Исследование новых архитектурных белков и их роли в регуляции транскрипции Hox-генов дрозофилы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Соколов Владимир Владимирович

• Соколов Владимир Владимирович
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Соколов Владимир Владимирович

Введение

Актуальность темы и степень её разработанности

Цели и задачи

Научная новизна работы. Теоретическая и практическая значимость исследования

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности результатов

Личный вклад автора

Структура и объем работы

1 Обзор литературы

1.1 Модели дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами

1.2 Современные модели энхансер-промоторных взаимодействий и их регуляция

1.3 Взаимодействие инсуляторов образует независимый регуляторный домен в гене eve

1.4 Механизм регуляции генов fushi tarazu и Sex comb reduced в ANT-C

1.5 Регуляция гомеозисного гена Abd-B в комплексе Bithorax

2 Материалы и методы

2.1 Получение линий с делецией CG1603attP и Fu2attP при помощи CRISPR/Cas9

2.2 Получение трансгенных линий мух и восстановление функции гена CG1603

2.3 Получение линий с заменой границ Bithorax

2.4 Получение линии с восстановлением гена piragua

2.5 Анализ сдвига электрофоретической подвижности (EMSA)

2.6 Измерение уровня экспрессии генов

2.7 Тест в дрожжевой двугибридной системе (Y2H)

2.8 Приготовление кутикулярных препаратов

2.9 Антитела

2.10 Иммуноокрашивание политенных хромосом

2.11 Иммуноокрашивание эмбрионов

2.12 Приготовление тотальных препаратов белка

2.13 Вестерн-блот

2.14 Ведение культур клеток, трансфекция

2.15 Коиммунопреципитация

2.16 Выделение фракций клеток

2.17 Иммунопреципитация хроматина

2.18 Обработка данных ChIP-seq

2.19 RNA-seq

3 Результаты

3.1 Mzfp1 входит в состав небольшой группы C2H2-белков, которые имеют два MADF-домена и N-концевой C2H2-домен

3.2 Mzfp1 непосредственно взаимодействует с CP190

3.3 Mzfp1 преимущественно связывается с промоторами генов «домашнего хозяйства»

3.4 Мутации в гене mzfp1 демонстрируют значимую роль белка в регуляции экспрессии генов D. melanogaster

3.5 Участок, взаимодействующий с CP190, и MADF-домены необходимы для функционирования белка Mzfp1 in vivo

3.6 Функциональная роль доменов Mzfp1

3.7 Активность проксимальной части границы Fub обеспечивается совместной работой Mzfp1, Pita и Su(Hw)

3.8 Делеция гена piragua не имеет мутантного фенотипа

Обсуждение

Mzfp1 и Fu2 - новые архитектурные белки

Организация границ Bithorax-комплекса требует кооперативной работы архитектурных

C2H2-белков

Выводы

Список литературы

Список использованных сокращений и терминов

5'UTR (5' untranslated region) - 5' нетранслируемая область. 3'UTR (3' untranslated region) - 3' нетранслируемая область а.о.- аминокислотные остатки

ChIP-seq - иммунопреципитация с последующим секвенированием нового поколения

RNA-seq - секвенирование транскриптома

MBP - Maltose Binding Protein, Мальтоза-связывающий белок

EMSA - Electrophoretic mobility shift assay, анализ сдвига электрофоретической подвижности ДНК-белкового комплекса

SDS - Sodium dodecyl sulfate, додецилсульфат натрия ЭДТА - Этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭГТА - Этиленгликоль-бис (2-аминоэтиловый эфир)-Ы^,^№тетрауксусная кислота CTCF - (CCCTC-binding factor) - инсуляторный высококонсервативный белок dCTCF - гомолог CTCF вида Drosophila melanogaster

С2Н2-домены - домены «цинковые пальцы», состоящие из Р-шпильки, за которой следует а-спираль, совместно образующие левостороннюю РРа-структуру CTD - carboxy-terminal domain, C-концевой домен РНК-полимеразы II

iab (infraabdominal) - парасегмент-специфичный цис-регуляторный домен регуляторных областей генов abd-A и Abd-B

in vitro - эксперименты «в пробирке», то есть, вне организма in vivo - эксперименты в живом организме

LIM - структурные домены белка, состоящие из двух смежных доменов с цинковыми пальцами, разделенных гидрофобным линкером из двух аминокислот

LBC (late boundary complex) - мультибелковый комплекс, обнаруженный в эмбриональном экстракте

PRC1 и PRC2 (Polycomb repressive complex 1 и 2) - репрессионные комплексы белков группы Polycomb

PRE (Polycomb Response Elements) - участки ДНК, на которых собираются репрессионные комплексы, образованные белками группы Polycomb А (abdominal) - брюшной сегмент D. melanogaster АА — акриламид

Бис-АА — ^№-метиленбисакриламид

Консенсусная последовательность (мотив) - обобщённая нуклеотидная (или аминокислотная) последовательность, регулярно встречающаяся с небольшими вариациями по отдельным нуклеотидам (или аминокислотам) в определённых генетических элементах, или в любых других выбранных для сравнения участках генома. п.н. — пар нуклеотидов

ПС - парасегмент (эмбриональный сегмент) D. melanogaster ПААГ - полиакриламидный гель Т (thoracic) - грудной сегмент D. melanogaster

ТФ (транскрипционный фактор) - белок, непосредственно связывающийся с ДНК и влияющий на транскрипцию

ТАД — топологически ассоциированный домен т.п.н. — тысяч пар нуклеотидов

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование новых архитектурных белков и их роли в регуляции транскрипции Hox-генов дрозофилы»

Актуальность темы и степень её разработанности

Белки с кластерами С2Н2-доменов (далее С2Н2-белки) представляют самый большой класс транскрипционных факторов у высших эукариот (Fedotova et al., 2017). У млекопитающих наиболее хорошо изученным белком этого класса является CTCF, играющий большую роль в формировании архитектуры хромосом (Maksimenko et al., 2021). У D. melanogaster имеется гомологичный ему белок dCTCF, а также найден ряд белков, как и dCTCF участвующих в функционировании регуляторных элементов и, предположительно, поддержании дистанционных взаимодействий между ними (Kyrchanova and Georgiev, 2021; Maksimenko et al., 2021). Такие белки называются архитектурными (так как они формируют и поддерживают архитектуру хроматина). Они обычно имеют кластеры из 4-5 доменов "цинковые пальцы" С2Н2-типа, специфично связывающие мотивы ДНК длиной 12-15 п.н. (Maksimenko et al., 2021).

У С2Н2-белков встречается очень широкий спектр дополнительных функциональных доменов, которые могут димеризоваться, участвовать во взаимодействиях с РНК и белками (Lambert et al., 2018; Schmitges et al., 2016). Сайты связывания С2Н2-белков встречаются в различных частях генома, в основном в регуляторных элементах: промоторах, энхансерах, инсуляторах, сайленсерах, а также и в интронах генов (Schmitges et al., 2016). Кроме того, С2Н2-белки участвуют в поддержании гетерохроматиновых доменов (Grewal, 2023; Maines et al., 2007; Marsano et al., 2019; Rezvykh et al., 2021). Гетерохроматин — это плотноупакованный хроматин, насыщенный репрессивными эпигенетическими метками. Но, несмотря на это, в гетерохроматине есть активно экспрессирующиеся гены (Marsano et al., 2019; Rezvykh et al., 2021). Однако, механизмы, поддерживающие активную транскрипцию этих генов, в том числе, ответственные за это транскрипционные факторы, пока недостаточно изучены. С2Н2-белки обогащены в районе репрессированных транспозонов (Schmitges et al., 2016) и участвуют в создании и поддержании границ репрессионного хроматина (Weiler, 2007).

Многие известные С2Н2-белки (M1BP, Su(Hw), dCTCF, ibf1/ibf2, Pita, ZIPIC, Ouib, Nom) рекрутируют белок CP190 (Centrosomal Protein 190) в область промоторов, инсуляторов, хроматиновых границ (Bag et al., 2021; Bushey et al., 2009; Cuartero et al., 2014; Maksimenko et al., 2015; Mohan et al., 2007; Pekina et al., 2023). CP190 стабилизирует связывание C2H2-белков с ДНК и участвует в функционировании промоторов и инсуляторов, а также в формировании дистанционных взаимодействий (Bartkuhn et al., 2009; Liang et al., 2014; Melnikova et al., 2018; Mohan et al., 2007; Vogelmann et al., 2014).

Все двусторонне - симметричные животные имеют кластеры гомеозисных генов, которые играют ключевую роль в формировании морфологических особенностей и специализации эмбриональных сегментов (Duboule, 2007). У Drosophila melanogaster комплекс Bithorax (BX-C) состоит из трех гомеозисных генов (Ubx, abd-A, Abd-B), регулируемых девятью доменами, определяющими уровень экспрессии генов в девяти задних сегментах (Maeda and Karch, 2015; Mihaly et al., 1998). Регуляторные домены в составе BX-C содержат энхансеры и сайленсеры, активность которых отличается в разных доменах в пределах одного сегмента. Домены изолированы друг от друга границами, обладающими свойствами инсуляторов. Однако, взаимодействие энхансеров регуляторных доменов с нужным промотором происходит несмотря на наличие границ, потенциально блокирующих такое взаимодействие между ними. Например, такие взаимодействия наблюдаются в случае гена Abd-B и его регуляторных доменов. Границы регуляторной области Abd-B имеют в своем составе архитектурный элемент, поддерживающий коммуникацию энхансеров проксимального домена с промотором Abd-B (Kyrchanova et al., 2016; Kyrchanova et al., 2019a; Kyrchanova et al., 2019b; Postika et al., 2018). В организации границ комплекса Bithorax участвуют известные архитектурные С2Н2-белки — dCTCF, Pita (Holohan et al., 2007; Kyrchanova et al., 2017). Нарушения в функционировании регуляторных элементов комплекса зачастую имеют яркие фенотипические эффекты, проявляющиеся в изменении морфологии отдельных сегментов, что делает этот комплекс удобной модельной системой для изучения энхансер-промоторных взаимодействий и тестирования белковых факторов, участвующих в их регуляции. Эти качества обусловили выбор Bithorax-комплекса в качестве модельной системы при изучении архитектурных функций белков в данной работе.

Данная работа посвящена исследованию новых архитектурных С2Н2-белков Drosophila melanogaster — Fu2 и Mzfp1. Предсказанная доменная структура Fu2 включает в себя кластер С2Н2-доменов и димеризационный ZAD-домен, таким образом, соответствуя структуре известных архитектурных белков, таких, как Pita, ZIPIC, Z4 (Bonchuk and Georgiev, 2024; Maksimenko et al., 2015). Белок Mzfp1 также имеет кластер С2Н2-доменов, и, по литературным данным, взаимодействует с кофактором архитектурных белков CP190 (Guruharsha et al., 2011). Из этих данных следует, что белки потенциально являются архитектурными белками, играющими роль в развитии D. melanogaster.

Цели и задачи

Целью данной работы являлось изучение функций двух новых архитектурных C2H2-белков - Fu2 и Mzfpl Drosophila melanogaster.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1 Исследовать роль белка Mzfpl в развитии Drosophila melanogaster

2 Картировать участки взаимодействия Mzfpl с CP190, являющимся кофактором большинства известных архитектурных белков Drosophila melanogaster

3 Исследовать функциональную роль доменов белка Mzfpl in vitro и in vivo

4 Изучить роль белка Mzfpl в функционировании границы Fub комплекса Bithorax

5 Исследовать роль белка Fu2 в развитии Drosophila melanogaster

Научная новизна работы. Теоретическая и практическая значимость исследования

В данной работе проведено исследование двух С2Н2-белков, Mzfpl и Fu2, и их роли в развитии Drosophila. С помощью высокоточного геномного редактирования впервые показано, что белок Fu2 не необходим для развития Drosophila melanogaster. Показано, что белок Mzfpl влияет на жизнеспособность мух: гомозиготы по полученной нами ноль-мутации CG1603attP гибнут на 2 личиночной стадии. Картированы 808 сайтов связывания белка Mzfpl в геноме D. melanogaster. В первую очередь Mzfpl связывается с промоторами генов домашнего хозяйства. На эухроматиновых промоторах Mzfpl часто связывается совместно с архитектурными C2H2-белками MlBP, Pita, ZIPIC, dCTCF.. Установлены участки белка Mzfpl, взаимодействующие с CPl90, являющимся кофактором архитектурных С2Н2-белков. Показано, что один из этих участков, а также кластер C2H2 доменов и одного из MADF-доменов (320-4l3 а.о., далее MADF2) влияют на распределение белка на хромосоме. Продемонстрировано, что домен MADF2 имеет решающее значение для ассоциации Mzfpl с гетерохроматином. Показано, что делеция любого из указанных доменов или MADF-домена, расположенного 20l-292 а.о. (далее MADFl), приводит к потере белком своей функции. Установлено, что Mzfpl в кооперации с белками Pita, и Su(Hw) участвует в формировании инсулятора проксимальной части границы Fub, F2411, изолирующего домены bxd/pbx и iab-2, которые регулируют гены Ubx и abd-A BX-C.

Полученная в ходе работы линия CG1603attP может быть использована в дальнейшем как платформа для исследования мутантных производных белка Mzfpl, экспрессирующегося под

нативным промотором, а также как ноль-мутант для исследования роли белка в функционировании регуляторных элементов. Кроме того, результаты по изучению архитектурных белков, в том числе Mzfpl и Fu2, полученные на D. melanogaster, вносят существенный вклад в развитие фундаментальной биологии и могут использоваться для разработки моделей функционирования регуляторных элементов у млекопитающих, в том числе и человека. Понимание принципов функционирования регуляторных элементов позволит в дальнейшем найти подходы к лечению заболеваний, обусловленных нарушением тканеспецифичной регуляции экспрессии генов.

Методология и методы исследования

Drosophila melanogaster - модельный объект, на котором выполнено данное исследование. Для получения трансгенных линий D. melanogaster применялись современные методы: направленное редактирование генома с использованием CRISPR/Cas9 и сайт-специфическая рекомбинация, опосредованная фС31- и Сге-рекомбиназами. Для детекции белка in vitro и in vivo применялись методы иммуноокрашивания. Белок-белковые взаимодействия изучали в дрожжевой двугибридной системе и методом коиммунопреципитации белков. ДНК-белковые взаимодействия изучали in vitro методом исследования изменения подвижности ДНК - белкового комплекса в геле (EMSA). Для экспериментов с белками in vitro белки экспрессировали в E.coli. Также применялись прочие стандартные лабораторные методы молекулярной биологии и генетики: выделение плазмидной и геномной ДНК, молекулярное клонирование, ПЦР

Положения, выносимые на защиту

1 Белок Mzfpl критически важен в процессе развития D. melanogaster. Гомозиготы по ноль-аллели по гену Mzfpl погибают на второй личиночной стадии.

2 Mzfpl преимущественно связывается с промоторами генов домашнего хозяйства.

3 Белок Mzfpl взаимодействует с CP190 посредством двух участков (161-194 а.о. и 294-319 а.о.). Со стороны CP190 во взаимодействии также задействовано два участка (210-245 а.о. и 309-390 а.о.). Участок взаимодействия с CP190 необходим для функциональности белка и способствует связыванию Mzfp1 с промоторами.

4 MADF-домены Mzfp1 необходимы для функционирования белка. Домен MADF2 необходим для привлечения Mzfp1 к гетерохроматину. Кластер из шести С2Н2-доменов необходим для специфического связывания с хроматином in vivo.

5 Mzfp1 совместно с архитектурными белками Su(Hw) и Pita определяет инсуляторную активность границы Fub комплекса Bithorax.

6 Делеция гена piragua ^кодирует белок Fu2) не влияет на жизнеспособность и фенотип D. melanogaster.

Степень достоверности результатов

Результаты работы были опубликованы в 3 статьях в рецензируемых научных журналах, входящих в Белый список, а также представлены на российских и международных конференциях. Статьи

1 Соколов, В., Георгиев., П., Кырчанова, О., 2021. Ген piragua не является важным для развития дрозофилы. Доклады Российской академии наук. Науки о жизни. T. 501, № 1, стр. 528-531

2 Kyrchanova, O., Sokolov, V. and Georgiev, P., 2023. Mechanisms of Interaction between Enhancers and Promoters in Three Drosophila Model Systems. Int J MolSci 24, 2855.

3 Sokolov, V., Kyrchanova, O., Klimenko, N., Fedotova, A., Ibragimov, A., Maksimenko O., Georgiev, P., 2024. New Drosophila Promoter-Associated Architectural Protein Mzfp1 Interacts with CP190 and Is Required for Housekeeping Gene Expression and Insulator Activity. Nucleic Acids Research 52(12):6886-6905.

