Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры на функции нейтрофилов человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Загряжская, Анна Николаевна

• Загряжская, Анна Николаевна
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Загряжская, Анна Николаевна

Условные обозначения.

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

Часть 1. Функции нейтрофилов в организме.

Часть 2. Регуляция активности 5-липоксигеназы и синтеза лейкотриенов.

1.2.1. Метаболизм арахидоновой кислоты и физиологическая активность лейкотриенов.

1.2.2. Особенности строения и экспрессии фермента 5-липоксигеназы.

1.2.3. Регуляция активности 5-липоксигеназы в клетке.

Часть 3. Бактериальные липополисахариды (эндотоксины).

1.3.1. Строение и биологическая активность липополисахаридов.

1.3.2. Взаимодействие липополисахаридов с клеткой иммунной системы.

Часть 4. Биосинтез оксида азота (N0).

1.4.1. Общие сведения о синтазах оксида азота.

1.4.2. Некоторые факторы, регулирующие активность синтаз оксида азота.

1.4.3. Физиологические свойства оксида азота.

Глава 2. Экспериментальная часть.

2.1. Реактивы и материалы.

2.2. Подготовка рабочих препаратов.

2.3. Методы исследования.

Глава 3. Результаты и обсуждение.

Часть 1. Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры из Salmonella typhimurium на функции нейтрофилов человека.

3.1.1. Эффекты различных хемотипов LPS из Salmonella enterica серотипа typhimurium на опсонин-зависимый фагоцитоз и адгезию нейтрофилов к коллагену.

3.1.2. Роль 5-липоксигеназы в эффектах хемотипов LPS на фагоцитоз частиц OZ нейтрофилами.

3.1.3. Исследование 5-липоксигеназной активности в нейтрофилах, стимулированных OZ.

3.1.4. Эффекты хемотипов LPS на высвобождение арахидоновой кислоты и транслокацию 5-липоксигеназы к ядру в нейтрофилах.

3.1.5. Образование активных форм кислорода и азота в нейтрофилах под действием различных форм LPS.

3.1.6. Детекция N0 синтазы в нейтрофилах человека.

3.1.7. Роль NO синтазы в функциях нейтрофилов человека, праймированных различными хемотипами LPS.

3.1.8. Прямое действие N0 на активность 5-липоксигеназы в бесклеточной системе.

3.1.9. Роль гуанилатциклазы и протеин киназы G в эффектах хемотипов LPS на активность 5-L0 в нейтрофилах.

3.1.10. Роль цитоплазматической фосфолипазы А2 в действии различных хемотипов LPS на образование оксида азота в нейтрофилах.

3.1.11. Роль протеин киназы С в эффектах различных хемотипов LPS на образование оксида азота в нейтрофилах.

3.1.12. Предлагаемый механизм действия липополисахаридов различной структуры из Salmonella typhimurium на фагоцитоз опсонизированного зимозана нейтрофилами человека.

Часть 2. Регуляция биосинтеза лейкотриенов под действием LPS из Pseudomonas aeruginosa холестерином и другими липидами.

3.2.1. Влияние LPS из Pseudomonas aeruginosa 10 на фагоцитоз частиц OZ нейтрофилами человека.

3.2.2. Влияние LPS из Pseudomonas aeruginosa 10 на синтез 5-липоксигеназных метаболитов в нейтрофилах человека.

3.2.3. Эффекты LPS и липидов на активность 5-липоксигеназы в нейтрофилах человека.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры на функции нейтрофилов человека»

Бактериальные липополисахариды (lipopolysaccharide, LPS) или эндотоксины, входят в состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий, и выделение LPS в свободном состоянии в процессе роста, деления бактерий, при действии антибиотиков и белков плазмы крови in vivo является ключевым звеном в индукции септического шока. Эндотоксины взаимодействуют со специфическими рецепторами клеток высшего организма и являются одними из наиболее сильных индукторов иммунного ответа. Учитывая высокую токсичность LPS для высшего организма, подробное изучение механизмов их воздействия на функции клеток, участвующих в иммунном ответе, является актуальной задачей биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины.

Структура липополисахарида играет важную роль в процессах фагоцитоза и разрушения бактерий. В полноразмерной структуре LPS выделяют 3 части: гидрофобный липид А, центральный гетерополисахарид, и полисахарид О-антиген. Однако роль центрального полисахарида в действии LPS на клетки иммунной системы не достаточно изучена. Поэтому исследование влияния различных форм LPS на функции нейтрофилов для определения функциональной значимости центрального полисахарида, является актуальным.

Клетки крови нейтрофилы участвуют в неспецифическом иммунном ответе. Нейтрофилы первые мигрируют к очагу воспаления и осуществляют захват (фагоцитоз) микроорганизмов и чужеродных частиц. Фагоцитоз — комплексный процесс, который сопровождается образованием активных форм кислорода и азота, высвобождением цитокинов, протеолитических ферментов и синтезом липидных медиаторов воспаления, в частности, метаболитов 5-липоксигеназы (5-LO) лейкотриенов. Machado Е. R. и соавт. продемонстировали, что мыши (-/-) по 5-LO более чувствительны к бактериальной инфекции по сравнению с мышами дикого типа. В связи с этим актуальность исследований механизма действия хемотипов LPS на активность 5-LO и роли лейкотриенов в реализации эффектов LPS на процесс фагоцитоза вполне очевидна. Важными факторами, регулирующими клеточные эффекты LPS, являются липопротеиды и липиды плазмы крови. Несомненный интерес представляет изучение модуляции ответов нейтрофилов на LPS этими липидами.

