

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Осин, Александр Владимирович

выводы

1. Штаммы V. cholerae 0139, выделенные из воды открытых водоемов на территории Российской Федерации, отличаются от клинических штаммов этой се-рогруппы повышенной продукцией гемолизина, а вряде случаев - и 0139 антигена. В тоже время эти штаммы менее подвижны, лишены маннозо-чувствительных пи-лей адгезии и белка внешней мембраны OmpU.

2. Вирулентные штаммы 0139 серогруппы, выделенные на территории Российской Федерации, отличаются друг от друга по структуре хромосомных участков, содержащих последовательность RS 1 и гены ctxAB, zot, асе, кодирующие продукцию различных токсинов.

3. Выявлены значительные отличия в генетической организации клинических и «водных» вибрионов 0139 серогруппы на основе гибридизационного анализа и данных ПЦР. Установлено, что в геноме «водных» вибрионов из десяти тестируемых генов отсутствуют семь различных генов, связанных с вирулентностью: ctxAB, zot, асе и tcpA, кодирующих биосинтез разных токсинов и основного фактора колонизации, регуляторный ген toxT, а также последовательность RS1 и Ö//RS-сайт. Общими для геномов сравниваемых штаммов являются гены rtxA и hap А, контролирующие продукцию токсина RTX и растворимой гемагглюти-нин/протеазы, а также регуляторный ген toxR.

4. Авирулентные вибрионы 0139 серогруппы могут получать гены ctxAB в составе рекомбинантных плазмид и продуцировать значительное количество биологического активного холерного токсина, но эти токсигенные клоны остаются

138 авирулентными из-за отсутствия у них эффективной колонизирующей способности.

5. Не обнаружено эффективного переноса хромосомных генов в процессе конъюгации от вирулентных штаммов V. скокгае 0139 к авирулентным, происходящего в результате гомологичной рекомбинации, что указывает на не высокую степень гомологии их хромосом.

6. Методом риботипирования были выявлены заметные различия в структуре геномов вирулентных и авирулентных штаммов V. скокгае 0139.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Охватившая в 1992-1993 гг. Индию и Бангладеш, эпидемия холеры, впервые вызванная холерными вибрионами новой 0139 еерогруппы (Бенгал), и быстрое ее распространение на территории других стран и континентов, привлекло к новому этиологическому агенту холеры большое внимание как зарубежных, так и отечественных исследователей. Всестороннее изучение бенгальских штаммов выявило несколько значительных отличий этого возбудителя от традиционного возбудителя холеры V. cholerae 01. Кроме нового 0139 антигена, вибрионы 0139 еерогруппы образовывали на поверхности клетки полисахаридную капсулу, защищающую их от бактерицидного действия человеческой сыворотки крови, обусловливая тем самым возможность септицимии, содержали в своем геноме SXT-элемент, определяющий резистентность V. cholerae 0139 к трем антибиотикам (триметоприму, сульфаметаксозолу, стрептомицину) и умеренный каппа фаг 139, кроме того, часть вирулентных штаммов несла новый профаг, содержащий гены ctxAB и обозначенный как СТХса1сф. [Cholera Working Group, 1993; Hisatsune К. et al., 1993; Johnson J. A. et al., 1994; Manning P. A. et al, 1994; Waldor M. K. et al., 1994; Albert M. J. et al., 1996; Waldor M. K. et al., 1996; Fallarino A. et al, 1997; Mekalanos J. J. et al., 1997; Sharma C. et al., 1997; Davis В. M. et al., 1999]. Большинство исследователей считает, что вирулентные V. cholerae 0139 произошли от вибрионов биовара эльтор, к которым они наиболее близки по свойствам, в результате изменения генов биосинтеза 01 антигена. Изучение вирулентных штаммов 0139 еерогруппы, выделенных в разные годы со времени их возникновения, показало, что возбудитель холеры новой еерогруппы - V. cholerae 0139 является быстро эволюционирующим патогеном, геном которого, включая и гены вирулентности, подвержен быстрым генетическим изменениям [Johnson J. A. et al., 1994; Albert, М. J. et al., 1997; Faruque S. M. et al., 1999; Davis В. M. et al., 1999; Singh D. V. et al., 2001].

В 1993 году на территории Ростовской области, а в 1994 г. и в другой стране СНГ - Киргизии от больных были выделены вирулентные штаммы V. cholerae 0139. Был изучен ряд свойств этих изолятов [Смирнова Н.И., с соавт., 1996; Чеховская Г. В., 1997; Щелканова Е. Ю., 1998], однако структура их геномов, и в частности строение локусов токсиногенности, а также степень родства с бенгальскими вибрионами остались не исследованными.

С 1996 года, в России, преимущественно на территории Новосибирской и Московской областей, из воды открытых водоемов выделяются авирулентные штаммы 0139 серогруппы. Изучение свойств этих штаммов показало отсутствие у них генов А-субъединицы холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии [Балахонов С.В. с соавт., 1998; Балахонов С.В., 2000; Водопьянов С. О., с соавт., 1999; Давыдова Н. А., 2001]. С помощью одно- и двупраймерной ПЦР были выявлены отличия в организации геномов этих штаммов от вирулентных V. cholerae 0139 [Мишанькин Б. Н., с соавт., 2000]. Однако фенотипические и генотипи-ческие особенности этих вибрионов изучены далеко недостаточно. Неизвестно происхождение авирулентных V. cholerae 0139 и степень их генетического родства с вирулентными вибрионами 0139 серогруппы. Остается также неясным, могут ли «водные» вибрионы конверсировать в вирулентные при горизонтальном переносе им генов вирулентности, и являются ли они в полной мере эпидемически безопасными.

Для решения выше указанных вопросов нами было проведено сравнительное изучение свойств авирулентных и вирулентных V. cholerae 0139, выделенных из разных источников на территории Российской Федерации.

Определение продукции 0139 антигена методом развернутой реакции агглютинации показало, что авирулентные V. cholerae 0139 продуцируют его в высоком титре. Половина авирулентных штаммов (9 из 20 изученных) агглютинировались 0139 - антисывороткой в титре 1:1600 - 1:3200, что в 2-4 раза превышает титр вирулентного штамма Р16064, а также семи других бенгальских штаммов. Кроме того, у одного из природных штаммов титр реакции был очень высок и составил 1:6400, что представляет собой определенный интерес, поскольку подобные штаммы в литературе не описаны. Таким образом, по крайней мере, у ряда этих штаммов 0139 антиген экспрессируется более эффективно, чем у вирулентных вибрионов.

При изучении продукции другой иммуногенной структуры V. cholerae 0139 - полисахаридной капсулы, было установлено, что «водные» штаммы, так же как и клинические, продуцируют её, но в отличие от последних не способны спонтанно утрачивать этот поверхностный антиген. Поскольку ранее было показано, что потеря продукции капсулы у вирулентных V. cholerae 0139 может быть связана с присутствием в их хромосоме профага 139, за счет индукции им вторичных хромосомных перестроек в близлежащих генах cap, а также mot и риг, то отсутствие бес-капсульных спонтанных мутантов в популяции авирулентных штаммов 0139 серо-группы может быть объяснено отсутствием этого фага в их геноме [Щелканова Е. Ю., 1998; Щелканова Е. Ю. с соавт., 2000]. Зондирование хромосомы авирулентных вибрионов 0139 серогруппы действительно подтвердило отсутствие у них последовательности ДНК фага 139.

Проверка изучаемых штаммов по питательным потребностям показала, что все они являются прототрофами. Лишь один штамм из группы вирулентных V. cholerae Р07 нуждался для своего роста в добавлении к среде культивирования пуринового основания - аденина. Способность вибрионов расти в условиях минимального количества питательных веществ, является важным адаптационным свойством к выживанию их в неблагоприятных условиях, особенно это касается штаммов V. cholerae, обитающих во внешней среде.

Немаловажная роль в колонизации тонкого кишечника V. cholerae и в развитии инфекционного процесса при холере принадлежит подвижности, так как подвижные вибрионы способны более эффективно колонизировать тонкий кишечник. Сравнительный анализ холерных вибрионов водного и клинического происхождения выявил существовавшие различия между ними по этому признаку. Авирулент-ные штаммы были менее подвижны, что вероятно, так же вносит свой вклад в их авирулентность.

