Гомо- и гетероолигомерные комплексы малых белков теплового шока человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Мымриков, Евгений Викторович

• Мымриков, Евгений Викторович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мымриков, Евгений Викторович

Список сокращений.

1. Обзор литературы.

1.1. Семейство малых белков теплового шока.

1.2. Структура малых белков теплового шока.

1.3. Малые белки теплового шока человека.

1.4. Некоторые функции малых белков теплового шока человека.

1.4.1. Предотвращение агрегации денатурированных белков.

1.4.2. Роль малых белков теплового шока в предотвращении апоптоза.

1.4.3. Возможное влияние малых белков теплового шока на актиновый цитоскелет

1.5. Мутации малых белков теплового шока, коррелирующие с развитием наследственных заболеваний. Роль Р7-складки в структуре sHsp.

1.6. Взаимодействие малых белков теплового шока человека.

2. Цель и задачи исследования.

3. Материалы и методы.

3.1. Получение плазмид, содержащих кодирующие последовательности исследуемых белков.

3.2. Тестовая и препаративная экспрессия рекомбинантных белков.

3.3. Получение компетентных клеток Е. coli.

3.4. Выделение и очистка рекомбинантных белков.

3.4.1. Выделение и очистка HspB 1 дикого типа (HspBl WT).

3.4.2. Выделение и очистка HspB6 дикого типа (HspB6WT) и HspB6 с заменами C46S/E116С (HspB6Cys).

3.4.3. HspB5 дикого типа (HspB5WT), выделение и очистка HspB5 с точечной мутацией El 17С (HspB5Cys).

3.4.4. Выделение и очистка HspB8 дикого типа (HspB8WT) и HspB8 с заменами С10S/C99S/N138С/С195S (HspB8Cys).

3.5. Сравнение структуры и шапероноподобой активности sHsp дикого типа и их «цистеиновых» мутантов.

3.5.1. Получение восстановленных и окисленных белков.

3.5.2. Сравнение вторичной структуры методом кругового дихроизма.

3.5.3. Исследование третичной структуры методом собственной триптофановой флуоресценции.

3.5.4. Исследование гидрофобных свойств с помощью зонда bis-ANS.

3.5.5. Сравнение олигомерного состояния методом гель-фильтрации.

3.5.6. Измерение шапероноподобой активности малых белков теплового шока

3.6. Формирование гетероолигомерных комплексов и анализ взаимодействия sHsp in vitro

3.6.1. Анализ взаимодействия различных малых белков теплового шока методом гель-фильтрации.

3.6.2. Детекция гетероолигомеров методом аналитического ультрацентрифугирования.

3.7. Анализ взаимодействия малых белков теплового шока с помощью метода коиммунопреципитации in vitro и in vivo.

3.7.1. Исследование взаимодействия sHsp человека на клеточном уровне.

3.7.2. Метод вестерн-блоттинга.

3.7.3. Получение моноклональных антител к HspB5 (аВ-кристаллину).

3.8. Аналитические методы.

3.8.1. Электрофоретические методы.

3.8.2. Определения концентрации белка.

3.8.3. Окрашивание гелей серебром.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1. Выделение и очистка рекомбинантных малых белков теплового шока человека

4.1.1. Выделение и очистка HspB 1 дикого типа.

4.1.2. Выделение и очистка «цистеинового» мутанта HspB5.

4.1.3. Выделение и очистка HspB6 дикого типа и его «цистеинового» мутанта

4.1.4. Выделение и очистка HspB8 дикого типа и его «цистеинового» мутанта

4.2. Сравнение структуры и шапероноподобной активности sHsp дикого типа и их «цистеиновых» мутантов.

4.2.1. Сравнение вторичной структуры sHsp дикого типа и их «цистеиновых» мутантов

4.2.2. Исследование третичной структуры белков методом собственной триптофановой флуоресценции.

4.2.3. Исследование гидрофобных свойств малых белков теплового шока с помощью флуоресцентного зонда bis-ANS.

4.2.4. Исследование олигомерного состояния методом гель-фильтрации.

4.2.5. Измерение шапероподобной активности малых белков теплового шока.

4.3. Исследование белок-белковых взаимодействий в гомоолигомерах sHsp человека

4.3.1. Сравнение структуры «цистеиновых» мутантов sHsp человека в восстановленном и окисленном состоянии.

4.3.2. Сравнение шапероноподобной активности «цистеиновых» мутантов sHsp человека в восстановленном и окисленном состоянии.

4.4. Формирование гетероолигомеров малых белков теплового шока человека

4.4.1. Образование гетсродимеров малыми белками теплового шока человека

4.4.2. Формирование гетероолигомерных комплексов малых белков теплового шока дикого типа и их «цистеиновых» мутантов в условиях in vitro.

4.5. Использование метода коиммунопреципитации для анализа взаимодействия малых белков теплового шока в условиях in vitro и in vivo.

4.6. Исследование механизма взаимодействия малых белков теплового шока

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Мымриков, Евгений Викторович

Выводы

1. Получены так называемые «цистеиновые» мутанты трех малых белков теплового шока человека, в которых все эндогенные остатки цистеина были заменены на остатки серина, а в положение, гомологичное Суз137 НврВЬ введен остаток цистеина.

2. Установлено, что структура и шапероноподобная активность «цистеиновых» мутантов НврВб, ШрВб и НэрВ8 существенно не отличаются от соответствующих свойств белков дикого типа.

