Использование люминесцирующих бактерий при оценке фагоцитарной активности нейтрофилов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Каримов, Ильшат Файзелгаянович

  • Каримов, Ильшат Файзелгаянович
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2009, Оренбург
  • Специальность ВАК РФ03.00.07
  • Количество страниц 114
Каримов, Ильшат Файзелгаянович. Использование люминесцирующих бактерий при оценке фагоцитарной активности нейтрофилов: дис. кандидат биологических наук: 03.00.07 - Микробиология. Оренбург. 2009. 114 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Каримов, Ильшат Файзелгаянович

Введение.

Глава 1 - Обзор литературы. Бактериальная биолюминесценция и ее применение при исследовании природных сред и живых систем.

1.1 - Молекулярная организация люминесцентной системы у бактерий.

1.2 - Использование люминесцирующих бактерий в системе биотестирования природных сред.

1.3 - Использование люминесцирующих микроорганизмов при исследовании живых систем.

Глава 2 - Материалы и методы исследований.

2.1 - Общая характеристика объектов исследования.

2.1.1 - Люминесцирующие бактерии.

2.1.2 - Бесклеточная ферментная система генерации свечения.

2.1.3 - Биологические среды, содержащие потенциальные фаторы опсонизации.

2.1.4 - Нейтрофилы переферической крови человека.

2.2 - Методы люминесцентного исследования фагоцитарной системы.

2.2.1 - Метод биолюминесцентного анализа.

2.2.2 - Метод хемилюминесцентного тестирования.

2.2.3 - Анализ спектральных характеристик био- и хемилюминесценции.

2.3 - Дополнительные методы исследования.

2.3.1 — Бактериологический метод оценки количества жизнеспособных микроорганизмов в анализируемых пробах.

2.3.2 - Метод исследования спектра жирных кислот использованных микроорганизмов.

2.3.2 - Метод определения содержания гликозилированного гемоглобина в крови человека.

2.4 - Методы статистической обработки результатов.

Глава 3 - Определение оптимальных условий для использования люминесцирующих бактерий в качестве объектов фагоцитоза.

3.1 - Обоснование варианта опсонизации рекомбинантных люминесцирующих бактерий Escherichia coli.

3.2 - Определение оптимального люминесцирующего штамма для оценки фагоцитоза.

3.3 — Определение соответствия между биолюминесценцией бактериальных клеток-мишеней и развивающимся в их отношении в фагоцитарной системе киллинговым эффектом.

Глава 4 - Раздельное определение биолюминесценции и хемилюминесценции в фагоцитарной системе.

Глава 5 - Устройство для осуществления биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитоза.^q

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Микробиология», 03.00.07 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование люминесцирующих бактерий при оценке фагоцитарной активности нейтрофилов»

Общая характеристика работы

Актуальность темы

Биолюминесценция - ферментативный процесс, сопровождающийся потреблением кислорода и выделением света [1]. У микроорганизмов центральным звеном подобной реакции является люцифераза -флавинзависимая монооксигеназа, катализирующая окисление ФМН-Н2 и длинноцепочечного альдегида в присутствии кислорода до ФМН, Н20 и соответствующей жирной кислоты с испусканием кванта света в видимой сине-зеленой области спектра [2, 3].

Высокая степень сопряженности биолюминесценции с основными энергетическими потоками в бактериальной клетке [4] явилась условием для использования светящихся микроорганизмы при биотестировании различных природных сред, биотоксичность которых может быть интегрально оценена-через изменение интенсивности биолюминесценции [5].

Клонирование генов люминесценции в широком круге патогенных и условно-патогенных микроорганизмов создало условия для существенного расширения сферы биолюминесцентного анализа, в том числе в направлении исследования живых систем [6, 7]. При этом в подобных условиях интенсивность биолюминесценции рассматривается как отражение числа бактериальных клеток, сохранивших свою жизнеспособность после взаимодействия с бактерицидными системами организма человека или животных.

В частности, на данной основе основывается широкая группа методов «биолюминесцентного имеджинга» [8], позволяющего осуществлять фотонную детекцию патогенных микроорганизмов непосредственно в органах и тканях лабораторных животных при экспериментальной инфекции. Другой подход ориентирован на оценку бактерицидных свойств гуморальных и клеточных факторов противоинфекционной резистентности при проведении исследований in vitro [9, 10]. При этом среди подобных методов достаточно перспективным представляется биолюминесцентная оценка фагоцитоза, основанная на использовании в качестве фагоцитируемых объектов светящихся микроорганизмов [11, 12, 13].

Однако до настоящего времени не определены многие условия для осуществления биолюминесцентной оценки фагоцитоза, отсутствуют данные о возможности совместного использования интегрально характеризующих фагоцитарную систему феноменов биолюминесценции и хемилюминесценции, а также не разработаны технические устройства, специализированные именно для проведения биохемилюминесцентной оценки фагоцитоза.

Цель работы- - разработка методических подходов к оценке фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека с использованием рекомбинантных люминесцирующих бактерий.

Задачи исследования

1. Определение оптимальных условий для использования люминесцирующих бактерий в качестве объектов фагоцитоза.

2. Разработка биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитарной активности нейтрофилов крови человека.

