Детальное изучение механизмов формирования и функционирования Su(Hw) зависимых белковых комплексов в геноме Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Молодина Варвара Викторовна

• Молодина Варвара Викторовна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Молодина Варвара Викторовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

1. 1 Актуальность работы

1.2 Цель и задачи исследования

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы

1.4 Личный вклад соискателя

1.5 Положения, выносимые на защиту

1.6 Степень достоверности и апробация результатов

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Drosophila melanogaster как первый модельный объект для изучения инсуляторов

2.2 Модели, объясняющие механизм функционирования инсуляторов

2.3 Основные инсуляторные белки

2.4 Su(Hw)-зависимый комплекс как модель для изучения структуры и активности инсуляторов

2.5 Моделирование хроматиновых петель в трансгенных линиях D. Melanogaster

2.6 Прямое участие инсуляторов в энхансер-промоторных взаимодействиях

2.7 Роль инсуляторных белков в формировании ТАД

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. 1 Тестирование прямых взаимодействий между белками с помощью дрожжевой двугибридной системы (ДДС)

3.2 Соосаждение белков на глутатион сефарозе (GPD)

3.3 Western блоттинг

3.4 Коиммунопреципитация белков из лизата эмбриональных клеток дрозофилы S2

3.5 РНК-интерференция (RNAi) в S2 клетках

3.6 Иммуноокрашивание политенных хромосом

3.7 Иммунопреципитация хроматина (ChIP анализ)

3.7.1 Получение хроматинового экстакта

3.7.2 Иммунопреципитация хроматина

3.8 Генетические скрещивания и фенотипический анализ

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1 Идентификация доменов, ответственных за взаимодействие белков Su(Hw) зависимого комплекса друг с другом

4.1.1 Изучение взаимодействий между доменами белков Su(Hw) и Моd(mdg4)-67

4.1.2 Изучение взаимодействий между доменами белков СР190 и Моd(mdg4)-67

4.1.3 Изучение взаимодействий между доменами белков СР190 и Su(Hw)

4.1.4 Подтверждение выявленных в ДДС взаимодействий между доменами белков Su(Hw), Моd(mdg4)-67.2 и СР190

4.1.5 Изучение взаимодействий между белком HIPP1 и инсуляторными белками

4.2 Исследование функционального значения взаимодействий между доменами белков Su(Hw)-зависимого комплекса

4.2.1 Роль C-концевого домена Su(Hw) в привлечении Mod(mdg4)-67.2 и CP190 к хроматину

4.2.2 Исследование функциональной роли N-концевого домена Su(Hw)

4.2.3 Исследование взаимодополняющей роли Mod(mdg4)-67.2 и CP190 в привлечении Su(Hw)-зависимого комплекса

4.3 Изучение возможных функций HIPP1 в составе Su(Hw)-зависимого комплекса

4.3.1 Белки Su(Hw) и CP190 участвуют в привлечении HIPP1 на хроматин

4.3.2 Одновременная инактивация белков Hippl и mod(mdg4)-67.2 вызывает изменение функционирования инсулятора gypsy

4.3.3 HIPP1 участвует в привлечении CP190 на SBS

5. ОБСУЖДЕНИЕ

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

7. ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ЭХП - эффект хромосомного положения;

PRE - Polycomb Response Element;

LCR - locus control region;

hsp70 - ген heat shock protein 70;

ANT-C - Antennapedia complex;

BX-C - Bithorax complex;

ТФ - транскрипционный фактор;

ZF (zinc finger) - цинковый палец;

ZAD - zink finger-associated domain;

BTB - bric-a-brac, tramtrack and broad complex;

POZ -poxvirus and zinc finger;

CID - домен, взаимодействующий с CP 190;

SID - Su(Hw) ineraction domain;

SBS (Su(Hw) binding site) - сайт связывания белка Su(Hw); SBS-O - сайт, с которым связывается только белок Su(Hw); SBS-C - сайт, с которым связываются Su(Hw) и CP190;

SBS-CM - сайт, с которым связываются три белка Su(Hw)/CP190/Mod(mdg4)-67.2;

ICR - imprinting control region;

ТАД - топологически ассоциированный домен;

PolII - РНК полимераза II;

ChIP анализ - Иммунопреципитация хроматина; ДДС - Дрожжевая двугибридная система; GST - Глутатион^-трансфераза;

GPD - GST Pull Down, Соосаждение белков на глутатион сефарозе; 6xHis - Участок для аффинной очистки, состоящий из 6 остатков гистидина;

ПЦР - Полимеразная цепная реакция;

qPCR - Количественный ПЦР;

RNAi - РНК-интерференция;

дцРНК - Двуцепочечные РНК;

co-IP - ко-иммунопреципитации;

Input - Образец до иммунопреципитации;

OutPut - Образец после иммунопреципитации;

IP -иммунопреципитат;

PI - иммунопреципитация с неспецифическими антителами;

Output PI - образец после преципитации с неспецифическими антителами;

п.н. - пара нуклеотидов;

а.о. - аминокислотный остаток.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Детальное изучение механизмов формирования и функционирования Su(Hw) зависимых белковых комплексов в геноме Drosophila melanogaster»

1. ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность работы

Инсуляторы изначально были описаны как регуляторные элементы, обладающие следующими свойствами: 1) они способны ограничивать взаимодействие регуляторных элементов с промоторами; 2) обладают способностью снимать эффект положения гена, то есть препятствуют инактивирующему влиянию гетерохроматина на транскрипцию. Однако с течением времени появляется все больше данных, свидетельствующих, что спектр функций инсуляторов не ограничивается блокирующим или барьерным воздействием на окружающие регуляторные элементы генома либо структуры хроматина. Уже доказано, что они способствуют формированию и поддержанию работы транскрипционных программ и играют существенную роль в регуляции экспрессии генов. Анализ научных публикаций нескольких последних лет позволяет рассматривать явление инсуляции как составную часть глобального процесса регуляции транскрипциии в ядре в целом. Также нужно отметить, что инсуляторные элементы были обнаружены в геномах разных представителей высших эукариот, в том числе у плодовой мушки дрозофилы и у позвоночных, что указывает на их консервативную роль в организации координированной работы эукариотического генома. У млекопитающих инсуляторы играют важнейшую роль во многих процессах развития, таких как импринтинг и дозовая компенсация. Нарушение барьерной функции инсуляторов может привести к серьезным патологиям эмбрионального развития. В результате нарушения инсуляторной области может измениться пространственная структура генома и онкогены окажутся под влиянием энхансеров.