3. Опыты, проведенные с использованием белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов, свидетельствуют о том, что Н8рВ1, НзрВ5 и НярВб взаимодействуют между собой и способны образовывать прочные гетероолигомерные комплексы.

4. Ни НзрВ8 дикого типа, ни его «цистеиновый» мутант не способны образовывать прочных гетероолигомерых комплексов с НзрВ1, НзрВ5 или НврВб.

5. Предложена модель, согласно которой свободные мономеры малых белков теплового шока человека необходимы для формирования гетероолигомерных комплексов.

4.7. Заключение

Таким образом, в ходе данной работы мы разработали новый подход для анализа взаимодействия малых белков теплового шока человека. Предложенный нами метод состоит во введении дополнительного остатка цистеина в участок, предположительно вовлеченный во взаимодействие соседних мономеров в составе димеров, образующих крупные олигомеры малых белков теплового шока человека. Получены так называемые «цистеиновые» мутанты четырех эНэр и установлено, что структура таких мутантных белков практически не отличается от структуры белков дикого типа. «Цистеиновые» мутанты эНвр эффективно образовывали дисульфидные связи как в составе гомо-, так и в составе гетеродимеров, что свидетельствует о том, что р7-складка, в которой расположен введенный остаток цистеина, принимает участие во взаимодействии мономеров различных эНэр человека. Эти результаты были подтверждены экспериментами, выполненными зарубежными учеными на изолированных а-кристаллиновых доменах Н$рВ5 (аВ-кристаллина) человека и Нэр20 крысы методами рентгеноструктурного анализа и ядерного магнитного резонанса (ЯМР) [11-13]. С использованием белков дикого типа и их «цистеиновых» мутантов установлено, что НзрВ1, НзрВ5 и ШрВб эффективно взаимодействуют между собой, в то же время они лишь очень слабо взаимодействуют с НзрВ8.

На основе полученных результатов предложена схема, описывающая предполагаемый механизм образования гетероолигомерных комплексов эНэр человека. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что для образования гетероолигомерных комплексов необходима диссоциация олигомеров до свободных мономеров. Взаимодействуя между собой, мономеры образуют гомо- или гетеродимеры, которые, ассоциируя, формируют различные по размеру и составу гетероолигомеры.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мымриков, Евгений Викторович, 2012 год

1. Mymrikov, E.V., A.S. Seit-Nebi, and N.B. Gusev, Large potentials of small heat shock proteins Physiol. Rev., 2011. 91(4): p. 1123-1159.

2. Narberhaus, T., Alpha-crystallin-type heat shock proteins socializing mimchaperones in the context of a multichapei one network Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2002. 66(1): p. 64-93.

3. Vos, M.J., et al., Sti uctural and functional diversities between members of the human IISPB, HSPH, HSPA, and DNAJ chaperone families Biochemistry, 2008. 47(27): p. 7001-7011.

4. Kappe, G., W.C. Boelens, and W.W. de Jong, Why proteins without an alpha-crystallin domain should not be included in the human small heat shock protein family IISPB. Cell Stress Chaperones, 2010. 15(4): p. 457-461.

5. Kriehuber, T., et al., Independent evolution of the core domain and its flanking sequences in small heat shock proteins FASEB J., 2010. 24(10): p. 3633-3642.

6. Kim, K.K., R. Kim, and S.H. Kim, Crystal structure of a small heat-shock protein Nature, 1998. 394(6693): p. 595-599.

7. Hilario, E , et al, Crystal structures of Xanthomonas small heat shock protein provide a structural basis for an active molecular chaperone oligomer J. Mol. Biol., 2011. 408(1): p. 74-86.

8. Stamler, R , et al., Wrapping the alpha-crystallin domain fold in a chaperone assembly J. Mol. Biol., 2005. 353(1): p. 68-79.

9. Bagneris, C, et al., Crystal structures of alpha-crystallin domain dimers of alphaB-crystallm and Hsp20 J. Mol. Biol., 2009. 392(5). p. 1242-1252.

10. Baranova, E V., et al., Three-dimensional structwe of alpha-crystallin domain dimers of human small heat shock proteins HSPB1 and HSPB6 J. Mol. Biol., 2011. 411(1): p. 110122.

11. Jehle, S., et al., alphaB-crystallm a hybrid sohd-state/solution-state NMR investigation reveals structural aspects of the heterogeneous oligomer J. Mol. Biol., 2009. 385(5): p. 1481-1497

12. Laganovvsky, A., et al., Crystal structures of ti uncated alphaA and alphaB crystallins reveal structural mechanisms of polydispersity important for eye lens function Protein Sci., 2010. 19(5): p 1031-1043.

13. Zavialov, A., et al., I he effect of the inter subunit disulfide bond on the structural and functional properties of the small heat shock piotem IIsp25 Int. J. Biol. Macromol., 1998. 22(3-4): p. 163-173.

14. Jehle, S., et al., Solid-state NMR and SAXS studies pi ovule a structural basis for the activation of alphaB-crystallm oligomers Nat. Struct. Mol. Biol., 2010. 17(9): p. 1037-42.

15. Jehle, S., et al., N-termmal domain of alphaB-aystallin provides a conformational switch for multimerization and structural heterogeneity Proc. Natl. Acad. Sci. U S.A., 2011. 108(16): p. 6409-6414.