Целью настоящей работы стало комплексное исследование влияния LPS с различной длиной полисахаридной цепи из патогенной грамотрицательной бактерии Salmonella typhimnrium на фагоцитоз и ряд функций нейтрофилов человека, связанных с процессом

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Загряжская, Анна Николаевна

выводы

1) Выявлен стимулирующий эффект различных форм эндотоксинов из Salmonella typhimurium на фагоцитоз частиц опсонизированного зимозана нейтрофилами человека с эффективностью действия хемотипов LPS: Re < S < Ra.

2) Показано, что действие хемотипов LPS на фагоцитоз OZ нейтрофилами в значительной степени обусловлено их воздействием на синтез продуктов 5-липоксигеназного окисления арахидоновой кислоты — лейкотриенов.

3) Показано, что эффективность стимулирующего действия различных форм LPS на фагоцитоз OZ коррелирует с их эффектами на адгезию, синтез LTs и образование супероксид-иона в нейтрофилах человека.

4) Установлено, что способность хемотипов LPS с различной эффективностью стимулировать фагоцитоз OZ, образование супероксид-иона и синтез LTs обусловлена различиями по эффективности активации синтеза оксида азота (Ra < S < Re).

5) Показано, что синтез N0 в нейтрофилах, стимулированный LPS и 0Z, осуществляется ферментативно под действием NO-синтазы. Продемонстрировано присутствие в клетках изоформ NOSI и NOSII.

6) Установлено, что эндогенный оксид азота ингибирует активность 5-липоксигеназы непосредственно, а также через активацию растворимой гуанилатциклазы и протеинкиназы G (sGC/cGK).

7) На основе анализа всей совокупности экспериментальных и литературных данных предложена модель, описывающая действие различных форм эндотоксинов с возрастающей длиной цепи на опсонин-зависимый фагоцитоз и связанные с этим процессом функции нейтрофилов человека. Предполагается, что центральный полисахарид инициирует сигнальный каскад, приводящий к подавлению стимулирующего эффект липида А на активность NOS, вызывая увеличение активности 5-L0.

8) Установлено, что фосфатидилхолин нейтрализует действие LPS на активность 5-L0 и что холестерин, присутствующий в мембране клетки, играет важную роль в реализации эффекта LPS на активность фермента.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Загряжская, Анна Николаевна, 2009 год

1. Kennedy A.D., Deleo F.R. Neutrophil apoptosis and the resolution of infection. // 1.munol Res. 2009. V.43. N.l-3. P.25-61.

2. Schymeinsky J., Mocsai A., Walzog B. Neutrophil activation via beta2 integrins (CD11/CD18): molecular mechanisms and clinical implications. // Thromb Haemost. 2007. V.98. N.2. P.262-73.

3. Swanson J.A., Hoppe A.D. The coordination of signaling during Fc receptor-mediated phagocytosis. // J Leukoc Biol. 2004. V.76. N.6. P. 1093-103.

4. Brown E.J. Complement receptors, adhesion, and phagocytosis. // Infect Agents Dis. 1992. V.l.N.2. P.63-70.

5. Ravetch J.V., Bolland S. IgG Fc receptors. //Annu Rev Immunol. 2001. V.19. P.275-90.

6. Kennedy A.D., Deleo F.R. PI3K and NADPH oxidase: a class act. // Blood. 2008. V.l 12. N.13. P.4788-9.

7. Segal A.W. How neutrophils kill microbes. // Annu Rev Immunol. 2005. V.23. P. 197223.

8. Fialkow L., Wang Y., Downey G.P. Reactive oxygen and nitrogen species as signaling molecules regulating neutrophil function. // Free Radic Biol Med. 2007. V.42. N.2. P.153-64.

9. Yamaoka K.A., Claesson H.E., Rosen A. Leukotriene B4 enhances activation, proliferation, and differentiation of human В lymphocytes. // J Immunol. 1989. V.143. N.6. P.1996-2000.

10. Salmon J.A. Role of arachidonic acid metabolites in inflammatory and thrombotic responses. // Biochem Soc Trans. 1987. V.l5. N.3. P.324-6.

11. Hill E., Maclouf J., Murphy R.C., Henson P.M. Reversible membrane association of neutrophil 5-lipoxygenase is accompanied by retention of activity and a change in substrate specificity. //J Biol Chem. 1992. V.267. N.31. P.22048-53.

12. Hansson G., Lindgren J.A., Dahlen S.E., Hedqvist P., Samuelsson B. Identification and biological activity of novel co-oxidized metabolites of leukotriene B4 from human leukocytes. //FEBS Lett. 1981. V.l30. P. 107-12.

13. Kalsotra A., Strobel H.W. Cytochrome P450 4F subfamily: at the crossroads of eicosanoid and drug metabolism. // Pharmacol Ther. 2006. V.l 12. P.589-611.15.