К важным свойствам V. cholerae относится их способность к адгезии, прикреплению возбудителя к эпителиальным клеткам. Одной из структур, принимающей участие в этом процессе, являются маннозо-чувствительные гемагглютинирующие пили адгезии (МЧПА). Анализ изучаемых штаммов показал, что все авирулетные штаммы лишены этой структуры, тогда как у большинства вирулентных вибрионов МЧПА были выявлены.

При проверке исследуемых изолятов на чувствительность к антибиотикам, установлено, что «водные» штаммы чувствительны к триметоприму, сульфаметаксозолу, стрептомицину и, по-видимому, в отличие от бенгальских V. скокгае 0139 не несут в своем геноме 8ХТ-элемента, кодирующего устойчивость к этим антибиотикам. Однако сибирские и московские изоляты были резистентны к ампициллину, в то время как все клинические штаммы были к нему чувствительны. Причины, приведшие к возникновению у авирулентных штаммов устойчивости к ампициллину, пока неизвестны. Можно предположить, что, вероятно, исследуемые штаммы содержат в своем геноме транспозон с геном Р-лактамазы, продукт которого способен нейтрализовать действие антибиотиков группы пенициллина.

Глобальный ген регулятор ШЯ контролирует экспрессию многих генов V. скокгае. В частности он непосредственно регулирует продукцию белков внешней мембраны Отри и ОтрТ, усиливая транскрипцию 0тр11 и подавляя ее у ОтрТ. Анализ белков внешней мембраны показал, что если у всех клинических штаммов,, белок Отри присутствовал в больших количествах, то у авирулентных вибрионов было обнаружено полное отсутствие этого белка. Белок ОтрТ имелся у всех штаммов V. скокгае 0139, независимо от источника их выделения. Очевидно, что экспрессия самого регуляторного гена ШЯ у вирулентных вибрионов 0139 серогруппы происходит более активно, чем у авирулентных вибрионов. Кроме того, следует особо отметить что, на электрофореграмме авирулентных штаммов обнаружен в большом количестве неидентифицированный белок с молекулярной массой приблизительно ЗЗШа, имеющийся в заметном количестве лишь у двух вирулентных штаммов V. скокгае 1306 и 1311. Возможно, что функциональная роль этого белка состоит в защите клеток V. скокгае 0139 от неблагоприятного действия факторов внешней среды.

К нашему удивлению, изучение продукции ферментов патогенности фосфо-липазы и протеазы у вирулентных и авирулентных штаммов V. скокгае 0139 не выявило отличий между ними. Однако, эти данные полностью согласуются с недавними результатами исследований [СиЬаШакийа В. et а!., 1999] клинических и выделенных из внешней среды индийских штаммов V. скокгае 0139. Очевидно, высокая активность этих ферментов необходима также и «водным» вибрионам для выживания в условиях внешней среды. В то же время гемолитическая активность авирулентных вибрионов в несколько раз превосходила таковую у клинических штаммов. По данным эпидемиологического анализа, проведенного рядом исследователей, именно штаммы холерных вибрионов эльтор, имеющие фенотип с1хА+ Н1у вызывали эпидосложнения, тогда как авирулентные штаммы были с(хА~ Н1у + [Подосинникова Л. С., 1993]. Эти данные позволяют рассматривать высокую продукцию гемолизина в качестве признака авирулентности.

Таким образом, изучение фенотипических свойств авирулентных и вирулентных вибрионов 0139 серогруппы выявило значительные отличия между ними, которые могут быть следствием их различного происхождения.

На втором этапе нашей работы, мы проводили изучение генетической организации вибрионов 0139 серогруппы, полученных из различных источников.

Исследование генома вирулентных V. скокгае 0139, выделенных в 1993 г. в Ростовской области, методом блот-гибридизации по Саузерну показало, что они имеют различную структуру локусов токсинообразования. Изучаемые штаммы Р16064 и Р16131, содержат подобно большинству бенгальских штаммов, по две копии генов токсигенности, которые располагаются на хромосоме в непосредственной близости друг от друга, как и у вибрионов эльтор. Однако размеры фрагментов, содержащие гены ctxAB, у этих штаммов неодинаковы, что может быть объяснено, как различиями в структуре самих локусов токсинообразования, так и различной организацией участков хромосомной ДНК, граничащих с этими локуса-ми. Различаются также изучаемые штаммы и по количеству последовательностей RS1, фланкирующие гены токсигенности. Поскольку штаммы Р16064 и Р16131, выделены на одной территории с небольшой разницей во времени, причина этих различий не совсем понятна. Возможно, она связана с неблагоприятными условиями существования, в которые попал штамм, завезенный из эндемического очага в Россию. В любом случае полученные результаты подтверждают данные других исследователей о том, что V. cholerae 0139, также как и V. cholerae биовара эльтор являются быстро изменяющимся возбудителем. Параллельные исследования, штаммов V. cholerae 0139, выделенных из водных источников показало, что они не содержат не только ctxA и tcpA генов, как было установлено ранее [Балахонов C.B. с соавт., 1998; Водопьянов С. О. с соавт., 1999; Балахонов C.B., 2000; Мишанькин Б. Н., с соавт., 2000; Давыдова Н. А., 2001], но что они также не несут гена ctxB, генов других холерных токсинов, таких как дополнительный холерный токсин (асе) и токсин зонального поглощения (zot) и не содержат повторяющейся последовательности RS1. Однако блот-гибридизация по Саузерну выявила наличие у «водных» штаммов 0139 серогруппы последовательности H [Мотин B.JL, 1988], которая видимо, содержит кластер токсина RTX, или его часть. Зондирование хромосом авирулентных штаммов 0139 toxR-зондом показало, что они также как вирулентные V. cholerae 0139 содержат глобальный ген-регулятор toxR, который кроме регуляции генов вирулентности, контролирует и другие важные для жизнедеятельности клеток функции.

Полученные нами результаты исследований генома вирулентных и авирулентных штаммов 0139 серогруппы были подтверждены и расширены на основе использования полимеразной цепной реакции, позволившей провести изучение 32 штаммов V. cholerae 0139, 20 из которых были авирулентны. У всех 20 авирулентных штаммов было подтверждено отсутствие генов ctxA и tcpA и показано также отсутствие генов zot, асе и повторяющейся последовательности RS1.

Использование праймеров на последовательность гена rtxA, подтвердило наличие у всех изученных авирулентных вибрионов кластера генов, определяющего биосинтез токсина RTX, который является пороформирующим белком и может вызывать слабую диарею [Бондаренко В. М. с соавт., 2002]. Полученные результаты не противоречат литературным данным о широком распространении генов rtx среди V. cholerae биовара эльтор и V. cholerae 0139 [Lin W. et al., 1999].

Нами впервые показано отсутствие у «водных» штаммов 0139 серогруппы, выделенных на территории России, attRS сайта, необходимого для интеграции в хромосому фага СТХср, несущего гены ctxAB, zot, асе и др. Это значит что, фаг не может внедряться в геном этих штаммов и образовывать стабильные лизогены по СТХф, что также свидетельствует в пользу их эпидемической безопасности.

Были также получены новые данные об отсутствии у авирулентных штаммов необходимого для экспрессии факторов вирулентности регуляторного гена toxT. Поскольку методом ПЦР у этих вибрионов показано отсутствие и гена tcpA, можно сделать вывод об отсутствии в хромосоме авирулентных V. cholerae 0139 не только последовательности фага СТХф, но и полной последовательности фага УР1ф, содержащего гены, кодирующие гоксин-корегулируемые пили адгезии и регуля-торный белок ТохТ. Использование праймеров на последовательность другого регуляторного гена toxR, подтвердило данные ДНК-ДНК гибридизации о его наличии у изучаемых штаммов. У всех 20 авирулентных штаммов также выявлено присутствие гена растворимой гемагглютинин/протеазы (hapA), что подтверждает его ви-доспецифичность для V. cholerae.

Изучение 12 клинических штаммов, российского и бенгальского происхождения показало, что они содержат все десять тестируемых генов (ctxA, zot, асе, Ö//RS, rstC (RSI), tcpA, toxR, toxT, rtxA, hapA), в то время как хромосомы авирулентных вибрионов содержат лишь 30 % изучаемых генов.

Несмотря на то, что вибрионы 0139 серогруппы, выделенные из внешней среды, не содержат основных генов вирулентности, и значительно отличаются от вирулентных V. cholerae 0139, существует вероятность того, что они могут изменить свою эпидемическую значимость в результате приобретения ими генов вирулентности. Горизонтальный перенос генов согласно современным представлениям является одним из механизмов образования новых вирулентных штаммов.

