Исследование механизмов адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к росту при щелочных условиях pH внешней среды тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Гусева, Марина Александровна

• Гусева, Марина Александровна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гусева, Марина Александровна

1. Введение.

2. Обзор литературы.

2.1 Введение.

2.2 Транскрипционный фактор YlRimlOlp и его роль в механизме обеспечения алкалотолерантности дрожжей Y. lipolytica.

2.2.1 Получение мутантов.

2.2.2Фенотипические особенности мутантов.

2.2.3 Отбор плазмид, обеспечивающих комплементацию мутаций PAL.

2.2.4 Анализ последовательности гена Y. lipolytica, гомологичного RIMIOl/pacC.

2.2.5 YIRIM101 не совпадает с генами, несущими мутации PALI, PAL2, PAL3 и PAL

2.2.6 Экспрессия YIRIM101 зависит от рН и необходима для дерепрессии гена щелочной протеазы.

2.2.7 Эффект С-концевой делеции YlRimlOlp на транскрипцию.

2.2.8 Влияние мутаций PAL и YIRIM101 на рост, скрещивание и споруляцию.

Обсуждение.

2.3 Транскрипционный контроль гена щелочной протеазы XPR2 у Y. lipolytica.

2.4 Механизмы адаптации Y. lipolytica к щелочному стрессу на уровне система транспорта метаболитов на уровне плазматической мембраны.

2.5 Протеомный анализ белкового состава дрожжей Y .lipolytica выращенных при щелочных значениях рН.

2.6 Использование методов протеомики для изучения молекулярных основ адаптации S. cerevisiae к солевому стрессу.

2.6.1 Введение.

2.6.2 Идентификация белков, реагирующих на солевой стресс, при повышении концентрации соли в митохондриях.

2.6.3 Активация антиоксидантной защиты митохондрий при солевом стрессе.

2.6.4 Регуляция накопления белков биосинтеза аминокислот при солевом стрессе.

2.6.5 Вклад идентифицированных белков, индуцируемых при солевом стрессе, в механизм защиты клеток от окислительного и солевого стресса.

2.6.6 Регуляция экспрессии генов белков внешней митохондриальной мембраны при солевом стрессе.

2.6.7 Идентификация белков, содержание которых в митохондриях снижается в условиях солевого стресса.

2.6.8 Регуляция синтеза ферментов гликолиза при солевом стрессе.

Обсуждение.

3. Материалы и методы.

3.1 Методы поддержания культуры дрожжей Y. lipolytica.

3.2 Определение протеолитической активности штаммов Y. lipolytica.

3.2.1 Методика колориметрического определения содержания белка по модифицированному методу Лоури с бицинхониновой кислотой.

3.3 Генноинженерное конструирование.

3.3.1 Выделение плазмидной ДНК (вариант минипреп).

3.3.2 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля.

3.3.3 Осаждение ДНК.

3.3.4 Обработка ДНК рестриктазами.

3.3.5 Постановка ПЦР.

3.3.6 Электрофорез ДНК.

3.3.7 Секвенирование ДНК.

3.3.8 Поддержание штаммов Е. coli.

3.3.9 Трансформация Е. coli плазмидными конструкциями.

3.3.10 Создание конструкции pQE-URA3-HP4d-XPR.

3.3.11 Введение конструкции pQE-URA3-HP4d-XPR в Y. lipolytica.

3.4 Протеомные методы исследования.

3.4.1 Одномерный денатурирующий электрофорез в ПААГ.

3.4.2 Двумерный электрофорез по О'Фарреллу.

3.4.3 Идентификация белков масс-спектрометрией.

3.5 Метод ПЦР в реальном времени.

3.5.1 Оптимизация метода выделения транскриптов из клеток дрожжей.

3.5.2 Получение препаратов суммарной кДНК У. Иро1уНса для использования в ПЦР-РВ.

4. Результаты и их обсуждение.

4.1 Изучение экспрессии множественных генов щелочной протеазы у У.Иро1уНса.

4.2 Изучение механизмов адаптации У.Нро1уНса к росту при щелочных условиях методами протеомики.

Таблица 8. Первичные данные масс-спектроскопического исследования белков У. Иро1уйса Ро1£, уровень продукции которых изменяется при рН 8.5 по сравнению с рН 4.0.

4.3 Изучение уровня экспрессии генов рН-индуцибельных белков У. Иро1уйса с помощью ПЦР в реальном времени.