Тезисы конференций

1. Соколов В.В., Золотарев Н. А., Максименко О. Г. CRISPR-опосредованный мутагенез архитектурных белков Fu2 и CG1603, участвующих в регуляции Hox-генов Drosophila melanogaster. Материалы международного конгресса CRISPR-2018. 10-14.09.2018, Новосибирск C. 87.

2. Соколов В. В., Клименко Н. С., Максименко О. Г., Георгиев П. Г., Кырчанова О. В. Исследование функций архитектурного белка CG1603. XXXII Зимняя молодёжная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». 10-13.02.2020, Москва С.74.

3. Соколов В. В., Кырчанова О. В., Клименко Н. С., Максименко О. Г., Георгиев П. Г. Новый архитектурный белок Mzfp1 участвует в организации гетерохроматиновых промоторов и инсуляторов дрозофилы. Международный Конгресс «VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 300-летию российской науки и высшей школы». 14.06-19.06.2024, Саратов Т.1.С.395.

Личный вклад автора

Большая часть представленных результатов была получена автором самостоятельно, либо при непосредственном участии автора. Самостоятельно были получены линии с делецией генов piragua (fu2, CG9233) и mzfpl (CG1603), линии с экспрессией производных Mzfpl и Fu2, проведены эксперименты по торможению ДНК-белковых комплексов в геле (EMSA). При получении линий с заменами границ Bithorax клонирование конструкций выполнено самостоятельно, отбор трансформантов и фенотипический анализ совместно с О. В. Кырчановой. Эксперименты в дрожжевой двугибридной системе выполнены самостоятельно, кроме первичных экспериментов по тестированию взаимодействия CP190, Z4, и Chromator. Плазмиды с производными для дрожжевой двугибридной системы, несущие производные Mzfpl клонированы самостоятельно, плазмиды с производными CP190 предоставлены М. С. Сабировым, А. А. Умновой. Иммуноокрашивание эмбрионов линий с заменой границы Fub выполнено А. Н. Ибрагимовым. Иммуноокрашивание политенных хромосом выполнено А. А. Федотовой. ChIP-seq и RNA-seq выполнены О. Г. Максименко, биоинформатическая обработка данных выполнена О. Г. Максименко совместно с Н. С. Клименко. Конструкции для анализа связывания Mzfpl с мотивами in vivo в S2 клетках клонированы самостоятельно, собственно анализ проведен О. Г. Максименко. Филогенетический анализ Mzfpl и белков его группы выполнен О. Г. Максименко. Препараты кутикул производились Н. Е. Постика. Другие соавторы указаны в соответствующих опубликованных работах. Автор участвовал в обсуждении и интерпретации результатов и подготовке данных для публикации.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из четырех глав («Обзор литературы», «Материалы и Методы», «Результаты» и «Обсуждение»), введения и заключения. Работа изложена на 94 страницах и содержит 29 рисунков. Все рисунки являются оригинальными или опубликованы в

статьях автора по теме диссертации. Список использованной литературы составляет 250 источников.

1 Обзор литературы

Экспрессия генов развития у высших эукариот чётко детерминирована и имеет сложную регуляцию. Часто экспрессия одного гена находится под контролем нескольких промоторов и нескольких энхансеров, расположенных в тысячах пар нуклеотидов друг от друга (Andersson and Sandelin, 2020; Furlong and Levine, 2018).

Промоторы - это генетические элементы, в которых может инициироваться продуктивная транскрипция. Промотор обычно включает ряд мотивов, важных для узнавания его РНК-полимеразой. Синтез белок-кодирующих и ряда некодирующих РНК осуществляется РНК-полимеразой II, за транскрипцию рРНК отвечает РНК-полимераза I, а РНК-полимераза III транскрибирует некодирующие тРНК и 5s-PHK. Однако, РНК-полимеразы не способны инициировать транскрипцию самостоятельно. Для инициации транскрипции также требуются несколько факторов транскрипции - отличающиеся для разных полимераз. Консервативные белки, необходимые для инициации транскрипции РНК-полимеразой II, называются базальными (общими) факторами транскрипции. Базальные факторы транскрипции образуют вместе с РНК-полимеразой II преинициаторный комплекс (PIC) (Danino et al., 2015). Базальные факторы транскрипции связываются с консервативными мотивами, совокупность которых образует коровый промотор. Однако коровый промотор недостаточен для тканеспецифичной и стадиеспецифичной экспрессии, которая обеспечивается взаимодействием с транскрипционными факторами и кофакторами (Spitz and Furlong, 2012; Thomas and Chiang, 2006). Транскрипционные факторы и кофакторы могут как привлекаться к сайтам непосредственно в промоторе, так и к сайтам в цис-регуляторных элементах (энхансеры, сайленсеры). Цис-регуляторные элементы могут находится на большом от регулируемых ими промоторов. При этом специфичность во взаимодействии цис-регуляторных элементов с промоторами есть, но сильно ограничена (Field and Adelman, 2020). Поэтому правильное тканеспецифичное и стадиеспецифичное взаимодействие между промотором и энхансерами и сайленсерами регулируется специальными элементами, формирующими архитектуру дальних взаимодействий в геноме - архитектурные элементы, инсуляторы (Spitz and Furlong, 2012). Организация этих элементов является функцией транскрипционных факторов, в том числе С2Н2-белков. Поэтому С2Н2-белки преимущественно связываются в промоторах и энхансерах (Schmitges et al., 2016; Spitz and Furlong, 2012).

1.1 Модели дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами

В настоящее время можно выделить две модели, которые объясняют дистанционные взаимодействия в геноме. Основная модель опирается на результаты Hi-C и ChIP-seq исследований у млекопитающих, согласно которым когезиновый комплекс совместно с CTCF находятся на границах большей части ТАДов (Dixon et al., 2012; Rao et al., 2014; Sexton et al., 2012; Ulianov et al., 2016). Инактивация когезинового комплекса или CTCF приводит к частичному разрушению организации хромосом в ТАДы (Nora et al., 2017; Rao et al., 2017; Schwarzer et al., 2017). Когезиновый комплекс является высококонсервативным у эукариот, и основной функцией когезинового комплекса является удержание вместе сестринских хроматид в процессе деления клетки (Davidson and Peters, 2021; Dorsett, 2019). Комплекс когезина состоит из четырех субъединиц, которые формируют кольцо вокруг двух молекул ДНК. CTCF имеет 11 доменов «цинковые пальцы» С2Н2-типа (Arzate-Mejia et al., 2018; Maksimenko et al., 2021; Ohlsson et al., 2001). Пять С2Н2-доменов CTCF специфично связываются с консервативным мотивом в 15 п.н., что определяет большую часть функциональных свойств этого архитектурного белка (Hashimoto et al., 2017). На N-конце CTCF человека был обнаружен консервативный мотив YxF, который взаимодействует с когезиновым комплексом (Li et al., 2020). Согласно модели «экструзии петли», когезиновый комплекс после фиксации на хроматине начинает АТФ-зависимую экструзию ДНК с формированием хроматиновой петли (Davidson and Peters, 2021; Oldenkamp and Rowland, 2022). Сайты связывания CTCF блокируют продвижение когезинового комплекса, что приводит к фиксации границ хроматинового домена (Fudenberg et al., 2017) (Рисунок 1А).

Альтернативная группа моделей основана на исследованиях фактора LIM domain-binding factor 1 (LDB1) млекопитающих (Krivega and Dean, 2016), белков, которые преимущественно регулируют активность промоторов домашнего хозяйства D. melanogaster (Ramirez et al., 2018; Wang et al., 2018) и архитектурных C2H2-белков D. melanogaster (Kyrchanova and Georgiev, 2021; Maksimenko et al., 2020). У млекопитающих C-концевой домен LDB1 взаимодействует с ДНК-связывающими транскрипционными факторами семейства LIM (Krivega and Dean, 2016). N-концевой домен LBD1 формируют стабильный гомодимер (Wang et al., 2020), что позволяет поддерживать дистанционные взаимодействия между энхансерами и промоторами генов (Deng et al., 2012; Krivega et al., 2014). Белки D. melanogaster, такие, как белки CP190, Chromator, Z4 и BEAF преимущественно связываются с инсуляторами и промоторами генов домашнего хозяйства, которые находятся на границах большей части ТАДов D. melanogaster (Cubenas-Potts

et al., 2017; Dong et al., 2020; Pal et al., 2019; Ramirez et al., 2018; Wang et al., 2018). CP190, Chromator, BEAF и Z4 взаимодействуют между собой и содержат гомодимеризующиеся домены (Bonchuk et al., 2011; Gan et al., 2011; Melnikova et al., 2021; Vogelmann et al., 2014), что предполагает их вероятное участие в поддержании дистанционных взаимодействий (Рисунок 1А). Как и LBD1 млекопитающих, белки CP190, Chromator и Z4 рекрутируются на регуляторные элементы через взаимодействие с ДНК-связывающими транскрипционными факторами. Например, CP190 взаимодействует с большой группой архитектурных С2Н2-белков, которые по структуре аналогичны белку CTCF млекопитающих (Sabirov et al., 2021a).

У D. melanogaster было охарактеризовано несколько архитектурных С2Н2-белков, которые преимущественно связываются с промоторами генов и инсуляторами (Kyrchanova and Georgiev, 2021; Maksimenko et al., 2020; Maksimenko et al., 2021). Эта группа архитектурных белков имеет кластеры С2Н2-доменов, часть из которых специфично связывается с мотивами длиной от 12 до 18 п. н. Большая часть архитектурных С2Н2-белков D. melanogaster имеет на N-конце структурированные домены, формирующие гомодимеры (Bonchuk et al., 2021; Bonchuk et al., 2022; Zolotarev et al., 2016). Интересно, что CTCF у D. melanogaster и млекопитающих имеет на N-конце неструктурированный домен, который гомодимеризуется (Bonchuk et al., 2020). У D. melanogaster этот домен нужен для функциональной активности CTCF (Bonchuk et al., 2015), роль аналогичного домена у CTCF млекопитающих пока остается неисследованной. В модельных трансгенных линиях D. melanogaster сайты связывания для любого из архитектурных C2H2-белков могут поддерживать дистанционные взаимодействия между регуляторными элементами (Kyrchanova et al., 2008b; Kyrchanova et al., 2013; Maksimenko et al., 2020; Zolotarev et al., 2016). Сайты связывания для трех архитектурных C2H2-белков Pita, CTCF и Su(Hw) определяют активность большей части известных инсуляторов D. melanogaster (Chen and Lei, 2019; Matthews and White, 2019; Melnikova et al., 2020).

Самостоятельно ни одна из этих двух моделей не может объяснить все экспериментальные результаты. Например, с помощью Micro-C было показано, что инактивация CTCF или когезина не влияет на формирование локальных хроматиновых петель и дистанционные взаимодействия между энхансерами и промоторами эмбриональных стволовых клетках мыши (Hsieh et al., 2022). С другой стороны, альтернативные модели не позволяют объяснить, каким образом происходит первоначальное сближение удаленных участков хроматина, лежащих в основании хроматиновой петли, необходимое для образования контакта между белковыми комплексами в этих участках.

Б

Рисунок 1. Комбинация двух моделей дистанционного взаимодействия. А. Локальное взаимодействие между регуляторными элементами. Разные комбинации архитектурных белков связываются с инсуляторами или архитектурными элементами. Сходный набор ассоциированных белков (таких, как СР190, 24, и ЗДготаЬог) связывается с различными комбинациями архитектурных белков. Специфичность дистанционных взаимодействий между архитектурными элементами/инсуляторами определяется набором С2Н2-белков, ассоциированных с разными элементами, способных взаимодействовать друг с другом. Б. Взаимодействуя, две копии инсулятора изолируют регуляторные элементы или способствуют их взаимодействию. Влияние на взаимодействие регуляторных элементов зависит от их расположения относительно инсуляторов и взаимной ориентации инсуляторов. На схеме слева инсуляторы расположены в противонаправленной ориентации. При этом энхансер, расположенный между ними (обозначен оранжевым прямоугольником), оказывается внутри петли, изолированной от элементов, расположенных снаружи. Элементы, расположенные вне пары инсуляторов, оказываются сближены в пространстве и взаимодействуют (энхансер, обозначенный серым прямоугольником, и промотор, обозначенных красным прямоугольником). На схеме справа инсуляторы расположены в сонаправленной ориентации. При этом энхансер, расположенный между ними (оранжевый), оказывается сближен в пространстве с промотором (красный), а энхансер, расположенный снаружи от них, оказывается изолированным от промотора (КугЛапоуа et а1., 2023).

Объединение этих двух моделей позволит объяснить большую часть существующих в настоящее время экспериментальных данных как у млекопитающих, так и D. melanogaster (Рисунок 1). У D. melanogaster по мере накопления данных ChIP-seq анализа становится все более очевидным, что многие инсуляторы и промоторы генов состоят из комбинаций мотивов, которые узнаются различными архитектурными С2Н2-белками ^аЫгоу е! а1., 2021а). Существующие данные согласуются с моделью, согласно которой С2Н2-белки связываются кооперативно и формируют открытый хроматин на регуляторных элементах. Последние

исследования на млекопитающих демонстрируют, что на многих геномных сайтах CTCF связывается в кооперации с другими С2Н2-белками, например - ZNF143, MAZ, и WIZ (Justice et al., 2020; Ortabozkoyun et al., 2022; Xiao et al., 2021; Zhou et al., 2021), которые вовлечены в формирование локальных дистанционных взаимодействий. Для белков MAZ и WIZ было показано взаимодействие с когезиновым комплексом (Justice et al., 2020; Xiao et al., 2021). Таким образом, когезиновый комплекс, вероятно, может взаимодействовать с большим количеством С2Н2-белков. Наиболее вероятно, что продвижение когезиновых комплексов наиболее эффективно блокируется на участках хроматина, связанных с группами С2Н2-белков. В результате когезин сближает в пространстве регуляторные элементы, взаимодействие между которыми в дальнейшем поддерживается димеризующимися доменами архитектурных C2H2-белков и ассоциированных с ними белков-партнеров, таких как CP 190, Z4 и Chromator.

Специфичность и стабильность взаимодействия между двумя регуляторными элементами определяется количеством доменов, вовлеченных во взаимодействие (Рисунок 1А). Исследования в трансгенных линиях D. melanogaster показали, что при взаимодействии двух идентичных копий любой пары инсуляторов в противоположной ориентации конфигурация образующейся петли благоприятна для взаимодействия промотора и энхансера, расположенных снаружи пары инсуляторов (Рисунок 1Б ). Когда взаимодействующие инсуляторы находятся в сонаправленной ориентации, энхансер, расположенный снаружи пары инсуляторов, взаимодействует исключительно с промотором, расположенным внутри пары. Такое ориентационно-зависимое взаимодействие согласуется с моделью, в которой регуляторные элементы состоят из сайтов связывания нескольких архитектурных С2Н2-белков, каждый из которых может поддерживать дистанционные взаимодействия при помощи гомодимеризационных доменов (Kyrchanova and Georgiev, 2014; Kyrchanova et al., 2008b).

Прямым выводом из такой модели является то, что инактивация любого архитектурного белка не должна значительно влиять на организацию архитектуры хромосом, но может нарушать отдельные локальные взаимодействия между энхансерами и промоторами.

1.2 Современные модели энхансер-промоторных взаимодействий и их регуляция

Энхансеры обычно имеют размеры в пределах 500 п. н. и состоят из комбинаций мотивов, которые узнаются ДНК-связывающими транскрипционными факторами (ТФ), определяющими его активность (Рисунок 2А) (Reiter et al., 2017; Spitz and Furlong, 2012). Энхансеры могут быть собраны в большие модульные супер-энхансеры, размеры которых

варьируют в пределах от 5 до 50 т. п. н. (Blobel et al., 2021). До настоящего времени не известно ни одного нативного энхансера, для которого были бы установлены все транскрипционные факторы. Основным способом активации транскрипции считается участие энхансеров в привлечении медиаторного комплекса на промоторы (Luyties and Taatjes, 2022; Richter et al., 2022). Медиаторный комплекс является консервативным у эукариот, у млекопитающих он состоит из 26 субъединиц, сгруппированных в трех модулях, получивших название «голова», «середина» и «хвост». С коровой частью медиаторного комплекса взаимодействует киназный модуль, который может функционировать как в составе комплекса, так и отдельно (Luyties and Taatjes, 2022). Модули «голова» и «середина» обеспечивают взаимодействие с РНК-полимеразой II, модуль «хвост» определяет связывание медиаторного комплекса с транскрипционными факторами на энхансерах и базальным фактором транскрипции TFIID на промоторах (Рисунок 2Б) (Richter et al., 2022). При связывании с медиаторным комплексом киназный модуль блокирует его взаимодействие с РНК-полимеразой II. Модуль «хвост» является наиболее гибким и может принимать различные конформации (Chen et al., 2021; Robinson et al., 2016). Медиаторный комплекс связывается с нефосфорилированным C-концевым доменом (carboxy-terminal domain, CTD) РНК-полимеразы II, что приводит к изменению конформации модуля «хвост», и, как следствие, специфичности связывания медиаторного комплекса с белками-партнерами - ТФ на энхансере и TFIID комплексом. Затем РНК-полимераза II освобождается из медиаторного комплекса после фосфорилирования CTD на промоторе, что снова приводит к изменению конформации модуля «хвост». Вероятно, что различные конформации модуля «хвост» определяют специфичность связывания медиаторного комплекса с транскрипционными факторами на энхансерах и TFIID на промоторах.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Соколов Владимир Владимирович, 2025 год

Использованные

праймеры:

ORF_dir CTGAAGGATTGGGAGCTGTT, HA_dir CTGCTCATGGCGGATATTAG, 3'UTR_dir CCACAGATCGGAATGAACTC, rpl32_dir GTTCGATCCGTAACCGATGT,

2.7 Тест в дрожжевой двугибридной системе (Y2H)

среде без триптофана, лейцина и гистидина. Через три дня фиксировали наличие или отсутствие роста.

