Иммуноферментный анализ естественных антител к ангиотензин-превращающему ферменту и его субстратам тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Кострикин, Дмитрий Сергеевич

• Кострикин, Дмитрий Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Кострикин, Дмитрий Сергеевич

Выполнено исследование по совместному определению Е-АТ к АН, БК и АПФ у больных с системными заболеваниями соединительной ткани. Результаты работы по анализу образцов сыворотки крови пациентов с РА представлены в таблице 27.

Таблица 27. Уровни естественных антител к ангиотензин-превращающему ферменту у доноров и больных ревматоидным артритом.

ДИАГНОЗ УРОВЕНЬ АНТИТЕЛ К ИССЛЕДУЕМОМУ АНТИГЕНУ

АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИЙ ФЕРМЕНТ АНГИОТЕНЗИН II БРАДИКИНИН

Ревматоидный артрит 0.42±0.181 0.31±0.122 0.33±0.

Ревматоидный артрит с системными проявлениями 0.38±0.162 0.33±0.099 0.35±0.

Ревматоидный артрит с суставной формой 0.47±0.119 0.36±0.089 0.38Ю.

Доноры 0.42±0.121 0.3210.114 0.25±0.

Как было показано ранее (раздел 3.1.3) не было установлено прямой зависимости между активностью ферментных и уровнем Е-АТ к нему.

Однако, отмечая участие антител к ферменту и его субстратам в течении и развитии этих патологий можно видеть, что при гипертонии и системных заболеваниях соединительной ткани происходит одновременное изменение уровня антител к ферменту и его субстратам.

У больных с суставной формой был самый высокий уровень Е-АТ к БК, как, впрочем, и уровень Е-АТ к другим субстратам. Этот феномен представляет особый интерес, так как поражение суставов есть у всех больных, а у пациентов с системными проявлениями имеется выраженный ревматоидный васкулит, и можно было бы предполагать обратное соотношение. Известно, что БК под влиянием карбоксипептидазы N в плазме превращается в дез-Агд9-БК, который расщепляется с помощью АПФ (киназы II) до пентапептида Arg-Pro-Pro-Gly-Phe и трипептида Ser-Pro-Phe.

Период полужизни БК в биологических жидкостях составляет менее минуты. Sheikh I.A. и Kaplan А.Р. показали, что у больных РА и СКВ скорость второго этапа деградации БК под влиянием АПФ значительно выше, чем у здоровых и больных остеоартритом. Не исключено, что это компенсанаторная реакция на избыточное образование провоспалительного медиатора. По аналогии, низкие уровни Е-АТ к БК при РА с системными проявлениями могут косвенно отражать нарушение баланса между образованием БК и его деградацией. Пока неясно, на каком этапе происходит взаимодействие Е-АТ - с самим БК или с его метаболитами, поэтому феномен снижения уровня Е-АТ к БК у больных с ревматоидным васкулитом может свидетельствовать как о недостаточной продукции Е-АТ, так и об избыточном их потреблении.

Корреляций между уровнями анти-АПФ антител и активностью самого фермента в нашем исследовании не выявлено, что может объясняться различиями AT, вырабатываемых к различным эпитопам разных фракций фермента. Тем не менее, полученные результаты свидетельствуют, что при системных заболеваниях соединительной ткани отмечаются особенности уровней циркулирующих Е-АТ. Они зависят как от нозологий, так и от клинической картины.

Следующий этап работы связан с исследованием сыворотки крови сердечно-сосудистых больных (ИБС), в терапии которых применяли ингибиторы АПФ (эналаприл и диротон).

Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента (ИАПФ) стали одним из главных средств терапии ГБ [62,67,82,83,117,250]. Не до конца изучены особенности бронхиальной проходимости у больных ГБ с сопутствующей бронхиальной астмой (БА), а также влияние ИАПФ на бронхиальную проходимость у этой группы больных [130,133,295]. Самым распространенным и раздражающим побочным эффектом ИАПФ является кашель. По данным различных исследователей [327,352,383] частота возникновения кашля колеблется от 2.2% до 25% случаев постоянного приема ИАПФ. У больных ГБ с сопутствующей БА требуется внесение корректив в общепринятые стандарты лечения ГБ.

Многочисленные эксперименты на животных и в клинике с использованием специфических антагонистов рецепторов БК доказали, что многие положительные, особенно органопротекторные, эффекты ингибиторов АПФ связаны со способностью блокировать разрушение БК и усиливать роль эндотелиальных факторов вазодилатации, ремоделирования сосудов и миокарда [264,277]. С другой стороны, этот же механизм обусловливает и один из главных побочных эффектов ИАПФ - кашель, так как накопление БК действует на рецепторный аппарат бронхиального дерева, повышает биоэлектрическую активность гладкой мускулатуры и приводит к бронхоконстрикции [6].