Для изучения того, как изменится вирулентность водных 0139 вибрионов, при получении ими основного фактора вирулентности холерного токсина в штамм V. cholerae 170 были введены гены токсигенности ctxAB, в составе рекомбинантной плазмиды рСО 107-2. Следует отметить, что частота передачи плазмиды была невысокой и составила лишь 2,0 хЮ ~ 1. Рекомбинантная плазмида рСО 107-2 стабильно сохранялась в клетках нового хозяина. Проверка полученного штамма V. cholerae 170 (рСО 107-2) выявила у него высокий уровень продукции холерного токсина. В реакции GMiELISA количество образуемого токсина составило 7,6 мкг/мл. Кроме того этот белок обладал и высокой биологической активностью, которая была определена в реакции кожной пробы Крейга. Большое количество синтезируемого холерного токсина, возможно, объясняется плазмидной локализацией генов ctxAB, а следовательно их большей копийностью, а также может быть связано с ToxR-независимой регуляцией экспрессии генов токсигенности, находящихся на внехромосомном репликоне. Несмотря на высокий уровень продукции холерного токсина, штамм V. cholerae 170 (рСО 107-2), остался авирулентным для лабораторных животных и не вызвал у них диареи, вероятно из-за отсутствия у него основного фактора адгезии ТКПА и неспособности колонизировать тонкий кишечник животных. Из этого следует, что обитающие в водоемах России авирулентные вибрионы 0139 серогруппы не могут быть эпидемически опасными даже при получении ими генов холерного токсина.

Кроме того, гены вирулентности могут быть переданы авирулентным вибрионам и с помощью иных генетических механизмов горизонтального переноса информации. На основе использования сконструированного ранее Hfr-донора, производного Р16064 [Смирнова Н. И. с соавт., 1996] и полученных нами методом индуцированного мутагенеза полиауксотрофных мутантов штамма 170 впервые проведен конъюгационный перенос хромосомных генов от вирулентного штамма 0139 серогруппы в клетки авирулентного реципиента. Осуществлена передача 8 маркеров ауксотрофности. Частота их переноса была различной и составила пхЮ -пхЮ Л Гены ctxAB и tcpA, однако, переданы не были. Следует также отметить, что в ряде случаев показатели совместной передачи селектируемых и неселектируемых генов были достаточно высоки, что может быть объяснено переносом небольших фрагментов хромосомы донора в клетки реципиента. Низкая частота образования рекомбинантовпроисходящая в результате гомологических рекомбинаций, указывает на отсутствие значительной гомологии у их хромосом. В целом следует отметить, что, несмотря на то, что существует принципиальная возможность конъюга-ционного переноса отдельных хромосомных генов, в том числе и генов вирулентности, низкие показатели частот переноса и небольшие размеры передаваемых фрагментов делают маловероятным возможность одновременного получения ави-рулентными вибрионами сразу нескольких факторов вирулентности, расположенных в различных участках хромосомы.

С целью определения степени генетического родства между вирулентными и авирулентными вибрионами 0139 и выяснения происхождения авирулентных V. cholerae, выделяемых из водоемов на территории России впервые проведено рибо-типирование этих штаммов. Рассчитаны праймеры на последовательности генов 16S и 23 S рРНК, подобраны оптимальные условия проведения полимеразной цепной реакции. Использование зондов на гены 16S и 23 S рРНК позволяет проводить дифференциацию вирулентных и авирулентных штаммов, а также дифференцировать вирулентные вибрионы 0139 серогруппы, выделенные на различных территориях.

С помощью метода риботипирования показано, что «водные» вибрионы 0139 серогруппы представляют собой обособленную группу, значительно отличающуюся от вирулентных V. cholerae 0139. Видимо, они не родственны друг другу и представляют собой эволюционно удаленные группы вибрионов. Единый ри-ботип авирулентных вибрионов, выделенных в Московской и Новосибирской областях, может свидетельствовать либо об их едином происхождении, либо, скорее всего, о существовании механизма селективного отбора, для вибрионов этой серогруппы с данной структурой генов рРНК.

136

Ввиду отсутствия основных генов вирулентности, глубоких фенотипических и генетических отличий авирулентных вибрионов от вирулентных, низкого уровня передачи генетической информации от последних и различного с ними происхождения, V. cholerae 0139, выделенные на территории России из водных источников являются эпидемически неопасными.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Осин, Александр Владимирович, 2002 год

1. Авдеева Е. П., Мазрухо Б. Л., Ишина Е. В., Воронежская Л. Г. Оценка метода серологической идентификации Vibrio cholerae не 01 // Журн. микробиол. -2001.-N4.-С. 75-78.

2. Адамов А.К. Иммунология холеры Саратов: изд-во Сарат. ун-та, 1981.- 320 с.

3. Адамов А. К., Наумшина М. С. Холерные вибрионы. Саратов, 1984. - 328 с.

4. Адамов А.К., Павлова Ю.П. Влияние иммунных антител и ферментного звена ксантина Vibrio cholerae II Журн. микробиол. 1990. -N 2. - С.6-10.

5. Андросова C.B., Быстрый Н.Ф., Хотько Н.И. Изучение влияния природных экологических факторов на микроорганизмы рода Vibrio в открытых водоемах // Микробиол., лаб. диагн. и специф. профилактика карантинных инфекций. -Саратов, 1989.-С. 126-132.

6. Балахонов C.B., Ганин B.C., Урбанович Л.Я. с соавт. Определение генных детерминант холерного энтеротоксина методом полимеразной цепной реакции // Журнал инфекционной патологии. 1998. - № 4. - С. 52-54.

7. Балахонов С. В. Геномные маркеры возбудителя чумы, псевдотуберкулеза, холеры, бруцеллеза: Дис. д-ра мед. наук. Иркутск, 2000. - 263 с.

8. Бондаренко В. М., Мавзютов А. Р., Golkocheva Е. Секретируемые факторы па-тогенности энтеробактерий // Журн. микробиол. 2002. -N 1. - С. 84-90.

9. Власов В. П., Монахова Е. В., Михась Н. К., Мазрухо Б. JI. Сравнительное изучение патогенных свойств различных по происхождению холерных вибрионов не Ol группы // Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 1999. - Вып. 12. - С. 65 - 66.

10. Водопьянов С.О., Олейников И.П., Черепахина И.Я. и др. Ген tcpA и эпидемиологическая значимость холерных вибрионов, выделенных из объектов окружающей среды // Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 1999. - Вып. 12. - С. 50-55.

11. Водопьянов С. О., Олейников И. П., Гончаров Е. К. с соавт. Вариабельные тан-демные повторы как инструмент анализа генома Vibrio cholerae II Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 2001. - Вып. 14. - С. 4547.

12. Ганин B.C., Урбанович Л.Я., Марамович A.C. и др. Vibrio cholerae 0139 («Бен-гал») в Сибири //Матер, науч. конф.посв.100 образования .противочумной службы России. Саратов, 1997 г. - Т.1.- С.30.

13. Гинцбург А. Л., Янишевский Н. В., Мотин В. Л. с соавт. Организация и клонирование структурных генов энтеротоксина Vibrio cholerae eltor RV79II Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. 1984. - N 9. - С. 12-18.

14. Гинцбург А. Л., Янишевский Н. В., Мотин В. Л. с соавт. Природа последовательностей RS 1, фланкирующих ген vet, кодирующий синтез холерного токсина; у Vibrio cholerae eltor // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1986. -N 2. -С.11-19.

15. Гордеева J1.A, Седова А.Г, Ковтунова А.И. Эпидемиология НАГ-инфекций в Астраханской области // Тез. к предстоящей обл. науч.-практ. конф. "Итоги и перспективы профилактики ООИ". Астрахань, 1989. - С. 43-44.

16. Давыдова Н. А. Конструирование тест-системы для выявления возбудителя холеры методом полимеразной цепной реакции: Дис. канд. биол. наук. -Саратов, 2001.- 159 с.

17. Дуванова О. В, Шиманюк Н. Я, Мордвинцева Т. Г, Мишанькин Б. Н. Твиназ-ная активность Vibrio cholerae 0139 серовара «Бенгал», выделенных из различных источников // Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 1999. - Вып. 12. - С. 78.

18. Дунаев Г.С, Зыкин Л.Ф. НАГ-инфекция самостоятельная нозологическая единица // Особо опасные и редко встречающиеся тропические инфекции. -Волгоград, 1980. - С.28-29.