В последние годы была создана концепция, согласно которой существует особый класс архитектурных белков, включающий некоторые инсуляторные белки. Архитектурные белки отвечают как за локальную регуляцию энхансер-промоторных взаимодействий, так и за глобальную архитектуру хромосом. Некоторые инсуляторные комплексы способствуют высокоупорядоченной организации хроматина в топологически ассоциированные домены (ТАДы), которые являются фундаментальными элементами структуры эукариотического генома.

Несмотря на достигнутый прогресс в изучении архитектуры хромосом, до сих пор не существует четкого понимания, как дистанционные взаимодействия между отдельными регуляторными регионами образуются и поддерживаются в течении клеточного цикла. Возможно, ведущая роль в формировании контактов между дистанцированными регуляторными элементами принадлежит инсуляторам. Однако в настоящее время механизмы

формирования сложных инсуляторных комплексов, их функциональная роль в регуляции транскрипции изучены недостаточно.

На сегодняшний день белок Su(Hw) является одним из наиболее охарактеризованных инсуляторных/архитектурных белков Drosophila. Su(Hw)-зависимый инсулятор был впервые обнаружен в ретротранспозоне gypsy, который содержит последовательность размером 460 п.н., включающую 12 вырожденных октамерных сайтов связывания белка Su(Hw). В процессе развития этот белок экспрессируется в большинстве тканей дрозофилы.

Представленная диссертация посвящена изучению механизмов, с помощью которых архитектурный белок Su(Hw) формирует комплексы, обладающие разной регуляторной активностью, специфично связывающиеся с геномными сайтами и обеспечивающие дистанционные взаимодействия между энхансерами и промоторами.

1.2 Цель и задачи исследования

Цель диссертационной работы состояла в разработке детализированной модели формирования и функционирования Su(Hw)-зависимого инсуляторного комплекса. Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

• С помощью методов in vitro и in vivo выявить домены белков Su(Hw)-зависимого комплекса, отвечающие за их взаимодействие друг с другом.

• Изучить функциональное значение найденных взаимодействий для формирования Su(Hw)-зависимого комплекса и привлечения его на хроматин.

• Выяснить, какую роль в формировании и функционировании Su(Hw)-зависимого комплекса играет белок HIPP 1.

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе выполнения диссертационной работы получен ряд совершенно новых научных данных. Впервые было показано, что N-концевой домен белка Su(Hw) взаимодействует с глютамин-богатым районом белка Mod(mdg4)-67.2; две граничащие последовательности в N-концевой части белка Su(Hw) взаимодействуют с ВТВ доменом белка CP190; BTB-домен белка Mod(mdg4)-67.2 взаимодействует с М-доменом белка CP190; белки Su(Hw), Mod(mdg4)-67.2 и CP190 привлекаются на хроматин взаимозависимо друг от друга; белок HIPP1 является новым компонентом Su(Hw)-зависимого комплекса; одновременная инактивация генов Hippl и mod(mdg4)-67.2 вызывает изменение функционирования инсулятора gypsy. На основании полученных данных предложена новая модель, объясняющая механизм формирования и

функционирования инсуляторов на примере Su(Hw)-зависимого комплекса. Результаты диссертационной работы вносят вклад в развитие фундаментальной науки и, в дальнейшем, будут способствовать изучению связи между нарушениями в регуляции транскрипции и различными заболеваниями человека. Полученные в ходе работы экспрессирующие векторы и коллекция трансгенных линий дрозофил могут быть использованы в проектах со сходной тематикой, что значительно упростит выполнение последующих научно-исследовательских работ и позволит оптимизировать материальные и временные затраты.

Используя дрозофилу как модельный организм, мы можем изучать работу сложных регуляторных комплексов in vivo в ряду поколений и в короткие сроки. Некоторые консервативные белки, участвующие в работе инсуляторов, являются общими для разных организмов. Поэтому результаты, полученные на дрозофиле, в дальнейшем могут использоваться для разработки моделей функционирования инсуляторов у млекопитающих и человека. Например, основным архитектурным белком человека и млекопитающих считается инсуляторный белок CTCF. Показано, что мутации белка CTCF вызывают целый ряд патологий. Так эмбрионы гомозиготных мышей с нокаутом по CTCF распадаются на стадии бластоцисты после истощения материнского пула белка. Пороки развития также могут наблюдаться у больных с гаплонедостаточностью CTCF, приводя к таким фенотипам, как умственная отсталость, микроцефалия или задержка роста. Мутации в гене CTCF, часто ассоциированы с различными видами рака. CTCF формирует контакты между энхансерами и промоторами и между ТАДами. Однако механизмы, обеспечивающие взаимодействия между CTCF-зависимыми комплексами и их специфичное рекрутирование на сайты генома исследованы недостаточно. Белок Su(Hw) сходен с основным архитектурным белком позвоночных, CTCF, по структуре, функциям и механизму связывания с ДНК. Поэтому результаты, полученные при выполнении диссертационной работы, могут быть использованы для разработки моделей функционирования архитектурных белковых комплексов, в том числе и CTCF-зависимых, у высших эукариот.

1.4 Личный вклад соискателя

Автором самостоятельно выполнены исследования в дрожжевой двугибридной системе, эксперименты по соосаждению белков на глютатионсефарозе и коиммунопреципитации белков, работы по экспрессии и очистке рекомбинантных белков. Использованные в работе конструкции получены лично В.В. Молодиной, либо при её непосредственном участии.

Иммуноокрашивание политенных хромосом выполнено Костюченко Маргаритой Владимировной. Эксперименты по РНК интерференции выполнены Головниным Антоном

Клеменсовичем. Эксперименты по иммунопреципитации хроматина выполнены Молодиной В.В. совместно с Головниным Антоном Клеменсовичем. Генетические скрещивания и фенотипический анализ мух проводились Мельниковой Ларисой Сергеевной и Головниным Антоном Клеменсовичем при участии Молодиной В.В. Молодина В.В. принимала активное участие в планировании экспериментов, анализе полученных данных и подготовке результатов работ к публикации.

1.5 Положения, выносимые на защиту

• Впервые обнаружено, что N-концевой домен белка Su(Hw) взаимодействует с глютамин-богатым районом белка Mod(mdg4)-67.2.

• В N-концевой части белка Su(Hw) картированы две граничащие последовательности, взаимодействующие с ВТВ доменом белка CP 190.

• Выявлено не описанное ранее взаимодействие между BTB-доменом белка Mod(mdg4)-67.2 и М-доменом белка CP190.