Концентрация БК в крови ничтожна мала (около 2x10"8 г/л) вследствие очень высокой скорости гидролиза БК: период его полураспада в крови человека равен 30 секундам. Инактивация БК осуществляется в организме АПФ, который гидролизует в его молекуле пептидные связи. БК в легких разрушается только этим ферментом. Определение содержания самого БК в кровотоке является дорогостоящим и трудоемким методом, что сдерживает его применение в клинической практике.

Известно, что Е-АТ - белковые молекулы сыворотки крови, долго циркулирующие в организме и обладающие специфичностью взаимодействия с тем или иным эндогенным веществом. Они сохраняют «память» о всех процессах и изменениях, которые происходят в организме при участии указанных бирегуляторов. В связи с этим целесообразно создавать методы выявления Е-АТ в организме. Ранее нами был разработан метод определения Е-АТ к БК в сыворотке крови человека и использован в сравнительном анализе для оценки их содержания в группе больных и здоровых доноров [46].

Показано, что уровень Е-АТ может коррелировать с тяжестью и течением заболевания. Мы обследовали группу больных ИБС с различными течениями патологии и наличием побочных эффектов, связанных с бронхиальными проявлениями.

Лечение этих больных проводили ингибиторами АПФ (эналаприл и диротон) (таблицы 28-29). В группе с БА легкого течения (20 пациентов) у 2 пациентов, принимавших 10 мг эналаприла начался кашель без изменения ФВД на 3 неделе. До лечения они имели бронхообструкцию легкой степени. У 3 пациентов, принимавших 20 мг эналаприла кашель с изменением ФВД зарегистрирован также на 3-ей неделе лечения.

До лечения они имели бронхообструкцию средней степени тяжести.

Выявленная отрицательная динамика ФВД у 3 пациентов (15%) и обеспечила достоверное снижение этих показателей в целом по группе. Повышение уровня Е-АТ к БК обнаружено у 5 (25%) пациентов (р<0.02) с указанными выше побочными реакциями.

В группе с БА средней тяжести (20 пациентов) кашель с изменением ФВД выявлен у 5 пациентов, 1 из которых принимал 10 мг и 4 пациента - 20 мг эналаприла. Изменения зарегистрированы в конце 2-ой недели лечения. Еще у 2 пациентов, принимавших 10 мг эналаприла к 4-ой неделе лечения выявлено асимптоматическое снижение ФВД более чем на 10%, что является диагностически незначимым, но дает снижение показателей ФВД в целом по группе.

До лечения 3 пациента, принимавшие 10 мг эналаприла имели бронхообструкцию легкой степени и 4 пациента были с бронхообструкцией средней степени тяжести. Выявленная отрицательная динамика ФВД у 7 пациентов (35%) обеспечила достоверное снижение этих показателей по группе. Повышение уровня Е-АТ к БК обнаружено у 7 (35%) с достоверностью р<0.02 пациентов с указанными выше побочными реакциями.

В группе пациентов с БА тяжелого течения (7 пациентов) было отмечено уже на 2-е сутки лечения снижение скоростных показателей ФВД у 2 больных. Эти пациенты имели тяжелую степень бронхообструкции и принимали 20 мг эналаприла.

Таблица 28. Частота возникновения кашля и снижение показателей ФВД при применении эналаприла.

ГРУППА КОЛИЧЕСТВО ПАЦИЕНТОВ ДОЗЫ ЛЕКАРСТВЕННОГ О ПРЕПАРАТА, МГ КАШЕЛЬ СНИЖЕНИЕ ФВД АСИМПТОМАТИЧЕСКОЕ % ПАЦИЕНТОВ С КАШЛЕМ И ИЗМЕНЕНИЕМ ФВД СТЕПЕНЬ БРОНХООБСТРУКЦИИ У ПАЦИЕНТОВ С ПОБОЧНЫМ ЭФФЕКТОМ ДО ЛЕЧЕНИЯ

Без изменения ФВД С изменением ФВД ЛЕГКАЯ СРЕДНЯЯ ТЯЖЕЛАЯ

ГБ, ИБС+БА ЛЕГКОЕ ТЕЧЕНИЕ 10 10 2 — — 25% 2 — —

10 20 — 3 — — 3 —

ГБ, ИБС+БА СРЕДНЕЕ ТЕЧЕНИЕ 5 10 — 1 2 35% 3 — —

15 20 — 4 — 4 —

ГБ, ИБС+БА ТЯЖЕЛОЕ ТЕЧЕНИЕ 2 10 — 4 — 85.7% —

5 20 — 2 — — — всего 47 (18М/29Ж) 2 14 2 38.3%

Таблица 29. Частота возникновения кашля и снижение показателей ФВД при применении диротона.