19. Ермольева З.В, Краснова И.Н, Ведышина Е.А. Неагглютинирующиеся вибрионы у людей с кишечными заболеваниями // Актуальные вопросы микробиологии. Москва, 1970. - С. 64-65.

20. Ерошенко Г. А. Получение ауксотрофных мутантов холерного вибриона методом индуцированного мутагенза. В кн.: Молекул, биол. и гентика особо опасных инф, Саратов, 1982. - ч. I. - С. 23-27.

21. Ерошенко Г. А, Смирнова Н. И. Изменение эффективности биосинтеза холерного токсина у Vibrio cholerae 01 в результате интеграции умеренного фага 139 в бактериальную хромосому // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. -2002.-N2.-C.9-14.

22. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липополисахаридов грамотрицатель-ных бактерий. I. Общая характеристика липополисахаридов и структура липи-да А (обзор) // Биохимия. 1993. - Т. 58, Вып.2. - С. 166-181.

23. Король В. В., Смоликова Л. М., Гофман Е. Л. Изучение взаимосвязи некоторых признаков вирулентности возбудителя холеры // В кн.: Тез. докл., предст. на науч.-практ. конф. по актуал. вопр. пробл. «Холера». Ростов-на-Дону., 1984. - С. 54-56.

24. Кузьмиченко И. А., Громова О. В., Киреев M. Н. с соавт. Фосфолипазная активность в холерной химической вакцине и ее компонентах // Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 2002. - Вып. 15. - С. 102 — 103.

25. Литвин В.Ю., Гинцбург A.JL, Пушкарева В.И. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий // Под. ред. C.B. Прозоровского. М., 1998. - 256 с.

26. Ломов Ю. М., Мазрухо Б. Л., Мишанькин Б. Н. с соавт. Случай завоза на территорию России холеры, вызванной новым сероваром // Журн. микробиол. -1995.-N2. -С. 97-101.

27. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984.-480 с.

28. Миллер Д. Эксперименты в молекулярной генетике // Москва, 1976. 396 с.

29. Мишанькин Б. Н., Ломов Ю. М., Шиманюк Н. Я. с соавт. Нейраминидазная активность у вибрионов различной серопринадлежности // Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 2000. - Вып. 13. - С. 78-80.

30. Мишанькин Б. Н., Романова Л. В., Ломов Ю. М. с соавт. Vibrio cholerae 0139, выделенные от людей и из воды открытых водоемов: сравнительное генотипи-рование // Журн. микробиол. 2000. - N 3. - С. 3-7.

31. Мишанькин Б. Н., Водопьянов А. С., Ломов Ю. М. с соавт. Мультилокусный VNTR-анализ Vibrio cholerae 0139, выделенных от людей и из проб воды поверхностных водоемов // Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 2002. Вып. 15. - С. 54-57.

32. Монахова Е.В., Михась Н.К., Смоликова A.M., Мишанькин Б.Н. Изучение генетических детерминант токсинов кассеты вирулентности и нейраминидазы холерных вибрионов с помощью молекулярного зондирования // Журн. микро-биол.-2001.-N2.-C. 25-29.

33. Мотин В.Л. Структурная организация хромосомы холерных вибрионов в области токсинообразования: конструирование вектора для создания живой вакцины: Автреф. дис. канд. биол. наук. М., 1988. - 22 с.

34. Онищенко Г.Г. Актуальные проблемы холеры М.: ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, 2000. -384 с.

35. Остерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. - 288 с.

36. Подосинникова Л. С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автореф. дис. д-ра мед. наук. Саратов, 1993. -44 с.

37. Развых В.М. Биологические свойства НАГ-вибрионов и особенности их циркуляции: Автореф. дис. уч. ст. канд. мед. наук. Москва, 1984. - 22 с.

38. Ривкус Ю. 3., Зайцева Т. С., Кочеровская Е. Ю. с соавт. Способность лизиро-вать эритроциты человека как фактор патогенности Vibrio cholerae // Журн. микробиол. 1999. -N 6. - С. 86-87.

39. Семиотрочев В. Л. Энтеропатогенные свойства штаммов холерных вибрионов, продуцирующих гемолизин I типа подтипа (3 // Тез. докл. Всесоюз. науч. конф. «Актуальные вопр. микробиол., лаб. диагн. и профилакт. холеры». Ростов-на-Дону, 1988.-С. 119-120.

40. Середин В.Г., Мухамедов С.М., Инжеватова М.В. К вопросу о роли холерных вибрионов не 01 группы (НАГ-вибрионов) в экологической структуре острых кишечных инфекций в Узбекистане // Тез. Всесоюз. науч. конф. Ростов-на-Дону, 1988. С. 276-279.

41. Смирнова Н. И., Ильина Т. С, Ливанова Л. Ф., Смирнов Г. Б. Генетический анализ мутаций, влияющий на синтез соматического О-антигена у холерного вибриона // Молек. генет., микробиол. и вирус. 1985. - №10. - С. 3-8.

42. Смирнова Н.И., Чеховская Г.В., Давыдова Н.И. Фенотипический анализ двухморфологически разных типов колоний Vibrio cholerae 0319 // Мол. генет., микробиол. и вирус. 1995. -N 3. - С. 30-34.

43. Смирнова Н. И., Ерошенко Г. А., Чеховская Г. В. с соавт. Создание системы конъюгационного переноса хромосомы и генетическое картирование хромосомы Vibrio cholerae серогруппы 0139 // Молекул, генетика, микробиол. и ви-русол,- 1996.-N2.-C.14-18.

44. Смирнова Н. И., Ерошенко Г. А., Щелканова Е. Ю. Умеренный фаг Vibrio cholerae 0139: характеристика и роль в изменении экспрессии хромосомных генов вирулентности // Молекул, генетика, микробиол. и вирусол. 1999. - N 1. -С. 17-22.

45. Смирнова Н.И. Генетический контроль патогенности Vibrio cholerae: умеренный нитевидный фаг ctx, кодирующий холерный токсин и остров патогенности // Молекул, генетика. 1999. - № 4. - С. 1-15.

46. Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследований / Под ред. М. О. Бригера. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 1982. - 462 с.

47. Сухарь В. В., Лобанов В. В, Ишина Е. В. К вопросу капсулообразования у V. cholerae 0139 // Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 2001. - Вып. 14. - С. 47-48.

48. Телесманич Н. Р., Непомнящая Н. Б., Винокур Н. И. Гемолизины холерных вибрионов как липогликопротеиновые полиферментные комплексы // Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 2001. - Вып. 14. - С. 52

49. Телесманич Н. Р., Мишанышн М. Б. Биологическая роль гемоцитолизина холерных вибрионов // Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 2002. - Вып. 15. - С. 46 - 49.

50. Ткаченко В.В. Липополисахариды холерного вибриона и некоторые энтеро-бактерии // Журн. микробиол. 1982. - N 2. - С. 20-28.

51. Федорова В.А., Девдариани 3.JL, Громова О.В., Ливанова Л.Ф. Некоторые им-мунохимические и иммунологические свойства капсульного антигена V.cholerae 0139 серовара // Мол. генет. 1997. - N3. - С. 12-20.

52. Челдышева Н. Б. Дифференциация штаммов Vibrio cholerae 01 с различной эпидемической значимостью на основании четырех генов вирулентности: ctxA, tcpA, toxR и hapA: Дис. канд. мед. наук. Саратов, 2002. - 173 с.

53. Чеховская Г. В., Смирнова Н. И. Создание и свойства штаммов Vibrio cholerae серовара 0139 с повышенной продукцией холерного токсина // Генетика. -1994. Т. 30.-С. 177-178.

54. Чеховская Г. В. Генетический анализ области Vibrio cholerae 0139, содержащий гены О-антигена: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1997. - 44 с.

55. Шагинян Б.М., Маракуша Б.И. Модификация метода пассивного иммунного гемолиза на плотной среде для выявления продукции термостабильных энте-ротоксинов штаммами холерных вибрионов и кишечной палочки // Журн. микробиол. 1983. -N 7. - С. 92-96.

56. Шиманюк Н. Я., Мордвинцева Е. Г., Мишанькин Б. Н. Полимиксинацилазнаяактивность V cholerae 0139 «Бенгал» // Пробл. комиссия «Холера и патогенные для человека вибрионы». Ростов-на-Дону, 1999. - Вып. 12. - С. 76-77.

57. Шопырева С. Ф. Vibrio cholerae не Ol/не 0139: генетическое картирование хромосомы и изучение возможности обмена генами О-антигена между холерными вибрионами разных серогрупп: Дис. канд. биол. наук. Саратов., 2000. -173 с.

