Генетический полиморфизм в клонах опухолевых линий гепатомы МГ-22А и саркомы J-774 мыши при разных условиях пролиферации и апоптозе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Александрова, Светлана Алексеевна

• Александрова, Светлана Алексеевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Александрова, Светлана Алексеевна

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1. Генетические перестройки в онтогенезе эукариот

2.1.1. Особенности структуры генома и его изменчивость

2.1.2. Роль мобильных генетических элементов в изменчивости генома

2.1.3. Изменения генома в генеративных и соматических клетках, необходимые для нормального онтогенеза

2.1.4. Генетические перестройки, имеющие значение в адаптации и видообразовании

2.1.5. Изменения в генетическом аппарате клетки при наследственных и спорадических заболеваниях

2.2. ПЦР-фингерпринт как метод для изучения геномного полиморфизма. Варианты метода

2.2.1. ПЦР

2.2.2. АР-ПЦР

2.2.3. РМРО-ПЦР

2.3. Особенности канцерогенеза, изучаемые с помощью ПЦР-фингерпринта

2.3.1. Молекулярно-генетические маркеры злокачественного роста

2.3.2. Прогрессия опухолей и прижизненный анализ

2.3.3. Выявление активности онкогенов

2.3.4.Гэнные и хромосомные перестройки

2.3.5.Выявление потери гетерозиготности генов-супрессоров опухолевого роста

2.3.6. Идентификация генов

2.3.7. Неспецифические геномные перестройки. Микросателлитная нестабильность

2.4. Сохранение способности опухолевых клеток к дифференцировке при разных условиях их пролиферации

2.5. Роль апоптоза при злокачественной трансформации клетки и прогрессии опухолей

2.5.1. Апоптоз при нормальном развитии организма

2.5.2. Апоптоз при злокачественном росте и генетическая вариабельность опухолевых клеток

2.5.3. Фунционирование системы Раэ-рецетор/Раэ-лиганд при взаимодействии опухолевых клеток с иммунной системой

3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

3.1.Материал

3.1.1. Опухолевые клеточные линии

3.1.2. Линейные мыши

3.2. Методы

3.2.1. Выделение высокомолекулярной ДНК

3.2.2. НАРО-ПЦР

3.2.3. Индукция дифференцировки опухолевых клеток и морфологическое исследование опухолей

3.2.4. Взаимоиндукция апоптоза опухолевыми клетками и лимфоцитами

3.2.5. Выявление апоптоза опухолевых клеток и спленоцитов

3.2.6. Выделение тотальной РНК

3.2.7. Обратно-транскриптазная полимеразная цепная реакция

3.2.8. Секвенирование ПЦР-фрагментов

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР

4.2. Характеристика генетической структуры популяции опухолевых гепатоцитов МГ-22а

4.3. Жизнеспособность клонов гепатомы M Г■22а с разной степенью генетической изменчивости

1* 4.4. Морфологические характеристики опухолей, выросших в ПСТ и ПКГ

4.5. Полиморфизм амплифицированных фрагментов ДНК в клетках клонов гепатомы мыши МГ-22а, выявленный методом RAPD-ПЦР, при разных условиях культивирования in vivo

4.6. Определение нуклеотидной последовательности амплифицированного фрагмента ДНК

4.7. Взаимоиндукция апоптоза в клоновыхлиниях гепатомы МГ■22а и саркомы J-774 мыши и сингенными спленоцитами

4.8. Генетическая гетерогенность и взаимоиндукция апоптоза опухолевых гепатоцитов МГ-22а и спленоцитов

4.9. Экспрессия Fas и FasL в популяциях и клонах клеточных линий МГ-22а и J-774 мыши in vitro

4.10. Экспрессия Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а, гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах при их пассировании in vivo

4.11. Экспрессия Fas и FasL в опухолевых гепатоцитах МГ-22а, гистиоцитах J-774 и сингенных спленоцитах при их совместном культивировании in vitro

4.12. Способность к апопотозу и экспрессия Fas и FasL в опухолевых клетках МГ-22а и J-774 и сингенных спленоцитах при их совместном культивировании in vitro

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетический полиморфизм в клонах опухолевых линий гепатомы МГ-22А и саркомы J-774 мыши при разных условиях пролиферации и апоптозе»