ГРУППА КОЛИЧЕСТВО ПАЦИЕНТОВ дозы ЛЕКАРСТВЕННОГ О ПРЕПАРАТА, МГ КАШЕЛЬ СНИЖЕНИЕ ФВД АСИМПТОМАТИЧЕСКОЕ % ПАЦИЕНТОВ С КАШЛЕМ И ИЗМЕНЕНИЕМ ФВД СТЕПЕНЬ БРОНХООБСТРУКЦИИ У ПАЦИЕНТОВ С ПОБОЧНЫМ ЭФФЕКТОМ ДО ЛЕЧЕНИЯ

Без изменения ФВД С изменением ФВД ЛЕГКАЯ СРЕДНЯЯ ТЯЖЕЛАЯ

ГБ, ИБС+БА ЛЕГКОЕ ТЕЧЕНИЕ 5 10 — — — — —

6 15 — — — — — —

9 20 — — — — — —

ГБ, ИБС+БА СРЕДНЕЕ ТЕЧЕНИЕ 2 10 — — 15% — 3 —

10 15 1 — — — — —

8 20 2 — — — — —

ГБ, ИБС+БА ТЯЖЕЛОЕ ТЕЧЕНИЕ 2 15 1 — — — 1 —

3 20 — 2 — 60% — — всего 45 (21М/24Ж) 4 2 13.3% (О

У этих больных было отмечено снижение ОФВ1, МОС25-75 на 10% от исходных величин, а к 5 суткам более, чем на 15% после чего препарат был отменен. К 3-ей неделе лечения еще у 4-х больных, получавших 10 мг эналаприла, снижались скоростные показатели ФВД. У 2 до лечения была бронхообструкция средней степени тяжести и у 2 - тяжелая. К 4-й неделе эналаприл был отменен у этих пациентов, так как снижение скоростных показателей превысило 15%, кашель усиливался. Выявленная отрицательная динамика ФВД у 6 пациентов (85.7%) обеспечила достоверное снижение этих показателей по группе. Повышение уровня Е-АТ к БК обнаружено у 6 пациентов (85.7%) с достоверностью р<0.02 с указанными выше побочными реакциями. Особое внимание заслуживает тот факт, что выявленные изменения показателей ФВД зависели от степени бронхообструкции: чем тяжелее бронхообструкция, тем больше пациентов зарегистрировано с кашлем и изменением ФВД (таблица 30). Большинство пациентов с кашлем и изменением ФВД до лечения имели бронхообструкцию средней и тяжелой степени тяжести.

Таблица 30. Определение естественных антител к брадикинину у больных ишемической болезнью сердца на фоне различной степени бронхиальной астмы при лечении эналаприлом

СТЕПЕНЬ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО ПАЦИЕНТОВ КОЛИЧЕСТВО ПАЦИЕНТОВ С ПОБОЧНЫМ ЭФФЕКТОМ КОЛИЧЕСТВО ПАЦИЕНТОВ С ПОВЫШЕННЫМ В ИФА УРОВНЕМ ЕСТЕСТВЕННЫХ АНТИТЕЛ К БРАДИКИНИНУ, О<0.

Легкая

Средняя

Тяжелая

Так, из 47 больных, принимавших эналаприл, у 2 был отмечен кашель без изменения ФВД, у 14 больных кашель и снижение скоростных показателей ФВД, и у 2 снижение скоростных показателей ФВД, которые были асимптоматическими и не сопровождались усилением экспираторной одышки. Также было выявлено, что частота побочных явлений увеличивалась в зависимости от тяжести течения заболевания.

Для эналаприла дозировка не имела значение. Пациенты с нарушением бронхиальной проходимости принимали как 10 мг, так 20 мг препарата.

При применении диротона выявлено значительно меньше побочных эффектов (13.3%) по сравнению с эналаприлом (38.3%). В группе пациентов с бронхиальной астмой легкого течения побочных эффектов выявлено не было.

В группе с БА средней тяжести (20 пациентов) кашель без изменения ФВД выявлен у 3 пациентов, 1 из которых принимал 15 мг и 2 пациента - 20 мг диротона. Изменения зарегистрированы в конце 2-ой недели лечения. До лечения у пациентов была бронхообструкция средней степени тяжести. Повышение уровня антител к БК обнаружено у 3 (15%) с достоверностью р<0.02 пациентов с указанными выше побочными реакциями.