58. Щелканова Е.Ю., Заднова С.П., Коннов Н.П., Смирнова Н.И Методические рекомендации по идентификации капсульных и бескапсульных штаммов Vibrio cholerae 0139 серогруппы при помощи холерных бактериофагов «20» и «Ина-ба». Саратов, 1998. - 6 с.

59. Щелканова Е.Ю., Смирнова Н.И. Новые гены Vibrio cholerae 0139 и их роль в патогенности // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1998. - С.31-37.

60. Щелканова Е. Ю., Ерошенко Г.А., Ливанова Л.Ф., Смирнова Н.И. Изучение распространенности и роли умеренного фага Vibrio cholerae 0139 в фенотипи-ческой изменчивости возбудителя холеры // Пробл. особо опасных инф. Саратов, 1998. - С. 163-169.

61. Щелканова Е. Ю. Молекулярно-генетический анализ хромосомной сар-области Vibrio cholerae 0139: Дис. канд. биол. наук. Саратов., 1998. - 139 с.

62. Щелканова Е. Ю., Чеховская Г. В., Смирнова Н. И. Бескапсульные мутанты Vibrio cholerae 0139 серогруппы: получение, идентификация и использование для изготовления диагностической 0139 антисыворотки // Журн. микробиол. -2000.-N1.-С. 34-37.

63. Яговкин Э.А. Иммунохимические и биологические свойства липополисахари-дов холерного вибриона эльтор: Автореф. дис. ст. канд. мед. наук. Саратов, 1982. -С.20.

64. Adelberg Е.А., Mandel М., Chen G.G. Optimal condition for mutagenesis by N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine in Escherichia coli K12 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1965. - V. 18, N 5. - 6, P.788-795.

65. Albert M. J., Siddique A. K., Islam M. S. Large outbreak of clinical cholera due to Vibrio cholerae non-01 in Bangladesh // Lancet. 1993. - V.341. - P.704.

66. Albert M. J., Anzaruzzaman M., Bardan P. K. Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet. 1993. - V. 342. - P. 387-390.

67. Albert M. J., Bhuiyan N. A., Talukder K. A. et al. Phenotypic and genotypic changes in Vibrio cholerae 0139 Bengal // J. Clin. Microbiol. 1997. - V.35. - P. 25882592.

68. Albert M. J., Qadri F., Bhuiyan N. A. et al. Phagocytosis of Vibrio cholerae 0139 Bengal by human polymorphonuclear leukocytes // Clin, and Diagn. Lab. Immun. -1999.-V. 6.-P. 276-278.

69. Arakawa E., Murase Т., Matsushita S. et al. Pulsed-fleld gel electrophoresis-based molecular comparison of Vibrio cholerae 01 isolates from domestic and importedcases of cholera in Japan // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 424-426.

70. Attridge S. R., Rowley D. The role the flagellum in the adherence of Vibrio cholerae II J. Infect. Dis. 1983. - V. 147. - P864-872.

71. Attridge S. R., Qadri F., Albert M. J., Manning P. A. Susceptibility of Vibrio cholerae 0139 to antibody-dependent, complement-mediated bacteriolysis // Clin, and Diagn. Lab. Immun. 2000. - V. 7. - P. 444-450.

72. Behari J., Stagon L., Calderwood S. B. pep A, a gene mediating pH regulation of virulence genes in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2001. - V. 183. -P. 178-188.

73. Beltran P., Delgado G., Navarro A. et al. Genetic diversity and population structure of Vibrio cholerae II J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37. - P. 581-590.

74. Bhaskaran K., Rouley D., Nutritional stadies on Vibrio cholerae II Gen. Microbiol. -1956. V.15, N 2. - P.417-422.

75. Bik E. M., Bunschoten A. E., Gouwn R.D. Genesis of the novel 8 epidemic Vibrio cholerae 0139 strain: evidence for horizontal transfer of genes involved in polysaccharide syntesis // EMBO. 1995. - V.14, N 2. - P.209-216.

76. Bik E.M., Gouw R.D., Mooi P.R. DNA fingerprinting of Vibrio cholerae strains with a novel insertion sequence elements: a tool identify epidemic strains // Clin.

77. Microbiol. 1996. - V.34, N6. - P. 1453-1461.

78. Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Vibrio cholerae hemaggluti-nin/protease nicks cholera enterotoxin // Infect. Immun. 1984. - V. 45. - 558-560.

79. Boyd E. F., Waldor M. K. Alternative mechanism of cholera toxin acquisition by Vibrio cholerae: generalized transduction of CTXcp by bacteriophage CP-T1 // Infect. Immun. 1999. -V. 67. - P. 5898-5905.

80. Boyd E. F., Heilpern A. J., Waldor M. K. Molecular analysis of a putative CTXcp precursor and evidence for independent acquisition of distinct CTXcps by toxigenic Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 5530-5538.

81. Boyd E. F., Waldor M. K. Evolutionary and functional analyses of variants of the toxin-coregulated pilus protein TcpA from toxigenic Vibrio cholerae non-Ol/non-0139 serogroup isolates // Microbiology. 2002. - V. 148. - P. 1655-1666

82. Bradley D.E., Taylor D.E., Cohen D.R. Specification of surface mating system among conjugative drug resistance plasmids in Escherichia coli K12 // Bacteriol. -1980. V.143, N 3. - P. 1466-1470.

83. Bramucci M. G., Holmes R.K. Radial passive immune hemolysis assay for detection of heat labile enterotoxin produced by individual colonies of E. coli or V cholerae II J. Clin. Microbial. 1978. - Vol. 2., № 2. - P. 252-255.

84. Broady K.W., Rietschel E., Luderitz O. The chemical structure of the lipid A component of lypopolysaccharides from Vibrio cholerae II Biochem. 1981. - V.115. -P. 463-468.

85. Burnet F.M., Stone J.D. Desquamation of intestinal epithelium in vitro by Vibriocholerae filtrates: characterization of mucinase and tissue disintegrating enzymes // AustrJ. Exp. Biol. Med. Sci. 1947. - N 25. - P. 219-226

86. Byun R., Elbourne L. D., Lan R., Reeves P. R. Evolutionary relationships of pathogenic clones of Vibrio cholerae by sequence analysis of four housekeeping genes // Infect. Imuran. 1999. - V. 67. - P. 1116-1124.

87. Calia K.E., Murtagh M., Ferraro M.J., Calderwood S.B. Comparison of Vibrio cholerae 0139 with V.cholerae 01 classical and Ei Tor biotypes // Infect. Immun. -1994. V.62. - P.1504-1506.

88. Chakraborty S., MukhopadhyaY A. K., Bhadra R. K. et al. Virulence genes in environmental strains of Vibrio cholerae II Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. -P. 4022-4028. „

89. Chithis D.S., Sharma K.D., Kamat R.S. Role of somatic antigen of Vibrio cholerae in adhesion to intestinal mucosa // Med. Microbiol. 1982. - V. 15, N 1. - P. 53-61.

90. Cholera Working Group. International center for diarrhea disease research, Bangladesh. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal // Lancet. 1993. - V.342. - P. 387-390.

91. Chongsa-Nguen M., Chalcumpa W., Moolasart P. et al. Vibrio cholerae 0139 Bengal in Bangkok//Lancet. 1993,-V. 341.-P. 1347.

92. Comstock L. E., Maneval D., Paningrahi P. The capsule and O-antigen in Vibrio cholerae 0139 Bengal are associated with a genetic region not present in Vibrio cholerae 01 // Infect. Immun. 1995. - V.63, N 1. - P. 317-323.

93. Cotter P.A., DiRita V.J., Bacterial virulence gene regulation: an evolutionary perspective // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - V. 54. - P. 519-565.

94. Craig J.P. A permeability factor (toxin) found in choler stools and culture filtrates and its neutralization by convalescent choler sera // Nature. 1965. - Vol. 207, N 4997.-P. 614-616.

95. Crawford J. A., Kaper J. B., DiRita V. J. Analysis of ToxR dependent transcription activation of ompU, the gene encoding a major envelope protein in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 1998. - V. 29. - P. 235-246.

96. Dalsgaard A., Serichantalergs O., Forslund A., et al. Clinical and environment isolates of Vibrio cholerae serogroup 0141 carry the CTX phage and genes encoding the toxin-coregulated pili // J. Clinical. Microbiology. 2001. - Vol. 39. - P. 40864092.

