Функции и механизм действия эукариотических ферментов NEIL1 и NEIL2 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Грин, Инга Ростиславовна

  • Грин, Инга Ростиславовна
  • кандидат химических науккандидат химических наук
  • 2010, Новосибирск
  • Специальность ВАК РФ03.01.04
  • Количество страниц 139
Грин, Инга Ростиславовна. Функции и механизм действия эукариотических ферментов NEIL1 и NEIL2: дис. кандидат химических наук: 03.01.04 - Биохимия. Новосибирск. 2010. 139 с.

Оглавление диссертации кандидат химических наук Грин, Инга Ростиславовна

1. Список сокращений.

2. Введение.

3. Обзор литературы.

3.1. Повреждения ДНК.

3.1.1. Потеря гетероциклических оснований.

3.1.2. Дезаминирование.

3.1.3. Алкилирование.

3.1.4. Фотохимические повреждения.

3.1.5. Окислительные повреждения.

3.2. Репарация ДНК.

3.2.1. Реактивация.

3.2.2. Эксцизионная репарация нуклеотидов.

3.2.3. Репарация гетеродуплексов.

3.2.4. Воссоединение негомологичных концов.

3.2.5. Гомологичная рекомбинация.

3.2.6. Эксцизионная репарация оснований.

3.2.6.1. Общий механизм.

3.2.6.2. Выбор между основными путями.

3.3. ДНК-гликозилазы.

3.3.1. Структурная классификация ДНК-гликозилаз.

3.3.1.1. Суперсемейство Ung.

3.3.1.2. Суперсемейство Nth.

3.3.1.3. Суперсемейство Fpg/Nei.

3.3.2. Механизм действия ДНК-гликозилаз.

3.3.2.1. Узнавание поврежденного основания.

3.3.2.2. Каталитический механизм.

3.3.3. Модуляция активности ДНК-гликозилаз.

3.4. Белки NEIL.

3.4.1. Общие характеристики.

3.4.2. Основные субстраты ферментов NEIL.

3.4.3. Структурные особенности белка NEIL 1.

3.4.4. Взаимодействие белков NEIL с другими белками.

3.4.5. Особенности экспрессии и полиморфизмы генов NEIL.

4. Материалы и методы.

4.1. Реактивы.

4.2. Стандартные буферы и смеси.

4.3. Ферменты.

4.4. Штаммы бактерий и плазмиды.

4.5. Олигонуклеотиды.

4.6. Получение олигонуклеотидных субстратов.

4.7. Гель-электрофорез, визуализация и обсчет результатов.

4.8. Выделение белка NEIL 1 человека.

4.9. Выделение белка NEIL2 человека.

4.10. Определение концентрации белка.

4.11. Анализ дезоксирибофосфатлиазной активности.

4.12. Анализ расщепления субстратов, содержащих 8-oxoAde.

4.13. Анализ расщепления субстратов, содержащих HoUra.

4.14. Определение влияния АРЕХ1 и POLß на активность фермента NEIL 1.

4.15. Реконструкция системы эксцизионной репарации оснований.

4.16. Влияние ионов тяжелых металлов на активность Fpg, Nei и NEIL1.

4.17. Связывание ионов металлов с белком NE1L1 и ДНК.

4.18. Связывание NEIL1 с ДНК в присутствии ионов тяжелых металлов.

4.19. Влияние PLP на активность ДНК-гликозилаз.

4.20. Анализ кинетики инактивации фермента NEIL 1 при обработке PLP.

4.21. Анализ связывания ДНК ферментом NEIL2 после обработки PLP.

4.22. Масс-спектрометрический анализ комплекса NEIL2*PLP.

5. Результаты и обсуждение.

5.1. Дезоксирибофосфатлиазная активность белков NEIL.

5.2. Роль фермента NEIL1 в репарации 8-oxoAde в ДНК.

5.3. Влияние ионов тяжелых металлов на активность NEIL1.

5.4. Ковалентная модификация белка NEIL2 пиридоксаль-5'-фосфатом.

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биохимия», 03.01.04 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Грин, Инга Ростиславовна

7. Выводы

1. Впервые показано, что ДНК-глнкозилазы NEIL1 и NEIL2 человека катализируют реакцию ß-элиминирования 5'-концевого дезоксирибонуклеозид-5'-фосфата в процессе эксцизионной репарации оснований. Определены значения кинетических параметров данной реакции, которые оказались близки к значениям этих параметров для реакции, катализируемой ДНК-полимеразой ß. Установлено, что предпочтительным субстратом для проявления данной активности ферментов NEIL1 и NEIL2 служит интермедиат эксцизионной репарации оснований после включения dNMP ДНК-полимеразой ß. Проведена реконструкция полной системы эксцизионной репарации оснований для урацила, апурин-апиримидинового сайта и 7,8-дигидро-8-оксогуанина с участием ферментов NEIL1 и NEIL2 как дезоксирибонуклеозид-5'-фосфатлиаз.

2. Установлено, что NEIL1 эффективно удаляет 7,8-дигидро-8-оксоаденин (8-oxoAde) из пар с цитозином, но не из других пар. Показано, что значения кинетических параметров этой реакции близки к значениям параметров реакции удаления 8-oxoAde из пар 8-oxoAde:Cyt, катализируемой ферментом OGG1. Выявлены два альтернативных пути репарации 8-oxoAde, один из которых инициируется OGG1, а другой инициируется NEIL1 и требует участия полинуклеотидкиназы-З'-фосфатазы для эффективного включения dNMP ДНК-полимеразой ß.

3. Установлено, что активность ДНК-гликозилазы NEIL1 и гомологичных ей бактериальных ферментов из структурного суперсемейства Fpg/Nei ингибируется ионами Cd2+, Zn2+ и Cu2+. Определены значения I50 для ингибирования фермента NE1L1. Показано, что ингибирование NEIL1 частично обусловлено образованием комплексов металлов с ДНК-субстратом, что ведет к потере способности фермента преимущественно связывать поврежденную ДНК.

4. Установлено, что NEIL2 инактивируется пиридоксаль-5'-фосфатом (PLP) за счет образования основания Шиффа с аминогруппой фермента. Определены значения констант скорости образования и гидролиза ковалентного аддукта PLP с NEIL2. Показано, что фермент NEIL2, модифицированный PLP, теряет способность связывать ДНК. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемным масс-спектрометрическим детектированием установлено, что модификации подвергается остаток Lys50 в составе белка NEIL2.

6. Заключение

До 2002 г. считалось, что за репарацию окисленных пуринов у эукариот отвечает ДНК-гликозилаза OGG1, а за репарацию окисленных пиримидинов — NTHL1. Открытие в 2002 г. ДНК-гликозилаз NEIL сразу несколькими группами исследователей поставило вопрос о возможных функциях этих белков. О том, что белки NEIL, возможно, играют в репарации ДНК нетипичную роль, свидетельствует несколько фактов. Во-первых, известный спектр субстратов ферментов NEIL в основном перекрывается со спектром субстратов ферментов OGG1 и NTHL1. Во-вторых, последовательности, кодирующие белки NEIL встречаются только у представителей типа хордовых и отсутствуют в секвенированных геномах других эукариот; это не позволяет считать, что белки NEIL выполняют какие-то незаменимые функции в эукариотической клетке. В-третьих, фенотип животных, дефицитных по белку NEIL1 не связан с общей геномной нестабильностью.

Настоящая работа представляет собой исследование нескольких аспектов функционирования белков NEIL, которые могут иметь значение для объяснения роли этих ферментов. В данном исследовании показано, что ферменты NEIL1 и NEIL2 обладают активностью dRP-лиаз, и что фермент NEIL 1 способен удалять основания 8-oxoAde из пар с Cyt. Интересно, что в обоих случаях описанная активность ферментов NEIL перекрывается с активностями других ферментов репарации (POLß и OGG1, соответственно). Таким образом, полученные нами и опубликованные другими авторами данные свидетельствуют о том, что белки NEIL образуют «вторую линию» защиты ДНК, необходимую при низкой активности основных ферментов ЭРО. Можно предположить, что такие ситуации возникают в каких-то определенных фазах клеточного цикла, в определенных типах клеток и тканей, на определенных стадиях развития организма, или при случайной инактивации генов, кодирующих основные ферменты ЭРО, в соматических клетках.