В группе из 5 пациентов с бронхиальной астмой тяжелого течения было отмечено через 10 дней от начала лечения снижение скоростных показателей ФВД и кашель у 2 больных, принимавших 20 мг диротона. Эти пациенты имели тяжелую степень бронхообструкции. У этих пациентов было отмечено снижение ОФВ^ МОС25-75 более чем на 10% от исходных величин, а к 15 суткам более, чем на 15%, после чего препарат был отменен. К 3-ей неделе лечения у 1 пациента, получавшего 10 мг диротона появился кашель без изменений ФВД. У этого пациента до лечения была бронхообструкция средней степени тяжести. Выявленная отрицательная динамика ФВД у 3 пациентов (15%) и обеспечила достоверное снижение этих показателей в целом по группе. Повышение уровня Е-АТ к БК обнаружено у 3 (60%) пациентов с указанными выше побочными реакциями с достоверностью р<0.02. Так, из 45 больных, принимавших диротон, у 4 был отмечен кашель без изменения ФВД, у 2 больных кашель и снижение скоростных показателей ФВД.

Выявленные изменения показателей ФВД также зависели от степени бронхообструкции (таблица 31). Пациенты с бронхиальной астмой, принимавшие эналаприл и диротон проводили пикфлоуметрию в домашних условиях. У пациентов со снижением скоростных показателей через 5-7 дней от начала лечения регистрировалось увеличение суточного разброса ПВС до 20%.

Тщательный клинический анализ показал, что усиление кашля и ухудшение скоростных показателей ФВД не было связано с обострением имевшегося хронического воспалительного заболевания легких. Ни у кого из больных не отмечалось изменение температуры тела, воспалительных изменений в крови и других признаков воспалительного процесса.

Таблица 31. Определение естественных антител к брадикинину у больных ишемической болезнью сердца на фоне различной степени бронхиальной астмы при лечении диротоном.

СТЕПЕНЬ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ ОБЩЕЕ КОЛИЧЕСТВО ПАЦИЕНТОВ КОЛИЧЕСТВО ПАЦИЕНТОВ С ПОБОЧНЫМ ЭФФЕКТОМ КОЛИЧЕСТВО ПАЦИЕНТОВ С ПОВЫШЕННЫМ В ИФА УРОВНЕМ ЕСТЕСТВЕННЫХ АНТИТЕЛ К БРАДИКИНИНУ, р<0.

Легкая

Средняя

Тяжелая

В ходе проведенного ИФА выявлено, что исходный уровень Е-АТ был равен среднему значению для доноров или был незначительно снижен. В сыворотке крови пациентов с побочными эффектами выявлено достоверное (р<0.02) повышение Е-АТ против БК по сравнению с исходными значениями.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанный метод твердофазного ИФА позволяет выявить различные уровни Е-АТ к АПФ и его субстратам у больных.

Изменение уровня антител к БК связано с течением побочных процессов при лечении ИАПФ. Можно предположить, что в этом случае происходит увеличение в кровотоке содержания БК, в свою очередь, который стимулирует дополнительную продукцию антител к нему.

Следующий этап работы связан с исследованием влияния диетотерапии у больных сердечно-сосудистыми заболеваниями на уровень антител к АПФ и его субстратам.

В период лечения все пациенты (137 человек) с сердечно-сосудистыми заболеваниями и нарушением обмена веществ были разделены на 2 группы:

Ш Больные 1-ой группы (87 человек) получали базисную диету (А I), содержащую 98 г белка, 88 г жира и 320 г углеводов при энергетической ценности рациона 2500 ккал.

W Больные 2-ой группы (50 человек) находились модифицированной на диете (A IJ1), в которой 20 г подсолнечного масла были заменены на 20 г льняного масла.

Ж Контрольную группу (25 человек) составили практически здоровые доноры такого же возраста и в тот же сезонный период.

Далее для пациентов 1-й и 2-й групп провели исследование влияния диетотерапии на содержание Е-АТ к АН и БК. В процессе диетотерапии у всех больных наблюдалась положительная динамика в клинической картине заболевания, проявлявшаяся в снижении степени выраженности коронарной недостаточности и уменьшении артериального давления [3,6,13,29].

Так, в результате лечения противоатеросклеротической диетой А I у пациентов ИБС, ГЛП и ГБ отмечалось снижение систолического артериального давления (САД) на 17-22%, диастолического артериального давления (ДАД) на 10-12%, а при использовании в диетотерапии льняного масла у больных ИБС и ГБ - САД снижалось на 2025%, ДАД-на 13-15%.