97. Dalsgaard A., Echeverria P., Larsen J. L. et al. Application of ribotyping for differentiating Vibrio cholerae non-Ol isolates from shrimp farms in Thailand // Appl. Environ. Microbiol. 1995. -V. 61. - P. 245-251.

98. Davis B. M., Kimsey H. H., Chang W., Waldor M. K. The Vibrio cholerae 0139 Calcutta CTXcp is infectious and encodes a novel repressor // J Bacteriol. 1999. -V. 181.-P. 6779-6787.

99. Dhar R., Mahbool A., Thafoor A. Unusual non-serogroup 01 Vibrio cholerae bacteremia associated with liver disease // Clin. Microbiol. 1989. - V.63. - P. 28532855.

100. DiRita V. J., Parsot C., Jander G., Mekalanos J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1991. V. 88. - P. 54035407.

101. Dumontier, S., Berche P. Vibrio cholerae 022 might be a putative source of exogenous DNA resulting in the emergence of the new strain of Vibrio cholerae 0139 // FEMS Microbiol. Lett. 1998. - V. 164. - P. 91-98.

102. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental choler in infant rabbits: a method for chemo-therapeutic investigation // Brit. J. Pharmocol. 1955. - Vol. 10, N 2. - P. 18981899.

103. Dziejman M., Balón E., Boyd D. et al. Comparative genomic analysis of Vibrio cholerae: gene that correlate with cholera endemic and pandemic disease // PNAS. -2002.-Vol. 99.- 1556-1561.

104. Farfan M., Minana-Galbis D., Fuste M. C., Lorén J. G. Allelic diversity and population structure in Vibrio cholerae 0139 Bengal based on nucleotide sequence analysis // J. Bacteriol. 2002. - V. 184.-P. 1304-1313.

105. Faruque A. S., Fuchs G. J., Albert M. J. Changing epidemiology of cholera due to

106. Vibrio cholerae Ol and 0139 Bengal in Dhaka, Bangladesh II Epidemiol. Infect. -1996.-V. 116.-P. 275-278.

107. Faruque S. M., Asadulghani, Alim A. R., et al. Induction of the lysogenic phage encoding cholera toxin in naturally occurring strains of toxigenic Vibrio cholerae 01 and 0139 // Infect. Immun. 1998. -V. 66. - P. 3752-3757.

108. Faruque S. M., Rahman M. M., Asadulghani et al. Lysogenic conversion of environmental Vibrio mimicus strains by CTXcp // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P. 5723-5729.

109. Faruque S. M., Siddique A. K., Saha M. N. et al. Molecular characterization of a new ribotype of Vibrio cholerae 0139 Bengal associated with an outbreak of cholera in Bangladesh // J. Clin. Microbiol. 1999. -V. 37. - P. 1313-1318.

110. Faruque S. M., Asadulghani, Rahman M. M. et al. Sunlight-induced propagation of the lysogenic phage encoding cholera toxin // Infect. Immun. 2000. - V. 68. - P. 4795-4801.

111. Faruque S.M, Rahman S.M, Hasan M.M. et al. Diminished diarrheal response to V cholerae strains carrying the replicative form of the CTX<() genome instead of CTX(|> lisogens in adult rabbits. // Infect. Immun. 2001. - Vol. 69, № 10. - 6084-6090.

112. Faruque S. M, Asadulghani, Kamruzzaman M. RSI element of Vibrio cholerae can propagate horizontally as a filamentous phage exploiting the morphogenesis genes of CTXcp // Infect. Immun. 2002. - V. 70. - P. 163-170.

113. Fields P. I, Popovic T, Wachsmuth K, Olsvik O. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae 01 strains from the Latin American cholera epidemic // J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30. - P. 2118-2121.

114. Finkelstein R.A, Boesman-Finkelstein M, Chang Y. et al Vibrio cholerae hemag-glutinin/protease, colonial variation, virulence and detachment // Infect. Immun. -1992.-V. 60.-P. 472-478.

115. Finkelstein R. A, Boesman-Finkelstein M, Sengupta D. K. et al. Colonial opacity variations among the choleragenic vibrios // Microbiology. 1997. - V. 13. - P. 2324.

116. Finn Th. M, Reiser J, Germanier R, et al. Cell-associated hemagglutinin-deficient mutant of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1987. -V. 55. - P. 942-946.

117. Fisher-Hock S.P, Khan A, Inam-ul-Haq et al. Vibrio cholerae 0139 in Karachi, Pakistan//Lancet. 1993.-V. 342, N 8884.-P. 1422-1423.

118. Fuerst J. A, Perry J. W. Demonstration of lipopolysaccharide on sheathed flagella of Vibrio cholerae Ol by protein A-gold immunoelectron microscopy // J. Bacteriol. -1988.-V. 170.-P. 1488-1494.

119. Fullner K.J., Mekalanos J.J. Genetic characterization of a new type IV-A pilus gene cluster found in both classical and Ei Tor biotypes of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1999. -V.67. - P. 1339-1404.

120. Gardel C.L., Mekalanos J.J. Alterations in Vibrio cholerae motility phenotypes correlate with changes in virulence factor expression // Infect. Immun. 1996. - V.6, N 6. - P. 226-2255.

121. Garg P., Nandy R. K., Chaudhury P. Emergence of Vibrio cholerae 01 biotype El Tor serotype inaba from the prevailing 01 ogawa serotype strains in India // J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 4249^253.

122. Ghosh C., Nandy R. K., Dasgupta S. K. et al. A search for cholera toxin (CT), toxin coregulated pilus (TCP), the regulatory element ToxR, and other virulence factors in non-01/non-0139 Vibrio cholerae II Microb. Pathog. 1997. -V. 22. - P. 199-208.

123. Goldberg I., Mekalanos J. J. Effect of a recA mutation on cholera toxin gene amplification and deletion events // J. Bacteriol. 1986. -V. 165. - P. 723-731.

124. Hall R.H., Khambaty L.M., Kothary M. et al. Non-01 Vibrio cholerae II Lancet. -1993.-Vol.32.-P. 430.

125. Hanne L.P., Finkelstein R.A. Characterization and distribution of the hemagglutinins production by Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1992. - V.36. - P. 209-214.

126. Hase C. C., Finkelstein R.A. Cloning and nucleotide sequence of the Vibrio cholerae hemagglutinin/protease (HA/Protease) gene and construction of an HA/Protease-negative strain // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P.3311-3317.

127. Hase C. C., Mekalanos J. J. TcpP protein is a positive regulator of virulence gene expression in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. V. 95. - P. 730-734.

128. Heilpern A. J., Waldor M. K. CTXcp infection of Vibrio cholerae requires the tolQRA gene products // J Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 1739-1747.

129. Hochhut B., Waldor M. K. Site-specific integration of the conjugal Vibrio cholerae SXT element into prfC // Mol. Microbiol. 1999. - V. 32. - P. 99-110.

130. Hochhut B., Marrero J., Waldor M. K. Mobilization of plasmids and chromosomal DNA mediated by the SXT element, a constin found in Vibrio cholerae 0139 // J. Bacteriol. 2000. -V. 182. - P. 2043-2047.

131. Holliday R.A. A new method for the identification of biochemical mutants of microorganism //Nature. 1956. - V. 178, N 4540. - P. 987.

132. Holliger P., Riechmann L. A conserved infection pathway for filamentous bacteriophages is suggested by the structure of the membrane penetration domain of the minor coat protein g3p from phage fd // Structure. 1997. - V. 5. - P. 265-275.

133. Honda T., Booth B.A., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Comparative study of Vibrio cholerae non-01 protease and solubb hemagglutining with this of Vibrio cholerae 01 // Infect. Immun. 1987. - P. 451-454.

134. International center for diarrhea disease research, Bangladesh. Recent diarrhea epidemic in Bangladesh used by a new strain of Vibrio cholerae non-01 // Glimpse. -1993.-Vol.15,N2.-P. 1-3.

135. Islam M.S., Hasan M.K., Miah M.A., Qadri F. Isolation of Vibrio cholerae 0139 Bengal Arom water in Bangladesh // Lancet. 1993. - Vol.32, N 8868. - P. 430.

136. Iwanaga M., Yamamoto K., Higa N. et al. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae 01 El Tor // Microbiol. Immunol. 1986. - V. 30. — P.1075—1083.

137. Johnson G., Osek J., Svennerholm A.M., Holmgren F. Immune Mechanism and protective antigens of Vibrio cholerae serogroup 0139 as a basis for vaccine development // Infect. Immun. 1996. - Vol.6. - P. 3778-3785.