Для клонирования делеционных производных mzfpl использовались следующие праймеры: 1603dir atagaattcgtaagcatggagctgtgcggcaat, 1603rev aagtcgacgttcattccgatctgtggctg, pradf ctattcgatgatgaagataccccaccaaaccc, 1603_160r ataagatctgaagtcactacaatcaac,

1603_169r aaagatctaggtgccaagtcatcc,

1603_183d acaagatctggacaggttttcaagttcaa,1603_196d ataagatctaatccccgtgtgctgc,1603_319r ataagatctgg tggttatcaggttttc, 1603_320d gcaagatctctcattcatagagacctatgc, 1603_293d gtaacgccaagggagaacg. 1603 200RSal ttgtcgaccagcacacggggattgctc, 1603_164r aaagatctaggtgccaagtcatcc

2.8 Приготовление кутикулярных препаратов

Взрослых мух (2-5 дней) собирали в микроцентрифужные пробирки объёмом 1,5 мл и добавляли 200 - 500 мкл 70% этанола. Выдерживали не менее 20 часов. Заменяли этанол на 10% KOH и инкубировали при 70°С 1-1,5 часа. Отбирали KOH, дважды промывали дистиллированной водой, и инкубировали в дистиллированной воде при 70°С ~45 минут. Кутикулы промывали 70% этанолом и хранили в 70% этаноле. С помощью тонкого пинцета и иглы инсулинового шприца отделяли брюшную часть кутикулы, помещали её на предметное стекло в каплю глицерина. Иглой делали продольный разрез по спинной стороне вдоль всего брюшка и надрезы между тергитами. Расправляли кутикулу на предметном стекле, капнув каплю минерального масла, и прижимали покровным стеклом. Фотографировали препараты. Фотографии, представленные в работе, были сняты при помощи стереомикроскопа Nikon SMZ18 на камеру Nikon DS-Ri2.

2.9 Антитела

Антитела к белку Mzfp1 получали в крысах и кроликах, использовали эпитоп 44-200 а. о., афинно очищали на Aminolink resin (Thermo Fisher Scientific, USA) в соответствии со стандартным протоколом. Прочие антитела, использованные в данной работе: афинно очищенные крысиные антитела к CP190 (Maksimenko et al., 2015); афинно очищенные кроличьи антитела к Pita (Maksimenko et al., 2015); афинно очищенные кроличьи антитела к Su(Hw) (Golovnin et al., 2007); мышиные моноклональные антитела к эпитопу HA, клон HA-7 (#H3663, Sigma, USA); мышиные моноклональные антитела к ламину anti-lamin Dm0, clone ADL84.12

(#ADL84.12, DSHB, USA); мышиные моноклональные антитела к abd-A anti-abd-A, clone Cil (sc-390990, Santa Cruz Biotechnology, USA).

2.10 Иммуноокрашивание политенных хромосом

D. melanogaster культивировали при 18°C, отбирали для окрашивания третью стадию личинок. Окрашивание политенных хромосом выполняли, как описано ранее (Tikhonova et al., 2024). Крысиные антитела к Mzfpl использовались в разведении 1:100, кроличьи антитела к Mzfpl в разведении 1:100, мышиные антитела к эпитопу HA в разведении 1:100. В качестве вторичных антител использовали Alexa Fluor 488 козьи анти-кроличьи 1:2000 и Alexa Fluor 555 козьи анти-мышиные 1:2000 (Thermo Fisher Scientific, USA). Политенные хромосомы параллельно окрашивались DAPI (AppliChem, Germany). Изображения были получены на флуоресцентном микроскопе Nikon Eclipse Ti с камерой Nikon DS-Qi2, обрабатывались ImageJ 1.50c4 и Fiji bundle 2.0.0-rc-46. Проводили три или четыре независимых окрашивания и 4-5 независимых образца на линию.

2.11 Иммуноокрашивание эмбрионов

Использовали первичные моноклональные мышиные антитела анти-abd-A в разведении 1:50. Использовали вторичные антитела козлиные анти-мышь Alexa Fluor 647 (Thermo Fisher Scientific, USA) в разведении 1:2000. Окрашенные эмбрионы фиксировали в растворе следующего состава: 23% глицерин, 10% Mowiol 4-88, 0.1M Трис-HCl pH 8.3. Изображения снимали на Leica Stellaris 5 конфокальном микроскопе и обрабатывали в GIMP 2.8.16, ImageJ 1.50c4, Fiji bundle 2.0.0-rc-46.

2.12 Приготовление тотальных препаратов белка

Двадцать взрослых мух (или эмбрионы там, где это указано) гомогенизировали пестиком в 200 мкл лизирующего буфера (1xPBS, 1% ß-меркаптоэтанола, 4М мочевины, 5 mM PMSF, 1:100 Calbiochem Complete Protease Inhibitor Cocktail VII), затем добавляли буфер для внесения в SDS-ПААГ (200 ммоль Трис pH 6.8, 5% SDS, 125 ммоль ß-меркаптоэтанола, 0.1% бромфенолового синего, 30% глицерина) нагревали при 90° 10 минут. Затем центрифугировали при 12000 g 2 минуты, и разделяли в 8% SDS-ПААГ геле.

2.13 Вестерн-блот

Мембрану Amersham Hybond-P (GE Healthcare) смачивали метанолом, замачивали мембрану, губки и бумагу 3ММ в буфере для переноса. После проведения электрофореза уравновешивали акриламидный гель в буфере для переноса, инкубируя 10 минут на качалке. Проводили перенос в камере BioRad Mini Trans-Blot Cell 1 час при охлаждении. После переноса мембрану отмывали на качалке в промывочном буфере (PBS, 0,1% Tween) и помещали на 1 час в 5% обезжиренное молоко, разведенное в промывочном буфере. Инкубировали мембрану в растворе 3% молока в промывочном буфере с первичными антителами ночь на ротаторе при 4°C. Отмывали 1 раз 20 минут, и 2 раза по 10 минут промывочным буфером. Затем инкубировали 1 час в растворе вторичных антител с 3% молоком в промывочном буфере на качалке при комнатной температуре. Снова отмывали так же, как и от первичных антител. Проявляли, используя Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate (Thermo Scientific), сигнал детектировали с помощью Chemidoc MP System (Bio-Rad, USA).

2.14 Ведение культур клеток, трансфекция

Культуру клеток D. melanogaster S2 выращивали в среде SFX (HyClone, USA) при 25°C. Плазмиды трансфецировали при помощи реагента Cellfectin II (Thermo Fisher Scientific, USA) по инструкции производителя. Клетки трансфецировали на 6- или 12-луночной плашке и растили 24-48 часов до сбора. Все трансфекции производили в трех независимых повторностях.

2.15 Коиммунопреципитация

S2 клетки котрансфицировали плазмидой, экспрессирующей 3xHA-Mzfp1 (дикого типа и с делецией участка, взаимодействующего с CP190) и плазмидой, экспрессирующей CP190 с использованием реагента Cellfectin II (Thermo Fisher Scientific, США). После трансфекции клетки инкубировали 48 часов, затем осаждали центрифугированием 5 минут при центробежной силе 700 g, отмывали в 1xPBS однократно, ресуспендировали в 20 объемах упакованных клеток гипотонического лизирующего буфера (20 ммоль Трис-HCl pH 7.4, с 10 ммоль KCl, 10 ммоль MgCl2, 2 ммоль ЭДТА, 10% глицерином, 1% Triton X-100, 1 ммоль дитиотреитола, 1:100 смеси ингибиторов протеаз Calbiochem Complete Protease Inhibitor Cocktail V). После инкубации на льду в течение 10 минут, клетки разрушали ультразвуком, добавляли

NaCl до финальной концентрации в 420 ммоль, и инкубировали на льду 60 минут, переодически перемешивая. Затем процедуру обработки ультразвуком повторяли, чтобы снизить вязкость образцов. Затем образцы центрифугировали 30 минут при центробежной силе 10 000 g при 4°. Магнитные частицы Protein G Magnetic beads (NEB, США) конъюгировали с антителами к CP190 и с иммуноглобулином G путем инкубации при комнатной температуре в PBST на ротационном шейкере в течение часа. Затем уравновешивали с буфером для инкубации "150" (20 ммоль Трис-HCl, pH 7.4, 150 ммоль NaCl, 10 ммоль MgCl2, 1 ммоль ЭДТА, 1 ммоль ЕГТА, 10% глицерина и 0.1% NP-40). Белковый экстракт (в рассчете на 50 мкг белка) доводили до объема 500 мкл буфером "150", смешивали с конъюгированными с антителами магнитными частицами (30 мкл суспензии), и инкубировали на шейкере-ротаторе в течение ночи при 4°. Магнитные частицы затем промывали двумя объемами буфера "150", двумя объемами буфера "300" (то же, что "150", но 300 ммоль NaCl), и снова одним объемом буфера "150", затем ресуспендировали в буфере для внесения ПААГ, и далее проводили анализ, как написано в протоколе анализа вестерн-блот.

2.16 Выделение фракций клеток

60 взрослых мух гомогенизировали при помощи гомогенизатора Даунса (Wheaton, США) в 500 мкл охлажденного на льду буфера для экстрагирования цитоплазмы (CEB; состав 50 ммоль HEPES-KOH pH 7.5, 10 ммоль NaCl, 1 ммоль ЭДТА, 10% глицерин, 0.5% NP-40, 0.25% Triton X-100, 1 ммоль дитиотреитола и по 1:100 смесей ингибиторов протеаз Calbiochem Complete Protease Inhibitor Cocktails VII и V). Затем фильтровали через 70 мкм сито (Miltenyi Biotec, USA) и инкубировали на льду 10 минут. Гомогенат центрифугировали при центробежной силе 3000 g в течение 5 минут при 4°. Супернатант, представляющий собой цитоплазматическую фракцию, отбирали. Осадок (ядерная фракция) трижды промывали тем же буфером. Затем осадок ресуспендировали в 100 мкл буфера для ядерной экстракции NEB (10 ммоль Трис-HCl pH 8.0, 300 ммоль NaCl, 1 ммоль ЭДТА, 0.5 ммоль ЭГТА pH8.0 и 1:100 смесей ингибиторов протеаз 1:100 Calbiochem Complete Protease Inhibitor Cocktails VII и V), инкубировали на льду 10 минут, затем центрифугировали при центробежной силе 3000 g в течение 5 минут при 4°. Супернатант (нуклеоплазматическую фракцию) отбирали и промывали трижды тем же самым буфером. Затем осадок ресуспендировали в 100 мкл охлажденного на льду буфера для экстракции хроматина ChEB (500 ммоль Трис-HCl pH 8.0, 500 ммоль NaCl и 1:100 смесей ингибиторов протеаз Calbiochem Complete Protease Inhibitor Cocktails VII и V) и

инкубировали на льду 10 минут. Раствор (хроматиновую фракцию) обрабатывали ультразвуком в системе ультразвуковой фрагментации Bioruptor (Diagenode, США) в течение 5 минут с настройкой H. 30 секунд обработки - 30 секунд охлаждения. Затем центрифугировали при центробежной силе 16000 g в течение 10 минут при 4°. Супернатант (хроматиновую фракцию) отбирали. Далее все три фракции анализировали, как описано в разделе относительно анализа вестерн-блот.

2.17 Иммунопреципитация хроматина

Хроматин получали из эмбрионов возрастом от 8 до 16 часов и из взрослых самцов, собранных на 2-3 день лёта. Один грамм эмбрионов собирали и фиксировали формальдегидом, как указано в работе (Ghavi-Helm and Furlong, 2012). 500 мг взрослых мух растирали в ступке в жидком азоте и ресуспендировали в 20 мл буфера А (15 ммоль HEPES-KOH pH 7.6, 60 ммоль KCl, 15 ммоль NaCl, 13 ммоль ЭДТА, 0.1 ммоль ЕГТА, 0.15 ммоль спермина, 0.5 ммоль спермидина, 0.5% NP-40 и 0.5 ммоль дитиотреитола) со свежедобавленным 0.5 ммоль PMSF и 1:500 смеси ингибиторов протеаз Calbiochem Complete Protease Inhibitor Cocktail V. Суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса с туго притертым пестиком, фильтровали через 100 мкм сито Nylon Cell Strainer (Miltenyi Biotec, США), сшивали 1% формальдегидом при 15 минутах при комнатной температуре. Сшивку останавливали добавлением глицина до 125 ммоль. Ядра трижды промывали в 10 мл буфера для промывки (15 ммоль HEPES-KOH pH 7.6, 60 ммоль KCl, 15 ммоль NaCl, 1 ммоль ЭДТА, 0.1 mM ЕГТА, 0.1% NP-40 и ингибиторы протеаз) и один раз в 5 мл стартового буфера для лизиса ядер (15 ммоль HEPES pH 7.6, 140 ммоль NaCl, 1 ммоль ЕДТА, 0.1 ммоль ЕГТА, 1% Triton X-100, 0.5 ммоль DTT, 0.1% дезоксихолат натрия, и ингибиторы протеаз) и ресуспендировали в 1 мл буфера для лизиса ядер (15 ммоль HEPES pH 7.6, 140 ммоль NaCl, 1 ммоль ЕДТА, 0.1 ммоль ЕГТА, 1% Triton X-100, 0.5 ммоль DTT, 0.1% дезоксихолат натрия, 0.5% SLS, 0.1% SDS и ингибиторы протеаз). Суспензию ядер обрабатывали на ультразвуковом гомогенизаторе для фрагментации нуклеиновых кислот Covaris ME220 focused-ultrasonicator (с программой: 40 циклов 15 сек озвучки с 45 сек перерывом, пиковая мощность 75, duty фактор 25), и аликвоты в 50 мкл использовали для контроля степени фрагментации ДНК ультразвуком и концентрации ДНК. Нерастворимую фракцию осаждали центрифугированием при центробежной силе 140000 g в течение 10 минут при 4°. Хроматин предочищали магнитными частицами, конъюгированными с белком А Protein A Dynabeads (Thermo Fisher Scientific, США). ^ответствующие антитела инкубировали с 20

мкл аликвотами частиц, несущих белок А (Protein A Dynabeads от Thermo Fisher Scientific, США) в случае кроличьих антител к Mzfpl, в разведении 1:100; к Pita, в разведении 1:500; к Su(Hw), в разведении 1:300; кроличьи неспецифические IgG или частиц, несущих белок G (Protein G Dynabeads от Thermo Fisher Scientific, США) в случае крысиных антител к Mzfp1, в разведении 1:100; к CP190, в разведении 1:300; крысиного неспецифического IgG, смешанных с 200 мкл PBST. Комплексы частиц Dynabeads с антителами и магнитные частицы со специфичностью к эпитопу HA (anti-HA Magnetic beads, Thermo Fisher Scientific, США) промывали и уравновешивали буфером для лизиса ядер. Образцы хроматина, содержащие 10-20 мкг ДНК в 200 мкл буфера для лизиса ядер (отобрав аликвоты непреципитированного хроматина по 2 мкл для использования в качестве референса) инкубировали в течение ночи при 4° с частицами Dynabeads, конъюгированными с антителам. Затем трижды промывали lysis buffer с 500 ммоль NaCl и однократно TE буфером (10 ммоль Трис-HCl pH 8.0; 1 ммоль ЭДТА). Затем ДНК элюировали буфером для элюции (50 ммоль Трис-HCl pH 8.0, 1 ммоль ЭДТА, 1% SDS), сшивки разрушали нагреванием образца, и преципитированную ДНК выделяли с применением ChIP DNA Clean & Concentrator kit (Zymo Research, США).