• В экспериментах in vivo показано, что взаимодействие между белками Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2 способствует связыванию белка CP190 с Su(Hw)-зависимыми сайтами генома. В свою очередь, связывание белка CP190 с хроматином так же необходимо для привлечения на хроматин белков Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2.

• Показано, что белок HIPP 1 является новым компонентом Su(Hw)-зависимого комплекса. Его N-концевой домен взаимодействует с белком CP190, а C-концевой кротоназный домен - с белком Su(Hw).

• Одновременная инактивация генов Hippl и mod(mdg4)-67.2 приводит к изменению функционирования инсулятора gypsy.

• Предложена новая детализированная модель формирования Su(Hw)-зависимого инсуляторного комплекса и его рекрутирования на сайты хроматина.

1.6 Степень достоверности и апробация результатов

Результаты работы были опубликованы в трех международных рецензируемых научных журналах и представлены на пяти научных конференциях. Цель, поставленная в работе, достигнута.

Публикации:

• Melnikova, L., Molodina, V., Erokhin, M., Georgiev, P., Golovnin, A., 2019. HIPP1 stabilizes the interaction between CP190 and Su(Hw) in the Drosophila insulator complex. Sci Rep 9, 19102. https://doi.org/10.1038/s41598-019-55617-6

• Melnikova, L., Kostyuchenko, M., Molodina, V., Parshikov, A., Georgiev, P., Golovnin, A., 2018. Interactions between BTB domain of CP190 and two adjacent regions in Su(Hw) are required for the insulator complex formation. Chromosoma 127, 59-71. https://doi.org/10.1007/s00412-017-0645-6

• Melnikova, L., Kostyuchenko, M., Molodina, V., Parshikov, A., Georgiev, P., Golovnin, A., 2017. Multiple interactions are involved in a highly specific association of the Mod(mdg4)-67.2 isoform with the Su(Hw) sites in Drosophila. Open Biol. 7, 170150. https://doi.org/10.1098/rsob.170150

Тезисы конференций:

• Молодина В.В., Мельникова Л.С., Костюченко М.В., Головнин А.К. Белок HIPP1 участвует в рекрутировании белка CP190 на Su(Hw)-зависимые сайты генома. XXXII Зимняя молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", Москва, Россия, 10-13 февраля 2020 г., Сборник тезисов, с. 70.

• Головнин А.К., Мельникова Л.С., Костюченко М.В., Молодина В.В. Исследование механизмов специфичного рекрутирования Su(Hw)-зависимых комплексов на хроматин и дистанционных взаимодействий между ними. VI Съезд биохимиков России и IX Российский симпозиум «Белки и пептиды». Россия, Сочи-Дагомыс. 1-6 октября 2019 г. Спецвыпуск, т.2, стр.11-12. http://www.rusbiochem.org/vi_syezd_biohimikov_rossii.html

• Молодина В.В., Мельникова Л.С., Костюченко М.В., Головнин А.К. Analysis of the mechanism of specific recruitment of the Su(Hw)/Mod(mdg4)67.2/ CP190 complex to Su(Hw) sites. 43-ий конгресс FEBS. г. Прага. 7 - 12 июля 2018 г, сборник тезисов, с. 136. https://2018.febscongress.org/

• Головнин А.К., Мельникова Л.С., Ерохин М.М., Молодина В.В. Белок HIPP1 взаимодействует с инсулятором Su(Hw), но не участвует в Su(Hw)-зависимой репрессии у плодовой мушки Drosophila melanogaster. Хромосома 2018. г. Новосибирск. 20-24 августа 2018г, сборник тезисов, с. 112-113. "http://chromosome2018.mcb.nsc.ru/ru/conference.php

• Молодина В.В., Мельникова Л.С., Костюченко М.В., Головнин А.К. Изучение роли взаимодействия между белками Su(Hw) и CP190 в рекрутировании Su(Hw)-зависимого комплекса на хроматин. 21-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА». Пущино. 17-21 апреля 2017 г, сборник тезисов, с. 114. http://www.biology21.ru/ru

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Drosophila melanogaster как первый модельный объект для изучения инсуляторов

В первых работах по изучению инсуляторов эукариот в качестве модельного организма часто использовалась Drosophila melanogaster. Одна из причин этого заключалась в том, что на основе Р-элемента Drosophila была разработана система эффективной транспозиционной модификации генома (Spradling et al. 1995). Системы, позволяющие in vivo модифицировать геном позвоночных животных, были созданы значительно позже (Carlson and Largaespada 2005; Jiang and Doudna 2017). В качестве инструмента инсерционного мутагенеза P-элементы использовались не только для поиска регуляторных элементов и картирования генов, но и для интеграции трансгенов. Перемещение Р-элемента катализируется транспозазой, которая связывается с последовательностями размером около 150 п.н. на обоих его концах (Beall and Rio 1997; Kaufman et al. 1989). Р-зависимая интеграция носила случайный характер, что позволяло изучать влияние различного хромосомного окружения на экспрессию трансгена, помещённого между 5' и 3' концами P-элемента. Часто в качестве репортёрного гена использовался ген white, отвечающий у Drosophila за пигментацию глаз (Pirrotta et al. 1985). Мухи, несущие трансген white без энхансеров (mini-white) демонстрировали широкий спектр цвета глаз в зависимости от сайта встраивания трансгена. Это явление было названо эффектом хромосомного положения (ЭХП) (Levis et al. 1985; Pirrotta et al. 1985). Предполагалось, что высокая чувствительность гена mini-white к ЭХП обусловлена стимулирующей транскрипцию активностью энхансеров, расположенных вблизи 5' или 3' конца транспозона. Однако позже было доказано, что в более чем 70% случаев за активирующий эффект хромосомного окружения ответственна проходящая через mini-white транскрипция (Silicheva et al. 2010).