Изучение гуморальных факторов иммунитета показало отрицательную корреляционную связь между содержанием Е-АТ к БК класса IgG и показателями САД (г=-0.91) и ДАД (г=-0.89) у больных ИБС, ГБ и ГЛП. Также была обнаружена отрицательная корреляция между содержанием Е-АТ к АН и показателями САД (г=-0.85) и ДАД (г=-0.89) у пациентов с ИБС, ГБ и ГЛП. У основной части наблюдаемых пациентов обнаружено изначальное снижение уровня Е-АТ к БК и All в сыворотке крови.

Лечебная терапия диетой с включением ПНЖК ю-3 льняного масла позволило значительно больше увеличить содержание Е-АТ в сыворотке крови пациентов к All (на 9-45%) и БК (на 5-14%), чем использование диеты А I для АН (на 8-13%) и БК (на 3-9%) (таблица 25).

Влияние рациона А I на пациентов с изначально повышенным уровнем Е-АТ к АН в сыворотке крови было менее выраженным, чем использование рациона А I Л.

На больных с изначально повышенным содержанием Е-АТ к All наибольший стабилизирующий эффект оказала диета А I Л (на 10-34%) (таблица 32). Диета А I оказала умеренное действие на уровень Е-АТ (на 919%).

Таким образом, при изучении содержания Е-АТ к биорегуляторам, являющимся представителями РАС, у больных с сердечно-сосудистой патологией и нарушением обмена веществ впервые было выявлено нормализующее действие антиатеросклеротической диеты с растительным источником ПНЖК со-З (льняное масло).

Таблица 32. Динамика уровней естественных антител к ангиотензину II и брадикинину у больных ишемической болезнью сердца, гипертонической болезнью и семейной формой гиперлипопротеидемией под влиянием диет с включением полиненасыщенных жирных кислот семейства со-3.

ИССЛЕДУЕМЫЙ АНТИГЕН СРЕДНЕЕ ЗНАЧЕНИЕ ОПТИЧЕСКОЙ ПЛОТНОСТИ В ИФА (OD492) ДЛЯ ГРУПП БОЛЬ НЫХ

ИБС ГБ ГЛП НА ГЛП НБ ГЛП IV

А 1 А 1Л А 1 А 1Л А 1 А 1Л А 1 А 1Л А 1 А 1Л

Антитела IgG класса кАМ <N 1 0.3910.012 0.40Ю.014 0.4310.018 0.4010.016 0.4610.020 0.50Ю.022 0.46Ю.017 0.44+0.019 0.48Ю.024 0.4610.

2 0.44±0.025 0.66+0.038 0.4610.021 0.56+0.028 0.5210.025 0.7010.048 0.5010.021 0.6210.038 0.5510.031 0.6910.

N 1 0.98±0.010 0.9710.013 0.9210.022 0.9810.025 0.9110.024 0.9510.022 - - -

2 0.79±0.024 0.7010.020 0.7810.045 0.6810.031 0.83+0.029 0.7610.051 - -

Антитепа IgM класса КАП <N 1 0.3210.011 0.32Ю.010 0.31+0.011 0.2810.012 0.3210.031 0.30+0.033 0.32*0 015 0.3410.019 0.39Ю.029 0.37+0.

2 0.3710.028 0.4610.029 0.3510.014 0.4110.029 0.3810.034 0.4410.037 0.3910.018 0.4910.024 0.4410.032 0.52+0.

N 1 0.8210.014 0.8410.010 0.8010.020 0.84+0.021 0.7910.021 0.8410.025 0.9710.028 0.9310.022 0.7510.020 0.7910.

2 0.6610.034 0.5510.027 0.7010.029 0.5910.038 0.6710.032 0.6410.047 0.7910.045 0.7410.038 0.60+0.024 0.5510.

Антитепа IgG класса кБК <N 1 0.39+0.015 0.37+0.019 0.41+0.015 0.3710.019 0.36+0.015 0.3710.019 0.36+0.017 0.3910.019 0.3510.011 0.3910.

2 0.43+0.018 0.50+0.025 0.45+0.018 0.4010.024 0.40+0.021 0.43Ю.022 0.4110.026 0.4410.022 0.38+0.022 0.46+0.

Антитела IgM класса кБК <N 1 0.4510.012 0.4610.010 0.4010.015 0.46+0.012 0.3910.020 0.43Ю.026 0.4010.013 0.41+0.016 0.3710.015 0.4310.

2 0.50+0.014 0.5310.019 0.45+0.017 0.5610.026 0.47+0.029 0.5710.031 0.4710.019 0.5110.027 0.4210.020 0.5210.

Примечание: в таблице приняты следующие обозначения:

1» - уровень антител до лечения; «2» - уровень антител после лечения; «N» - норма.