3. Создание устройства для осуществления технологии оценки фагоцитоза с использованием люминесцирующих бактерий.

Научная новизна

Определены оптимальные условия для использования люминесцирующих бактерий в качестве объектов фагоцитоза. Разработай оригинальный вариант опсонизации рекомбинантных люминесцирующих бактерий нормальным иммуноглобулином человека в конечной концентрации 10 мг/мл в течение 10 мин при 37 °С, что исключает не связанные с фагоцитозом киллинговые эффекты и определяемое этим подавление интенсивности биолюминесценции, одновременно обеспечивая достаточный уровень последующей активации фагоцитов. Показана предпочтительность использования в качестве фагоцитируемых объектов рекомбинантных люминесцирующих бактерий Escherichia coli с клонированными luxCDABE генами Photobacterium leiognathi, демонстрирующих пропорциональность между остаточными значениями свечения и количеством сохранивших жизнеспособность бактериальных клеток-мишеней. Установлено опережающее- по отношению к развитию бактерицидного эффекта подавление биолюминесценции, в качестве одной из причин которого определено воздействие на ферментную систему генерации свечения продуктов пероксидации бактериальных жирных кислот.

Установлены различия в спектрах бактериальной биолюминесценции и-люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов, определяющие возможность их раздельной регистрации на неперекрывающихся длинноволновом (> 540 нм) и коротковолновом.(< 420'нм) участках спектра. На данной основе разработан биохемилюминесцентный метод оценки фагоцитоза, позволяющий проводить одновременную оценку активации кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов и выраженности обусловленного их действием киллингового эффекта в отношении бактериальных клеток-мишеней, приоритет которого подтвержден патентом на изобретение № 2366953 «Биохемилюминесцентный способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов».

Для реализации данного способа разработан и создан опытный образец двухканального биохемилюминометра, позволяющего проводить регистрацию- анализируемых параметров в режиме реального времени (Патент РФ на полезную модель № 49998). Новизна этого устройства определяется наличием в его конструкции двух независимых регистраторов (фотоэлектронных умножителей) и двух сменных юоветных отделений, использование которых позволяет проводить одновременное кинетическое измерение интенсивности свечения смесей «бактерии : фагоциты» в одной пробе в двух диапазонах длин волн, либо в двух параллельных пробах различного компонентного состава во всем спектральном диапазоне (Патент РФ на полезную модель № 64373).

Теоретическая и практическая значимость

Разработанный метод оценки фагоцитарной активности нейтрофилов с использованием в качестве фагоцитируемых объектов рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов существенно сокращает длительность и трудоемкость исследований, а также позволяет в режиме реального времени получать комплексную информацию как об уровне активации кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов, так и об интенсивности обусловленного этим бактерицидного эффекта. Апробация разработанной биохемилюминесцентной технологии при оценке фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови у лиц, больных сахарным диабетом 2-го типа позволила констатировать сочетанное изменение регистрируемых показателей (Акт внедрения МСЧ ГОУ ОГУ от 10.06.2009 г.)

Техническая документация на двухканальный биохемилюминометр и комплект сменных юоветных отделений к нему передана Специальному конструкторско-технологическому бюро «Наука» Красноярского научного центра Сибирского отделения Российской Академии наук, где реализована в серии устройств линии «БЛМ 8802 МК» (Акт внедрения от 29.11.2007 г.). При этом данное устройство, наряду с его прямым использованием при оценке фагоцитоза, может применяться и для совершенствования иных технологий люминесцентного анализа, оценивающих свободнорадикальные и ферментативные процессы в живых организмах (перекисное окисление липидов, биотестирование и др.).

Основные положения, выносимые на защиту

1. В качестве объекта для биолюминесцентной оценки фагоцитоза рекомендуется рекомбинантный люминесцирующий штамм Escherichia coli с клонированным /wx-опероном Photobacterium leiognathi, опсонизированный нормальным иммуноглобулином человека.

2. Раздельная оценка бактериальной биолюминесценции и люминолзависимой хемилюминесценции в фагоцитарной системе возможна на неперекрывающихся (> 540 нм и < 420 нм) участках спектров их световой эмиссии.

3. Реализация биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитоза возможна с использованием двухканального биохемилюминометра, снабженного располагаемыми между анализируемой пробой и фотоэлектронными умножителями светофильтрами.

Связь автора с научными программами и собственный вклад автора в исследования

Исследования выполнены в рамках ГБ НИР № 01200407020 «Использование природных и генно-инженерных люминесцирующих бактерий для тестирования абиотических сред и биологических жидкостей», а также при поддержке фанта РФФИ 06-04-96906-рофи «Разработка биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитоза в режиме реального времени и создание устройства для его осуществления».

Научные положения и выводы диссертации полностью базируются на результатах собственных исследований автора.

Апробация работы

Отдельные фрагменты работы доложены и обсуждены на V конференции иммунологов Урала (Оренбург, 2006), IV Международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (СПб, 2008), III Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь - Н. Новгород, 2008), Российской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009), V Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (СПб, 2009).

Разработка «Двухканальный биохемилюминометр и технологии его использования для оценки бактерицидных систем крови человека» награждена золотой медалью VIII Московского международного салона инноваций и инвестиций (Москва, 2008).