Первыми описанными в геноме D. melanogaster инсуляторами были последовательности scs и scs' (specialised chromatin structure), картированные в цитогенетическом локусе 87A7 как гиперчувствительные к нуклеазам участки ДНК, окружающие последовательность 14 т.п.н., включающую пять генов, в том числе два гена hsp70 (Kellum and Schedl 1991; Kellum and Schedl 1992; Udvardy et al. 1985). При активации генов hsp70 за счет тепловой индукции, хромомер 87A7 деконденсируется, образуя пуф на политенных хромосомах слюнных желез, а затем, когда гены «выключаются» во время восстановления после теплового шока, снова конденсируется. Цитологические исследования показали, что элементы scs и scs' локализованы в местах, где деконденсированный локус 87А7 фланкируется конденсированным хроматином. Эти данные позволили предположить, что scs и scs' функционируют как границы отдельного домена транскрипции. Дальнейшие исследования с использованием трансгенов показали, что элементы scs и scs' обладают свойствами инсуляторов. Во-первых, была подтверждена их барьерная

активность. Когда фрагменты ДНК, содержащие scs и scs', были размещены по обе стороны от репортерного гена white, они защищали его как от положительного, так и от отрицательного влияния ЭХП (Kellum and Schedl 1991). В экспериментах по изучению энхансер-блокирующей активности последовательности ДНК, содержащие любой из этих элементов, препятствовали активации репортерного гена hsp70-lacZ, если находились между энхансерами и промотором hsp70 (Kellum and Schedl 1992). Также, на люциферазной репортёрной системе в культуре эмбриональных клеток дрозофилы S2 было показано, что инсулятор scs способен терминировать транскрипцию (Kyrchanova et al. 2013a).

Известно, что встраиваясь в различные участки генома, ретротранспозон gypsy влияет на экспрессию соседних генов, вызывая мутантные фенотипы (Modolell et al. 1983). Влияние gypsy на транскрипцию обусловлено инсулятором, расположенным в его 5' транскрибируемой нетранслируемой области (Geyer and Corces 1992; Kim et al. 1996). Инсулятор gypsy блокирует специфические энхансеры множества генов в различных тканях на разных этапах развития (Bender et al. 1983; Hoover et al. 1992; Parkhurst et al. 1988; Peifer and Bender 1986). Удобной модельной системой, на которой были получены первые данные о свойствах инсулятора gypsy, стал ген yellow, отвечающий за пигментацию кутикулярных структур у эмбрионов, личинок и имаго (Geyer et al. 1986). Энхансеры, контролирующие транскрипцию yellow в крыльях, кутикуле тела и пигментированных структурах личинки, расположены в 5' области гена, тогда как энхансеры, контролирующие экспрессию в щетинках и коготках, находятся в интроне (Geyer and Corces 1992). В аллеле y Встраивание gypsy в 5' область yellow блокирует взаимодействие между промотором гена и вышележащими энхансерами крыльев и кутикулы тела, но не влияет на энхансер щетинок, расположенный в интроне (Рис. 1). Также, энхансер-блокирующий эффект gypsy наблюдался в генах hsp70 и cut (Holdridge and Dorsett 1991; Jack et al. 1991). Анализ ревертантов мутаций, вызванных инсерциями gypsy, а также исследования различных мутаций в gypsy, сконструированных in vitro, позволили точно локализовать инсулятор и описать его структуру. Инсуляторные свойства gypsy обусловлены последовательностью размером 460 п.н., включающей 12 вырожденных октамерных сайтов связывания белка Su(Hw) (Geyer et al. 1988; Kim et al. 1996; Smith and Corces 1995). В трансгенах последовательности инсулятора gypsy, окружающие ген white, защищали его от ЭХП, т.е. демонстрировали барьерную активность (Roseman et al. 1995; Roseman et al. 1993). Кроме того, gypsy может функционировать в качестве барьера, блокирующего репрессионную активность PRE (Polycomb Response Element) (Mallin et al. 1998; Sigrist and Pirrotta 1997).

ЭнК ЭнТ ЭнЩ

2

Рисунок 1. Схематичное изображение аллеля у . Экзоны гена yellow обозначены прямоугольниками со стрелкой, указывающей направление транскрипции; ЭнК - энхансер крыльев; ЭнТ - энхансер тела; ЭнЩ - энхансер щетинок; Пр - промотор гена. Ретротранспозон gypsy изображен в виде треугольника, прямоугольники на его концах - длинные концевые повторы, их направление указано стрелками. Инсулятор Su(Hw) изображен как шестиугольник внутри gypsy. На фотографиях представлены фенотипы мух: y+ - дикий тип, ген yellow экспрессируется во всех кутикулярных структурах; y2 - энхансеры тела и крыльев блокированы инсулятором Su(Hw) (изображено как зачеркивание), ген yellow не экспрессируется в кутикуле тела и крыльях, но продолжает экспрессироваться в щетинках.

Инсулятор, способный изолировать ген white от влияния близлежащего энхансера, так же был обнаружен и в длинном концевом повторе ретротранспозона Idefix (Conte et al. 2002). С помощью трансгенных линий были продемонстрированы барьерная активность этого инсулятора и его способность блокировать различные геномные энхансеры (Brasset et al. 2010).

В настоящее время в геноме дрозофилы идентифицировано множество инсуляторных последовательностей. Среди них инсуляторы SF1 и SF2 из комплекса Antennapedia (ANT-C) (Belozerov et al. 2003; Li et al. 2015); последовательности facet-strawberry, защищающие ген Notch от влияния окружающего хроматина (Vazquez and Schedl 2000); инсуляторы 1A2 (Golovnin et al. 2003; Parnell et al. 2003) и Wari (Chetverina et al. 2008), расположенные на 3' концах генов yellow и white; граничный элемент ME, блокирующий действие энхансера из гена eyeless на промотор соседнего гена myoglianin (Sultana et al. 2011). В гене Abd-B из комплекса Bithorax были обнаружены элементы Mcp, Fab-6, Fab-7 и Fab-8 (Aoki et al. 2012; Barges et al. 2000; Gruzdeva et al. 2005; Gyurkovics et al. 1990; Hogga et al. 2001; Iampietro et al. 2008; Iampietro et al. 2010; Rodin et al. 2007; Schweinsberg and Schedl 2004), работающие не только как границы функциональных доменов, но способные проявлять свойства инсуляторов в составе трансгенов (Barges et al. 2000; Ciavatta et al. 2007; Gruzdeva et al. 2005; Hagstrom et al. 1996;

Maksimenko et al. 2015; Perez-Lluch et al. 2008; Schweinsberg et al. 2004; Schweinsberg and Schedl 2004; Zhou et al. 1996). Недавно были найдены геномные инсуляторы, содержащие от одного до трёх сайтов связывания белка Su(Hw) (Baxley et al. 2017; Schwartz et al. 2012).