Обогащение специфических фрагментов ДНК анализировали при помощи количественной ПЦР, как описано в соответствующем разделе. Результаты измерения количества ДНК, преципитированного из исследуемого участка, нормализовали на результаты измерения количества ДНК преципитированного из контрольного участка, в котором наблюдается стабильное связывание исследуемого белка. В качестве такового участка использовались: для Pita — участок 50E, для Su(Hw) — 62D, для Mzfp1 и CP190 — 94C. Кодирующий участок гена rpl32 (не содержащий участков связывания тестируемых белков) использовали в качестве отрицательного контроля во всех случаях.

Использованные при этом праймеры и их последовательности:

Fub_dir CAATTGTCAGGTGTCCTCATT, Fub_rev TAGGAGGCATTCGATTGGT.

Библиотеки для иммунопреципитации хроматина с последующим глубоким секвенированием (ChIP-seq) готовили с помощью NEB-Next®_Ultra™_Q DNA Library Prep kit в соответствии с инструкциями изготовителя. Разведенные библиотеки кластеризовали в ячейках для pair-read и секвенировали с использованием NovaSeq 6000 (Illumina, США).

50E_dir TCTGCGCTATGCCTCTT, 62D_dir TGATACCAGGCGAACAGAAATC, 94C_dir AAATGCGATTGGTAGCTTGG, rpl32_dir GTTCGATCCGTAACCGATGT,

50E_rev GTCTGCGCTATGTTCTGATTA, 62D_rev TTTGGGCTTGGTGAGAACAG, 94C_rev GTGCCATGCTAATCGGAACT, rpl32_rev CCAGTCGGATCGATATGCTAA,

2.18 Обработка данных ChIP-seq

Полученные данные доступны в базе NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) под номером GSE242677. Для всех образцов иммунопреципитация производилась в двух биологических повторностях, за исключением преимунного контроля и преципитации Mzfpl из хроматина эмбрионов с применением крысиной и кроличьей сыворотки (эти два образца считались повторностями друг относительно друга). Обработка данных производилась, как описано в работе (Kyrchanova et al., 2021). Все образцы прошли проверку на воспроизводимость между двумя биологическими повторностями. Из двух образцов с одной биологической повторностью (из хроматина эмбрионов с крысиными и кроличьими антителами анти-Mzfpl) мы получили объединенный набор пиков Mzfpl используя функцию findOverlapsOfPeaks пакета ChIPpeakAnno (Zhu et al., 2010). Гетерохроматиновые регионы определялись в соответствии с координатами центромер в геноме сборки dm6 (2L:2200097523513712; 2R:1:5398184, 3L:22962476-28110227, 3R:14174178, X:22628490-23542271) (Hoskins et al., 2015). Гены домашнего хозяйства определяли в соответствии с работой (Corrales et al., 2017).Колокализацию сайтов связывания Mzfp1 с прочими белками (M1BP, Su(Hw), ZIPIC, Pita, dCTCF, BEAF-32, CP190) определяли с использованием доступных публично данных ChIP-seq. Данные относительно белка M1BP взяты из (Baumann and Gilmour, 2017), Su(Hw) — (Nègre et al., 2011), ZIPIC, Pita — (Zolotarev et al., 2016), dCTCF — (Kyrchanova et al., 2021), BEAF-32 — (Yang et al., 2012), CP190 — (Bowman et al., 2014). Достоверность колокализации пар белков в промоторах генов «домашнего хозяйства» оценивали при помощи метода Монте-Карло. Для каждой пары белков (белок P1 с N1 сайтов связывания в промоторах генов «домашнего хозяйства» и P2 с N2 таких сайтов) составляли 5000 пар случайных наборов промоторов (размером N1 и N2). Для каждой из этих 5000 пар рассчитывалось отношение между числом промоторов, встречающихся в обоих наборах к общему числу промоторов в паре. Полученное распределение считали ожидаемой долей числа промоторов, совпадающих случайно. В дальнейшем рассчитывали p-value как долю отношений, превосходящих реально наблюдаемое отношение числа промоторов с пиками обоих белков к числу промоторов с одним из двух белков. К полученным p-value применяли поправку на множественное тестирование Бенджамини-Хохберга.

2.19 RNA-seq

Тотальную РНК выделяли при помощи реагента TRI (Molecular Research Center, США) в соответствии с инструкцией изготовителя. Матричную РНК выделяли при помощи магнитных частиц с олиго-dT oligo(dT) Magnetic beads (NEB, США) в соответствии с инструкцией изготовителя. Библиотеки RNA-seq готовили при помощи NEBNext® Ultra RNA Library Prep kit (NEB, США) в соответствии с инструкцией изготовителя. Разведенные библиотеки кластеризовали в ячейках для pair-read и секвенировали с использованием NovaSeq 6000 (Illumina, США). RNA-seq выполняли с двумя образцами: личинки третьей стадии линий yl4w1118 (в двух биологических повторностях) и CG1603attP (в трех биологических повторностях). Полученные данные доступны в базе NCBI Gene Expression Omnibus (GEO) под номером GSE242679.

3.1

3 Результаты Mzfp1 входит в состав небольшой группы C2H2-белков, которые имеют два MADF-домена и ^концевой C2H2-домен

Белок CG1603 в литературных источниках впервые упоминается в качестве партнера по взаимодействию с белками Chromator (ген Chriz/Chro) и Z4 (ген pzg/Z4) (Guruharsha et al., 2011). Поскольку Chromator и Z4 вместе с CP190 ассоциированы с промоторами генов "домашнего хозяйства" (Cubenas-Potts et al., 2017; Pokholkova et al., 2018; Vogelmann et al., 2014), мы предположили, что белок CG1603 участвует в организации промоторов генов "домашнего хозяйства" по аналогии с белком M1BP (Bag et al., 2021; Baumann and Gilmour, 2017; Li and Gilmour, 2013). Поэтому была поставлена задача исследовать взаимодействие белка Mzfp1 с CP190, Chromator и Z4.

Белок CG1603 (Рисунок 6) имеет размер 586 а.о. Содержит N-концевой цинк-пальцевый домен C2H2-rara (18-43 а.о.), два MADF-домена, обозначаемых далее MADF1 (201-292 а.о.) и MADF2 (320-413 а.о.), и C-концевой кластер, состоящий из шести цинковых пальцев C2H2-rarn (418-583 а.о.) (Рисунок 6). Мы назвали этот белок Mzfp1 - MADF and Zinc-Finger Protein 1, то есть, «содержащий MADF и цинковые пальцы белок 1».

Рисунок 6. Доменная структура белка Mzfp1 и разнообразие изоэлектрических точек MADF-доменов в гомологах Mzfp1 секции Schizophora. Филогенетическое древо видов секции Schizophora, содержащих гомологи Mzfp1. Выше приведена схема доменной организации белка Mzfp1. Два MADF-домена (розовый и голубой пятиугольники) и доменов "цинковые пальцы" С2Н2-типа (оранжевые прямоугольники). Справа представлены MADF-домены из аннотированных белков с соответствующими изоэлектрическими точками. Цвет пятиугольников соответствует заряду — синий положительному, розовый отрицательному ^око1оу et а1., 2024).

Домен MADF1 имеет отрицательный заряд с изоэлектрической точкой (р1) 6.65, что

предполагает его участие в привлечении белковых комплексов. MADF2 имеет положительный

заряд (pI 9.6), что позволяет ему участвовать в специфичном связывании с ДНК, что было описано ранее для других MADF-доменов (Maheshwari et al., 2008).

Мы проанализировали распространение белков со структурой, аналогичной белку Mzfpl. У всех видов семейства Drosophilidae мы нашли несколько белков, которые имеют характерную доменную организацию: (C2H2)-MADF1-MADF2-(C2H2)6-7. MADF-домены ортологичных белков Drosophila (в основном группы melanogaster) имеют сходные pI (MADF1 6.2-6.8; MADF2 8.5-9.7). Ортологи более отдаленных видов Drosophila тоже имеют два MADF-домена, но pI этих доменов может сильно отличаться (Рисунок 7). Например, во многих случаях оба домена заряжены положительно (группы видов willistoni, repleta, и virilis). В то же время, группа obscura имеет домен MADF1 с крайне низким pI. Поиск среди прочих семейств Díptera также обнаруживает ортологи, ближайшие из которых в секции Schizophora (Рисунок 6, 7).

Рисунок 7. Филогенетическое древо видов DrosophШdae, в которых обнаружены гомологи Mzfp1. В

правой части изображены MADF-домены, обнаруженные в этих белках, с указанием их изоэлектрических точек. Цвет пятиугольников, символизирующих MADF-домены соответствует их заряду: синий — положительно заряженный, розовый/фиолетовый — отрицательно заряженный ^око^ et а1., 2024).

Несмотря на более низкий процент совпадения последовательностей с Mzfp1, нежели внутри Drosophi1idae, доменная организация гомологов сохраняется и имеет вид ((С2Н2)-MADF1-MADF2-(C2H2)6-7), в то время, как MADF-домены могут иметь резко отличающиеся р1

(Рисунок 6, 7). В геноме Drosophila melanogaster есть еще четыре белка-паралога Mzfp1 со сходной организацией (Рисунок 8).

Mzfpl (CG1603)

100 200 300 400 500 600 700 800 900

Цинковые о/ ___ __ I— пальцы -, %СХОДСТВЭ

$-^Н^ШННЮ 586 о о

pl 6.65 pl 9.6

Цинковые пальцы

CG1602 _д-^^^ХННННН}"7

pl 9.59 pl 6.36

24

Цинковые пальцы

AZ2 —^>-^>{ХНХНХК> 564 15 23

pl 9.66 pl 6.49

Цинковые пальцы

CG8944 _[]--ЩЩ{^762 18;19

pl 10.33 pl 9.59

Цинковые I_ пальцы _|

Rgr —□-22;16 18

pl 9.79 pl 5.56 pl 5.07 Рисунок 8. Доменная организация паралогаов Mzfp1. Справа указан процент сходства последовательностей MADF-доменов (определенный с помощью Clustal Omega). Условные обозначения, как на рисунке 6 (Sokolov et al., 2024).

Таким образом, на основе анализа предположительной доменной структуры Mzfpl и поиска гомологов в других видах Díptera выяснилось, что этот белок входит в группу белков, отличительной чертой структуры которых является наличие одиночного цинкового пальца на N-конце, двух MADF-доменов, имеющих pI выше и ниже 7. и кластера цинковых пальцев на C-конце. Геном D.melanogaster кодирует несколько таких белков. Белки этой группы есть у всех видов семейства Drosophilidae, и встречаются вне неё. Белок Mzfpl взаимодействует с белками, организующими промоторы "домашнего хозяйства". Кластер "цинковых пальцев" характерен для архитектурных белков и может участвовать в связывании длинных специфичных мотивов, MADF-домены также характерны для белков, участвующих в регуляции транскрипции. То есть, белки группы Mzfpl потенциально являются транскрипционными факторами.

3.2 Mzfp1 непосредственно взаимодействует с CP190

В литературе белок Mzfpl описан в массовом скрининге, направленном на поиск прямых взаимодействий между белками при помощи коиммунопреципитации с последующим масс-спектрометрическим анализом, в качестве партнера белков Z4 и Chromator (Guruharsha et al.,

2011). Chromator и Z4 совместно с CP190 ассоциированы с промоторами генов "домашнего хозяйства" (Cubenas-Potts et al., 2017; Pokholkova et al., 2018; Vogelmann et al., 2014). Нашей следующей задачей было изучение прямых взаимодействий между Mzfp1 и CP190, Z4, и Chromator. Для изучения прямых взаимодействий Mzfp1 с CP190, Z4, и Chromator мы использовали дрожжевую двугибридную систему (Y2H). Результаты показали взаимодействие только между Mzfp1 и CP190. Затем мы картировали конкретные участки в белках CP190 и Mzfp1, которые участвуют во взаимодействии. С этой целью перекрывающиеся фрагменты mzfpl были клонированы в вектор pGAD в рамке с активационным доменом GAL4 (AD) и исследованы на предмет взаимодействия с CP190, ген которого был клонирован в вектор pGBT в рамке с ДНК-связывающим доменом GAL4 (DBD) (Рисунок 9, 10, 11 ).

Рисунок 9. Картирование участков Mzfp1, взаимодействующих с CP190. Диаграмма показывает доменную организацию Mzfp1. Мы клонировали фрагменты Mzfp1 в рамку с активационным доменом GAL4 (AD) и тестировали на взаимодействие с СР190, клонированным в рамку с ДНК-связывающим доменом GAL4 (BD). Мы протестировали СР190 на отсутствие взаимодействия с AD доменом самим по себе. Мы протестировали все производные Mzfp1 на отсутствие взаимодействия с BD доменом самим по себе. Мы использовали dCTCF, клонированный в рамке с AD в качестве позитивного контроля к СР190. Результаты сведены в колонки, "+" и "-" означают наличие и отсутствие взаимодействия, соответственно. Рост дрожжей, котрансформированных соответствующими плазмидами на чашках Петри с селективной средой показан на фотографиях. Участки Mzfp1, потенциально взаимодействующие с СР190, обозначены красным ^око1оу et а1., 2024).

Мы проверили наличие взаимодействия полного белка М^р! (1-586 а.о. ) и фрагментов М^1 А161-194 а. о., Mzfp1 А161-194 А295 - 319 а. о., М^1 1-200 а. о., Mzfp1 1-169 а. о. с полным белком СР190. В результате было показано, что потенциально участвуют во взаимодействии два фрагмента белка Mzfp1: 161 а. о. - 194 а. о. И 295 а. о.- 319 а. о. (расположен между MADF-доменами) (Рисунок 9).

Рисунок 10. Картирование доменов CP190, взаимодействующих с Mzfp1. Диаграмма показывает доменную организацию СР190. Мы клонировали фрагменты СР190 в рамку с ДНК-связывающим доменом ОАЬ4 (BD) и тестировали на взаимодействие с Mzfp1 клонированным в рамку с активационным доменом ОАЬ4 (АО). Мы протестировали Mzfp1 на отсутствие взаимодействия с BD доменом самим по себе. Мы протестировали все производные СР190 на отсутствие взаимодействия с АО доменом самим по себе. Результаты сведены в колонки, "+" и "-" означают наличие и отсутствие взаимодействия, соответственно. Рост дрожжей, котрансформированных соответствующими плазмидами на чашках Петри с селективной средой показан на фотографиях (8око1оу е! а1., 2024).

Затем мы установили участки белка CP190, которые участвуют во взаимодействии. Белок CP190 содержит домен BTB (1-126 а. о.), аспарагин-богатый домен (262-286 а. о.), четыре цинковых пальца С2Н2-типа (471-594 а. о.). BTB-домен отвечает за мультимеризацию, а также, вместе с участком 126-209 а. о. он отвечает за взаимодействие с микротрубочками (Bonchuk et al., 2011; Plevock et al., 2015). Ранее было показано, что хорошо изученные инсуляторные белки, такие, как Su(Hw), dCTCF, и Pita, преимущественно взаимодействуют с BTB доменом (Sabirov et al., 2021b). Три ранее охарактеризованных белка, преимущественно связывающихся в

промоторах "генов домашнего хозяйства" - М1ВР, ОрЬр, и 21Р1С - взаимодействуют с участками СР190 210-245 а. о.и 309-390 а. о. ^о1оушп ^ а1., 2023). Мы тестировали фрагменты СР190 11096 а. о., СР190 1-599 а. о., СР190 1-470 а. о., СР190 1-245 а. о., СР190 1-220 а. о., СР190 1-293Д190-210 а. о. на предмет взаимодействия с полным белком Mzfp1. В результате мы установили, что с Mzfp1 взаимодействуют участки СР190 210-245 а. о. и 309-390 а. о., как и в случае ранее охарактеризованных архитектурных белков (Рисунок 10).

Рисунок 11. Картирование взаимодействий между участками Mzfp1 и CP190. Диаграмма показывает доменную организацию Mzfp1 и СР190. Мы клонировали фрагменты СР190 в рамку с ДНК-связывающим доменом GAL4 (ВБ) и тестировали на взаимодействие с фрагментами Mzfp1 клонированными в рамку с активационным доменом GAL4 (АБ). Мы протестировали все фрагменты СР190 на отсутствие взаимодействия с АБ доменом самим по себе. Мы протестировали все производные Mzfp1 на отсутствие взаимодействия с ВБ доменом самим по себе. Мы использовали dCTCF и 21Р1С, клонированные в рамке с АБ в качестве позитивного контроля к фрагментам СР190. Результаты сведены в колонки, "+" и "-" означают наличие и отсутствие взаимодействия, соответственно. Рост дрожжей, ^трансформированных соответствующими плазмидами на чашках Петри с селективной средой показан на фотографиях. Участки Mzfp1, потенциально взаимодействующие с СР190, обозначены красным ^око1оу е! а1., 2024).