138. Johnson J.A., Salles C.A., Panigrahi P., Albert M.J. Vibrio cholerae 0139 synonym Bengal is closely related to Vibrio cholerae Eltor but has important differenes // Infect. Immun. 1994. - Vol.62, N 5. - P. 2108-2110.

139. Jones G. W., Freter R. Adhesive properties of Vibrio cholerae: nature of the interaction with isolation rabbit brush border membranes and human erythrocytes // Infect. Immun. 1976. -V. 14. - P. 240-245.

140. Kabir S. Characterization of the lopopolysaccharide from Vibrio cholerae 395 (Ogawa) // Infect. Immun. 1982. - V.38, N 3. - P. 1263-1272.

141. Kado C. I., Liu S. T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmid // J. Bacteriol. 1981. - V. 145, N3.-P. 1365-1373.

142. Kaper J.B., Fasano A., Trucksis M. Toxins of Vibrio cholerae II Vibrio cholerae and cholera: Molecular to global, perspectives. Edited by L.K. Wahsmuth, P.A.Blake, O. Olsvik. ASM Press, Washington, 1994. P. 145-176.

143. Kaper J.B., Morris J.G., Levine M.M. Cholera // Clin. Microbiol. Rev. 1995. - V.8.- P. 48-86.

144. Karaolis D. K. R, Lan R., Reeves P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-01 Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1995. -V. 177. - P. 3191-3198.

145. Karaolis D. K. R, Johnson J. A., Bailey C. C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemik strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1998. V.95, N 6. - P.3134-3139.

146. Karaolis D. K. R., Somara S., Maneval D. R. et al. A bacteriophage encoding a pathogenicity island, a type-IV pilus and a phage receptor in cholera bacteria // Nature. 1999. -V. 399. - P. 375-379.

147. Keasler S. P., Hall R.N. Detecting and biotyping V cholerae 01 with multiplex polimerase chain reaction // Lancet. 1993 - Vol. 341. - P. 1661.

148. Kimsey H. H., Nair G. B., Ghosh A., Waldor M. K. Diverse CTXcp and evolution of new pathogenic Vibrio cholerae H Lancet. 1998. - V. 352. - P. 457-458.

149. Kimsey H. H., Waldor M. K. CTXcp immunity: application in the development of cholera vaccines // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. V. 95. - P. 7035-7039.

150. Krukonis E. S., Yu R. R., DiRita V. J. The Vibrio cholerae ToxR/TcpP/ToxT virulence cascade: distinct roles for two membrane-localized transcriptional activators on a single promoter // Mol. Microbiol. 2000. - V. 38. - P. 67-84.

151. Lan R., Reeves P. R. Recombination between rRNA operons created most of the ri-botype variation observed in the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae II Microbiology. 1998.-V. 144.-P. 1213-1221.

152. Lazar S., Waldor M.K. ToxR-independent expression of cholera toxin of replicative form of CTX4> // Infect. Immun. 1998. - Vol.66, №1. - P. 394-397.

153. Levine M. M., Kaper J. B., Black R. E., Clements M. L. New knowledge on pathogenesis of bacterial enteric infections as applied to vaccine development // Microbiol. Rev. 1983. - V. 47. - P. 510-550.

154. Li C. C., Crawford J. A., DiRita V. J., Kaper J. B. Molecular cloning and transcriptional regulation of ompT, a ToxR-repressed gene in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2000. -V. 35. - P. 189-203.

155. Li M., Shimada T., Morris J. G., et al. Evidence for the emergence of non-Ol and non-0139 Vibrio cholerae strains with pathogenic potential by exchange of O-antigen biosynthesis regions // Infect. Immun. 2002. - V.70, N 5. - P. 2441-2453.

156. Lin W., Fullner K. J., Clayton R. et al. Identification of a Vibrio cholerae RTX toxingene cluster that is tightly linked to the cholera toxin prophage // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999. -V. 96. P. 1071-1076.

157. Lugtenberg B., Bronstein H., van Selm N., Peters R. Peptidoglycan associated outer membrane proteins in gramm-negative bacteria // Biochim. Biophys. Acta. -1977.-V.433.-P.118.

158. Marsh J. W., Taylor R. K. Genetic and transcriptional analyses of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus // J. Bacteriol.- 1999. -V. 181. P.l 110-1117.

159. Mekalanos J. J. Duplication and amplification of toxin genes in Vibrio cholerae II Cell. 1983. -V. 35. - P. 253-263.

160. Mekalanos J.J., Rubin E.J., Waldor M.K. Cholera: molecular basis for emergence and pathogenesis // FEMS Microbiol. Lett. 1997. - V. 18. - P. 241-248.

161. Miller V. L., Taylor R. K., Mekalanos J. J. Cholera toxin transcriptional activator ToxR is a transmembrane binding protein // Cell. 1987. - V. 48. - P. 271-279.

162. Mooi F.R., Bik E.M. The evolution of epidemic Vibrio cholerae strains // Trends Microbiol. 1997. - V.5, N4. - P. 161-165.

163. Mudd S., Anderson T.F., Selective "staining" for electron microscopy. The effect of heavy metal salts on individual bacterial cells // Exp. Med. 1942. - V.76. - P. 103107.

164. Mukhopadhyay A.K., Chakraborty S., Takeda Y. et al. Characterization of VPI pathogenicity island and CTXcp prophage in environmental stains of Vibrio cholerae. II J. Bacteriology. 2001. - V. 183. - 4737-3746.

165. Murley, Y. M., Carroll P. A., Skorupski K et al. Differential transcription of the tcpPH operon confers biotype-specific control of the Vibrio cholerae ToxR virulence regulon // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P. 5117-5123.

166. Nair G.B., Bag P.K., Ramamurthy J., Takeda I. et al. Evolution of DNA probes for specific ditection of Vibrio holerae 0139 Bengal // Clin. Microbiol. 1995. - V.33, N 8.-P. 2186-2187.

167. Nair G.B., Albert M.J., Shimada T., Takeda Y. Vibrio cholerae 0139 Bengal, thenew serogroup causing cholera // Rev. Med. Microbiol. 1996. - V.7. - P. 43-51.

168. Nandy R.K., Sengupta D.K., Mukhopsdhyay S., Ghose A.S. A comparative study of the properties of Vibrio cholerae 0139, 01 and other non-01 strains // Med. Microbiol. 1995. - V. 2.-P. 251-257.

169. Nelson E. T., Clements J. D., Finkelstein R. A. Vibrio cholerae adherence and colonization in experimental cholera: electron microscopic studies // Infect. Immun. -1976.-V. 14.-P. 527-547.

170. Olive D. M., Bean P. Principles and applications of methods for DNA-based typing of microbial organisms // J. Clin. Microbiol. 1999. - V. 37. - P. 1661-1669.

171. Pajni S., Sharma C., Bhasin N. et al. (). Studies on the genesis of Vibrio cholerae 0139: Identification of probable progenitor strains // J. Med. Microbiol. 1995. - V. 42.-P. 20-25.

172. Pearson G. D., Woods A., Chiang S. L., Mekalanos J. J. CTX genetic element encodes a site-specific recombination system and an intestinal colonization factor // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993. V. 90. - P. 3750-3754.

173. Popovic T., Fields P. I., Olsvik O. et al. Molecular subtyping of toxigenic Vibrio cholerae 0139 causing epidemic cholera in India and Bangladesh, 1992-1993 // J. Infect. Dis.- 1995.-V. 171.-P. 122-127.

174. Prabhakar H., Lei M., Kaur H. Outbreak of gastroenteritis due to a new strain of non O group 1 Vibrio cholerae, in Luahiana in may-august 1993 // Ind. J. Med. Res.1994.-V. 99.-P. 107-108.

175. Preston L.M., Xa Q., Johnson J.A., Joseph A. Preliminary structure determination of the capsular polysaccharide of Vibrio cholerae 0139 Bengal A11837 // Bacteriol.1995.-V. 177, N3,-P. 835-838.

176. Ramamurthy T.S., Garg S., Sharma G.R. Emergence of novel strain of Vibrio cholerae with epidemic potential in southern and eastern India // Lancet. 1993. - V. 341.-P. 703-704.

177. Raziuddin S. Studies of the polysaccharides (0-antigen) of Vibrio cholerae II Bio-chem. Biophys. 1977. - V.14. - P. 262-263.