У позвоночных животных выявление сложных паттернов экспрессии соседних генов или соседствующих регуляторных областей с различной активностью так же привело к поиску инсуляторных сайтов. Первой выявленной последовательностью, опосредующей инсуляцию, был элемент HS4, находящийся на 5'-конце ß-глобинового локуса курицы. Этот элемент расположен рядом с LCR (locus control region) кластера ß-глобиновых генов и находится между областью компактного хроматина и LCR-индуцированным деконденсированным хроматином. Коровая последовательность инсулятора содержит несколько сайтов связывания белка CTCF (Chung et al. 1993). Еще один CTCF-зависимый инсулятор был обнаружен между генами мыши hl9 и igf2. Подобный инсулятор был обнаружен и у человека (Bell and Felsenfeld 2000; Hark et al. 2000; Kanduri et al. 2000). Он обеспечивает родитель-специфичную моноаллельную экспрессию этих генов и опосредует множество функций, связанных с их импринтированной экспрессией. В настоящее время у позвоночных выявлен большой ряд последовательностей, обладающих инсуляторными функциями (Herold et al. 2012).

2.2 Модели, объясняющие механизм функционирования инсуляторов

На основании данных о свойствах инсуляторов изначально были предложены две не исключающие друг друга модели, объясняющие механизм их функционирования. Одна из них основывалась на данных о влиянии инсуляторов на регуляцию транскрипции, а другая - на данных о связи инсуляторов с формированием высокоупорядоченных структур хроматина.

Транскрипционные модели предполагали, что инсулятор оказывает серьезное влияние на механизм действия энхансера (Bell et al. 1999; Dorsett 1999; Geyer 1997). Считалось, что ДНК-белковые инсуляторные комплексы могут действовать как физические барьеры, способные блокировать распространение активирующего сигнала от энхансера вдоль ДНК, или же, мимикрируя промотор, непосредственно взаимодействовать с транскрипционными факторами (ТФ) энхансера, создавая непродуктивное взаимодействие (Рис. 2А). Также допускалось, что инсулятор может блокировать действие вспомогательных ТФ, способствующих энхансер-промоторному взаимодействию (Рис. 2Б). Одним из примеров, подтверждавших эту модель, послужило взаимодействие белка Chip, облегчающего энхансер-промоторное взаимодействию в гене cut, с компонентами инсулятора gypsy, белками Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2 (Gause et al. 2001; Morcillo et al. 1997). Генетические эксперименты показали, что Su(Hw)-зависимая инсуляция становится более эффективной, когда энхансер-промоторное взаимодействие

ослаблено мутацией в белке Chip. Возможно, образование комплексов Chip-Su(Hw) препятствует взаимодействию между Chip и вспомогательными белками, что нарушает сближение энхансера и промотора.

Рисунок 2. Модели механизма действия инсуляторов. А - модель «ловушки энхансера». Б - блокирование вспомогательных белков. В - структурная модель. Формирование независимых транскрипционных доменов. Обозначения: Эн - энхансер; И - инсулятор; Пр -промотор. Красными стрелками обозначена активация транскрипции специфичным энхансером, синими - базовая активность промотора. Зачеркнутые стрелки обозначают блокирование взаимодействий между энхансерами и промоторами из соседних доменов.

Однако самую широкую популярность приобрела структурная модель работы инсулятора (Labrador and Corees 2002). Она во многом основывалась на имеющихся на тот момент данных об инсуляторе gypsy (Gerasimova et al. 2000). Сайты связывания белковых компонентов gypsy инсулятора локализуются на политенных хромосомах Drosophila на границах дисков (гетерохроматин) и междисков (эухроматин), что предполагает их роль в формировании структуры хроматина. Эти сайты объединяются в 20 - 25 крупных структур, называемых

«инсуляторными тельцами», которые преимущественно локализуются на переферии клеточных ядер. Каждое инсуляторное тельце состоит из множества отдельных инсуляторных сайтов, которые удерживаются вместе благодаря взаимодействию белковых компонентов инсулятора. Взаимодействующие инсуляторы делят хроматиновую фибриллу на отдельные доменные петли, образуя структуры, подобные розетке (Рис. 2В). При этом находящиеся в основании розетки инсуляторы могут взаимодействовать с ядерной ламиной (оболочкой) или с компонентами ядерной поры, что создаёт основу для пространственной организации хроматина. Согласно структурной модели, основная роль инсулятора состоит в организации фибрилл хроматина, а инсуляторная активность рассматривается как следствие этой организации (Gerasimova and Corces 2001). Образование независимых хроматиновых петель может вызывать топологические или физические затруднения, препятствующие передаче сигнала между находящимися в разных доменах энхансером и промотором (Valenzuela and Kamakaka 2006). Таким образом, считалось, что разделённые инсулятором регуляторные элементы, находящиеся в разных петлях, не могут взаимодействовать.

Необходимо отметить, что ни одна из перечисленных моделей не была универсальной и данные о различных инсуляторах косвенно подтверждали одну и/или другую из них. Ни транскрипционные, ни структурные модели действия инсуляторов не были доказаны напрямую, экспериментально. Последующие исследования на трансгенных линиях дрозофилы во многом опровергли эти модели и заставили по-новому взглянуть на структурную и регуляторную роль инсуляторов в геноме.

2.3 Основные инсуляторные белки

Активность инсулятора обеспечивается комплексами взаимодействующих белков, которые связываются с инсуляторной последовательностью ДНК. Большинство известных инсуляторных комплексов формируется вокруг одного ключевого белка, который связывается со специфичным сайтом ДНК. У D. melanogaster описано 11 инсуляторных белков с энхансер-блокирующими свойствами, содержащих ДНК-связывающие домены. Почти половина из них, CTCF, Su(Hw), Pita, ZIPIC, ZW5 включают домен, состоящий из разного количества цинковых пальцев (ZF) C2H2 типа (Iuchi 2001; Najafabadi et al. 2015; Razin et al. 2012).