Мы протестировали фрагменты, участвующие во взаимодействии между белками, на взаимодействие друг с другом. Мы тестировали фрагменты СР190 309-390 а.о. СР190 1-245 а. о., СР190 1-220 а. о., СР190 1-293Д190-210 а. о. против Mzfp1 Д161-194 а. о., Mzfp1 1-200

а. о., Mzfp1 1-169 а. о.(Рисунок 11). В результате, мы установили, что с участком 210-245 а. о. СР190 взаимодействуют оба участка Mzfp1. Фрагмент Mzfp1 1-200 а. о. взаимодействует с СР190 309-390 а. о.

Затем мы подтвердили роль участка Mzfp1 152-193 а. о во взаимодействии с СР190 вариантами Mzfp1 методом коиммунопреципитации. СР190 коэкспрессировали в S2 клетках с Mzfp1 или Mzfp1A152-193 а. о., меченым НА-эпитопом. (Рисунок 12). В этой системе делеция Mzfp1 152-193 а. о. приводит к почти полной утрате взаимодействия с СР190. Сохранение слабого взаимодействия с СР190 может быть связано с тем, что участок 295-319 а. о. тоже участвует во взаимодействии.

Рисунок 12. Исследование взаимодействия CP190 и Mzfp1 методом коиммунопреципитации.

Тотальные экстракты из S2-raeTOK, котрансфицированных CP190 и Mzfp1-3xHA иммунопреципитировали антителами к CP190 и неспецифическому IgG в качестве негативного контроля, и иммунопреципитаты (IP) анализировали методом Вестерн-блота на наличие HA-тагированных белков. Input это образцы экстракта до иммунопреципитации, output это супернатант после седиментации иммунопреципитированного материала. Образцы, иммунопреципитированные с CP190 и IgG нанесены соответственно в двадцатикратной и пятикратной концентрации (Sokolov et al., 2024).

3.3 Mzfp1 преимущественно связывается с промоторами генов «домашнего

хозяйства»

Следующей задачей работы стало исследование геномного распределения сайтов связывания Mzfp1. С этой целью мы получили поликлональные афинно-очищенные крысиные и кроличьи антитела против эпитопа Mzfp1 44-200 а. о. Для тестирования качества антител была проведена окраска политенных хромосом слюнных желез личинок. В результате были получены сходные паттерны окрашивания политенных хромосом слюнных желёз. Крысиные и кроличьи антитела преимущественно окрашивали перицентромерный гетерохроматин и некоторое число междисковых участков в эухроматине, что предполагает, что Mzfp1 связывается как с эухроматиновыми, так и с гетерохроматиновыми участками. Необходимо отметить, что

крысиные антитела окрашивали эухроматиновые районы политенных хромосом эффективнее, чем кроличьи.

Рисунок 13. Поиск связывающих ДНК доменов Mzfp1 in vitro. Связывание in vitro полноразмерного Mzfpl, C-концевого кластера С2Н2-доменов (2-7 Zf) Mzfpl, и MADF-доменов с ДНК-зондом, состоящим из четырех сайтов связывания Mzfpl (Mzfp1x4), и с фрагментом содержащим четыре сайта связывания Zw5 (Zw5x4 ) в качестве негативного контроля. Рекомбинантный белок, состоящий из MBP и исследуемого фрагмента белка, инкубировали с Mzfp1x4 и Zw5x4, меченными Cy5 и FAM соответственно (Sokolov et al., 2024).

Для идентификации сайтов связывания Mzfpl in vivo мы провели ChIP-Seq хроматина, выделенного из эмбрионов. Были сделаны две биологические повторности — с крысиными и кроличьими антителами. В результате было получено 784 пика в ChIP-seq с крысиными антителами и 110 пиков в ChIP-seq с кроличьими антителами. Произвели анализ последовательностей полученных пиков при помощи ChIPmunk (Kulakovskiy et al., 2010; Kulakovskiy et al., 2013). В результате был предсказан новый мотив длиной 15 п. н. Наличие такого мотива типично для транскрипционных факторов с кластером C2H2-доменов "цинковые пальцы" (Maksimenko et al., 2021). При помощи метода EMSA мы подтвердили специфичное связывание как полноразмерного Mzfp1, так и части белка, включающей кластер C2H2-доменов, с искусственным ДНК-фрагментом, представляющим собой четыре сайта связывания,

соотвествующих сайту с мотивом связывания Mzfp1 в промоторе гена mRpS7 (Mzfp1x4) (Рисунок 13).

При дальнейшем анализе результатов ChIP-seq было установлено, что большая часть сайтов связывания Mzfp1 (более 70%) находится в промоторах как эухроматиновых, так и гетерохроматиновых генов (Рисунок 14). Более того, почти все пики в эухроматине, содержащие мотив связывания (более 95%) расположены в промоторах. Мотивы связывания Mzfp1 располагаются в ±200 п. н. от сайтов старта транскрипции (TSS), что позволяет предположить участие белка в организации промоторов. Более, чем 60% Mzfp1-зависимых эухроматиновых промоторов относятся к генам "домашнего хозяйства". Лишь небольшое число сайтов Mzfp1 локализовано в межгенных промежутках (менее, чем 2% от общего числа пиков в эухроматине, содержащих мотив связывания Mzfp1).

Рисунок 14. Распределение сайтов связывания Mzfp1 между геномными элементами (Sokolov et al., 2024).

Ранее было показано, что все изученные архитектурные С2Н2-белки взаимодействуют с CP190 (Bag et al., 2021; Kyrchanova et al., 2021; Kyrchanova et al., 2021; Maksimenko et al., 2015; Melnikova et al., 2017; Pai et al., 2004; Sabirov et al., 2021a; Vogelmann et al., 2014). Для исследования колокализации Mzfp1 с CP190 и другими архитектурными С2Н2-белками мы использовали ранее полученные данные по M1BP (Baumann and Gilmour, 2017), Su(Hw) (Nègre et al., 2011), Pita, ZIPIC (Zolotarev et al., 2016), dCTCF (Kyrchanova et al., 2021), BEAF-32 (Herman et al., 2022; McKowen et al., 2022) и CP190 (Bowman et al., 2014). Мы обнаружили оценили статистическую значимость в колокализации сайтов связывания архитектурных белков в промоторах генов «домашнего хозяйства», а также значимую колокализацию между Mzfp1 с CP190, что согласуется с результатами, свидетельствующими об их прямом взаимодействии

(Рисунок 15). Также наблюдалась значимая колокализация Mzfp1 с BEAF-32, ZIPIC, Pita, dCTCF (Рисунок 15). Колокализация между сайтами связывания архитектурных C2H2-белков в промоторах генов «домашнего хозяйства» согласуется с гипотезой о том, что для организации промотора необходима кооперация нескольких архитектурных C2H2-белков, привлекающих CP190.

Mzfpl СР190 Ml BP Pita Su(Hw) ZIPIC dCTCF

BEAF-32

00 II

Mzfpl ^^^ * * *

CP 190 О • • • *

Ml BP *

Pita * *

Su(Hw) *

ZIPIC

0.24 0.22 0.19 0.17

0.15 0.13 0.1 1 0.09

0.07 0.05

0.02

Рисунок 15. Колокализация сайтов связывания Mzfp1 с сайтами связывания M1BP, dCTCF, Su(Hw), Pita, ZIPIC, BEAF-32 и CP190. Размер и цвет кружков соответствует доле пересекающихся сайтов связывания в каждой паре (из объединенного множества сайтов связывания в промоторах генов домашнего хозяйства). Звездочкой обозначена достоверная колокализация (см. Методы) (Sokolov et al., 2024).

3.4 Мутации в гене т1/р1 демонстрируют значимую роль белка в регуляции

экспрессии генов D. melanogaster

Для определения функциональной роли Mzfp1, мы использовали мутацию гена mzfpl (CG1603) - CG160304743 (BL18801) полученную в работе (Thibault et al., 2004). Мутация CG1603f04743 представляет собой интеграцию транспозона pBac в 5'UTR область mzfpl в 70 п. н. от старт-кодона (Рисунок 16). Данная мутация летальна. Мы установили, что гомозиготы доживают до второй, или, реже, третьей личиночной стадии. Линию с мутацией CG160304743 мутацию поддерживали в гетерозиготе с балансерной хромосомой CyOGFP (BL4533).

CG 1603ю4743

mini-w uas

mzfpl (CG1603)

7517

CG16Q3attP

3-е

ih:

7516

7515

=000000

2R¡7516276..7514199

-1

7514 тыс п.н.

*=4>т

ЗхРЗ , „ , sv40 PAS _ф000 . .dsRed

гомологическая рекомбинация

it

attPloxP

loxP

T

-tie

]f

CRE-loxP рекомбинация

айР 1охР

Рисунок 16. Получение делеции CG1603attP. Схематическое изображение геномного района CG1603 с мутацией CG1603f04743 и делецией CG1603attP. Кодирующие участки гена т2/р1 (CG1603) обозначены желтыми прямоугольниками, серыми прямоугольниками отмечены некодирующие транслируемые участки. Узкими вертикальными красными прямоугольниками отмечены СИКРЯ-мишени. Белыми горизонтальными прямоугольниками обозначены фрагменты, использованные в качестве плеч для гомологичной рекомбинации. Серыми прямоугольником обозначен промотор hsp70. Три розовых кружка обозначают сайты связывания белка pax6, входящие в состав 3хР3 промотора. Красной стрелкой обозначен маркерный ген dsRed. Черной горизонтальной полоской обозначен терминатор SV40. Оранжевыми треугольниками обозначены /ох-сайты. Белым треугольником обозначен аИР-сайт ^око1оу et а1., 2024).

С целью получения ноль-мутации мы индуцировали делецию гена CG1603 в линии y!w1118 (Рисунок 16) с использованием CRISPR/Cas9 (Gratz et al., 2014; Osadchiy et al., 2023; Port et al., 2014). Мы получили делецию гена CG1603 длиной 2077 п. н. с интегрированным вместо этого участка сайтом attP и репортером 3P3:dsRed, фланкированным сайтами loxP и назвали её CG1603attP (Рисунок 16). Наличие в балансерной хромосоме CyOGFP репортерного гена, кодирующего флуоресцентный белок eGFP позволило установить, что гомозиготы CG1603attP или гетерозиготы CG1603f04743/CG1603attP доживали до второй и, редко, третьей личиночной стадии. Таким образом, мутации гена CG1603 летальны. Мы использовали личинок CG1603attP/CG1603attP чтобы проверить специфичность антител к Mzfp1 (Рисунок 17А). Для того, чтобы проверить распределение Mzfp1 в клетках, мы сравнили содержание Mzfp1 в цитоплазматической, нуклеоплазматической и хроматиновой фракции мух линии y1w1118 (Рисунок 17Б). При помощи как крысиных, так и кроличьих антител удалось детектировать примерно равные количества Mzfp1 в нуклеоплазме и в ассоциации с хроматином. CP190, не взаимодействующий с ДНК напрямую, мы, напротив, обнаружили в основном в нуклеоплазматической фракции.

кДа

100

100

5

со r-V

8

Mzfpl (крысиные антитела)

Mzfpl (кроличьи антитела)

180 75

CP190

Ламин

кДа

180

100

100

63

75

20

о? £

и §

S

zr

ПЗ

Ж

#

о

QJ

!

£

о £

Рисунок 17. Вестерн-блот анализ ноль-мутации CG1603attp и распределения белка в клетке. А.

Вестерн-блот анализ (разделение в 6% денатурирующем ПААГ) белковых экстрактов,

приготовленных из личинок линии y'w1118; CGI603attP/CGl603attP

крысиными и кроличьими антителами против Mzfpl. Антитела

(крысиные R дамину Dm0 и СР190. Б. Вестерн-антитела)

СР190

Mzfpl

Mzfpl (кроличьи антитела)

блот анализ (разделение в 4-15% денатурирующем ПААГ)

ц ито п л аз м ати ч ес ко й, нуклеоплазматической, а-тубулин хроматиновой фракции,

приготовленных из взрослых самцов линии у1w1118. Окрашивание крысиными и кроличьими антителами против Mzfpl, антителами против СР190 и антителами против а-тубулина в качестве контроля

> Г и стон НЗ (цитоплазматического маркера), ламина DmO (ядерного маркера), и гистона НЗ (his3, хроматинового маркера) (Sokolov et al., 2024).

Ламин

Для проверки роли Mzfp1 в регулировании промоторов, мы сравнили экспрессию выборки генов в личинках линии у^1118 с уCG1603attP/CG1603attP при помощи RNA-seq (Рисунок 18). Были выбраны гены, имеющие постоянный уровень экспрессии в ходе развития (см. методы) и содержащие в промоторе пик обогащения Mzfp1. В этой выборке мы сравнили гены, имеющие в промоторе мотив связывания Mzfp1 и не имеющие. В результате было обнаружено, что инактивация Mzfp1 влияла на транскрипцию 21 из 37 расположенных в гетерохроматине генов с мотивом связывания Mzfp1 в промоторе. Влияние на транскрипцию с промоторов в эухроматине было ограниченным, при этом снижение и увеличение транскрипции наблюдалось примерно в равном числе генов (около 20%) (Рисунок 18). Таким образом, Mzfp1 необходим для активности гетерохроматиновых промоторов. В эухроматиновых промоторах, возможно, Mzfp1 работает в кооперации с другими архитектурными C2H2-белками и его инактивация компенсируется другими белками.

Промоторы с пиками

Без мотива В гетерохроматине

N = 38

Без мотива N = 225 В эухроматине

С мотивом В гетерохроматине

N = 16

N = 9

N = 66

N = 61

N = 21

Изменение уровня экспрессии

без изменения ■ повышение понижение

С мотивом В эухроматине

N = 291

N = 83

Доля

Рисунок 18. Влияение делеции на экспрессию генов. Сравнение экспрессии генов, содержащих,

либо не содержащих мотив связывания М^*р1 в промоторе в линии дикого типа и линии, гомозиготной по СС1603апР, выполненное при помощи КЫА-зед. Гены сгруппированы по признаку наличия или отсутствия мотива связывания М^р1 в промоторе, отдельно сгруппированы эухроматиновые и гетерохроматиновые гены. Личинки дикого типа относятся к линии у1м?Ш8, личинки с генотипом С01603мР/С01603апР отобраны в потомстве линии СС1603стР1СуСРгр. На гистограмме показаны пропорции числа генов, изменивших уровень экспрессии, в разных группах. (8око1оу а1., 2024).

3.5 Участок, взаимодействующий с СР190, и MADF-домеиы необходимы для функционирования белка Mzfpl in vivo

Следующей задачей исследования было исследование функций отдельных доменов белка МгГр1. С этой целью была создана трансгенная линия (С/; Мг^рГ*) в которой кДНК mzfpl, клонированная в рамке с троекратным эпитопом НА (МгГр1^-НА), экспрессировалась под контролем сильного промотора Ubiquitin-63E (Ц) (Рисунок 19). Поскольку последний С2Н2-домен находятся непосредственно на С-конце белка Mzfp1 (561-583 а.о., длина белка 586 а.о.), то, для того, чтобы исключить влияние со стороны эпитопа НА, был встроен линкер в виде альфа-спирали длиной в 23 а. о. (Arai е! а1., 2001).

Промотор Ubi-p63E

5'UTR

Ubi-p63E 3xHA dCTCF интрон rUTTl интрон

»

dCTCF3'UTR

PAS

Mzfpl rl

U:Mzfplwt-HA

U:MzfplA42-HA

U:MzfplAMl-HA

U:MzfplAM2-HA

U:MzfplAZF-HA

жизнеспособность CG1603ю4743

1-586

Д152-193 Д201-292 ■ Д320-412 Д479-586

Рисунок 19. Схема трансгенных конструкций Mfzp1, исследованных in vitro. Схема конструкции для экспрессии вариантов Mzfpl с делециями под контролем промотора Ubi-p63E. Зеленым обозначены промотор и 5'UTR гена Ubi-p63E, красным - 3'UTR с сигналом полиаденилирования гена dCTCF, желтым - PAS, сигнал полиаденилирования вируса SV40, фиолетовым - эпитоп HA. Были получены линии с интеграцией трансгенов, экспрессирующих варианты Mzfpl с удаленными участками Л42, AZF, ЛМ1, ЛМ2, на третьей хромосоме. Полученные линии объединяли с ноль-мутацией mzfpl CG1603attP/CyO. Это позволило оценить жизнеспособность гомозигот CG160304743 на фоне конструкций, экспрессирующих различные варианты Mzfpl (Sokolov et al., 2024).