3.4. Определение естественных антител к ангиотензинпревращающему ферменту, ангиотензину II и б радики ни ну в локальной ренин-ангиотензиновой системе глаза.

В настоящее время установлено наличие локальной РАС, регулирующей биохимические процессы глаза. В ряде исследований показано изменение активности АПФ при нарушениях сосудистой стенки глазного яблока. Поэтому представляет интерес расширить наши исследования и выявить наличие Е-АТ к АПФ и его субстратам в глазной жидкости.

Этот раздел работы выполнен для установления роли компонентов локальной РАС глаза (АПФ, АН, БК) в патогенезе широко распространенных, трудно поддающихся лечению и составляющих большой удельный вес среди причин слепоты и слабовидения, заболеваний глаза - ожоговой болезни глаз и глаукомы.

Определение прогностической и диагностической значимости новых иммунохимических методов анализа для клинической практике может привести к разработке новых подходов в лечении этих болезней, основанных на направленной регуляции локальной РАС глаза.

В качестве антигена для разработка ИФА определение Е-АТ использооали АПФ кролика. Этот фермент выделен в необходимых количествах в гомогенном состоянии из легких и почек кролика. В основе этой работы применили ранее разработанную методику для получения АПФ человека.

Так, выделение и очистка соматического АПФ включали в себя следующие стадии:

1. Гомогенизация ткани легких и почек;

2. Экстракция фермента буфером в присутствии тритона Х-100, что обычно используется для перевода интегральных мембранных белков в раствор;

3. Фракционирование белков осаждением сульфатом аммония;

4. Аффинная хроматография фермента на специально синтезированном нами носителе: в качестве матрицы использовали эпоксиактивированную агарозу, в качестве лиганда - специфический ингибитор фермента лизиноприл, а в качестве спейсера использовали М-(р-аминобензоил)-6-аминокапроновую кислоту.

Чистоту полученных препаратов контролировали по результатам Ds

Na-электрофореза. Электрофорез проводили в 7.5% полиакриламидном геле в присутствии 0.1% Ds-Na и 0.1% p-меркаптоэтанола по методу Лэмли. Для окрашивания белков использовали Кумасси бриллиантовый синий R-250.

Следующая задача включала создание иммуноферментных методов анализа Е-АТ к вазоактивным пептидам: АН и БК. Для выполнения поставленной задачи на первом этапе были синтезированы конъюгированные антигены указанных выше пептидов. В качестве макромолекулярного носителя был выбран 4-полинитрофенилакрилат.

В результате работы получены конъюгаты пептидов, содержащие 1012 молей гаптена на моль полимерной матрицы. В исследованиях, выполненных нами ранее, показано, что именно такая эпитопная плотность синтетического антигена позволяет наиболее полностью выявлять широкий спектр антител, присутствующих, например, в сыворотке крови человека.

В настоящее время этот способ получения искусственных антигенов является приоритетным при выборе стратегии синтеза конъюгатов для создания новых иммуноферментных систем.

Второй этап работы связан с выбором оптимальных условий проведения ИФА антител к АН и БК. Впервые в качестве биологического объекта исследования использовали слезную жидкость кролика. Ранее нами было установлено наличие Е-АТ к вазоактивным пептидам в сыворотке крови человека, исследована их роль в течении ряда патологических процессов, происходящих в организме человека.

Выполнение настоящей работы основывалось на тех же методических приемах, которые были разработаны нами при создании иммуноферментной системы анализа антител к All и БК в сыворотке крови человека.

Результаты проведенного эксперимента представлены в таблице 33 для АН и в таблице 34 для БК.

Таблица 33. Результаты ИФА пула слезной жидкости при использовании в качестве антигена ангиотензина II.

РАЗВЕДЕНИЕ ПУЛА СЛЕЗНОЙ жидкости КОНЦЕ НТРАЦИЯ СОРБИ РУЕМОГО КОНЪЮГАТА, мкг/мл

10 0.1 0.

OD OS OD OS OD OS OD OS

1:1 0.41 0.36 0.39 0.37 0.28 0.24 0.21 0.

1:2 0.40 0.31 0.32 0.29 0.30 0.17 0.12 0.

1:4 0.32 0.27 0.28 0.21 0.21 0.14 0.10 0.

1:8 0.36 0.21 0.12 0.15 0.10 0.04 0.08 0.

Фон 0.12 0. Э9 0. D7 0. D

Таблица 34. Результаты ИФА пула слезной жидкости при использовании в качестве антигена брадикинина.

РАЗВЕДЕНИЕ ПУЛА СЛЕЗНОЙ жидкости КОНЦЕНТРАЦИЯ СОРБИРУЕМОГО КОНЪЮГАТА, мкг/мл

10 5 2.5 1.

OD OS OD OS OD OS OD OS

1:1 0.38 0.42 0.21 0.36 0.24 0.21 0.18 0.

1:2 0.30 0.30 0.12 0.32 0.10 0.24 0.12 0.

1:4 0.39 0.21 0.06 0.12 0.09 0.18 0.04 0.

1:8 0.32 0.10 0.09 0.04 0.04 0.10 0.09 0.

Фон 0.12 0. 07 0. 09 0.

Как видно из представленных данных, в слезной жидкости левого (OS) и правого (OD) кролика присутствуют иммуноглобулины, связывающиеся с конъюгатом как БК, так и АН. Полученные значения оптической плотности в ИФА лежат в диапазоне от 0.41 до 0.12 для АН и БК и косвенно отражают невысокий уровень этих белков в слезе. С другой стороны можно отметить изменения значения оптической плотности в ИФА от концентрации сорбированного антигена и разведения слезной жидкости. Для конъюгата АН характерные изменения наблюдаются при С=0.1 мкг/мл и разведении 1:4. В случае конъюгата БК С=5 мкг/мл и разведении 1:2. Однако, полученные линейные закономерности недостаточно выражены, что может быть связано с одной стороны с низкой концентрацией иммуноглобулинов, присутствующих в донорской слезе кролика, и с другой стороны с низкой аффинностью, связывающей способностью этих белков с антигеном.

В исследованиях, выполненных нами ранее, установлено, что антитела, присутствующие в сыворотке крови доноров, связывающие эндогенные биорегуляторы, часто не могут быть обнаружены в ИФА, так как не обладают выраженными иммунохимическими свойствами (аффинность, специфичность). Однако они могут становиться диагностическими маркерами при развитии патологии.

На следующем этапе работы провели ИФА иммуноглобулинов, связывающих конъюгаты АН и БК в индивидуальных образцах слезной жидкости. В качестве антигена для сравнения в ИФА использовали аг-макроглобулин. Как видно из результатов ИФА, представленных в таблице 35, мы не наблюдаем достоверных различий в значениях оптической плотности для слезной жидкости из левого (OS) и правого (OD) глаза кроликов при выявлении иммуноглобулинов, связывающихся с конъюгатами АН и БК.

Таблица 35. Значения оптической плотности (OD492) в ИФА в среднем по группе для исследуемых антигенов.

БРАДИКИНИН* АНГИОТЕНЗИН* аг-МАКРОГЛОБУЛИН

OS OD OS OD OS OD

0.34±0.020 0.36±0.016 0.34±0.014 0.38±0.016 0.5±0.031 0.2310. о=0.089 ст=0.066 ст=0.057 а=0.069 о=0.128 ст=0.

Примечание: * Значение OD492 в ИФА для фона не превышает 0.12.

Однако можно отметить разницу в связывании иммуноглобулинов к указанным выше антигенам и белку аг-макроглобулину. Данные результаты косвенно свидетельствуют о специфическом взаимодействии с пептидами РАС и белком.

При ожогах глаз, как правило, происходит сочетанное поражение роговицы, конъюнктивы и области лимба. Влияние локализации ожога на характер течения ожоговой болезни и метаболические процессы в слезной жидкости остается малоизученным вопросом.

Поэтому была поставлена задача сравнить клиническую картину течения экспериментальной ожоговой болезни глаз и изменения в слезе некоторых показателей, активности АПФ, содержанием антител к ферменту и его субстратам в случае поражения только роговицы и равного по площади и глубине сочетанного ожога роговицы, конъюнктивы и части лимба.

Результаты эксперимента показали, что равные по площади и глубине ожоги центральной зоны роговицы и ожоги периферического фрагмента роговицы в сочетании с фрагментом конъюнктивы и лимба значительно отличаются по клиническому течению и по исходам травмы.

При сочетанном ожоге части роговицы и конъюнктивы симптомы раздражения глаза были слабо выражены и исчезли к концу 3-й недели после травмы. В то же время вокруг обожженной конъюнктивы наблюдали ишемизированную зону, в которой и вокруг нее отмечались участки некроза конъюнктивы.

При ожоге центральной области роговицы васкуляризация ее началась с первой недели и сохранялась в течение всего срока наблюдения. Исследуемые биохимические показатели в слезной жидкости изменялись следующим образом. На 1-3 сутки после травмы в обоих группах возрастала активность АПФ, однако при ожоге роговицы прирост активности фермента составил 30% от исходного уровня, а при сочетанном ожоге - 75%.