Участие CCCTC-связывающего фактора (CTCF) в инсуляции было впервые описано у позвоночных (Bell et al. 1999). Белок CTCF экспрессируется в большинстве тканей млекопитающих (Wendt et al. 2008), он необходим на ранних стадиях развития мышей (Fedoriw et al. 2004), участвует в протекании клеточного цикла, апоптозе и дифференцировке клеток (Heath et al. 2008; Soshnikova et al. 2010; Splinter et al. 2006). Позже было продемонстрировано,

что CTCF высоко консервативен и его ортолог с аналогичной доменной структурой был обнаружен у дрозофилы (dCTCF) (Moon et al. 2005). ДНК-связывающие домены CTCF человека и Drosophila примерно на 60% сходны. CTCF связывается со специфичной последовательностью ДНК через домен ZF-C2H2, содержащий у позвоночных и насекомых 11 ZF, которые по-разному задействованы в связывании ДНК в зависимости от структуры сайта связывания (Nakahashi et al. 2013; Ohlsson et al. 2010).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Молодина Варвара Викторовна, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Alekseyenko AA, Gorchakov AA, Zee BM, Fuchs SM, Kharchenko PV, Kuroda MI (2014)

Heterochromatin-associated interactions of Drosophila HP1a with dADDl, HIPP1, and repetitive RNAs Genes & development 28:1445-1460 doi:10.1101/gad.241950.114

2. Ali, T., Krüger, M., Bhuju, S., Jarek, M., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., 2017. Chromatin

binding of Gcn5 in Drosophila is largely mediated by CP190. Nucleic Acids Res 45, 23842395. https://doi.org/10.1093/nar/gkw1178

3. Ahanger, S.H., Shouche, Y.S., Mishra, R.K., 2013. Functional sub-division of the Drosophila

genome via chromatin looping: The emerging importance of CP190. Nucleus 4, 115-122. https://doi.org/10.4161/nucl.23389

4. Ansari A, Hampsey M (2005) A role for the CPF 3'-end processing machinery in RNAP II-

dependent gene looping Genes & development 19:2969-2978 doi:10.1101/gad.1362305

5. Aoki T, Sarkeshik A, Yates J, Schedl P (2012) Elba, a novel developmentally regulated

chromatin boundary factor is a hetero-tripartite DNA binding complex eLife 1:e00171 doi:10.7554/eLife.00171

6. Barges S et al. (2000) The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-

7 domain and insulates iab-7 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain Development 127:779-790

7. Bartkuhn M et al. (2009) Active promoters and insulators are marked by the centrosomal

protein 190 EMBO J 28:877-888 doi:10.1038/emboj.2009.34

8. Bartoletti M et al. (2012) Genetic basis for developmental homeostasis of germline stem cell

niche number: a network of Tramtrack-Group nuclear BTB factors PloS one 7:e49958 doi: 10.1371/j ournal .pone.0049958

9. Baxley RM, Bullard JD, Klein MW, Fell AG, Morales-Rosado JA, Duan T, Geyer PK (2017)

Deciphering the DNA code for the function of the Drosophila polydactyl zinc finger protein Suppressor of Hairy-wing Nucleic acids research doi:10.1093/nar/gkx040

10. Baxley RM, Soshnev AA, Koryakov DE, Zhimulev IF, Geyer PK (2011) The role of the

Suppressor of Hairy-wing insulator protein in Drosophila oogenesis Developmental biology 356:398-410 doi:10.1016/j.ydbio.2011.05.666

11. Beall EL, Rio DC (1997) Drosophila P-element transposase is a novel site-specific

endonuclease Genes & development 11:2137-2151 doi:10.1101 /gad. 11.16.2137

12. Bell AC, Felsenfeld G (2000) Methylation of a CTCF-dependent boundary controls imprinted

expression of the Igf2 gene Nature 405:482-485 doi:10.1038/35013100

13. Bell AC, West AG, Felsenfeld G (1999) The protein CTCF is required for the enhancer

blocking activity of vertebrate insulators Cell 98:387-396

14. Belozerov VE, Majumder P, Shen P, Cai HN (2003) A novel boundary element may facilitate

independent gene regulation in the Antennapedia complex of Drosophila The EMBO journal 22:3113-3121 doi:10.1093/emboj/cdg297

15. Bender W et al. (1983) Molecular Genetics of the Bithorax Complex in Drosophila

melanogaster Science 221:23-29 doi:10.1126/science.221.4605.23

16. Bischof, J., Maeda, R.K., Hediger, M., Karch, F., Basler, K., 2007. An optimized transgenesis

system for Drosophila using germ-line-specific phiC31 integrases. Proc Natl Acad Sci U S A 104, 3312-3317. https://doi.org/10.1073/pnas.0611511104

17. Bohla, D., Herold, M., Panzer, I., Buxa, M.K., Ali, T., Demmers, J., Krüger, M., Scharfe, M.,

Jarek, M., Bartkuhn, M., Renkawitz, R., 2014. A Functional Insulator Screen Identifies NURF and dREAM Components to Be Required for Enhancer-Blocking. PLoS ONE 9, e107765. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0107765

18. Bonchuk A, Denisov S, Georgiev P, Maksimenko O (2011) Drosophila BTB/POZ domains of

"ttk group" can form multimers and selectively interact with each other J Mol Biol 412:423-436 doi:10.1016/j.jmb.2011.07.052

19. Bonchuk A et al. (2015) Functional role of dimerization and CP190 interacting domains of

CTCF protein in Drosophila melanogaster BMC biology 13:63 doi:10.1186/s12915-015-0168-7

20. Brasset E, Hermant C, Jensen S, Vaury C (2010) The Idefix enhancer-blocking insulator also

harbors barrier activity Gene 450:25-31 doi:10.1016/j.gene.2009.09.015

21. Buchner K, Roth P, Schotta G, Krauss V, Saumweber H, Reuter G, Dorn R (2000) Genetic and

molecular complexity of the position effect variegation modifier mod(mdg4) in Drosophila Genetics 155:141-157

22. Bushey AM, Ramos E, Corces VG (2009) Three subclasses of a Drosophila insulator show

distinct and cell type-specific genomic distributions Genes & development 23:1338-1350 doi:10.1101/gad.1798209

23. Butcher, R.D.J., Chodagam, S., Basto, R., Wakefield, J.G., Henderson, D.S., Raff, J.W.,

Whitfield, W.G.F., 2004. The Drosophila centrosome-associated protein CP190 is essential for viability but not for cell division. Journal of Cell Science 117, 1191-1199. https://doi.org/10.1242/jcs.00979

24. Buxa, M.K., Slotman, J.A., van Royen, M.E., Paul, M.W., Houtsmuller, A.B., Renkawitz, R.,

2016. Insulator speckles associated with long-distance chromatin contacts. Biology Open 5, 1266-1274. https://doi.org/10.1242/bio.019455

25. Cai HN, Shen P (2001) Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-

blocking activity Science 291:493-495 doi:10.1126/science.291.5503.493

26. Carlson CM, Largaespada DA (2005) Insertional mutagenesis in mice: new perspectives and

tools Nature reviews Genetics 6:568-580 doi:10.1038/nrg1638

27. Caron C, Pivot-Pajot C, van Grunsven LA, Col E, Lestrat C, Rousseaux S, Khochbin S (2003)

Cdyl: a new transcriptional co-repressor EMBO reports 4:877-882 doi:10.1038/sj. emb or. emb or917