Мы интегрировали экспрессирующую конструкцию в район 86Fb линии M{3xP3-RFP.attP}ZH-86Fb при помощи фС31-опосредованной интеграции (Bateman et al., 2006; Bischof et al., 2007). Путем серии скрещиваний мы получили линию U:Mzfp1WT/TM6,Tb; CG1603f04743ICyO и установили, что при наличии этой конструкции гомозиготы U:Mzfp1 WTITM6,Tb; CG1603f04743ICG1603f04743 имеют фенотип дикого типа. Mzfpl имеет два потенциальных ДНК-связывающих участка - C-концевой кластер цинк-пальцевых доменов С2Н2-типа и положительно заряженный MADF2-домен. Для выяснения функции отдельных доменов, мы получили конструкции с делецией отдельных доменов Mzfpl: делеция участка, взаимодействующего с CP190 (Д42), MADF1 (AMI), MADF2 (AM2), и делеция цинковых пальцев в C-концевом кластере с 4 по 6 (AZF). Мы получили трансгенные линии с экспрессией этих форм аналогично тому, как получали U:Mzfp1wt (Рисунок 19). Анализ экспрессии методом вестерн-блота (Рисунок 20А) показал, что уровень белка в линиях Mzfp1wt-HA и Mzfp1AZF-HA присутствуют во взрослых мухах в приблизительно равном количестве. Количество Mzfp1AM2-HA было выше, а количество Mzfp1AM1-HA и MzfpA42-HA ниже, чем Mzfp1wt-HA.

wt Д42 AZF ДМ1 ДМ2

wt Д42 ÄZF ДМ1 ДМ2

Mzfpl кроличьи 90 антитела

эпитоп HA

Mzfpl крысиные антитела

Ламин

й 3.6

о 3.2 ii о

л 2.8

2.4

i 1.6

1.2

О 0.4

■ y1w1118

■ Wt

□ ДМ1

□ ДМ2

□ Д42

□ AZF

ORF

НА

взрослые мухи

Рисунок 20. Анализ экспрессии Mzfp1 и его делеционных производных. А. Вестерн-блот анализ (разделение в 8% денатурирующем ПААГ) белковых экстрактов мух из трансгенных линий, экспрессирующих Mzfpl дикого типа и его делеционные варианты под убиквитиновым промотором: wt (Mzfp1wt-HA), А42 (Mzfp1A42-HA ), AZF (Mzfp1AZF-HA), AMI (MzfpAM1-HA), AM2 (MzfpAM2-HA). Окрашивание антителами против Mzfpl (крысиными и кроличьими), эпитопу HA, и ламину D0. Б. Уровень экспрессии гена mzfpl (CG1603) во взрослых мухах из трансгенных линий, экспрессирующих Mzfpl дикого типа и его делеционные варианты под убиквитиновым промотором. В качестве контроля уровня экспрессии в диком типе использована линия y1w1118. Индивидуальные уровни транскриптов определялись при помощи RT-qPCR с соответствующих праймеров («ORF» - праймеры из кодирующей последовательности CG1603; «HA» - праймеры из HA-эпитопа) нормализованные относительно RpL32 на количество входной кДНК. Столбики ошибок показывают стандартное отклонение в группе из трех измерений (Sokolov et al., 2024).

Поскольку транскрипция мРНК рекомбинантных белков была на сопоставимых уровнях (Рисунок 20Б), можно предположить, делеция участка, взаимодействующего с CP190 или MADF1 домена уменьшает стабильность белка, а делеция MADF2 увеличивает стабильность белка. Экспрессия рекомбинантных белков в трансгенных линиях выше, чем экспрессия белка в линии дикого типа (y1w1118 ) (Рисунок 20А). Вестерн-блот анализ показал очень маленькое содержание белка в тотальном экстракте y1w1118. Мы сравнили содержание Mzfpl в цитоплазматической, ядерной и хроматиновой фракции белкового экстракта из трехдневных взрослых мух линий y1w1118 и U:Mzfp1WT/TM6,Tb; CG1603f04743/CG1603attP (Mzfp1WT) (Рисунок 17Б). Вестерн-блот анализ показал малое содержание Mzfpl в цитоплазматической фракции y1w1118 и U:Mzfp1WT/TM6,Tb, что указывает на преимущественно ядерную локализацию белка. В обеих линиях белок был в равной мере представлен между хроматиновой и ядерной фракцией. Количество Mzfpl в линии Mzfp1WT в несколько раз выше, чем в y1w1118.

Ни одна делеционная производная Mzfpl не комплементировала CG1603f04743/CG1603f04743, что предполагает, каждый из исследованных участков (оба MADF-домена, участок,

взаимодействующий с CP 190, и кластер цинковых пальцев) важны для функционирования белка (Рисунок 19). Затем мы использовали антитела к Mzfpl и эпитопу HA, чтобы сравнить связывание Mzfp1-HA и его мутантных производных с политенными хромосомами личинок третьей стадии. Мы не смогли получить достаточно качественные препараты политенных хромосом из редких гомозигот по мутации CG1603, доживших до 3 стадии. По этой причине мы использовали политенные хромосомы мух, гетерозиготных по мутации (генотип CG1603attP/CyO; Ubi:Mzfp1*/ TM6,Tb, где * - wt, Д42, AZF, AMI, AM2) (Рисунок 21).

Несмотря на значительно более сильную экспрессию Mzfpl в мухах CG1603attP/CyO; Ubi:Mzfp1/ TM6,Tb в сравнении с мухами y1w1118, окрашивание Mzfpl выглядит сходным (наблюдается несколько ярких сайтов связывания в плечах хромосом, ряд менее выраженных сайтов связывания, есть окрашивание в центромерном районе), из чего мы сделали вывод, что сверхэкспрессия Mzfpl не влияет на специфичность связывания. Удаление домена MADF1 или связывающего CP190 участка не оказало заметного влияния на связывание с политенными хромосомами в сравнении с полным белком (Mzfp1WT-HA) (Рисунок 21). Удаление домена MADF2 вело к потере связывания белка в центромерном участке и усилению связывания в плечах хромосом. Мы полагаем, что это отражает перераспределение белка из перицентромерного гетерохроматина в эухроматиновые районы. Таким образом, домен MADF2 может участвовать в привлечении Mzfp1 к гетерохроматину. Вариант Mzfp1AZF-HA, в котором удалены цинковые пальцы 4-7 все равно явно присутствовал в некоторых эухроматиновых районах и в гетерохроматине. Можно предположить, что Mzfp1AZF-HA связывается с хроматином за счет белок-белковых взаимодействий. Также, MADF2 может отвечать за связывание с ДНК, компенсируя роль удаленных С2Н2-доменов. Чтобы определить роль доменов MADF, мы провели эксперименты по торможению ДНК-белковых комплексов в геле (EMSA). Мы экспрессировали фрагмент MADF1-MADF2 (100-434 а. о.) и фрагмент с кластером С2Н2-доменов (404-587 а. о.), клонированный в рамке с MBP. Только кластер С2Н2-доменов специфично связывался с Mzfp1 мотивами (Mzfp1x4) (Рисунок 13).

Oregon

Mzfpl [48-200]

Wt

ЛМ1

ЛМ2

Д42

AZF

Mzfpl [48-200]

совмещение

эпитоп ha

Рисунок 21. Распределение Mzfp1 на политенных хромосомах из личиночных слюнных желез в мухах дикого типа (Oregon) и вариантов Mzfp1-HA (wt (Mzfplwt-HA), А42 (Mzfp1A42-HA), AMI (Mzfp AM1-HA), AM2 (Mzfp AM2-HA) и AZF (Mzfpl AZF-HA)) в соотвествующих линиях. На

фотографиях приведено совмещение окрашивания ДНК по DAPI (синий) с иммуноокрашиванием Mzfp1 кроличьми анти-Mzfp! антителами (зеленый) и эпитопа HA мышиными анти-HA (пурпурный)— как указано в методах. Красной стрелкой выделено окрашивание перицентромерного гетерохроматина. Зеленой стрелкой указаны одиночные сайты, в которых сохраняется связывание производной Mzfp1AZF (Sokolov et al., 2024).

В совокупности эти результаты позволяют сделать вывод о том, что все исследованные нами участки белка (C-концевой С2Н2-доменов, оба MADF-домена, и участок CP190-взаимодействующий участок 152-193 а.о.) необходимы для функционирования белка.

Чтобы изучить роль отдельных доменов Mzfp1 в специфическом привлечении к различным классам геномных элементов, мы, используя ChIP-seq, сравнили связывание различных вариантов Mzfp1 в хроматине из взрослых мух (CG1603attP/CyO; Ubi:Mzfp1*/ TM6,Tb где * - wt, A42, AZF, AM1, AM2). Как было показано ранее, ни одна производная, кроме Ubi:Mzfp1wt не восстанавливает жизнеспособность мутации mfzpl. Таким образом, пришлось исследовать связывание производных Mzfp1 при их гиперэкспрессии на фоне экспрессии Mzfp1 дикого типа. Поэтому мы выполнили ChIP-seq с взрослых мух линии y1w1118 и со взрослых мух

3.6 Функциональная роль доменов Mzfp1

CG1603attP/CyO; Ubi:Mzfp1wt/ TM6,Tb с крысиными антителами анти-Mzfpl и анти-HA. В результате ChIP-seq хроматина линии с гиперэкспрессией Mzfpl антителами анти-Mzfpl и хроматина линии дикого типа мы идентифицировали 1684 и 1666 пиков соответственно, из них общих 1345. Это свидетельствует о том, что при гиперэкспрессии Mzfpl эффективность и специфичность связывания остается близкой к наблюдаемой в линии дикого типа. В результате ChIP-seq хроматина линии CG1603attP/CyO; Ubi:Mzfp1wt/ TM6,Tb с антителами анти-HA были выявлены те же пики, что и с антителами анти-Mzfpl.

Затем мы сравнили характер связывания производных Mzfp1wt-HA, Mzfp1AM2-HA, MzfplA42-HA, MzfplAZF-HA, проведя ChIP-seq хроматина соответствующих линий при помощи антител анти-HA и анти-Mzfpl. Мы не нашли достоверных пиков в хроматине линии MzfplAZF-HA, в отличие от линий с экспрессией прочих производных, что подтверждает критическую роль C-концевого кластера цинковых пальцев в специфическом связывании Mzfpl с хроматином. Наблюдаемое при этом заметное содержание MzfplAZF-HA в перицентромерном гетерохроматине политенных хромосом (Рисунок 2l) можно объяснить взаимодействием MzfplAZf-HA с белками гетерохроматина без прямого связывания с ДНК. Варианты MzfplAM2-HA, MzfplA42-HA и Mzfplwt-HA связываются с сайтами в эухроматине со сходной эффективностью. Однако, есть сайты, которые эффективно связываются только одним вариантом белка. Такие пики в основном располагались в эухроматиновых промоторах.

Анализ данных ChIP-seq позволил нам изучить роль доменов Mzfpl в специфическом привлечении Mzfpl к различным классам геномных элементов. Исходя из полученных нами данных можно сделать вывод, что C-концевой кластер С2Ж-доменов критичен для специфического связывания Mzfpl с хроматином, в то время как СР!90-взаимодействующий участок и MADF2-домен связываются с белками-партнерами и влияют на эффективность связывания Mzfpl с определенными группами участков генома.

3.7 Активность проксимальной части границы Fub обеспечивается совместной

работой Mzfp1, Pita и Su(Hw)

Мы обнаружили одиночный пик Mzfpl с мотивом связывания Mzfpl в проксимальной части границы Fub (Front-ultraabdominal). Эта граница изолирует домены bithoraxoid/postbithoraxoid (bxd/pbx) и infraabdominal-2 (iab-2). Домен bxd/pbx контролирует ген Ubx в парасегменте 6 (ПС6) эмбрионов (сегмент Al во взрослых мухах), домен infraabdominal-2

(iab-2) контролирует abd-A в ПС7 (A2) комплекса Bithorax (Рисунок 22) (Bender and Lucas, 2013).

Рисунок 22. Анализ инсуляторной активности фрагмента F2411 и ее производных. Гены Ubx, abd-A и Abd-B показаны оранжевой, синей и зеленой стрелкой, соответственно. Регуляторные домены генов размечены соответствующим им цветом. Границы (Fab-1, Fub (Fab-2), Fab-3, Fab-4, Mcp, Fab-6, Fab-7 и Fab-8), которые разделяют сегмент-специфические регуляторные домены (abx/bx, bxd/pbx - регулируют Ubx, iab-2, iab-3 и iab-4 -abd-A, iab-5, iab-6, iab-7 и iab-8,9 - Abd-B) обозначены вертикальными черными черточками. Ниже изображена схема делеции F2attP. Два сайта гиперчувствительности к ДНКзе I в составе границы Fub обозначены серыми прямоугольниками. Проксимальная часть инсулятора в составе границы Fub, F2411, обозначена оранжевой полоской, на ней овалами обозначены сайты связывания белков - Mzfpl (пурпурный овал), Pita (синий овал), Su(Hw) (зеленый овал). Дистальная часть инсулятора - F2177 показана желтой полоской, на ней овалами обозначены сайты связывания белков -Su(Hw) (зеленый овал), dCTCF (красный овал). Инактивированные сайты обозначены, как стертые участки на месте соответствующих сайтов связывания. Точки разрыва хромосомы при делеции F2attP обозначены разрывом в черной линии. Фрагменты F2411, использованные в эксперименте, и фенотип линий с интеграцией этих фрагментов в геном (в делеции F2attp и Fab-7attp50 ) показаны в нижней части схемы. (+) - фрагмент имеет инсуляторную активность; (-) фрагмент не имеет инсуляторной активности (±) - фрагмент имеет частичную инсуляторную активность (Sokolov et al., 2024).

Делеция Fub размером в 4328 п. н. приводит к эктопической экспрессии abd-A в ПС6, что приводит к трансформации сегмента A1 в A2 (Bender and Lucas, 2013). Делеция захватывает два сайта гиперчувствительности к ДНКзе I, один из которых (HSFub) включает в себя сайты, соответствующие мотивам Pita, Su(Hw), Mzfpl (Adryan et al., 2007; Maksimenko et al., 2015),

наличие пиков связывания в этом сайте подтверждается литературными данными (Kyrchanova et al., 2017; Nègre et al., 2011).

Гомозиготы F2attp имели низкую жизнеспособность, были стерильны, и имели сильные фенотипические изменения (Рисунок 23). В эмбрионах F2attp экспрессия abd-A наблюдалась в ПС6, что отражает эктопическую активацию энхансеров iab-2 доменом bxd/pbx (Рисунок 25). Мы протестировали проксимальную часть HSFub длиной 411 п. н. (F2411), которая содержит сайт связывания Mzfp1 и двух других архитектурных белков Pita и Su(Hw).

wt FTnP F?11

F2^p Ffs

Рисунок 23. Анализ функциональной роли Mzfp1, Su(Hw) и Pita в активности F2411, вставленного вместо границы Fab-7. На представленных кутикулярных препаратах видна морфология брюшных сегментов A1 и A2 (номера сегментов указаны) мух линий с различными аллелями границы Fub. У мух дикого типа (wt, линия Oregon) стернит сегмента A1 отсутствует; тергит имеет характерную форму, утончаясь в центральной части, не имеет длинных щетинок. A2 в диком типе имеет четырехугольный стернит с вертикально ориентированными щетинками и тергит с окрашенной полосой и длинными щетинками. У мух с делецией F2attp тергит A1 шире, покрыт щетинками и его задний край пигментирован; стернит А1 покрыт щетинками и волосками, то есть, сегмент A1 приобретает морфологические признаки A2. Признаки трансформации A1 ^ A2 указаны красными стрелками (Sokolov et al., 2024).

Мы подтвердили связывание Pita, Su(Hw), Mzfp1 с соответствующими сайтами в F2411 методом EMSA. Удаление сайтов связывания вело к потере связывания белка с мотивом связывания (Рисунок 24). Интеграция F2411 в F2attp полностью восстанавливает фенотип дикого

типа, что позволяет предположить, что проксимальная часть длиной 411 п. н. позволяет заменить границу Fub (Рисунок 23).

Рисунок 24. Связывание Mzfp1, Pita, и Su(Hw) с F2411 и его производными in vitro. EMSA было выполнено с белками Mzfpl, Pita, и Su(Hw) (A, Б и В соответственно), клонированными в рамке с MBP и с собственно MBP в качестве контроля. В качестве ДНК-зондов использовали F2411, и его производные с делецией сайтов связывания этих белков (F2AM, F2AP, F2AS). ДНК-зонды, маркированные Cy5 обозначены красным, маркированные FAM обозначены зеленым. Граница Fab-8 лишена связывания с Mzfpl, согласно данным ChIP-seq, и поэтому фрагмент F8337 используется в качестве негативного контроля. Звездочка обозначает неспецифическое связывание фрагмента белком, происходящее при избыточной концентрации белка (Sokolov et al., 2024).

