Идентификация, клонирование и биохимическая характеристика нового сердечно-специфического белка Сердина-1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Адамейко, Игорь Игоревич

• Адамейко, Игорь Игоревич
• кандидат биологических наук
• 0

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Адамейко, Игорь Игоревич

L Введение

II.Обзор литературы

2.1. Лейцин-богатые белки, содержащие LRR-домен

2.1.1. Структура и функции LRR-белков 8 2.1.2 Разнообразие LRR-содержащих белков

2.2. Развитие сердца млекопитающих 17 2.2.1 Предшественники различных сердечных клеточных 17 типов локализованы в эпибласте

2.2.2. Паттернизация и детерминация клеток- 19 предшественниц к фенотипу, характерному для кардиомиоцитов

2.2.3. Формирование проводящей системы сердца в 25 развивающемся органе

2.2 4. Формирование системы сосудов в сердце

2.2 5. Транскрипционная регуляция развития сердца

2.2.5.1. Механизмы индукции и основные 32 молекулярные события раннего развития сердца беспозвоночных и позвоночных животных

2.2.5.2. Основные транскрипционные факторы 41 сердечного развития

2.2.5.3 Транскрипционная регуляция процессов 52 пространственного морфогенеза сердца, паттернизации и формирования дифференцированных регионов в составе сердца

III. Экспериментальная часть.

3.1. Объекты и методы исследований 54 3.1.1 Объекты исследований 54 3.1.2. Основные методы исследований

3.2. Результаты и их обсуждение

3.2.1. Идентификация Сердина-1 методами 72 компьютерного (In Silico) анализа

3.2.2. Экспериментальное подтверждение уникальной 79 экспрессии Сердина-1 в сердце на уровне мРНК

3.2.3. Анализ экспрессии Сердина-1 на уровне белка 85 3.2.4 Поиск белкового партнера, взаимодействующего с 93 Сердином

3.2.5. Идентификация геномных регуляторных областей, 99 отвечающих за специфичность экспрессии Сердина

3.2.6. Обсуждение потенциальной функции Сердина-1 в 102 контексте полученных данных

IV. Выводы 112 V Цитированная литература

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация, клонирование и биохимическая характеристика нового сердечно-специфического белка Сердина-1»

Сердце - одна из первых структур, возникающих в органогенезе (DeRuiter et al., 1992; Icardo, 1996). Несмотря на то, что к настоящему времени известно большое количество регуляторных и структурных белков, специфично экспрессирующихся в развивающемся сердце, точные механизмы формирования эмбрионального сердца позвоночных остаются загадочными. Более глубокое проникновение в суть подобных механизмов дифференцировки и органогенеза подразумевает идентификацию и анализ белков, играющих специфическую роль в эмбриональном сердечном развитии. Сложность процесса кардиогенеза отражает высокий процент врожденных дефектов у человека 5-8 случаев из 10 ООО новорожденных (Bower, Ramsey, 1994; Wren, O'Sullivan. 2001; McConnell. Elixson, 2002: Трисветова, 2003). Множественные внутриклеточные взаимодействия и морфогенетические стратегии необходимы для полноценного своевременного реформирования примитивного эмбрионального сердца в зрелый четырехкамерный орган (Mably, Liew, 1996; Olson, Shneider, 2003).

Идентификация новых сердечно-специфических белков и выяснение их функции являются необходимым подходом для углубления наших знаний о природе и механизмах эмбрионального кардиогенеза, экспрессии и регуляции определенных генов в течение этого сложного процесса (Small. Kreig, 2004). Наиболее стандартным подходом для идентификации новых генов позвоночных является позиционное клонирование или изоляция по принципу интересующей исследователя гомологии с последующим анализом специфичности экспрессии и обратной генетики (Федоров, 2004). И, хотя позиционное клонирование остается актуальным до сих пор, технологии обратной генетики (генный таргетинг, трансгенные мыши) являются сложными, дорогостоящими и зарезервированы, как правило, для генов с хорошо охарактеризованными функциональными доменами. Необходимо отметить, что в качестве относительно недорогой и производительной альтернативы для поиска и идентификации новых генов несомненно выгодно использование ключевого преимущества доступных компьютерных баз данных, содержащих случайно отсеквеннированные короткие экспрессирующиеся последовательности (EST) (Marra et al., 1999).

Все вышесказанное обуславливает развитие разнообразных In Silico (компьютерных) алгоритмов, направленных на идентификацию белков, обладающих заданными свойствами, и расширению количества транскриптомных баз данных, доступных для открытого анализа.

В последние несколько лет исследования в области кардиогенеза были сфокусированы в основном на изучении роли нескольких семейств транскрипционных факторов, вовлеченных в комбинированную регуляцию развития сердца, а также белков, имеющих в своем составе определенные домены или области, охарактеризованные функционально.