4.3.1 Разработка системы праймеров и зондов для определения транскриптов потенциальных рН-реактивных генов У. \ipolytica с помощью ПЦР в реальном времени.

4.3.2 Разработка методики выделения суммарной РНК, получения кДНК и проведения измерений методом ПЦР в реальном времени.

4.3.3 Исследования регуляции транскрипции потенциальных рН-реактивных генов

У. Иро1уйса с помощью ПЦР в реальном времени.

5. Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизмов адаптации дрожжей Yarrowia lipolytica к росту при щелочных условиях pH внешней среды»

В настоящее время экстремофильные дрожжи Yarrowia lipolytica рассматриваются в качестве одного из наиболее перспективных биотехнологических объектов. Они выступают и в качестве удобной клеточной модели для исследования механизмов апоптоза и клеточной дифференцировки. Это обусловлено сочетанием в этом организме нескольких уникальных особенностей. Во-первых,, это способность быстро расти на органических субстратах самого различного биогенного и абиогенного происхождения, включая сточные воды, нефтяные парафины и ксенобиотики. Эта особенность, обусловленная наличием пероксисом, позволяет использовать Y. lipolytica для создания биологических систем очистки воды, биоремедиации почвы, утилизации ксенобиотиков и для получения кормовой биомассы из малоценного органического сырья. Во вторых, Y. lipolytica устойчива ко многим агрессивным органическим соединениям, что позволяет использовать ее для их получения с хорошими выходами. Наиболее ярким примером такого применения являются созданные на основе Y. lipolytica сверхпродуценты янтарной и лимонной кислот. В третьих, Y. lipolytica является традиционной моделью для исследования клеточной дифференцировки на примере так называемого диморфического перехода, т.е. переключения от дрожжеподобного к истинно мицелиальному росту в зависимости от условий среды. Эта особенность находит практическое применение, позволяя использовать Y. lipolytica в качестве генетически исследованного и легко культивируемого аналога дрожжевого патогена человека и животных Candida albicans. Именно на модели Y. lipolytica были разработаны и испытаны эффективные противогрибковые средства, применяемые для лечения кандидозов. В четвертых, Y. lipolytica обладает способностью к высокоэффективной секреции белков во внешнюю среду (до 10 г/л), что значительно превышает возможности пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae и приближается к секреторному потенциалу метилотрофных дрожжей родов Pichia и Hansenula.

В совокупности перечисленные особенности привели к решению о необходимости расшифровки полной геномной последовательности Y. lipolytica. Эта работа была выполнена независимо двумя исследовательскими группами во Франции и США. Наличие доступной для анализа последовательности позволило использовать мощный и быстрый в использовании инструмент протеомики в качестве универсального средства для первичной идентификации белков, задействованных в реализации перечисленных важных особенностей Y. lipolytica. В частности, в 2007 г этим методом были идентифицированы некоторые белки Y. lipolytica. принимающие участие в диморфическом переходе. Однако, до настоящего времени эти исследования носят фрагментарный характер. Так в указанной работе 2007 г для облегчения выполнения эксперимента анализировались только водорастворимые клеточные белки, хотя важность компонентов мембран и клеточной стенки в процессе морфогенеза не вызывает сомнений.

Наряду с перечисленными, важной особенностью Y. lipolytica, являющейся непосредственным предметом настоящей работы, является уникальная для дрожжей способность не только без потерь выдерживать кратковременный щелочной стресс, но и эффективно расти на средах со щелочными значениями рН — вплоть до 10.5. Механизмы переключения генов Y. lipolytica в ответ на изменение рН внешней среды начали активно изучать с 1997 года, когда появились данные о структуре и функции транскрипционного факторов семейства YRimlOl. Имеются убедительные данные о том, что этот белок является элементом рН-зависимого транскрипционного контроля. Ранее гомолог YRimlOl - Rimlp был обнаружен у пекарских дрожжей Saccharomyces cerevisiae в качестве фактора, задействованного на начальных стадиях мейоза, обеспечивающего SOS-ответ, и на короткое время продлевающего жизнеспособность культуры в условиях стресса. Другой гомолог YRimlOlp - белок РасС встречается у нескольких видов мицелиальных аскомицетов, в частности, у Aspergillus nidulans. Здесь он обусловливает рН-зависимую индукцию синтеза генов щелочной и кислой протеаз, не оказывая влияния на рН-зависимую адаптацию роста гриба в целом. Нарушение гена расС у A. nidulans приводит к замедлению роста, нарушению образованияj конидий и изменению морфологии мицелия, однако, все эти эффекты проявляются вне зависимости от рН внешней среды. Таким образом, хотя однотипные по составу компонентов RimlOlp-зависимые механизмы реагирования на изменение рН внешней среды найдены у двух групп аскомицетов: S. cerevisiae и С. albicans с одной стороны, A. nudulans, Pénicillium canescens и Neirospora crassa с другой, их физиологическое предназначение в обоих случаях существенно отличается. Можно предполагать, что Y. lipolytica занимающая промежуточное между дрожжами и мицелиальными аскомицетами таксономическое положение, имеет уникальный механизм использования YRimlOlp, отличающийся от известных прототипов. Можно предполагать, что исследование этого механизма методами генетики, молекулярной биологии и биофизики, способно пролить свет на принципы организации сенсорной компоненты системы рН-адаптации у Y. lipolytica.