В эмбрионах при этом не наблюдается экспрессия abd-A в ПС6 (Рисунок 25), что подтверждает функционирование F2411 на всех стадиях развития. Затем мы исследовали вклад белков в функционирование границы F2411 путем введения одиночных и двойных делеций сайтов связывания. Делеции Su(Hw) (F2AS) или Mzfp1 (F2AM) не влияли на функционирование границы F2411 (Рисунок 23). Делеция сайта Pita вела к легкому крыловому фенотипу. Одновременное удаление сайтов двух белков в любой комбинации вело к нарушению функционирования F2411 в качестве границы. Мы наблюдали сильную трансформацию сегмента

А1 в копию А2 у мух с интеграцией фрагментов с парными делециями. Однако, фертильность и жизнеспособность не претерпевали значительного снижения. Соответственно, при этом наблюдалась умеренная активация abd-A в ПС6 (Рисунок 25).

Wf р2пР F2*11 F?P F?s F?M FtmP F?ms F?P&S

aícf-A

Рисунок 25. Экспрессия гена abd-A в эмибрионах линии F2attP, различных производных этой линии и диком типе. На каждом снимке представлен эмбрион на 14 стадии, окрашенный антителами к белку Abd-B (пурпурный). Зеленой линией обозначена граница между ПС6 и ПС7, примерно соответствующим сегментам A1 и A2. Желтыми стрелками указана эктопическая экспрессия abd-A. Парасегменты пронумерованы. Возле эмбриона дикого типа (крайний левый) приведено примерное соответствие эмбриональных парасегментов (ПС5-14) сегментам взрослой мухи (Т3, А1-7). В эмбрионах дикого типа abd-A неактивен в ПС5 и ПС6, и активен в ПС7-ПС12. В эмбрионах F2attP экспрессия abd-A обнаруживается в ПС6 (Sokolov et al., 2024).

По литературным данным, ChIP-Seq в эмбрионах в Fub наблюдаются четкие пики обогащения белков Mzfpl, Pita, Su(Hw), и CP190. Чтобы подробнее изучить их профиль связывания, мы выполнили qChIP-PCR с хроматина взрослых мух. Мы проанализировали связывание Mzfpl, Pita, Su(Hw), и CP190 с F2411, F2AS, F2AM, F2AP, F2APAS ,F2AMAP и F2AMAS. Результаты подтвердили, что Mzfpl, Pita, Su(Hw), и CP190 связывают фрагмент F2411 in vivo (Рисунок 26). Делеция сайта связывания Mzfpl повлияла значительно только на связывание Su(Hw) (Рисунок 26). Связывание Pita и Su(Hw) оказалось взаимозависимо, что указывает на кооперативное связывание с инсулятором (Рисунок 26). Удаление сайта связывания Pita влияло на связывание Mzfpl, в то время как удаление сайта связывания Su(Hw) не оказывало значимого влияния на связывание Mzfpl (Рисунок 26). Совместное удаление сайтов связывания Su(Hw) и Pita сильно снизило связывание Mzfpl. Совместное удаление сайтов связывания Pita и Mzfpl сильно снизило связывание Su(Hw) (Рисунок 26).

Рисунок 26. Связывание Pita, Su(Hw), Mzfp1, и CP190 с F2411, F2am, F2ap, F2as, F2amap, F2amas, и F2apas. Результаты иммунопреципитации хроматина представлены в виде доли количества ДНК до иммунопреципитации, нормализованной по отношению к положительному сайту в геноме. Столбики ошибок означают стандартное отклонение в выборке из всех повторностей (Sokolov et al., 2024).

Мы обнаружили, что граничная функция разных вариантов F2411 была прямо связана с эффективностью привлечения CP190 к фрагменту (Рисунок 26). Привлечение CP190 сильно зависит от связывания Pita, но не Su(Hw) и Mzfpl. Даже при одновременном удалении сайтов связывания Su(Hw) и Mzfpl привлечение CP190 снижалось лишь частично. Эти результаты объясняют, почему инактивация Pita имела более выраженное влияние на активность границы в сравнении с инактивацией мотивов Su(Hw) и Mzfpl.

Для подтверждения наших результатов, мы изучили активность инсулятора F2411 и его производных в другой модельной системе (Рисунок 27). В линии Fab-7attP50 граница Fab-7 замещена attP сайтом (Wolle et al., 2015). Граница Fab-7 блокирует взаимодействие между регуляторными элементами доменов iab-6 и iab-7, будучи, таким образом, необходимой для поддержания паттерна экспрессии Abd-B в парасегментах ПС11 и ПС12, соответственно. Удаление границы Fab-7 вызывает перекрестную активацию регуляторных доменов iab-6 и iab-7, что приводит к фенотипу GOF, трансформации ПС11 в ПС12 (Gyurkovics et al., 1990; Karch et al., 1994; Mihaly et al., 1997). Фенотип GOF - результат активации домена iab-7 в ПС11 (A6), ведущего к гиперэкспрессии Abd-B в этом сегменте и морфологической трансформации A6 в A7 (Рисунок 27).

Рисунок 27. Морфология брюшных сегментов самцов в линиях с заменой Fab-7.

Красными стрелками указаны характерные особенности морфологии сегмента A6, демонстрирующие потерю инсуляторной функции. В линии с интеграцией Pita5 тергиты сегментов A5 и A6 имеют сходную

прямоугольную форму и пигментированы, в то время, как A7 не создает видимых кутикулярных структур. В линии Fab-7a"P5° (делеция границы) сегмент A6 отсутствует и A6^-A7. Инсерция F2411 в Fab-7attP5° восстанавливает функцию границы: взрослые самцы имеют сегмент A6, сходный с A5. Такой фенотип свидетельствует о том, что интегрированный фрагмент имеет нормальную

инсуляторную функцию. Сходные результаты были получены в случае F2AM и F2AS. Производная F2AP

не полностью восстанавливала инсуляторную функцию: порядка 50% самцов имели перетяжку на тергите A6, что свидетельствует о дисфункции в некоторых клетках сегмента А6. При интеграции производных F2AMáP и F2apas инсуляторная активность практически целиком теряется; у самцов почти целиком отсутствуют структуры сегмента A6 (в некоторых случаях имеется рудиментарный тергит). В случае F2AMAS наблюдалась частичная инактивация инсуляторной функции у самцов: размер сегмента A6 был уменьшен в сравнении с сегментом А5 (Sokolov et al., 2024).

Мы задались вопросом, может ли F2411 функционировать, как граница вместо удаленной последовательности Fab-7. Фенотипический анализ кутикулы взрослых самцов F2411 показал, что элемент F2411 полностью блокировал перекрестную активацию доменов iab-6 и iab-7 (Рисунок 27). Для того, чтобы изучить вклад Mzfpl, Su(Hw), и Pita в граничную функцию, мы заменили Fab-7 мутантными вариантами F2411 с делецией одного или обеих сайтов связывания. Как и ожидалось, удаление сайтов Mzfpl или Su(Hw) не влияло на граничную активность, в то время как удаление сайта Pita повело к умеренному GOF фенотипу, что говорит о частичной инактивации граничной функции. Двойная мутация в Pita и Mzfpl или Pita и Su(Hw) полностью устраняла граничную активность. Напротив, делеция сайтов связывания Su(Hw) и Mzfpl вела лишь к мягкому GOF фенотипу. Эти результаты подтверждают, что сайт связывания Pita

критичен для активности фрагмента F2411, а Su(Hw) и Mzfpl имеют меньший вклад в функции границы.

3.8 Делеция гена piragua не имеет мутантного фенотипа

Белок Fu2 (кодируется геном piragua, CG9233) потенциально является архитектурным С2Н2-белком, по литературным данным, важен для развития D. melanogaster. Белок содержит N-концевой ZAD-домен и два кластера цинковых пальцев С2Н2-типа из 6 и 3 доменов, что сближает его по структуре с описанными архитектурными С2Н2-белками, такими, как Pita, ZIPIC, Z4 (Bonchuk and Georgiev, 2024; Maksimenko et al., 2015). Согласно литературным данным, с помощью мутагенеза, опосредованного мобилизацией Р-элемента, были получены мутации piragua, которые значительно снижали количество белка Fu2 и приводили к летальности на разных стадиях развития от эмбриогенеза до 1-2 стадии личинки (Nazario-Yepiz and Riesgo-Escovar, 2017). Был сделан вывод о том, что Fu2 нужен в процессе формирования имагинальных дисков и кутикулы. Данные, полученные методом РНК-интерференции (Rhiner et al., 2010), указывают на роль данного белка в клеточной конкуренции, опосредованной flower. РНК-интерференция под контролем драйвера pannier приводила к нехватке щетинок, дефектам пигментации и смерти на стадии куколки (Mummery-Widmer et al., 2009). При помощи CRISPR/Cas9 опосредованной гомологической рекомбинации мы получили линию с делецией размером 1770 п. н., имеющую координаты 2L:8464499..8466269 в референсном геноме R6.40 (Рисунок 28). Полученная делеция оказалась жизнеспособной и морфологически соответствовала мухам дикого типа. Это резко отличается от фенотипа мутации, полученной путем ремобилизации транспозонов (Nazario-Yepiz and Riesgo-Escovar, 2017), а также результатов, наблюдавшимся при РНК-интерференции под драйвером pannier (Mummery-Widmer et al., 2009). Мы полагаем, что эти описанные в литературе фенотипы являются артефактами использованных методов.

А

Fu2

0 100 200 300 400 500

1_i_i_i_i_i_

цинковые

__I— пальцы —i

«—МЮШО-ММ—

Agpat2'

piragua (fu2, CG9233)

5'плечо

fu2

>attPR+

t

dachs

dsRed

^»"attP loxP

loxP

3'плечо гомологическая рекомбинация

фСЗ 1 -индуцированная attB/attP-интеграция

т-

attL

i>= attL

piragua/fu2

■fr

white

dsRed

X

piragua/fu2

НАхЗ-маг

IdxP yellow attR

-Da

......................loxP

CRE/lox-рекомбинация

loxP

Рисунок 28. Схема получения делеции и восстановления гена piragua. А. Доменная структура белка Fu2. На схеме указан ZAD-домен и два кластера С2Н2-доменов. Цифрами обозначены координаты в аминокислотах. Б. Кодирующие участки гена piragua (fu2, CG9233) обозначены желтыми прямоугольниками, серыми прямоугольниками отмечены некодирующие транслируемые участки. Узкими вертикальными красными прямоугольниками отмечены CRISPR-мишени. Белыми горизонтальными прямоугольниками обозначены фрагменты, использованные в качестве плеч для гомологичной рекомбинации. Черными флажками обозначены промоторы генов. Серыми прямоугольником обозначен промотор hsp70. Три розовых кружка обозначают сайты связывания pax6. Красной стрелкой обозначены маркерные гены (dsRed, yellow, white). Черной горизонтальной полоской обозначен терминатор SV40. Оранжевыми треугольниками обозначены lox-сайты. Белым треугольником обозначен attP-сайт, и рекомбинантные сайты attL и attR. Тремя красными кругами обозначен HA *3-таг. (Соколов et al., 2021).

Мы получили линию, экспрессирующую Fu2, слитый с эпитопом HA, которая в дальнейшем позволит нам исследовать профиль связывания Fu2 в геноме. Для этого мы клонировали геномную область, включающую ген piragua, в вектор c репортерными генами mCherry и yellow. В ходе отбора трансформантов с интеграцией конструкции, восстанавливающей ген piragua, оказалось, что репортер mini-yellow в геномном районе piragua не экспрессируется. Вследствие этого, отбор производили по флуоресценции mCherry. С помощью Сге-опосредованной рекомбинации по lox-сайтам все репортерные гены были удалены и получена линия fu2-HA. Для подтверждения экспрессии меченого эпитопом белка был произведены вестерн-блот анализ с антителами к HA-тагу с лизатом из взрослых самок и из эмбрионов линии fu2-HA (Рисунок 29).

Рисунок 29. Исследование полученных линий. А. Флуоресценция мух линии fu2attPR+. У молодых мух наблюдается интенсивная флуоресценция в 4 и следующих брюшных сегментах. Со временем она угасает, и остается слабая флуоресценция участка в 6-7 сегменте брюшка. Снимки получены на микроскопе Leica. Б. Экспрессия тагированного белка Fu2-HA. Слева - белковые экстракты, выделенные из мух линий fu2attPR+, fu2-HAR+, fu2-HA, справа - белковые экстракты, выделенные из эмбрионов линии fu2-HA (Соколов et al., 2021).

Белок преимущественно присутствует в эмбрионах, что соответствует доступным данным относительно экспрессии гена piragua (Larkin et al., 2021). Так как экспрессия dsRed в полученной линии находится под контролем регуляторных элементов piragua, то сигнал dsRed должен отражать локализацию экспрессии piragua в организме. Оказалось, что репортер помимо глаз преимущественно активируется задних брюшных сегментах (А2 - А6), причем экспрессия затухает у взрослых мух в течение 3 дней (Рисунок 29).

Обсуждение Mzfp1 и Fu2 - новые архитектурные белки

Белки с доменами типа "цинковые пальцы" являются самой многочисленной группой транскрипционных факторов у высших эукариот (Fedotova et al., 2017). Примером подобного фактора является хорошо изученный белок млекопитающих CTCF, играющий большую роль в формировании хромосомной архитектуры (Maksimenko et al., 2021). D. melanogaster имеет гомологичный ему белок dCTCF, а также ряд прочих белков, вместе с dCTCF участвующих в функционировании регуляторных элементов и, предположительно, поддержании дистанционных взаимодействий между ними (Kyrchanova and Georgiev, 2021; Maksimenko et al., 2021). Такие белки, называемые архитектурными (так как они поддерживают архитектуру хроматина), обычно имеют кластеры доменов "цинковые пальцы" С2Н2-типа, разделенных консервативным линкером. Такие кластеры позволяют связывать мотивы длиной 12-15 п. н. (Maksimenko et al., 2021).

Согласно предложенной в нашей лаборатории модели, архитектурные С2Н2-белки участвуют в организации инсуляторов и промоторов (Kyrchanova et al., 2022). У D. melanogaster большая часть архитектурных С2Н2-белков имеет на N-конце ZAD-домены, которые обеспечивают гомодимеризацию. Ранее было показано, что ZAD-домены участвуют в обеспечении дистанционных взаимодействий С2Н2-белков (Bonchuk et al., 2021).

Белок Mzfp1 имеет доменную структуру, отличающуюся от имеющейся у описанных архитектурных белков. Вместо типичного для С2Н2-белков N-концевого ZAD-домена он имеет N-концевой С2Н2-домен. В центральной части Mzfp1 находится два MADF-домена, и на C-конце расположен кластер состоящий из 6 С2Н2-доменов. Существует группа гомологов Mzfp1, обладающая сходной доменной структурой, в частности, достаточно часто гомологи этого белка представлены в видах группы Schizophora. Мы предполагаем, что консервативность такой доменной структуры свидетельствует о её важной роли. В некоторых транскрипционных факторах MADF-домены отвечают за специфическое ДНК-связывание (Lang and Juan, 2010). Ряд транскрипционных активаторов содержит MADF-домены с двумя функциями -специфическим связыванием с ДНК и взаимодействием с транскрипционными комплексами (Cutler et al., 1998; Shukla et al., 2014; Zimmermann et al., 2006).

Наше исследование показало, что C-концевой кластер С2Н2-доменов отвечает за высокоспецифичное связывание с длинным мотивом, преимущественно находящимся в регуляторных участках. Взаимодействие MADF-доменов Mzfp1 с ДНК обнаружить не удалось,

однако, оба домена важны для функционирования белка in vivo. Следовательно, можно предположить, что они нужны для белок-белковых взаимодействий. Можно предположить, MADF1 участвует в привлечении транскрипционных комплексов, подобно MADF-домену фактора Adfl (Cutler et al., 1998). MADF2 необходим для привлечения Mzfpl к гетерохроматину в результате взаимодействия с пока неидентифицированными гетерохроматиновыми белками. Интересно, что MADF имеется в белке Stonewall, участвующем в поддержании гетерохроматиновой репрессии (Maines et al., 2007), колокализующимся с инсуляторами и ассоциированными с ними архитектурными белками (Rohrbaugh et al., 2013; Zinshteyn and Barbash, 2022). Учитывая негативный заряд домена MADF2, можно также предположить, что он непосредственно связывается с неустановленным мотивом связывания ДНК. В таком случае, MADF2 домен может стабилизировать связывание с ДНК в дополнение к кластеру из 6 C2H2-доменов, подобно тому, как в случае белка CTCF млекопитающих 1-2 и 9-11 С2Н2-домены стабилизируют связывание С2Н2-доменов 2-7, связывая дополнительные сайты ДНК.

Mzfp1 преимущественно связывается с промоторами генов, расположенных как в эухроматине, так и в гетерохроматине. В наибольшей мере с ним колокализуются BEAF-32 и Pita. Эти белки могут кооперироваться для образования активных промоторов и совместного привлечения CP190. Известно, что мутации, нарушающие взаимодействие dCTCF и Pita с CP190 не влияют на связывание CP190 в промоторах, имеющих сайты связывания соответствующих белков (Sabirov et al., 2021a). Эти результаты согласуются с моделью, согласно которой промоторы имеют мотивы для нескольких архитектурных С2Н2-белков, которые взаимодействуют с CP190.

Нам удалось установить, что Mzfp1 взаимодействует с CP190 - белком-партнером всех известных архитектурных белков, задействованным во множестве процессов, связанных с регуляцией транскрипции: привлечении транскрипционных комплексов, создании участков открытого хроматина, дистанционными взаимодействиями, и функционировании инсуляторов (Bartkuhn et al., 2009; Liang et al., 2014; Melnikova et al., 2018; Mohan et al., 2007; Vogelmann et al., 2014). Мы определили два неструктурированных участка Mzfp1, взаимодействующие с CP190 - 152-194 а. о. и 292-320 а. о. Мы установили, что со стороны CP190 за взаимодействие отвечают участки 152-194 а. о., 292-320 а.о. Другие архитектурные С2Н2-белки (M1BP, ZIPIC, Opbp) связываются с теми же участками CP190 (Golovnin et al., 2023). Эти белки участвуют в организации архитектуры промоторов генов "домашнего хозяйства" (Baumann and Gilmour, 2017; Li and Gilmour, 2013; Maksimenko et al., 2015; Zolotarev et al., 2017). Наши результаты позволяют предположить, что эти два участка связываются с CP190 независимо друг от друга,

поскольку удаление одного из них (161-194 а. о.) ведет к значительной, но не полной утрате взаимодействия между Mzfpl (вариант Mzfp1M2-HA) и CP190 in vivo.

Fu2 (кодируется геном piragua, CG9233) представляет собой белок с двумя кластерами цинковых пальцев С2Н2-типа из 3 и 6 пальцев. Также Fu2 имеет на N-конце ZAD-домен, который отвечает за димеризацию. Белки с ZAD-доменом составляют значительную часть цинк-пальцевых белков в типе Членистоногие (Bonchuk et al., 2021; Chung et al., 2007). В геноме D. melanogaster белки, содержащие ZAD-домены составляют примерно треть всего числа C2H2-белков и одну десятую транскрипционных факторов (Chung et al., 2002). Среди изученных белков с ZAD-доменом можно выделить Pita, ZIPIC, Zw5, Z4 (putzig), ZAF1 (Maksimenko et al., 2020; Melnikova et al., 2021; Zolotarev et al., 2016).

Согласно литературным данным, мутации в гене piragua, кодирующем Fu2, полученные ремобилизацией P-элементов, значительно снижают количество белка Fu2 и приводят к летальности на разных стадиях развития от эмбриогенеза до 1-2 стадии личинки (Nazario-Yepiz and Riesgo-Escovar, 2017). Был сделан вывод, что Fu2 нужен в процессе формирования имагинальных дисков и кутикулы. РНК-интерференция под контролем драйвера pannier приводила к нехватке щетинок, дефектам пигментации и смерти на стадии куколки (Mummery-Widmer et al., 2009). Однако нами было показано, что делеция не имеет мутантного фенотипа. Расхождение с литературными данными можно объяснить возникновением дополнительных мутаций в результате ремобилизации P-элемента, которые ответственны за мутантный фенотип независимо или в комбинации с мутациями в гене piragua.

Отсутствие мутантного фенотипа при инактивации Fu2 можно объяснить избыточностью функций данного архитектурного С2Н2-белка: многие гены, кодирующие С2Н2-белки, возникли в процессе эволюции сравнительно недавно путем дупликации, и поэтому имеют дублирующие функции в регуляции экспрессии генов D. melanogaster.

Организация границ Bithorax-комплекса требует кооперативной работы архитектурных ClHl-белков

Наши результаты показали, что Mzfp1 совместно с Pita и Su(Hw) играют роль в инсуляторной функции проксимальной части границы Fub. Эта граница разделяет BX-C на два ТАДа (Savitsky et al., 2016; Schuettengruber et al., 2014). Fub находится между доменами bxd/pbx и iab-2 (Bender and Lucas, 2013; Bowman et al., 2014). При удалении границы Fub bxd/pbx инициаторы активируют iab-2 в ПС6 (Bender and Lucas, 2013). Инсулятор, находящийся в

границе Fub, принято делить на дистальную и проксимальную части. Эти части разделены точкой интеграции транспозона jockey, присутствующего в некоторых линиях. Эти две части функционально избыточны, как проксимальная часть длиной 411 п. н., так и фрагмент дистальной части длиной в 177 п. н. выполняют роль инсуляторов при интеграции в эндогенное положение (F2attp) и вместо другой границы (Fab7attP50) (Kyrchanova et al., 2020). Fub411 содержит мотивы связывания Su(Hw), Pita, Mzfpl. Сильно влияет на граничную функцию фрагмента Fub411 только удаление мотива Pita. Присутствие белка Pita на границе необходимо для связывания Su(Hw) и Mzfpl, в то время, как привлечение Pita к границе зависит от Su(Hw) лишь частично и не зависит от Mzfpl. Даже одновременная инактивация мотивов Mzfpl и Su(Hw) ограниченно влияет на связывание Pita на фрагменте Fub411.

Кроме того, Pita играет критическую роль в привлечении CP190 к Fub411. При этом непосредственно взаимодействие Pita с CP190 играет критическую роль в привлечении последнего к сайтам связывания Pita лишь в небольшом числе случаев (Sabirov et al., 2021a). Следовательно, Pita реализует свою функцию по привлечению CP190 к сайтам связывания опосредованно, путем обеспечения связывания других архитектурных белков. Привлечение CP190 важно для инсуляторной функции границ (Cavalheiro et al., 2023; Kahn et al., 2023; Sabirov et al., 2021a). Поскольку даже двух сайтов связывания Pita самих по себе недосточно для формирования функционального инсулятора даже при наличии HS3 границы Fab-7 (Wolle et al., 2015), вероятно, есть некие неизвестные белки, связывающиеся с Fub411, действующие кооперативно с Pita.

Совместно эти результаты показывают, что Mzfp1 кооперирует с M1BP и Pita в формировании активных промоторов, и может кооперировать с Pita и Su(Hw) при формировании инсуляторов. Поскольку одни и те же архитектурные белки участвуют в формировании промоторов и инсуляторов, этот результат указывает на возможное объяснение того, почему промоторы могут функционировать как инсуляторы, что было показано в некоторых работах (Arzate-Mejía et al., 2020; Bag et al., 2021; Cavalheiro et al., 2023; Chopra et al., 2009; Ohtsuki and Levine, 1998). Полученные результаты соответствуют модели, в которой регуляторные элементы формируются архитектурными белками, которые связываются в определенной комбинации с сайтами на регуляторном элементе, и привлекают к нему белки-партнеры. Этот принцип верен как для границ комплекса Bithorax, так и для промоторов генов. Представители класса архитектурных белков участвуют как в организации промоторов, так и границ. Границы комплекса Bithorax включают в себя сайты связывания известных белков -Pita, Su(Hw), dCTCF, Mzfp1, однако объяснить их функции связыванием исключительно этих

белков не удается. Мы предполагаем, что в организации границ участвуют пока не установленные архитектурные белки. Значение сайтов тех или иных белков может варьировать в зависимость от границы, однако, некоторые белки - такие, как Pita, являются пионерными и нужны для связывания прочих белков. Mzfpl пионерным не является и имеет в контексте границы Fub другие функции, в частности, кооперирует с белком Su(Hw) при связывании с границей. Белок Fu2 оказался не жизненно важным, а его делеция — не имеющей фенотипа, что может свидетельствовать о том, что его функции компенсируются функцией других архитектурных белков.

Выводы

1 Продемонстрировано, что белок Mzfpl важен в процессе развития D. melanogaster: ноль-аллели по гену mzfp1 летальны, гомозиготы доживают до 2 личиночной стадии.

2 Установлено, что большая часть сайтов связывания белка Mzfpl в геноме D. melanogaster находится в промоторах генов. Всего картировано более 800 сайтов связывания белка Mzfpl.

3 Показано, что белок Mzfpl взаимодействует с CP190 посредством участков 161-194 а. о. и 294-319 а. о. Со стороны CP190 во взаимодействии задействованы участки 210-245 а. о. и 309-390 а. о. При этом участок Mzfp1 161-194 а. о. взаимодействует с обоими участками CP190, а 293-319 а. о. только с 210-245 а. о. Участок Mzfp1 161-194 а. о. необходим для функционирования белка и способствует связыванию Mzfp1 с промоторами.

4 Показано, что Mzfp1 специфически связывает ДНК за счет C-концевого кластера C2H2-доменов. Оба MADF-домена и кластер С2Н2-доменов являются необходимыми для функционирования Mzfp1. MADF-домен 320-413 а. о. играет вспомогательную роль в специфическом связывании с хроматином. MADF-домен 320-413 а. о. играет роль в привлечении Mzfp1 к гетерохроматину.

5 Установлено, что белок Mzfp1 участвует в функционировании проксимального участка границы Fub F2411 в кооперации с белками Pita и Su(Hw).

6 Продемонстрировано, что делеция гена piragua, кодирующего белок Fu2 не влияет на жизнеспособность и фенотип D. melanogaster.

Список литературы

1 Adryan, B., Woerfel, G., Birch-Machin, I., Gao, S., Quick, M., Meadows, L., Russell, S. and White, R. (2007). Genomic mapping of Suppressor of Hairy-wing binding sites in Drosophila. Genome Biol 8, R167.

2 Andersson, R. and Sandelin, A. (2020). Determinants of enhancer and promoter activities of regulatory elements. Nat Rev Genet 21, 71-87.

3 Aoki, T., Schweinsberg, S., Manasson, J. and Schedl, P. (2008). A stage-specific factor confers Fab-7 boundary activity during early embryogenesis in Drosophila. Mol Cell Biol 28, 1047-1060.

4 Arai, R., Ueda, H., Kitayama, A., Kamiya, N. and Nagamune, T. (2001). Design of the linkers which effectively separate domains of a bifunctional fusion protein. Protein Eng 14, 529-532.

5 Arzate-Mejía, R. G., Recillas-Targa, F. and Corces, V. G. (2018). Developing in 3D: the role of CTCF in cell differentiation. Development 145, dev137729.

6 Arzate-Mejía, R. G., Josué Cerecedo-Castillo, A., Guerrero, G., Furlan-Magaril, M. and Recillas-Targa, F. (2020). In situ dissection of domain boundaries affect genome topology and gene transcription in Drosophila. Nat Commun 11, 894.

7 Bag, I., Chen, S., Rosin, L. F., Chen, Y., Liu, C.-Y., Yu, G.-Y. and Lei, E. P. (2021). M1BP cooperates with CP190 to activate transcription at TAD borders and promote chromatin insulator activity. Nat Commun 12, 4170.

8 Barges, S., Mihaly, J., Galloni, M., Hagstrom, K., Müller, M., Shanower, G., Schedl, P., Gyurkovics, H. and Karch, F. (2000). The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-7 domain and insulates iab-7 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain. Development 127, 779-790.

9 Bartkuhn, M., Straub, T., Herold, M., Herrmann, M., Rathke, C., Saumweber, H., Gilfillan, G. D., Becker, P. B. and Renkawitz, R. (2009). Active promoters and insulators are marked by the centrosomal protein 190. EMBO J28, 877-888.

10 Bateman, J. R., Lee, A. M. and Wu, C. -ting (2006). Site-specific transformation of Drosophila via phiC31 integrase-mediated cassette exchange. Genetics 173, 769-777.

11 Batut, P. J., Bing, X. Y., Sisco, Z., Raimundo, J., Levo, M. and Levine, M. S. (2022). Genome organization controls transcriptional dynamics during development. Science 375, 566-570.

12 Baumann, D. G. and Gilmour, D. S. (2017). A sequence-specific core promoter-binding transcription factor recruits TRF2 to coordinately transcribe ribosomal protein genes. Nucleic Acids Research 45, 10481.

13 Baxley, R. M., Bullard, J. D., Klein, M. W., Fell, A. G., Morales-Rosado, J. A., Duan, T. and Geyer, P. K. (2017). Deciphering the DNA code for the function of the Drosophila polydactyl zinc finger protein Suppressor of Hairy-wing. Nucleic Acids Res 45, 4463-4478.

14 Belozerov, V. E., Majumder, P., Shen, P. and Cai, H. N. (2003). A novel boundary element may facilitate independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila. The EMBO journal 22, 3113-3121.

15 Bender, W. and Lucas, M. (2013). The border between the ultrabithorax and abdominal-A regulatory domains in the Drosophila bithorax complex. Genetics 193, 1135-1147.

16 Bergman, D. T., Jones, T. R., Liu, V., Ray, J., Jagoda, E., Siraj, L., Kang, H. Y., Nasser, J., Kane, M., Rios, A., et al. (2022). Compatibility rules of human enhancer and promoter sequences. Nature 607, 176-184.

17 Bischof, J., Maeda, R. K., Hediger, M., Karch, F. and Basler, K. (2007). An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific ^C31 integrases. PNAS 104, 3312-3317.

18 Blackledge, N. P. and Klose, R. J. (2021). The molecular principles of gene regulation by Polycomb repressive complexes. Nat Rev Mol Cell Biol 22, 815-833.

19 Blobel, G. A., Higgs, D. R., Mitchell, J. A., Notani, D. and Young, R. A. (2021). Testing the super-enhancer concept. Nat Rev Genet 22, 749-755.

20 Boija, A., Mahat, D. B., Zare, A., Holmqvist, P.-H., Philip, P., Meyers, D. J., Cole, P. A., Lis, J. T., Stenberg, P. and Mannervik, M. (2017). CBP regulates recruitment and release of promoter-proximal RNA polymerase II. Mol Cell 68, 491-503.e5.

21 Bonchuk, A. N. and Georgiev, P. G. (2024). Drosophila Protein Z4 Possesses ZAD Dimerization Domain. DoklBiolSci 518, 133-136.

22 Bonchuk, A., Denisov, S., Georgiev, P. and Maksimenko, O. (2011). Drosophila BTB/POZ Domains of "ttk Group" Can Form Multimers and Selectively Interact with Each Other. Journal of Molecular Biology 412, 423-436.

23 Bonchuk, A., Maksimenko, O., Kyrchanova, O., Ivlieva, T., Mogila, V., Deshpande, G., Wolle, D., Schedl, P. and Georgiev, P. (2015). Functional role of dimerization and CP190 interacting domains of CTCF protein in Drosophila melanogaster. BMC Biol 13, 63.

24 Bonchuk, A., Kamalyan, S., Mariasina, S., Boyko, K., Popov, V., Maksimenko, O. and Georgiev, P. (2020). N-terminal domain of the architectural protein CTCF has similar structural organization and ability to self-association in bilaterian organisms. Sci Rep 10, 2677.

25 Bonchuk, A., Boyko, K., Fedotova, A., Nikolaeva, A., Lushchekina, S., Khrustaleva, A., Popov, V. and Georgiev, P. (2021). Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila. Nucleic Acids Res 49, 2375-2389.

26 Bonchuk, A. N., Boyko, K. M., Nikolaeva, A. Y., Burtseva, A. D., Popov, V. O. and Georgiev, P. G. (2022). Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity. Structure 30, 1004-1015.e4.

27 Bonchuk, A., Balagurov, K. and Georgiev, P. (2023). BTB domains: A structural view of evolution, multimerization, and protein-protein interactions. Bioessays 45, e2200179.

28 Bowman, S. K., Deaton, A. M., Domingues, H., Wang, P. I., Sadreyev, R. I., Kingston, R. E. and Bender, W. (2014). H3K27 modifications define segmental regulatory domains in the Drosophila bithorax complex. Elife 3, e02833.

29 Bushey, A. M., Ramos, E. and Corces, V. G. (2009). Three subclasses of a Drosophila insulator show distinct and cell type-specific genomic distributions. Genes Dev 23, 1338-1350.

30 Busturia, A., Lloyd, A., Bejarano, F., Zavortink, M., Xin, H. and Sakonju, S. (2001). The MCP silencer of the Drosophila Abd-B gene requires both Pleiohomeotic and GAGA factor for the maintenance of repression. Development 128, 2163-2173.