Актуальность проблемы

Известно, что кодирующие последовательности ДНК занимают не более 10-15% всего генома (Li et al., 2001). Эти последовательности наиболее консервативны в процессе эволюции, так как мутации в них подвержены давлению жесткого естественного отбора. Функции же остальной ДНК еще не ясны, известно, однако, что эта часть ДНК обладает высоким полиморфизмом (Алтухов, Салменкова, 2002). Наиболее хорошо изучены два варианта генетического полиморфизма: количественные изменения в области локализации мини- и микросателлитных последовательностей ДНК и качественные замены отдельных нуклеотидов (Salisbury et al., 2003; Никитина, Назаренко, 2004). Также большой вклад в геномную изменчивость как генеративных, так и соматических клеток вносят мобильные элементы (Smit, 1999). Изучение генетического полиморфизма показало важность и актуальность исследований этого явления в нормальной жизнедеятельности клеток и организмов, при патологии, в частности, при злокачественном росте, а также в процессе эволюции (Алтухов, Салменкова, 2002; Брага и др., 2004). Одним из наиболее перспективных методов изучения генетического полиморфизма являются разные варианты ПЦР-фингерпринта, в частности, RAPD-ПЦР (Caetano-Anolles, 1996; Гречко, 2002).

С появлением методов ПЦР-фингерпринта геномной ДНК расширились знания об опухолевом росте, так как с помощью этих методов были выявлены не только специфические изменения генома, связанные с функционированием генов, участвующих в канцерогенезе, но и неспецифические, являющиеся результатом дестабилизации генома вследствие множества мутаций в различных частях генома (lonov et al., 1993; Luo et al., 2003). Степень геномных изменений, выявляемых этими методами, коррелирует с генотипическими, фенотипическими и клиническими признаками при прогрессии опухолей и может быть полезна для прогностических оценок (Arribas et al., 1997; Papadopulus et al., 2002).

Одним из критериев злокачественности клеток является их способность к дифференцировке (Lotem, Sachs, 2002). Поэтому большое значение приобретает изучение зависимости способности опухолевых клеток к if* дифференцировке от степени генетической изменчивости, в частности, от перестроек генетического аппарата клетки, выявляемых методом RAPD-ПЦР.

Особое место в исследованиях взаимодействия опухоль-организм занимает способность опухолей не только уходить от иммунологического надзора организма, но и активно подавлять защитную иммунную реакцию, тем самым обеспечивая себе иммунологическую привилегированность (Weller et al., 1997; O'Connell et al., 1999). Иммунологическая привилегированность опухолей, образующаяся благодаря способности опухолевых клеток вызывать апоптотическую гибель лимфоцитов, показана в ряде работ (Rabinowich et al., 1998; Bennett et al., 1999; Pinkoski, Green, 2000). Представляет интерес изучение влияния генетической изменчивости опухолевых клеток на их способность вызывать апоптоз у клеток иммунной системы, а также на их чувствительность к индукции апоптоза лимфоцитами, (^г Изучение генетического полиморфизма в опухолевых клетках имеет важное значение для оценки степени злокачественности опухолей и прогнозировании течения заболевания.

Последнее десятилетие ознаменовалось бурным изучением молекулярных механизмов апоптоза как в физиологических условиях, так и при злокачественном росте. В результате этих исследований было выявлено большое значение в апоптозе системы Fas-рецепторэ и Fas-лиганда (Fas/FasL) (Барышников, Шишкин, 2002). Имеются данные, что именно от экспрессии FasL в опухолевых клетках зависит сопротивление опухолей иммунной системе организма и, следовательно, само развитие и течение заболевания (Houston et al., 2003). Однако до настоящего времени нет данных о гетерогенности популяции опухолевых клеток по экспрессии Fas и FasL. Поэтому важное значение имеет проведенное в работе выявление гетерогенности опухолей и по экспрессии Fas, и по экспрессии FasL с помощью клонального анализа для исследования злокачественных опухолей и прогнозирования их взаимоотношений с иммунной системой организма.

Цели и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в изучении динамики генетического полиморфизма, выявляемого методом RAPD-ПЦР, в гепатоме МГ-22а и гистиоцитарной саркоме J-774 мыши и в их (слоновых линиях при их & пассировании in vitro и in vivo.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Изучить генетическую структуру гепатомы Мг-22а мыши методом RAPD-ПЦР in vitro.

2. Изучить зависимость жизнеспособности клеток клонов гепатомы МГ-22а мыши in vitro от числа выявленных методом RAPD-ПЦР генетических изменений.

3. Изучить зависимость между генетическим полиморфизмом в клоновых линиях гепатомы МГ-22а мыши при их трансплантации в подкожную соединительную ткань (ПСТ) и переднюю камеру глаза (ПКГ) и уровнем дифференцировки.