X (0 X ( буфер -каптоприл -лизиноприл -контроль

--- - / XZ

- уА^

----- - -щ- ш сутки

-буфер каптоприл

-лизиноприл контроль

Рисунок 47. Уровень естественных антител к ангиотензину II в слезной жидкости кролика при терапии ингибиторами ангиотензин-превращающего фермента. к с о о.

X S X а (О a га С

-буфер -каптоприл ■лизиноприл -контроль сутки буфер каптоприл лизиноприл контроль

Рисунок 48. Уровень естественных антител к брадикинину в слезной жидкости кролика при терапии ингибиторами ангиотензин-превращаюицего фермента.

В дальнейшие сроки наблюдения при сочетанном ожоге активность АПФ практически не отличалась от контрольных значений, а при ожоге роговицы на 7-14 сутки снижалась и вновь возрастала на 21 сутки, когда усиливались процессы изъязвления ткани роговицы.

Исследованы иммунохимические показатели - уровни Е-АТ к АПФ и его субстратам в модельных экспериментах ожоговой болезни. Показано, что уровень антител к АПФ остается одинаковым для каждого типа ожога и не отличается от нормы.

В случае определения Е-АТ к АН и БК в слезной жидкости глаза кролика установлена зависимость изменения Е-АТ от проводимой терапии только в случае сочетанного типа ожога роговицы и конъюктивы.

Так, на рисунках 47-48 представлены средние по группе значения OD492, выраженные в процентах от контроля для All и БК при проведении терапии ингибиторами АПФ.

Результаты ИФА определения Е-АТ к АПФ и АН и БК в слезной жидкости кроликов в экспериментах ожога роговицы представлены на рисунке 49. а с s

S ь с а> о га z

0,5 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,

-ангиотензинМ -брадикинин

- ангитензин-превращающий фермент ангиотензин II

V •- ф-- -•

N— --♦ -•

0,38 0,26 0,22 0,24 0,29 0,25 0,

0,44 0,36 0,37 0,37 0,38 0,38 0,

0,21 0,18 0,17 0,15 0,15 0,13 0, сутки

-брадикинин —Ь— ангитензин-превращающий фермент

Рисунок 49. Изменение уровня естественных антител к ангиотензин-превращающему ферменту, ангиотензину II и брадикинину в слезной жидкости кролика при ожоге роговицы.

В этом случае не обнаружено закономерности в изменении уровня антител как для фермента так и для его субстратов в динамике лечения.

Таким образом, установлено, что ожоговая болезнь глаз при сочетанном ожоге части роговицы, прилежащей конъюнктивы и фрагмента лимба протекает легче и с меньшими осложнениями, чем при равном по глубине и площади ожоге центральной части роговицы. Изменения соотношения активности протеолитических ферментов и их основных ингибиторов в этом случае являются адекватными, что обеспечивает быстрое и полное завершение процесса послеожоговой репарации.

ВЫВОДЫ

Получены иммунохимические реагенты для иммуноферментных методов анализа специфических антител к ангиотензин-превращающему ферменту и его пептидным субстратам. Синтезированы оригинальным способом конъюгированные антигены, содержащие 10-15% молей гаптена (ангиотензина II и брадикинина), с использованием поли(4-нитрофенил)акрилата в качестве высокомолекулярной матрицы. Методом аффинной хроматографии выделен высокоочищенный ангиотензин-превращающий фермент.

Разработаны условия проведения твердофазного иммуноферментного анализа для выявления антител к ангиотензин-превращающему ферменту в сыворотке крови доноров и больных. Установлена специфичность антител при взаимодействии с N- и С-доменами молекулы фермента и гомологичными белками.

Обнаружены в сыворотке крови здоровых людей естественные антитела к субстратам ангиотензин-превращающего фермента -ангиотензину II и брадикинину. Установлено изменение уровня специфических антител к данным биорегуляторам у больных с сердечно-сосудистыми патологиями и нарушением обмена веществ по сравнению с донорами. Показана возможность использования твердофазного иммуноферментного анализа антител к указанным биорегуляторам для наблюдения за эффективностью лечения в клинике.

С помощью аффинной хроматографии выделены антитела к ангиотензину II и брадикинину из сыворотки крови доноров и больных сердечно-сосудистыми патологиями. Установлено, что при возникновении заболевания происходит изменение аффинности и специфичности этих антител.

Установлена диагностическая значимость определения антител к ангиотензин-превращающему ферменту и его пептидным субстратам в клинике. Определена зависимость между содержанием в сыворотке крови больных естественных антител к исследуемым антигенам и активностью фермента. Полученные результаты показывают возможность использования методов определения уровня естественных антител к указанным выше соединениям в качестве важного критерия оценки состояния больных.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Кострикин, Дмитрий Сергеевич

ВЫВОДЫ112