Основные результаты проведенных исследований представлены в 11 печатных работах, в том числе 4 статьях в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК РФ для публикации материалов диссертационных исследований. По материалам исследований получен патент РФ на изобретение и 2 патента РФ на полезные модели.

Структура и объем диссертации.

Похожие диссертационные работы по специальности «Микробиология», 03.00.07 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Каримов, Ильшат Файзелгаянович

Выводы

1. Обоснован вариант опсонизации рекомбинантных люминесцирующих штаммов E.coli нормальным иммуноглобулином человека, позволяющая исключить не связанный с фагоцитозом преждевременный бактерицидный эффект и обеспечивающая достаточный уровень активации фагоцитов.

2. Показана предпочтительность использования в качестве объекта для фагоцитоза рекомбинантных штаммов E.coli с клонированными lux-оперонами Photobacterium leiognathi, демонстрирующих прямую пропорциональность между величинами свечения и количеством клеток, сохранивших жизнеспособность после подобного воздействия.

3. Установлено опережающее по отношению к развитию бактерицидного эффекта снижение интенсивности биолюминесценции бактериальных клеток-мишеней при фагоцитозе, что может определяться влиянием на ферментную систему генерации свечения продуктов пероксидации их жирных кислот.

4. Продемонстрирована неидентичность спектров биолюминесценции бактерий и люминолзависимой хемилюминесценции фагоцитов и определены диапазоны длин волн (> 540 нм и < 420 нм), при которых возможен раздельный учет интенсивности каждого из названных видов свечения.

5. Разработаны два варианта биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека, проводимого в одной пробе путем оценки интенсивности свечения в двух различных дипазонах спектра или в двух отдельных пробах, в одну из которых бактериальные клетки-мишени вносят после дополнительной термообработки (для подавления биолюминесценции), а в другую не вносят люминол (для исключения хемилюминесценции).

6. Для реализации данного метода разработан двухканальный биохемилюминометр, конструкция которого включает два независимых регистратора (фотоэлектронных умножителя) и двух сменных кюветных отделений, использование которых позволяет проводить одновременное кинетическое измерение интенсивности свечения смесей «бактерии : фагоциты» в одной пробе в двух диапазонах длин волн, либо в двух параллельных пробах различного компонентного состава во всем спектральном диапазоне.

7. Апробация биохемилюминесцентного метода оценки фагоцитоза в группе больных сахарным диабетом 2 типа позволила констатировать сочетанные изменения активированной хемилюминесценции лейкоцитов и их киллинговой активности, а также зависимость данных показателей от степени компенсации заболевания.

Заключение

Диагностические и аналитические методы, основанные на использовании феномена люминесценции - свечения, возникающего в ходе биохимических реакций in vitro и in vivo, получают в настоящее время все большее распространение. В значительной степени это определяется тем, что уже к началу 80-х годов XX века технологии детекции излучения в оптическом диапазоне достигли чувствительности, позволяющей считать отдельные кванты. Другим важным преимуществом люминесцентных методов является их быстродействие с возможностью исследования протекающих процессов в режиме реального времени.

Яркой иллюстрацией данного положения является широкий круг методов исследования природных сред и живых систем с использованием люминесцирующих микроорганизмов. Так тесная сопряженность процесса биолюминесценции с основными энергетическими потоками в бактериальной клетке была положена в основу оценки интегральной токсичность (биотоксичность) различных сред и химических соединений через изменение интенсивности свечения соответствующих бактериальных биосенсоров. С другой строны, клонирование генов биолюминесценции в широком круге патогенных и условно-патогенных микроорганизмов позволило позволил расширить сферу биолюминесцентного анализа в направлении исследования живых систем. В подобном случае оценка интенсивности биолюминесценции позволяет судить о жизнеспособности микроорганизмов после взаимодействия с бактерицидными системами организма человека или животных в моделях in vitro и in vivo.

Сказанное в полной мере относится к возможности биолюминесцентной оценки бактерицидного потенциала фагоцитов. Однако использование для этих целей природного люминесцирующего штамма V.cholerae biotype albensis [11, 12] ограничивается требованием к его биологической безопасности, а сходный метод с использованием рекомбинантного люминесцирующего штамма Escherichia coli [13] имеет ряд спорных технологических моментов.

Сказанное определило актуальность проведенного исследования, целью которого явилось использование рекомбинантных люминесцирующих бактерий в системе оценки фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека. При этом для достижения названной цели были поставлены и последовательно решены задачи, связанные с определением оптимальных условий для использования люминесцирующих бактерий в качестве объекта фагоцитоза, раздельным определением в фагоцитарной системе феноменов биолюминесценции и хемилюминесценции, а также разработкой технического устройства, специализированные для проведения биохемилюминесцентной оценки фагоцитоза.

При проведении первого этапа исследования были определены оптимальные условия для опсонизации клеток E.coli, которые не оказывали бы выраженного влияния на их биолюминесценцию, не вызывали несвязанного с фагоцитозом бактерицидного эффекта, одновременно обеспечивая достаточный уровень последующей активации фагоцитов. При этом было установлено, что использование обычного метода опсонизации с использованием сыворотки крови и большинства ее производных не удовлетворяет поставленным требованиям, что определяется высокой чувствительностью к ним существующих рекомбинантных люминесцирующих штаммов E.coli. Возможным выходом из подобной ситуации могло бы стать использование в качестве объекта для фагоцитоза рекомбинантных люминесцирующих штаммов Staphylococcus aureus, имеющих иное, нежели E.coli, строение клеточной стенки и за счет этого достаточно резистентных к действию гуморальных бактерицидных факторов. Однако, решение задачи эффективной экспрессии люминесценции в подобных микроорганизмах требует проведения сложных генетических манипуляций, связанных с интродукцией перед каждым из /шг-генов характерных для грамположительных бактерий рибосом-связывающих сайтов (т.н. «последовательностей Шайна-Дальграно»), что определяет отсутствие таких коммерчески доступных генетических конструкций. На этом фоне единственным фактором, применимым для опсонизации рекомбинантных люминесцирующих штаммов E.coli оказывался нормальный иммуноглобулин человека. И хотя его использование обеспечивало взаимодействие микроорганизма только с Fc-, но не с СЗЬ-рецепторами на поверхности фагоцитов, уровень активации последних лишь несколько уступал таковой при фагоцитозе опсонизированных цельной сывороткой крови клеток S. aureus и даже превосходил его при использовании СЗЬ-зимозана.

При продолжении исследований в этом направлении было установлено, что не все рекомбинантные штаммы E.coli являются одинаково приемлемыми для оценки фагоцитарной активности нейтрофилов, что определялось различиями в происхождении клонированных в них генов люминесценции. Так если E.coli с /wx-оперонами природного морского люминесцирующего микроорганизма Photobacterium leiognathi демонстрировали пропорциональность между уровнем биолюминесценции и определенным бактериологическим методом числом выживших при контакте с фагоцитами бактериальных клеток, то конструкция с клонированным /ш:-опероном почвенного люминесцирующего микроорганизма Photorhabdus luminescence характеризовалась противоположным характером изменения данных параметров. В этой связи следует отметить, что расхождения в значениях светимости и жизнеспособности бактериальных клеток с генами люминесценции P.luminescence отмечались и ранее [43, 81], что может объясняться особенностями строения и функционирования кодируемых ими ферментных систем генерации свечения. Одновременно полученные данные свидетельствуют о недопустимости использования в качестве объекта фагоцитоза абстрактных рекомбинантных штаммов E.coli «lwc+» без указания источника (донора) клонированного генетического материала. При этом использованию подобных микроорганизмов в системе оценки фагоцитоза всегда должно предшествовать экспериментальное доказательство соответствия достигаемых величин тушения биолюминесценции с выраженностью формируемого бактерицидного эффекта. Применительно же к задаче настоящего исследования возможной оказывается рекомендация использования для заявленных целей рекомбинантных люминесцирующих штаммов E.coli с генами люминесценции P.leiognathi.

Сравнительное исследование динамики свечения и гибели подобных бактериальных клеток-мишеней в фагоцитарной системе при соответствии характера регистрируемых показателей и достигаемых значений биолюминесценции/бактерицидности одновременно заставило констатировать опережающий характер изменения первого из названных параметров. В качестве возможной причины подобного явления изучен спектр жирных кислот бактериальной клетки, пероксидация которых генерируемыми фагоцитами активными формами кислорода может вести к появлению модуляторов ферментной системы генерации свечения.

Полученные результаты позволили констатировать, что у природного морского люминесцирующего микроорганизма Photobacterium phosphoreum спектр жирных кислот и их производных в значительной степени представлен субстратами и предшественниками субстратов бактериальной люциферазы. В результате при окислительном стрессе бактериальная клетка оказывается способной извлекать для себя «двойную пользу», заключающуюся как в потреблении молекулярного кислорода в ходе биолюминесцентной реакции, так и в одновременно происходящем окислении альдегидных продуктов пероксидации липидов. С другой стороны, рекомбинантные люминесцирующие микроорганизмы с искусственно интродуцированной системой генерации свечения в этих условиях могут реагировать принципиально иным образом, что определяется меньшей адекватностью состава их жирных кислот для субстратного обеспечения люминесценции, а также образовании при пероксидации потенциальных ингибиторов бактериальной люциферазы. Сказанное заставляет более внимательно относиться к свойствам штаммов-реципиентов при определении возможностей и ограничений их использования в каждой из исследуемых модельных систем, в том числе предполагающих развитие окислительного стресса. В использованной же фагоцитарной системе подобная особенность реагирования создает возможность для более ранней (по сравнению с классическим бактериологическим методом) биолюминесцентной оценки итоговых величин киллинга бактериальных клеток-мишеней.

Полученные результаты сформировали необходимые и достаточные условия для использования рекомбинантных люминесцирующих микроорганизмов в системе оценки фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови человека. При этом в качестве второго желательного результата была определена совместная оценка в фагоцитарной системе двух видов свечения - люминолзависимой хемилюминесценции и бактериальной биолюминесценции, характеризующих как процесс генерации фагоцитами активных форм кислорода, так и выраженность обусловленного их действием бактерицидного эффекта.

Для решения подобной задачи было предложено два варианта проведения исследования. Первый из них предполагает одновременное или последовательное измерение свечения в двух пробах сходного компонентного состава, в одну из которых для проявления хемилюминесценции вносят люминол, а бактериальные клетки для подавления биолюминесценции предварительно инкубируют в течение 10 минут при 42 °С. Соответственно, компонентный состав второй пробы предусматривает отсутствие люминола, но использование люминесцирующих бактериальных клеток-мишеней. Другой вариант основан на выявленной в эксперименте неидентичности спектров люминолзависимой хемилюминесценции и бактериальной биолюминесценции, что создает возможность для их раздельного определения в одной анализируемой пробе в двух неперекрывающихся спектральных диапазонах: < 420 нм при оценке хемилюминесценции и > 540 нм при оценке биолюминесценции. Приоритет разработанного метода подтвержден патентом РФ № 2366953 на изобретение «Биохемилюминесцентный способ оценки фагоцитарной активности нейтрофилов». Дальнейшее же развитие подобного подхода предположительно может обеспечить возможность двухмерной визуализации происодящих в фагоцитарной системе процессов, что возможно с использованием современных методов люминесцентной микроскопии и соответствующего программного обеспечения.

В свою очередь разработанный биохемилюминесцентный метод оценки фагоцитоза также потребовал создания соответствующего лабораторного оборудования, конструкция которого должна обеспечивать возможность измерения свечения в двух пробах различного компонентного состава или в одной пробе в двух диапазонах длин волн. Новизна подобного устройства, защищенного патентами РФ на полезные модели № 49998 «Устройство для измерения хемилюминесценции и биолюминесценции» и № 64373 «Кюветное отделение для биохемилюминометра» определяется наличием в его конструкции двух независимых регистраторов (фотоэлектронных умножителей) и двух сменных кюветных отделений, первое из которых позволяет размещать перед каждым ФЭУ одну из двух сравниваемых проб, а второе предусматривает помещение между анализируемой пробой и ФЭУ полосовых или отсекающих светофильтров с неидентичными характеристиками пропускания.

Обобщающая предлагаемые технические решения разработка «Двухканальный биохемилюминометр и технологии его использования для оценки бактерицидных систем крови человека» награждена золотой медалью VIII Московского международного салона инноваций и инвестиций (2008).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Каримов, Ильшат Файзелгаянович, 2009 год

1. Hastings J.W. Bacterial bioluminescence / J.W. Hastings, K.H. Nealson //Ann. Rev. Microbiol. 1977.-Vol. 31.-P. 549-595.

2. Hastings J.W. Biochemistry and physiology of bioluminescent bacteria / J.W. Hastings, C.J. Potrikus, S.C. Gupta, M. Kurfurst, J.C. Makemson // Adv. Microb. Physiol. 1985.-Vol. 26.-P. 235-291.

3. Meighen E.A. Enzymes and genes from the lux operons of bioluminescent bacteria / E.A. Meighen // Annu. Rev. Microbiol. 1988. — №42. -P. 151-176.

4. Meighen E.A. Molecular biology of bacterial bioluminescence / E.A. Meighen//Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1991. - Vol.55. - №1 - P. 123-142.

5. Kaiser K.L.E. Correlations of Vibrio fischeri bacteria test data with bioassay data for other organisms / K.L.E. Kaiser // Environmental Health Perspectives. 1998.-Vol. 106,-Suppl. 2.-P. 583-591.

6. Contag C.H. Photonic detection of bacterial pathogens in living hosts / C.H. Contag, P.R. Contag, J.I. Mullins, S.D. Spilman, D.K. Stevenson, D.A. Benaron//Mol. Microbiol.- 1995.-Vol. 18. -№ 4. -P. 593-603.

7. Rice B.W. In vivo imaging of light-emitting probes / B.W. Rice, 1VI.D. Cable, M.B. Nelson // J. Biomed. Opt. 2001. - Vol. 6. - № 4. - P. 432-440.

8. Forde C.B. Bioluminescence as a reporter of intracellular survival of Bordetella bronchiseptica in murine phagocytes / C.B. Forde, R. Parton, J.G. Coote // Infect. Immun. 1998. - Vol. 66. -№ 7. - P. 3198-3207.

9. Kampmann B. Evaluation of human antimycobacterial immunity using recombinant reporter mycobacteria / B. Kampmann, P.O. Gaora, V.A. Snewin, M.-P. Gares, D.B. Young, M. Levin // J. Infect Dis. 2000. - Vol. 182. - P. 895-901.

10. Barak M. The use of luminous bacteria for determination of phagocytosis / M. Barak, S. Ulitzur, D. Merzbach // J. Immunol Methods. — 1983. Vol. 64. - № 3. - P. 353-363.

11. Barak M. Elucidation of the phagocytosis mechanism with the aid of luminous bacteria / M. Barak, S. Ulitzur, D. Merzbach // J. Med. Microbiol. -1984.-Vol. 18.-№ l.-p. 65-72.

12. Baldwin Т.О. Structure of bacterial luciferase / Т.О. Baldwin, J.A. Christopher, F.M. Raushel, J.F. Sinclair, M.M: Ziegler, A.J. Fisher, I. Rayment // Cuit. Opin. Struct. Biol. 1995. - Vol. 5. - № 6. - P. 798-809.

13. Hastings J.W. Bacterial bioluminescence light emission in the mixed function oxidation of reduced flavin and fatty aldehyde / J.W. Hastings // Crit. Rev. Biochem.- 1978.-Vol. 5.-P. 163-184.

14. Hastings J.W. The chemistry and biology of bacterial light emission / J.W. Hastings // Photochem. Photobiol. 1978. - Vol. 27. - № 4. - P. 397-404.

15. Nealson K.H. Bacterial bioluminescence: its control and ecological significance / K.H. Nealson, J.W. Hastings // Microbiol. Rev. 1979. - Vol. 43. -P. 496-518.

16. Suzuki K. 02 incorporation into a long-chain fatty-acid during bacterial luminescence / K. Suzuki, T. Kaidoh, M. Katagiri, T. Tsuchiya // Biochim. Biophys. Acta. 1983. - Vol. 722. - P. 297-301.

17. Kurfurst M. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction / M. Kurfurst, S. Ghisla, J.W. Hastings // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - Vol. 81. -№ 10. - P. 2990-2994.

18. Duane W. Flavin mononucleotide reductase of luminous bacteria / W. Duane, J.W. Hastings // Mol. Cell. Biochem. 1975. - Vol. 6. -№ 1. - P. 53-64.

19. Берия JI.В. Перекисное окисление липидов в процессе роста и развития биолюминесценции у бактерии Vibrio harveyi / Л.В. Берия, А.Д. Исмаилов, B.C. Данилов // Микробиология. 1991. - Т. 60. - № 1. - С. 77-83.

20. Исмаилов А.Д. Ферментативный и неферментативный процессы перекисного окисления липидов в бесклеточном экстракте Vibrio harveyi / А.Д. Исмаилов, Л.В. Берия, B.C. Данилов // Микробиология. — 1994. Т.63. -№3. - С.466-472.

21. Bulich A.A. Use of the luminescent bacterial system for the rapid assessment of aquatic toxicity / A.A. Bulich, D.L. Isenberg // ISA Trans. — 1981. — Vol. 20.-№ i.-p. 29-33.

22. Евгеньев М.И. Тест-методы и экология / М.И. Евгеньев // Соросовский образовательный журнал. 1999. - № 11. - С. 29-34.

23. Кудинова И.Ю. Использование светящихся бактерий в экологическом биотестировании / И.Ю. Кудинова — Красноярск: Краснояр. гос. ун-т, 2001.- 30 с.

24. Кратасюк В.А. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном анализе / В.А. Кратасюк, И.И. Гительзон // Успехи микробиологии. 1987. - Т. 21. - С. 3-30.

25. Кудряшева Н.С. Физико-химические основы биолюминесцентного анализа / Н.С. Кудряшева, В.А. Кратасюк, Е.Н. Есимбекова Красноярск: КГУ, 2002.- 154 с.

26. Родичева Э.К. Биолюминесцентные биотесты на основе светящихся бактерий для экологического мониторинга / Э.К. Родичева, A.M. Кузнецов, С.Е. Медведева // Вестник Оренбургского гос. ун-та. 2004. - № 5. -С. 96-100.

27. КНД 211.1.4.060-97. Методика визначення токсичност1 води на бактер1ях Photobacterium phosphoreum (Cohn) Ford. Затв. наказом Мшприроди Украши вщ, 1997.

28. Илларионов Б. А. Клонирование и экспрессия генов люминесцентной системы Photobacterium leiognathi в плазмидном векторе pUC18 / Б.А. Илларионов, М.В. Протопопова // Генетика. 1985. - № 6. - С. 10-13.

29. Кузнецов A.M. Использование генетически модифицированного светящегося штамма Escherichia coli в биотестировании / A.M. Кузнецов, С.Е. Медведева, Э.К. Родичева // Проблемы окружающей среды и природных ресурсов. 2000. - № 10. - С. 67-73.

30. Ulitzur S. A novel and sensitive test for rapid determination of water toxicity / S. Ulitzur, T. Lahav, N. Ulitzur // Environmental Toxicology. 2002. -Vol. 17. -№ 3. - P. 291-296.

31. Малыгина В.Ю. Светящиеся бактерии Черного и Азовского морей / В.Ю. Малыгина, A.M. Кацев // Экология моря. 2003. - Вып. 64. - С. 18-23.

32. Massoud T.F. Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light / T.F. Massoud, S.S. Gambhir // Genes & Development. 2003. - Vol. 17. - № 5. - P. 545-580.

33. Jawhara S. In vivo imaging of ioluminescent Escherichia coli in a utaneous wound infection model for evaluation of an antibiotic therapy / S. Jawhara, S. Mordon // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2004. - Vol. 48. - № 9. - P. 3436-3441.

34. Wiles S. In vivo bioluminescence imaging of the murine pathogen Citrobacter rodentium / S. Wiles, K.M. Pickard, K. Peng, T.T. MacDonald, G. Frankel // Infect. Immun. 2006. - Vol. 74. -№ 9. - P. 5391-5396.

35. Hardy J. Extracellular replication of Listeria monocytogenes in the murine gall bladder / J. Hardy, K.P. Francis, M. DeBoer, P. Chu, K. Gibbs, C.H. Contag//Science. 2004. - Vol. 303.-P. 851-853.

36. Hutchens M. Applications of bioluminescence imaging to the study of infectious diseases / M. Hutchens, G.D. Luker // Cell. Microbiol. 2007. - Vol. 9. -№ 10. - P. 2315-2322.

37. Lipshutz G.S. In utero delivery of adeno-associated viral vectors: intraperitoneal gene transfer produces long-term expression / G.S. Lipshutz, C.A. Gruber, Y. Cao, J. Hardy, C.H. Contag, K.M. Gaensler // Mol. Ther. 2001. - Vol. 3.-P. 284-292.

38. Contag C.H. Advances in; in vivo bioluminescence imaging of gene expression / C.H; Contag, M.H. Bachmann // Ann. Rev. Biomed. Eng. 2002. — Vol. 4.-P. 235-260.

39. Barak M. Determination of serum bactericidal activity with the aid of luminous bacteria / M. Barak, S. Ulitzur, D; Merzbach // J; Clin. Microbiol. -1983:-Vol. 18.-№ 2.-P. 248-253.

40. Дерябин Д.Г. Причины, определяющие; характер изменения бактериальной люминесценции при> воздействии сыворотки крови; / Д.Г. Дерябин, Е.Г. Поляков// Микробиология. 2005. - №5.- С.616-625

41. Virta М. Kinetic measurement of the membranolytic activity of serum complement using bioluminescent bacteria / M. Virta, M. Karp, S. Ronnemaa, E.-M. Lilius // J. Immunol. Methods. • 1997. Vol. 201 .-№ 2. - P. 215-221.

42. Дерябин Д.Г. Определение бактерицидной активности сыворотки; крови с использованием рекомбинантных штаммов Escherichia coli / Д.Г., Дерябин, Е.Г. Поляков // Клин, лаб; диаг. 2005: - №2.' - С.53-55

43. Schmidt Т.М. Bioluminescence of the insect pathogen Xenorhabchis luminescens / T.M. Schmidt; K. Kopecky, K.H. Nealson // Appl. Environ. Microbiol.- 1989.-Vol. 55.-№10;-P: 2607-26121

44. Snewin V. Assessment of immunity to mycobacterial infection with luciferase reporter constructs / V. Snewin, M.P. Gares, P. Gaora, Z. Hasan, I. Brown, D. Young // Infect Immun. 1999. - Vol. 67. - P. 4586-4593.

45. Мажуль М.М. FMN-редуктаза из Escherichia coli и ее влияние на активность люциферазы из морских бактерий Vibrio fischeri / М.М. Мажуль, Г.Б. Завильгельский, А.П. Зарубина, Т.П. Юдина, B.C. Данилов // Микробиология. 1999.-Т. 68.-№2. -С. 149-154.

46. Илларионов Б.А. Клонирование и экспрессия генов люминесцентной системы Photobacterium leiognathi в плазмидном векторе pUC18 / Б.А. Илларионов, М.В. Протопопова // Генетика. 1985. - № 6. - С. 10-13.

47. Каталог культур светящихся бактерий / Ред. Э.К. Родичева. Новосибирск: Наука, СО РАН, 1997. 125с

48. Медицинская микробиология. Учебное пособие / Под ред. A.M. Королюка и В.Б. Сбойчикова. СПб.: ЭЛБИ-СПб, 2002. - 267 с.

49. Рудик Д.В. Методы изучения процесса фагоцитоза и функционально-метаболитического состояния фагоцитирующих клеток / Д.В. Рудик, Е.И. Тихомирова Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. - 112 с.

50. Хейфец- Л.Б. Разделение форменных элементов крови человека в градиенте плотности фиколл-верографин / Л.Б. Хейфец, В.А. Абалакина // Лаб. дело. 1973.-№ 10.-С. 579-581.

51. Хаитов P.M. Современные подходы к оценке основных этапов фагоцитарного процесса / Р.М: Хаитов, Б.В. Пинегин // Иммунология. 1995. -№ 3. - С. 3-8.

52. Ярилин А.А. Основы иммунологии / А.А. Ярилин М.: Медицина, 2000.-608 с.

53. Долгушин И.И. Нейтрофилы и гомеостаз,/ И.И. Долгушин, О.В. Бухарин Екатеринбург: Уро РАН, 2001. - 284 с.

54. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко М.: Дрофа, 2006. - 285 с.

55. Гринкевич Ю.А. Хемилюминесцентный метод в иммунологии /

56. Ю.А. Гринкевич, В.А. Барабой, В.Э. Орел // Журн. микробиол. вирусол.иммунобиол. 1986. - № 1. - С. 91-97.

57. Гурвич А.А. Энергетические основы митогенетического излучения и его регистрация на фотоэлектронных умножителях / А.А. Гурвич, В.Ф. Еремеев; Ю.А Коробчиевский М.: Медицина, 1974. - 96 с.

58. Любимов Г.Ю. Хемилюминесценция перитонеальных макрофагов при действии макрофаг-активирующего фактора / Г.Ю. Любимов, Н.К.

59. Зенков, Н.Н. Вольский, В.А. Козлов // Иммунология. 1992. - № 1. - С. 4043.