4. Выявить влияние генетической вариабельности на способность к индукции апоптоза у опухолевых клеток гепатомы МГ-22а мыши и сингенных у. спленоцитов при их совместном культивировании in vitro.

5. Выявить зависимость индукции апоптоза у опухолевых клеток гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши с разным уровнем генетического полиморфизма и сингенных спленоцитов от экспрессии Fas и FasL.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В генетической структуре популяции клеток гепатомы МГ-22а мыши, основанной на числе перестроек на фингерпринтах клонов, полученных методом RAPD-ПЦР, выделены стволовая, вариабельная и аберрантная части популяции. Наибольшей жизнеспособностью обладают клоны с наименьшей генетической изменчивостью.

2. Клетки клонов гепатомы МГ-22а мыши сохраняют способность к дифференцировке при пролиферации в передней камере глаза, несмотря на высокие значения индекса генетической вариабельности.

3. Клоновые линии гепатомы МГ-22а мыши с высоким уровнем генетической вариабельности устойчивы к апоптозу, вызываемому спленоцитами, и обладают способностью индуцировать апоптоз спленоцитов. у 4. Опухолевые клетки гепатомы МГ-22а и гистиоцитарной саркомы J-774 мыши с разным уровнем генетического полиморфизма могут влиять на экспрессию FasL в спленоцитах при их совместном культивировании, что приводит к разной интенсивности индуцированного спленоцитами апоптоза у опухолевых клеток.

Научная новизна полученных результатов

Впервые был изучен генетический полиморфизм в клеточной популяции и клоновых линиях гепатомы МГ-22а мыши методом RAPD-ПЦР и показана широкая вариабельность клоновых линий по этому признаку. Показана зависимость жизнеспособности клонов МГ-22а от числа выявленных генетических перестроек. Было выявлено, что способность опухолевых клеток к дифференцировке при их пролиферации в ПКГ может сохраняться при достаточно высокой частоте генетических перестроек. На клоновых линиях МГ-22а и J-774 с разным уровнем генетического полиморфизма впервые была изучена способность опухолевых клеток индуцировать апоптоз спленоцитов, а также подвергаться апоптозу, индуцированному спленоцитами, при их совместном культивировании. Показано, что устойчивость к апоптозу у опухолевых клеток, вызываемому спленоцитами, наблюдается у клоновых линий с высокой генетической вариабельностью. В то же время, такие клоновые линии обладают способностью индуцировать апоптоз спленоцитов. Впервые был проведен клональный анализ популяции опухолевых клеток по экспрессии генов апоптоза Fas и FasL, для чего был использован метод ОТ-ПЦР, с помощью которого была показана широкая вариабельность их экспрессии. В опытах по совместному культивированию опухолевых клеток с сингенными спленоцитами в спленоцитах после культивирования обнаружено значительное повышение вариабельности экспрессии FasL. Таким образом показано, что опухолевые клетки с разным уровнем генетического полиморфизма могут оказывать воздействие на контактирующие с ними лимфоциты, влияя на экспрессию FasL и определяя таким образом интенсивность апоптоза опухолевых клеток.

Теоретическое и практическое значение работы

Полученные данные показывают, что в возникновении и нарастании генетического полиморфизма в процессе пролиферации опухолей in vitro и in vivo участвуют перестройки, выявляемые методом RAPD-ПЦР. Вариабельность числа перестроек такого типа может дать представление о жизнеспособности опухолевых клоновых линий. Важное теоретическое значение имеет показанная в работе возможность повышения уровня дифференцировки в клоновых линиях даже при высоких значениях индекса генетической вариабельности.

Практическое значение работы заключается в том, что показана целесообразность использования для изучения взаимодействия опухолевых клеток с иммунной системой модели совместного культивирования опухолевых клонов с сингенными спленоцитами. Такая модель может быть использована не только в экспериментальной онкологии, но также и для изучения опухолей человека с целью определения их взаимоотношения с лимфоцитами носителя опухоли. При этом показана целесообразность выявления генетической вариабельности в опухолях методом RAPD-ПЦР для определения степени их злокачественности и способности индуцировать апоптоз лимфоцитов, а также претерпевать индукцию апоптоза лимфоцитами. В работе показана целесообразность использования метода ОТ-ПЦР для выявления экспрессии Fas и FasL в опухолевых клетках и спленоцитах.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР