Процессивность ферментов эксцизионной репарации оснований тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат химических наук Мечетин, Григорий Вениаминович

• Мечетин, Григорий Вениаминович
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Мечетин, Григорий Вениаминович

1. Список принятых сокращений.

2. ВВЕДЕНИЕ.

3.1. Повреждения ДНК и их последствия.

3.1.1. Апурин-апиримидиновые сайты.

3.1.2. Урацил и другие продукты дезаминирования оснований ДНК.

3.1.3. Продукты электрофильного присоединения.

3.1.4. Фотопродукты.

3.1.5. Окислительные повреждения ДНК.

3.1.5.1. Окислительные повреждения пиримидиновых оснований.

3.1.5.2. Окислительные повреждения пуриновых оснований.

3.2. Репарация ДНК.

3.2.1. Эксцизионная репарация оснований.

3.2.1.1. Структура, свойства и механизм действия ДНК-ТУ-гликозилаз.

3.2.1.2. Структура, свойства и механизм действия АП-эндонуклеаз.

3.2.1.3. Механизм дискриминации повреждений ДНК-ГчГ-гликозилазами и АП-эндонуклеазами.

3.3 Механизмы поиска специфических мишеней ДНК-зависимыми белками.

3.3.1 Влияние дополнительных последовательностей и макромолекулярного окружения на механизмы поиска мишеней ДНК-зависимыми белками.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Реактивы.

4.2. Дезоксирибоолигонуклеотиды.

4.3. «Ферменты.

4.4. Штаммы бактерий и клеточные линии.

4.5. Получение экстракта клеток Е. coli.

4.6 Получение экстракта клеток RPMI-8226.

4.7. Определение суммарной концентрации белка в экстрактах Е. coli и клеток линии RTMI-8226.

4.8. Гель-электрофорез и количественный обсчет результатов экспериментов.

4.9. Введение радиоактивной метки в дезоксирибоолигонуклеотиды.

4.10. Стандартные условия отжига комплементарных цепей олигонуклеотидов.

4.11. Получение субстратов для изучения коррелированного расщепления.

4.12. Определение кинетических параметров расщепления субстратов, содержащих единичное повреждение.

4.13. Изучение коррелированного расщепления субстратов, содержащих два повреждения

4.14 Анализ зависимости величины вероятности коррелированного поиска от расстояния между сайтами расщепления.

4.15 Анализ распределения поверхностного потенциала и заряда ДНК-связывающей области для урацил-ДНК-гликозилаз и АП-эндонуклеаз.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

5.1. Основы предложенного метода.

5.2. Влияние условий реакции, имитирующих внутриклеточные условия, на коррелированное расщепление субстратов ферментом Ung из Е. coli.

5.3. Коррелированное расщепление ДНК полноразмерной урацил-ДНК-гликозилазой человека и ее каталитическим доменом.

5.4. Коррелированный поиск мишеней АП-эндонуклеазами АРЕХ1 и Nfo из человека и Е. coli.

5.5. Влияние расстояния между фермент-специфическими сайтами на вероятность коррелированного расщепления Ung из Е. coli.

5.5.1. Проверка теории Белоцерковского-Зарлинга.

5.5.2. Определение параметров коррелированного поиска Ura ферментом Ung из Е. coli при помощи теории Белоцерковского-Зарлинга.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Мечетин, Григорий Вениаминович

7. ВЫВОДЫ

1. Развит новый метод, позволяющий изучать параметры коррелированного поиска мишеней в ДНК ферментами репарации с использованием величины вероятности коррелированного расщепления (Рсс) субстратов, содержащих два фермент-специфических сайта. Показано, что метод применим для исследования коррелированного поиска мишеней как в одноцепочечной, так и в двуцепочечной ДНК.

2. Показано различное влияние ионов Mg2+ и К+ на эффективность коррелированного поиска мишеней в двуцепочечной ДНК урацил-ДНК-гликозилазой Ung из Е. coli, объясняемое разной способностью этих ионов образовывать с ДНК координационные связи и экранировать отрицательный заряд ДНК. Установлено отсутствие значительного влияния эффекта вытесненного объема, одноцепочечных разрывов и брешей различной длины на величину Pce- Показано значительное влияние ДНК-связывающих белков в клеточных экстрактах на величину Рсс урацил-ДНК-гликозилазы.

3. Исследовано влияние N-концевого фрагмента ядерной изоформы урацил-ДНК-гликозилазы человека (UNG) на эффективность коррелированного поиска мишеней этим ферментом. При низкой ионной силе N-концевой фрагмент уменьшает значения Рсс, а при оптимальной концентрации соли — увеличивает их, что может быть связано с увеличением сродства полноразмерной формы UNG к ДНК за счёт положительного заряда N-концевого фрагмента.

4. Показано, что АП-эндонуклеазы человека (АРЕХ1) и Е. coli (Nfo) способны к коррелированному расщеплению ДНК-субстратов, причем значения Рсс при концентрациях KCl, близких к физиологическим (100-200 мМ), достигают 0,20,5, что указывает на возможность реализации АП-эндонуклеазами коррелированного поиска in vivo.

5. При помощи теории Белоцерковского-Зарлинга, описывающей процесс одномерной диффузии белков по ДНК, оценены параметры поиска мишеней ферментом Ung: характерная дистанция коррелированного поиска (100 пар нуклеотидов), вероятность отражения от концов линейного субстрата (0,83), константа скорости транслокации (2x10б с-1) и константа скорости диссоциации комплекса белок-ДНК при расположении фермента на конце линейной ДНК (4x105 с-1). Установлено, что хоппинг вносит значительный вклад в коррелированный поиск мишеней ферментом и^, при этом характерная дистанция слайдинга составляет 8-9 пар нуклеотидов.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе развит новый биохимический подход для изучения механизмов поиска специфических мишеней ферментами репарации. В отличие от ранее существующих биохимических методов изучения механизмов поиска специфических мишеней белковыми факторами, подход позволяет четко контролировать структуру используемого субстрата и вводить в субстрат сайты расщепления практически любой химической природы или распознаваемые изучаемым белком последовательности ДНК, а также модифицировать структуру ДНК между ними, что делает метод применимым для изучения механизмов транслокации широкого спектра ДНК-зависимых белковых факторов, а не только ферментов репарации. Метод позволяет, исходя из легко измеряемой в эксперименте зависимости величины вероятности коррелированного расщепления субстрата (Рсс) от расстояния между фермент-специфическими сайтами, определить кинетические параметры транслокации ДНК-зависимых белков вдоль двойной цепи при помощи вариации расстояния между фермент-специфическими сайтами, используя теорию Белоцерковского-Зарлинга [165] для обработки результатов. Возможна также разработка и использование совмесно с данным подходом альтернативных теоретических описаний для получения количественных параметров процесса поиска мишеней. Кроме того, метод также позволяет изучать коррелированный поиск на одноцепочечном субстрате, чего нельзя было сделать при помощи существующих биохимических подходов. С помощью предложенного метода в настоящей работе исследован механизм поиска мишеней урацил-ДНК-гликозилазами Е. coli (Ung) и человека (UNG), а также АП-эндонуклеазами Е. coli (Nfo) и человека (АРЕХ1), причем для ферментов UNG и Nfo такой анализ проведен впервые.

В настоящей работе впервые представлен анализ влияния на коррелированный поиск ионов Mg2+ в сопоставлении с ионами К+, эффекта вытесненного объема, а также дополнительной не участвующей в каталитическом акте аминокислотной последовательности полноразмерной формы урацил-ДНК-гликозилазы человека. Изучено также влияние брешей различной длины в ДНК на вероятность коррелированного расщепления.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Мечетин, Григорий Вениаминович, 2011 год

1. Barnabas J., Schwartz R.M., Dayhoff M.O. Evolution of major metabolic innovations in the Precambriaa //Orig. Life- 1982. -V. 12. -№1. -p. 81-91.

2. Lindahl Т., Nyberg B. Rate of depurination of native deoxyribonucleic acid. // Biochemistry 1972. -V. 11. -№19.-p. 3610-3618.

3. Atamna H., Cheung I., Ames B.N. A method for detecting abasic sites in living cells: age-dependent changes in base excision repair. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000. -V. 97,-№2.-p. 686-691.

4. Кочетков H.K., Будовский Э.И., Свердлов Е.Д., Симукова Н.А., Турчинский М.Ф., Шибаев В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. Москва: Химия, 1970. -486 с.

5. Shearman C.W., Loeb L.A. Depurination decreases fidelity of DNA synthesis in vitro. H Nature 1977. - V. 270. - №5637. - p. 537-538.

6. Schaaper R.M., Kunkel T.A., Loeb L.A. Infidelity of DNA synthesis associated with bypass of apurinic sites. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1983. - V. 80. - №2. - p. 487491.

7. Goodman M.F., Cai H., Bloom L.B., Eritja R. Nucleotide insertion and primer extension at abasic template sites in different sequence contexts. // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1994. -V. 726.-p. 132-142.

8. Cuniasse P., Fazakerley G.V., Guschlbauer W., Kaplan B.E., Sowers L.C. The abasic site as a challenge to DNA polymerase. A nuclear magnetic resonance study of G, С and T opposite a model abasic site. // J. Mol. Biol. 1990. - V. 213. - №2. - p. 303-314.

9. Gestl E.E., Eckert K.A. Loss of DNA minor groove interactions by exonuclease-deficient Klenow polymerase inhibits 06-methylguanine and abasic site translesion synthesis. // Biochemistry 2005. - V. 44. - №18. - p. 7059-7068.

10. Kokoska R.J., McCulloch S.D., Kunkel T.A. The efficiency and specificity of apurinic/apyrimidinic site bypass by human DNA polymerase r\ and Sulfolobus solfataricus Dpo4. // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - №50. - p. 50537-50545.

11. Pages V., Johnson R.E., Prakash L., Prakash S. Mutational specificity and genetic control of replicative bypass of an abasic site in yeast. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2008. -V. 105.-№4.-p. 1170-1175.

12. Chen Y.-H., Bogenhagen D.F. Effects of DNA lesions on transcription elongation by T7 RNA polymerase. // J. Biol. Chem. 1993. - V. 268. - №8. - p. 5849-5855.

13. Lindahl Т., Andersson A. Rate of chain breakage at apurinic sites in double-stranded deoxyribonucleic acid. //Biochemistry- 1972. -V. 11. -№19. -p. 3618-3623.

14. Василенко H.JI., Невинский Г.А. Пути накопления и репарации остатков дезоксиуридина в ДНК клеток низших и высших организмов. // Биохимия 2003. -Т. 68,-№2.-с. 165-183.

15. Frederico L.A., Kunkel Т.А., Shaw B.R. A sensitive genetic assay for the detection of cytosine deamination: determination of rate constants and the activation energy. // Biochemistry 1990. - V. 29. -№10. - p. 2532-2537.

16. Туе B.-K., Chien J., Lehman I.R., Duncan B.K., Warner H.R. Uracil incorporation: a source of pulse-labeled DNA fragments in the replication of the Escherichia coli chromosome. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1978. - V. 75. - №1. - p. 233-237.

17. David S.S., Williams S.D. Chemistry of glycosylases and endonucleases involved in base-excision repair. // Chem. Rev. 1998. - V. 98. - №3. - p. 1221-1261.19,20.21,22,23,24,25.