28. Cavalheiro, G.R., Girardot, C., Viales, R.R., Pollex, T., Cao, T.B.N., Lacour, P., Feng, S.,

Rabinowitz, A., Furlong, E.E.M., 2023. CTCF, BEAF-32, and CP190 are not required for the establishment of TADs in early Drosophila embryos but have locus-specific roles. Sci. Adv. 9, eade1085. https://doi.org/10.1126/sciadv.ade1085

29. Chathoth, K.T., Mikheeva, L.A., Crevel, G., Wolfe, J.C., Hunter, I., Beckett-Doyle, S.,

Cotterill, S., Dai, H., Harrison, A., Zabet, N.R., 2022. The role of insulators and transcription in 3D chromatin organization of flies. Genome Res 32, 682-698. https://doi.org/10.1101/gr.275809.121

30. Chetverina D, Aoki T, Erokhin M, Georgiev P, Schedl P (2014) Making connections: insulators

organize eukaryotic chromosomes into independent cis-regulatory networks BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology 36:163-172 doi:10.1002/bies.201300125

31. Chetverina D, Fujioka M, Erokhin M, Georgiev P, Jaynes JB, Schedl P (2017) Boundaries of

loop domains (insulators): Determinants of chromosome form and function in multicellular eukaryotes BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology 39 doi:10.1002/bies.20160023 3

32. Chetverina D et al. (2008) Red flag on the white reporter: a versatile insulator abuts the white

gene in Drosophila and is omnipresent in mini-white constructs Nucleic acids research 36:929-937 doi:10.1093/nar/gkm992

33. Chung JH, Whiteley M, Felsenfeld G (1993) A 5' element of the chicken beta-globin domain

serves as an insulator in human erythroid cells and protects against position effect in Drosophila Cell 74:505-514 doi:10.1016/0092-8674(93)80052-g

34. Ciavatta D, Rogers S, Magnuson T (2007) Drosophila CTCF is required for Fab-8 enhancer

blocking activity in S2 cells Journal of molecular biology 373:233-239 doi:10.1016/j.jmb.2007.07.065

35. Comet I et al. (2006) PRE-mediated bypass of two Su(Hw) insulators targets PcG proteins to a

downstream promoter Developmental cell 11:117-124 doi:10.1016/j.devcel.2006.05.009

36. Comet I, Schuettengruber B, Sexton T, Cavalli G (2011) A chromatin insulator driving three-

dimensional Polycomb response element (PRE) contacts and Polycomb association with the

chromatin fiber Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 108:2294-2299 doi:10.1073/pnas.1002059108

37. Conte C, Dastugue B, Vaury C (2002) Coupling of enhancer and insulator properties identified

in two retrotransposons modulates their mutagenic impact on nearby genes Molecular and cellular biology 22:1767-1777 doi:10.1128/mcb.22.6.1767-1777.2002

38. Cuartero S, Fresan U, Reina O, Planet E, Espinas ML (2014) Ibf1 and Ibf2 are novel CP190-

interacting proteins required for insulator function EMBO J 33:637-647 doi:10.1002/embj .201386001

39. Dai Q, Ren A, Westholm JO, Duan H, Patel DJ, Lai EC (2015) Common and distinct DNA-

binding and regulatory activities of the BEN-solo transcription factor family Genes & development 29:48-62 doi:10.1101/gad.252122.114

40. de Wit E et al. (2015) CTCF Binding Polarity Determines Chromatin Looping Molecular cell

60:676-684 doi:10.1016/j .molcel.2015.09.023

41. Dixon JR, Gorkin DU, Ren B (2016) Chromatin Domains: The Unit of Chromosome

Organization Molecular cell 62:668-680 doi:10.1016/j.molcel.2016.05.018

42. Dorn R, Krauss V (2003) The modifier of mdg4 locus in Drosophila: functional complexity is

resolved by trans splicing Genetica 117:165-177

43. Dorn R, Morawietz H, Reuter G, Saumweber H (1993) Identification of an essential Drosophila

gene that is homologous to the translation initiation factor eIF-4A of yeast and mouse Molecular & general genetics : MGG 237:233-240

44. Dorsett D (1999) Distant liaisons: long-range enhancer-promoter interactions in Drosophila

Current opinion in genetics & development 9:505-514 doi:10.1016/s0959-437x(99)00002-7

45. Duan T, Geyer PK (2018) Spermiogenesis and Male Fertility Require the Function of

Suppressor of Hairy-Wing in Somatic Cyst Cells of Drosophila Genetics 209:757-772 doi:10.1534/genetics.118.301088

46. Eagen KP, Hartl TA, Kornberg RD (2015) Stable Chromosome Condensation Revealed by

Chromosome Conformation Capture Cell 163:934-946 doi:10.1016/j.cell.2015.10.026

47. El-Sharnouby S et al. (2017) Regions of very low H3K27me3 partition the Drosophila genome

into topological domains PloS one 12:e0172725 doi:10.1371/journal.pone.0172725

48. Emberly E et al. (2008) BEAF regulates cell-cycle genes through the controlled deposition of

H3K9 methylation marks into its conserved dual-core binding sites PLoS biology 6:28962910 doi:10.1371/journal.pbio.0060327

49. Erokhin M, Davydova A, Kyrchanova O, Parshikov A, Georgiev P, Chetverina D (2011)

Insulators form gene loops by interacting with promoters in Drosophila Development 13 8:4097-4106 doi:10.1242/dev.062836

50. Espinas ML, Jimenez-Garcia E, Vaquero A, Canudas S, Bernues J, Azorin F (1999) The N-

terminal POZ domain of GAGA mediates the formation of oligomers that bind DNA with high affinity and specificity The Journal of biological chemistry 274:16461-16469

51. Fedoriw AM, Stein P, Svoboda P, Schultz RM, Bartolomei MS (2004) Transgenic RNAi

reveals essential function for CTCF in H19 gene imprinting Science 303:238-240 doi:10.1126/science. 1090934

52. Fedotova A et al. (2018) The BEN Domain Protein Insensitive Binds to the Fab-7 Chromatin

Boundary To Establish Proper Segmental Identity in Drosophila Genetics 210:573-585 doi:10.1534/genetics. 118.301259

53. Fedotova AA, Bonchuk AN, Mogila VA, Georgiev PG (2017) C2H2 Zinc Finger Proteins: The

Largest but Poorly Explored Family of Higher Eukaryotic Transcription Factors Acta naturae 9:47-58