60. Бакуев М.М. Особенности секреции миелопероксидазы и хемилюминесцентного ответа нейтрофилов человека при контакте со стимуляторами различной природы / М.М. Бакуев, М.З. Саидов // Иммунология, 1991.-Вып. 1.-С. 15-18.

61. Галактионов В.Г. Иммунология: Учеб. для студ. Вузов / В.Г. Галактионов М.: Издательский центр «Академия», 2004. - 528 с.

62. Blood cell biochemistry. Vol. 1. Erythroid Cell / Под ред. J.R. Harris. — NY: Springer, 1990. 537 c.

63. Ройт А. Иммунология / Пер. с англ. / А. Ройт, Дж. Бросгофф, Д. Мейл М.: Мир, 2000. - 592 с.

64. Хаитов P.M. Иммунология / P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович М.: Медицина, 2000. - 432 с.

65. Albrecht D. Luminol-enhanced chemiluminescence induced in peripheral blood-derived human phagocytes: obligatory requirement of myeloperoxidase exocytosis by monocytes / D. Albrecht, T.W. Jungi // J. Leucocyte Biol. 1993. - V.54. - N.4. - P.300-306.

66. Дерябин Д.Г. Влияние сыворотки крови человека на уровень свечения природных и рекомбинантных люминесцирующих бактерий / Д.Г. Дерябин, Е.Г. Поляков // Бюлл. экспер. биол. мед. 2004. - №9. - С.311-315.

67. Makemson J.С. Bovine serum albumin interacts with bacterial luciferase / J.C. Makemson, J.W. Hastings // J. Biolum. Chemilum. 1991. - V.6. - № 2. - P.131-136.

68. Исмаилов А.Д. Ферментативный и неферментативный! процессы перекисного окисления липидов в бесклеточном экстракте Vibrio harveyi / А.Д. Исмаилов, JI.B. Берия, B.C. Данилов // Микробиология. 1994. - Т.63. -№3. - С.466-472.

69. Forst S. Molecular biology of the symbiotic-pathogenic bacteria Xenorhabdus spp. and Photorhabdus spp. / S. Forst, K. Nealson // Microbiol, rev. -1996. V.60 -Nl. -P.21-43.

70. Владимиров Ю:А. Биологические мембраны и ^запрограммированная смерть клетки / Ю.А. Владимиров // Соросовский образовательный журнал. 2000. - № 9. - С. 2-9.

71. Ulitzur S. Myristic acid stimulation of bacterial bioluminescence in "aldehyde" mutants / S. Ulitzur, J.W. Hastings // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1978.-Vol. 75.-№ l.-P. 266-269.

72. Wilson A.F. Interaction of bacterial luciferase with aldehyde substrates and inhibitors / A.F. Wilson, M.A.S. Husam, O.B. Thomas, M.R. Frank // J. Biol. Chem. 1993. - Vol. 268. -№ 33. - P. 24734-24741.

73. Eutkauskaite A. Oleic acid: detection in environmental samples, models of toxic action / А. Ёткашкакё // Biologija. 2004. - № 1. - P. 13-16.

74. Szpilewska H. Experimental evidence for the physiological role of bacterial luciferase in the protection of cells against oxidative stress / H. Szpilewska, A. Czyz, G. Wegrzyn // Curr. Microbiol. 2003. - Vol. 47. - № 5. -P. 379-382.

75. Martin E. Flow cytometric assay for quantifying opsonophagocytosis and killing of Staphylococcus aureus by peripheral blood leukocytes / E. Martin, S. Bhakdi // J. Clin. Microbiol. -1992. V.30. - N9. - P.2246-2255.

76. Маянский A.H. Очерки о нейтрофиле и макрофаге / А.Н. Маянский, Д.Н'. Маянский Новосибирск: Наука, 1989. - 254 с.

77. Roda A. Analytical bioluminescence and chemiluminescence / A. Roda, M. Guardigli, E. Michelini // Analytical Chem. 2003. - Vol. 75. - № 25. -P. 462-470.

78. Thouand G. Comparison of the spectral emission of lux recombinant and bioluminescent marine bacteria / G. Thouand, P. Daniel, H. Horry // Luminescence. 2003. - V. 18. - N.3. - P. 145-155.

79. Kurfurst M. Characterization and postulated structure of the primary emitter in the bacterial luciferase reaction / M. Kurfurst, S. Ghisla, J.W. Hastings // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. -N.81 - P.2990-2994.

80. Берковский А.Г. Вакуумные фотоэлектронные приборы. Издание 2-е, переработанное и дополненное / А.Г. Берковский, В.А. Гаванин, И.Н. Зайдель М.:. Изд-во «Радио и связь», 1988. - 272с.

81. Багаев А.В. Устройство для измерения хемилюминесценции и биолюминесценции жидкости / А.В. Багаев, Н.М. Гаврилов, В.А. Зенин // Патент на изобретение SU 1400258, опубл. 10.01.2000.

82. Абашин B.M. Устройство для регистрации при комнатной температуре люминесценции биологических мембран / В.М. Абашин, Н.Г. Сергиенко, В.И. Жуков, JI.A. Белоконь, Н.С. Бондаренко, В.И. Мацкивский // Патент на изобретение RU 2031400, опубл. 20.03.1995.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.