178. Raziuddin S. Toxin and immunological properties of the lipopolysaccaride (O-antigens) from Vibrio eltor // Immunochemistry. 1978. - V.15, N 9. - P.611-614.

179. Reidl J., Mekalanos J. J. Characterization of Vibrio cholerae bacteriophage K139 and use of a novel mini transposon to identify a phage-encoded virulence factor // Mol. Microbiol. 1995.-V. 18.-P. 685-701.

180. Rijpketa S.T., Jansen W.H., Gielen H., Guince P.A. Immunoglobulins in bile and serum of the rabbit associated with protection after Vibrio cholerae infection and vaccination // Microbiol. Pathog. 1987. - V.3, N 5. - P. 365-375.

181. Rivas M., Toma C., Miliwebsky E., Caffer M. I., Galas M., Varela P., Tous M., Bru A. M., Binsztein N. Cholera isolates in relation to the "eighth pandemic." // Lancet. -1993.-V. 342. -P. 926-927.

182. Rossi M., Maurano F., Luongo D. et al. Zonula occludens toxin (Zot) interferes with the induction of nasal tolerance to gliadin // Immunol. Lett. 2002. - V. 81. - P. 217- 221.

183. Said B., Smith H. R., Scotland S. M., Rowe B. Detection and differentiation of the gene for toxin co-regulated pili (tcpA) in Vibrio cholerae non-01 using the polymerase chain reaction // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 125. - P. 205-210.

184. Salles C. A., Momen H., Vicente A. C. P., Coelho A. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis // Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1993. - V. 87. - P. 272.

185. Schneider D.R., Parker C. D. Isolation and characterization of protease-deficient mutants of Vibrio cholerae II Journal of Infectious Diseases. 1978. - V. 138. - P.143-151.

186. Sears C. L., Kaper J. B. Enteric bacterial toxins: mechanisms of action and linkage to intestinal secretion // Microbiol. Rev. 1996. - V. 60. - P. 167-215.

187. Sengupta D.K., Boesman-Finkelstein M., Finkelstein R.A. Antibody against the capsule of Vibrio cholerae 0139 protects against experimental challenge // Infect. Immun. 1996. - V.6, N1. - P. 343-345.

188. Sharma C., Maiti S., Mukhopadhyay A. K. et al. Unique organization of the CTX genetic element in Vibrio cholerae 0139 strains which reemerged in Calcutta, India, in September 1996 // J. Clin. Microbiol. 1997. - V. 35. - P. 3348-3350.

189. Sharma C., Thungapathra M., Ghosh A. et al. Molecular analysis of non-Ol, non-0139 Vibrio cholerae associated with an unusual upsurge in the incidence of cholera-like disease in Calcutta, India // J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36. - P. 756763.

190. Shimada T., Nair G.B., Deb B.C., Albert M.J. Outbreak of Vibrio cholerae non-01 in India and Bangladesh // Lancet.- 1993. V.341. - P. 1347.

191. Simon R., O'Connell M., Labes M., Puhler A. Plasmid vectors for the genetic analysis and manipulation of rhizobia and other gram-negative bacteria // Methods Enzy-mol. 1986. - V. 118. - P. 640-659.

192. Singh D.V., Matte M.H., Matte G.R. et al. Molecular analyses of Vibrio cholera 01, 0139, non-01 and non-0139 strains: clonal relationships between clinical and environmental isolates // Appl. and Environmental Microbiol. 2001. - Vol. 67. - P. 910-921.

193. Sozhamannan S., Deng Y. K., Li M. et al. Cloning and sequencing of the genes downstream of the wbf gene cluster of Vibrio cholerae serogroup 0139 and analysis of the junction genes in other serogroups // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P. 5033-5040.

194. Sperandio V., Giron J. A., Silveira W. D., Kaper J. B. The OmpU membrane protein, a potential adherence factor of Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1995. - V. 63.1. P.4433-4438.

195. Stroeher, U. H., Parasivam G., Dredge B. K., Manning P. A. Novel Vibrio cholerae 0139 genes involved in lipopolysaccharide biosynthesis // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P.2740-2747.

196. Stull T. L., LiPuma J. J., Edlind T. D. A broad spectrum probe for molecular epidemiology of bacteria: ribosomal RNA // J. Infect. Dis. 1988. - V. 157. - P. 280-286.

197. Svennerholm A.M., Stromberg G.J. Holmgren, J. Purification of Vibrio cholerae soluble haemagglutinin, development enzyme-linked immunosorbent assays for antigen, antibody quantitations // Infect. Immun. 1983. - V. 41. - P. 237.

198. Svennerholm A.M., Wiklund G. Rapid GMj-enzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin // J. Clin. Microbiol. 1983. - V. 17.

199. Swerdlow D.L., Ries A. Vibrio cholerae non-01 the eighth pandemic? // Lancet. -1993. V.242, N 8868. - P. 282-283.

200. Tackett C. O., Taylor R. K., Losonsky G. et al. Investigation of the roles of toxin-coregulated pili and mannose-sensitive hemagglutinin pili in the pathogenesis of Vibrio cholerae 0139 infection // Infect. Immun. 1998. - V. 66. - P. 692-695.

201. Tan N.H. Tan C.S. Acidimetric assay of phospholipase A using egg yolk suspension as substrate // Anal. Biochem. 1988. - V. 170. - P. 282-288.

202. Taylor R. K., Miller V. L., Furlong D. B., Mekalanos J. J. Use ofphoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987. V. 84. - P. 2833-2837.

203. Trucksis M., Michalski J., Deng Y. K., Kaper J. B. The Vibrio cholerae genomecontains two unique circular chromosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998. V. 95.-P. 14464-14469.

204. Waldor M. K., Colwell R., Mekalanos J. J. The Vibrio cholerae 0139 serogroup antigen includes an O-antigen capsule and lipopolysaccharide virulence determents // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 11388-11392.

205. Waldor M. K., Mekalanos J. J. Vibrio cholerae 0139 specific gene sequences // Lancet. 1994.-V. 343.-P. 1366.

206. Waldor M. K., Tschape H., Mekalanos J. J. A new type of conjugative transposon encodes resistance to sulfamethoxazole, trimethoprim, and streptomycin in Vibrio cholerae 0139 // J. Bacteriol. 1996. - V. 178. - P. 4157^1165.

207. Waldor M. K., Mekalanos J. J. Lysogenic conversion by a filamentous phage encoding cholera toxin // Science. 1996. - V. 272. - P. 1910-1924.

208. Waldor M. K., Rubin E. J., Pearson G. D. et al. Regulation, replication, and integration functions of the Vibrio cholerae CTXcp are encoded by region RS2 // Mol. Microbiol. 1997. - V. 24. - P. 917-926.

209. Wang S. Y., Lauritz J., Jass J., Milton D. L. A ToxR homolog from Vibrio anguil-larum serotype 01 regulates its own production, bile resistance, and biofilm formation // J Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 1630-1639.

210. Ward H. M., Morelli G., Kamke M. et al. A physical map of the chromosomal region determining O-antigen biosynthesis in Vibrio cholerae II Gene. 1987. -Vol. 55.-P. 197-204.

211. Watnick P.J., Fullner K.J., Kolter R. The role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor // J. Bacteriol. 1999. - V. 181, N 11.-P. 3606-3609.

212. Weintraub A., Winmalm G., Jansson P. E. et al. Vibrio cholerae 0139 Bengal possesses a capsular polysaccharide which may confer increased virulence // Mic. Pathog. 1994. - V. 16. - P. 235-243.

213. Wibbenmeyer J.A., Provensano D., Landry C.F. et al. Vibrio cholerae OmpU and OmpT porins are differentially affected by bile // Infect. Immun. 2002. - V. 70. - P. 121-126.

214. Yamasaki S., Garg S, Nair G. B., Takeda Y. Distribution of Vibrio cholerae 01 antigen biosynthesis genes among 0139 and other non-Ol serogroups of Vibrio cholerae IIFEMS Microbiol. Lett. 1999. - V. 179. - P. 115-121.

215. Yamasaki, S., Shimizu T., Hoshino K., Ho S. T., Shimada T., Nair G. B., Takeda Y. The genes responsible for O-antigen synthesis of Vibrio cholerae 0139 are closely related to those of Vibrio cholerae 022 // Gene. 1999. - V. 237. - P. 321-332.

216. Yancey R. J., Willis D. L., Berry L. J. Role of motility of in experimental cholera in adult rabbits // Infect. Immun. 1978. -V. 22. - P. 387-392.