Таким образом, логично предположить, что некоторые белки, не имеющие в своем составе охарактеризованных структур, остались неидентифицированными, хотя их важность для кардиогенеза может быть весьма велика. Именно поэтому разработка методов, позволяющих идентифицировать подобные белки, весьма актуальна. В конкретном случае сердца важность роли белка для процесса кардиогенеза может быть отражена через высокую пространственно-временную специфичность экспрессии, а отсутствие известных к настоящему времени доменов может приводить к характеризации принципиально новых структур, ответственных за неизвестные на сегодняшний день функции. Несмотря на постоянно увеличивающееся количество работ, посвященных вопросам клонирования новых сердечно-специфичных белков, тем или иным способом участвующих в процессах кардиогенеза. вопрос о множественных механизмах, лежащих в основе сердечного развития. остается открытым, что обуславливает высокую актуальность проведенного исследования.

Цели и задачи исследования: Основной целью данной работы был поиск и идентификация новых сердечно-специфических белков современными методами анализа транскриптома, как биоинформатическими, так и экспериментальными. а также характеризация и изучение молекулярной роли отобранного белка Сердина-1. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. Разработать алгоритм In Silico скрининга доступных баз данных на предмет идентификации тканеспецифичных EST тагов.

2. Проанализировать эмбриональные сердечные библиотеки для получения набора кандидатов с высокой степенью сердечно-специфичной экспрессии.

3. Подтвердить сердечно-специфическую экспрессию отобранных кандидатов с помощью In Situ гибридизации на целых мышиных эмбрионах Отобрать наиболее подходящего кандидата, где сильная экспрессия проявляется исключительно в сердце.

4. Проанализировать профиль экспрессии полученного кандидата (Сердина-I) на уровне мРНК и белка. Исследовать его внутриклеточную локализацию в гетерологичных и паралогичных клеточных системах.

5. Клонировать и охарактеризовать ближайшего гомолога в геноме млекопитающих.

6. Оценить схему регуляции экспрессии Сердина-1 на уровне промотера.

7. Получить представление о функции Сердина-1 с помощью идентификации взаимодействующих партнеров благодаря методу дрожжевой двухгибридной системы.

Научная новизна работы: Впервые проведен In Silico анализ мышиного транскриптома с целью выявления сердечно-специфичных ESTтагов с использованием предложенного в данной работе алгоритма. Идентифицирован, клонирован и охарактеризован новый сердечно-специфичный белок Сердин-1, клонирован его ближайший гомолог Сердин-R. Внесены поправки в геномный сиквенс Danio rerio в месте, соответствующем 5 - фрагменту кодирующей области гена Сердина-1

Впервые получены поликлональные кроличьи антитела против Сердина-1, с помощью ряда экспериментов подтверждена их высокая специфичность. Продемонстрирована ранняя эмбриональная экспрессия Сердина-1, специфичная исключительно для кардиомиоцитов. Показана корреляция между созреванием недифференцированных клеток по кардиомиоцитному пути с началом синтеза Сердина-1 и других молекулярных кардиальных маркеров.

Проведенное исследование выявило способность Сердина-1 к внутриклеточному транспорту из цитоплазмы в ядро, при этом впервые была установлена его локализация в зрелых кардиомиоцитах в составе N2A-perHOHa титина 1-диска саркомера

В экспериментах на полученных трансгенных мышах было показано, что область длиной 7.5 тысяч пар нуклеотидов перед первым ATG кодоном Сердина-1 достаточна для полного восстановления сердечно-специфичной экспрессии lacZ-репортера. Компьютерный анализ позволил идентифицировать 80-ти нуклеотидную область гомологии между человеческим и мышиным геномом, отстоящую от начала трансляции Сердина-1 на 3 тысячи пар нуклеотидов и содержащую сайты узнавания сердечно-специфических транскрипционных факторов GATA, MEF-2 и SRF. Полученные данные подтверждают гипотезу о том. что Сердин-1 глубоко интегрирован в пути регуляции, контролирующие развитие сердца позвоночных на протяжении эмбрионального развития.

Таким образом, в дополнение к особенностям экспрессии белка, было показано, что сердечно-специфическая регуляция работы промотора Сердина-1 является консервативной между мышью и человеком на уровне генома. В настоящее время исследования продолжаются в направлении изучения конкретной роли Сердина-1 в процессе эмбрионального кардиогенеза.

Практическая значимость работы: Создан новый биоинформатический алгоритм для скрининга баз данных с целью поиска тканеспецифично экспрессирующихся белков, способный применяться на любом объекте, для которого существуют доступные транскриптомные библиотеки. Данный подход был успешно апробирован на эмбриональной сердечной библиотеке, в результате чего впервые был идентифицирован и отклонирован новый сердечно-специфичный ЫЩ-содержащий белок, получивший название Сердин-1. Впервые был получен минимальный промотер гена Сердина-1, подтвердивший теорию о специфичной организации сердечного проксимального регуляторного элемента и способный использоваться для создания трансгенов с ранней (начиная со стадии 7.5 ОРС), исключительно сердечной экспрессией.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, выводов, списка литературы И приложения. Работа изложена на 135 страницах и включает 19 рисунков и схем. Список литературы содержит 210 источников, из них 205 зарубежных.