В качестве примера YRimlOlp-зависимого переключения экспрессии генов у Y. lipolytica в ответ на изменение рН внешней среды традиционно рассматривается ген XPR2. Продукт этого гена - АЕР представляет собой субтилизиноподобную сериновую протеазу, предназначенную для неспецифического протеолиза внеклеточных источников белка. АЕР является наиболее массовым секретируемым белком большинства штаммов У. Иро1уНса, её ген послужил источником эндогенных элементов секреторного сортинга рекомбинатных белков: препропептид Хрг2 успешно применялся для секреции амилазы и других гетерологичных продуктов. Несмотря на значительные усилия и перечисленные выше большие достижения в области изучения работы гена ХРЫ2 У. Иро1уИса, существует целый пласт нерешенных проблем, связанных с явлением множественности генов щелочной протеазы в геноме У. Иро1уйса. Определение последовательности генома У \ipolytica СЫВ122 позволило установить наличие в нём 13 генов субтилизиноподобных протеаз. Измерение уровня активности этих генов при различных условиях, в том числе, при изменении рН внешней среды, может дать ценную информацию о сигнальных механизмах адаптации У. Иро1уНса.

Чуть позже появилась гипотеза о том, что адаптация У. Иро1уНса к щелочным значениям рН; невозможная для других видов дрожжей, обусловлена наличием двух независимых систем транспорта метаболитов через плазматическую мембрану. При этом при низких значениях рН работает преимущественно протон-зависимая система, характерная» для большинства аскомицетов. При повышении рН среды до величин, превышающих рН цитоплазмы, рН которой '«7.3, работа этого механизма1 становится невозможной из-за деполяризации мембраны. Однако, в случае У. Иро1уИса происходит его смена на №+-зависимый симпорт. Эта гипотеза вполне согласуется с известными экспериментальными, фактами, однако, функционирование этого механизма показано лишь применительно к частному случаю транспортеров фосфат-иона. Кроме того, не имеется доказательств того, что перестройка механизмов симпорта фосфата опосредована на уровне регуляции транскрипции (синтеза белка), а не связана с изменением характера работы предсуществующих белков плазматической мембраны. Отсутствуют прямые данные об изменении содержания транскриптов наиболее массовых белков« в клетках У. Нро1уИса при изменении рН внешней среды.

Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение изменений протеома У. Иро1уНса, обусловливающих способность этого дрожжеподобного аскомицета к росту при щелочных значениях рН внешней среды.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи:

1. С использованием методов обратной генетики'изучить влияние рН в сочетании с другими физиологическими факторами на регуляцию экспрессии наиболее существенной части секретома У. \ipolytica — комплекса щелочных протеаз ХРЯ. 1

2. С использованием методов протеомики идентифицировать наиболее массовые белки V. \ipolytica, накапливающихся в культуре при росте на средах со щелочным значением рН.

3. С использованием метода ПЦР в реальном времени исследовать физиологические факторы, влияющие на экспрессию кандидатных генов рН-адаптации.