Ингибирование белка NEIL1 ионами тяжелых металлов и инактивация белка NEIL2 при ковалентной модификации остатка Lys50 служат примерами модуляции и регуляции активности ферментов NEIL, которые могут также иметь значение in vivo. В самом общем случае модуляция активности фермента — это изменение активности под влиянием любого внешнего фактора, а регуляция — частный случай модуляции, подразумевающий существование отдельных систем с определенными состояниями активности и сигналов, определяющих переходы между этими состояниями. Нами показано, что активность фермента NEIL1, а также его бактериальных гомологов, белков Fpg и Nei, может подавляться при наличии ионов Cd2+, Zn2+ и связанных с ДНК. Концентрации, при которых наблюдается это явление, сравнимы (по крайней мере, для Cd ) с концентрациями, достижимыми при высвобождении ионов из металлотионеиновых резервов при окислительном стрессе. Однако еще более общее значение для биологических функций ДНК-гликозилаз и ДНК-связывающих белков вообще имеет сам принцип модуляции активности за счет связывания ионов металлов с ДНК. Саму ДНК можно рассматривать как структурированный полимер, связывающий с достаточно высокой аффинностью разные катионы, в особенности те из них, которые способны к образованию координационных связей. При этом в ДНК существуют анионные, нуклеофильные и электрофильные группы, преимущественно связывающие те или иные ионы, что открывает широкие возможности для регуляции связывания с этими участками белков.

Ковалентная модификация белков представляет собой достаточно хорошо исследованный способ регуляции их функций, и ДНК-гликозилазы здесь не представляют исключения. Однако в очень немногих случаях известны последствия такой модификации. Обнаруженная нами инактивация фермента NEIL2 пиридоксальфосфатом проливает свет на возможный механизм регуляции за счет ковалентной модификации одной из петель белка, важной для связывания ДНК. Ацетилирование другого остатка Lys в этой петле было показано ранее, но механизм инактивации при этом раскрыт не был. Снижение положительного заряда ДНК-связывающей бороздки и введение в нее объемных заместителей при ацетилировании или фосфорилировании представляет собой достаточно логичный способ регуляции активности ДНК-гликозилаз.

Таким образом, в настоящем исследовании описаны дополнительные функции белков NEIL и возможные механизмы модуляции и регуляции их активности. Можно ожидать, что в дальнейшем изучение этой интересной группы белков откроет новые стороны процесса ЭРО.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Грин, Инга Ростиславовна, 2010 год

1. Lindahl Т. (1993) Instability and decay of the primary structure of DNA. Nature, 362, p. 709-715.

2. Lindahl Т., Nyberg B. (1972) Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 11, p. 3610-3618.

3. Male R., Fosse V.M., Kleppe K. (1982) Polyaminewinduced hydrolysis of apurinic sites in DNA and nucleosomes. Nucleic Acids Res., 10, p. 6305-6318.

4. Burrows C.J., Muller J.G. (1998) Oxidative nucleobase modifications leading to strand scission. Chem. Rev., 98, p. 1109-1151.

5. Shen J.-C., Rideout 111 W.M., Jones P.A. (1994) The rate of hydrolytic deamination of 5-methylcytosine in double-stranded DNA. Nucleic Acids Res., 22, p. 972-976.

6. Friedberg E.C., Walker G.C., Siede W., Wood R.D., Schultz R.A., Ellenberger Т., DNA Repair and Mutagenesis. — Washington: American Society for Microbiology, 2006 pp.

7. Василенко H.JI., Невинский Г.А. (2003) Пути накопления и репарации остатков дезоксиуридина в ДНК клеток низших и высших организмов. Биохимия, 68, с. 165183.

8. Duncan B.K., Miller J.H. (1980) Mutagenic deamination of cytosine residues in DNA. Nature, 287, p. 560-561.

9. Singer В., Kusmierek J.T. (1982) Chemical mutagenesis. Annu. Rev. Biochem., 51, p. 655-693.14.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.