2. Обзор литературы

2.1 Введение

Предметом рассмотрения настоящего обзора литературы является уникальная для дрожжей способность не только без потерь выдерживать кратковременный щелочной стресс, но и эффективно расти на средах со щелочными значениями рН — вплоть до 10.5. Механизмы рН-адаптации Y. lipolytica начали активно изучать с 1997 года, когда была продемонстрирована роль глобального регулятора транскрипции RimlOl в индукции адаптационных физиологических реакций. Этот транскрипционный фактор, впервые найденный у пекарских дрожжей (Rimlp) Saccharomyces cerevisiae, необходимый им на начальных стадиях мейоза, обеспечивает SOS-ответ, на короткое время продлевающий жизнеспособность в условиях стресса. Инактивация гена RIM101 у S. cerevisiae приводит к изменению морфологии колоний, нарушению споруляции и повышенной чувствительности к замораживанию. Гомолог RimlOlp — белок РасС из нескольких видов мицелиальных аскомицетов, в частности, из Aspergillus nidulans обусловливает рН-зависимое переключение экспрессии генов щелочной и кислой протеаз, не оказывая влияния на рН-зависимую адаптацию роста гриба в целом. Нарушение гена расС у А. nidulans приводит к замедлению роста, нарушению образования конидий и изменению морфологии колоний вне зависимости от рН. Таким образом, хотя состав факторов,-' задействованных в RimlOlp-зависимых сигнальных путях, может быть сходен для всех имеющих его видов аскомицетов: S. cerevisiae, С. albicans, A. nudulans, Pénicillium canescens, Neirospora crassa, лишь y Y. lipolytica его работа' позволяет организму-хозяину эффективно расти на средах с высоким значением рН. Поэтому можно предполагать, что эффекторные механизмы рН-адаптации Y. lipolytica и таксономически близких к ней видов коренным образом отличаются и нуждаются в идентификации в прямых экспериментах.

В г качестве маркера адаптации секреторной системы Y. lipolytica к изменению рН внешней среды традиционно рассматривается ген XPR2 и его продукт АЕР -субтилизиноподобная сериновая протеаза, обеспечивающая неспецифический протеолиз внеклеточных источников белка. АЕР является наиболее массовым секретируемым белком большинства штаммов Y. lipolytica, её ген послужил источником эндогенных элементов секреторного сортинга рекомбинатных белков: препропептид Хрг2 успешно применялся для секреции амилазы и других гетерологичных продуктов. Несмотря на значительные усилия и перечисленные выше большие достижения в области изучения работы гена XPR2 Y. lipolytica, существует целый пласт нерешенных проблем, связанных с явлением множественности генов щелочной протеазы в геноме Y. lipolytica.

Определение последовательности генома У Иро1уНса СЫВ122 позволило установить наличие в ней 13 генов субтилизиноподобных протеаз. Измерение уровня активности этих генов при различных условиях, в том числе, при изменении рН внешней среды, может дать ценную информацию о сигнальных механизмах адаптации У Нро1уНса.

В 2004 году Звягильской и соавторами была высказана гипотеза о том, что адаптация У. Иро1уИса к щелочным значениям рН, невозможная для других видов дрожжей, обусловлена наличием двух независимых систем транспорта метаболитов через плазматическую мембрану. При этом при низких значениях рН работает преимущественно протон-зависимая система, характерная для большинства аскомицетов. При повышении рН среды до величин, превышающих рН цитоплазмы, работа этого механизма становится невозможной из-за деполяризации мембраны. Однако, в случае У. Иро1уНса происходит его смена на На+-зависимый симпорт. Эта гипотеза вполне согласуется с известными экспериментальными фактами, однако, функционирование этого механизма показано лишь применительно к частному случаю транспортеров фосфат-иона. Кроме того, не имеется доказательств того, что перестройка механизмов симпорта фосфата опосредована на уровне регуляции транскрипции (синтеза белка), а не связана с изменением характера работы предсуществующих белков плазматической мембраны. Отсутствуют прямые данные об изменении содержания транскриптов наиболее массовых белков в клетках У Иро1уНса при изменении рН внешней среды.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Гусева, Марина Александровна

5. Выводы

1. Методом обратной геномики показана однотипность механизмов регуляции экспрессии основного и минорных генов щелочной протеазы на изменение рН внешней среды.

2. На примере регуляции экспрессии генов семейства ХРИ. показано, что повышение уровня рН среды снижает чувствительность клеток У. Нро1уйса к содержанию фосфата.

3. Методами протеомики идентифицировано 9 белков, уровень накопления которых повышается при культивировании при рН 8.5 по сравнению с рН 4.0.

4. Методом ПЦР в реальном времени идентифицировано 7 генов, уровень транскрипции которых повышается при культивировании Г. \ipolytica на среде с рН 8.5 вне зависимости от состава питательных компонентов. Все исследованные гены, обладающие этим свойством, кодируют белки митохондриальной локализации