54. Flavahan WA et al. (2016) Insulator dysfunction and oncogene activation in IDH mutant

gliomas Nature 529:110-114 doi:10.1038/nature16490

55. Fudenberg G, Imakaev M, Lu C, Goloborodko A, Abdennur N, Mirny LA (2016) Formation of

Chromosomal Domains by Loop Extrusion Cell reports 15:2038-2049 doi:10.1016/j.celrep.2016.04.085

56. Gaszner M, Vazquez J, Schedl P (1999) The Zw5 protein, a component of the scs chromatin

domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction Genes & development 13:2098-2107

57. Gause M, Morcillo P, Dorsett D (2001) Insulation of enhancer-promoter communication by a

gypsy transposon insert in the Drosophila cut gene: cooperation between suppressor of hairy-wing and modifier of mdg4 proteins Molecular and cellular biology 21:4807-4817 doi:10.1128/MCB.21.14.4807-4817.2001

58. Georgiev P, Kozycina M (1996) Interaction between mutations in the suppressor of Hairy wing

and modifier of mdg4 genes of Drosophila melanogaster affecting the phenotype of gypsy-induced mutations Genetics 142:425-436

59. Gerasimova TI, Byrd K, Corces VG (2000) A chromatin insulator determines the nuclear

localization of DNA Molecular cell 6:1025-1035

60. Gerasimova TI, Corces VG (2001) Chromatin insulators and boundaries: effects on

transcription and nuclear organization Annual review of genetics 35:193-208 doi:10.1146/annurev.genet.35.102401.090349

61. Gerasimova TI, Gdula DA, Gerasimov DV, Simonova O, Corces VG (1995) A Drosophila

protein that imparts directionality on a chromatin insulator is an enhancer of position-effect variegation Cell 82:587-597

62. Gerasimova TI, Lei EP, Bushey AM, Corces VG (2007) Coordinated control of dCTCF and

gypsy chromatin insulators in Drosophila Molecular cell 28:761-772 doi: 10.1016/j .molcel.2007.09.024

63. Geyer PK (1997) The role of insulator elements in defining domains of gene expression

Current opinion in genetics & development 7:242-248 doi:10.1016/s0959-437x(97)80134-7

64. Geyer PK, Corces VG (1987) Separate regulatory elements are responsible for the complex

pattern of tissue-specific and developmental transcription of the yellow locus in Drosophila melanogaster Genes & development 1:996-1004

65. Geyer PK, Corces VG (1992) DNA position-specific repression of transcription by a

Drosophila zinc finger protein Genes Dev 6:1865-1873

66. Geyer PK, Green MM, Corces VG (1988) Mutant gene phenotypes mediated by a Drosophila

melanogaster retrotransposon require sequences homologous to mammalian enhancers Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 85:8593-8597

67. Geyer PK, Spana C, Corces VG (1986) On the molecular mechanism of gypsy-induced

mutations at the yellow locus of Drosophila melanogaster The EMBO journal 5:2657-2662

68. Ghosh D, Gerasimova TI, Corces VG (2001) Interactions between the Su(Hw) and Mod(mdg4)

proteins required for gypsy insulator function The EMBO journal 20:2518-2527 doi:10.1093/emboj/20.10.2518

69. Gilbert MK, Tan YY, Hart CM (2006) The Drosophila boundary element-associated factors

BEAF-32A and BEAF-32B affect chromatin structure Genetics 173:1365-1375 doi:10.1534/genetics.106.056002

70. Glenn SE, Geyer PK (2019) Investigation of the Developmental Requirements of Drosophila

HP1 and Insulator Protein Partner, HIPP1 G3 (Bethesda) 9:345-357 doi:10.1534/g3.118.200705

71. Golovnin A et al. (2003) An endogenous Su(Hw) insulator separates the yellow gene from the

Achaete-scute gene complex in Drosophila Development 130:3249-3258

72. Golovnin A et al. (2007) Integrity of the Mod(mdg4)-67.2 BTB domain is critical to insulator

function in Drosophila melanogaster Molecular and cellular biology 27:963-974 doi:10.1128/MCB.00795-06

73. Golovnin A, Melnick E, Mazur A, Georgiev P (2005) Drosophila Su(Hw) insulator can

stimulate transcription of a weakened yellow promoter over a distance Genetics 170:11331142 doi:10.1534/genetics.104.034587

74. Golovnin A, Melnikova L, Shapovalov I, Kostyuchenko M, Georgiev P (2015) EAST

Organizes Drosophila Insulator Proteins in the Interchromosomal Nuclear Compartment

and Modulates CP190 Binding to Chromatin PloS one 10:e0140991 doi:10.1371/journal.pone.0140991

75. Golovnin A, Melnikova L, Volkov I, Kostuchenko M, Galkin AV, Georgiev P (2008) 'Insulator

bodies' are aggregates of proteins but not of insulators EMBO reports 9:440-445 doi:10.1038/embor.2008.32

76. Golovnin A, Volkov I, Georgiev P (2012) SUMO conjugation is required for the assembly of

Drosophila Su(Hw) and Mod(mdg4) into insulator bodies that facilitate insulator complex formation J Cell Sci 125:2064-2074 doi:10.1242/jcs.100172

77. Gruzdeva N, Kyrchanova O, Parshikov A, Kullyev A, Georgiev P (2005) The Mcp element

from the bithorax complex contains an insulator that is capable of pairwise interactions and can facilitate enhancer-promoter communication Molecular and cellular biology 25:36823689 doi:10.1128/MCB.25.9.3682-3689.2005

78. Gyurkovics H, Gausz J, Kummer J, Karch F (1990) A new homeotic mutation in the

Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation The EMBO journal 9:2579-2585

79. Haarhuis JHI et al. (2017) The Cohesin Release Factor WAPL Restricts Chromatin Loop

Extension Cell 169:693-707 e614 doi:10.1016/j.cell.2017.04.013

80. Hagstrom K, Muller M, Schedl P (1996) Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to

ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex Genes & development 10:3202-3215 doi:10.1101/gad.10.24.3202

81. Han L, Lee DH, Szabo PE (2008) CTCF is the master organizer of domain-wide allele-specific

chromatin at the H19/Igf2 imprinted region Molecular and cellular biology 28:1124-1135 doi:10.1128/MCB.01361-07

82. Handoko L et al. (2011) CTCF-mediated functional chromatin interactome in pluripotent cells

Nature genetics 43:630-638 doi:10.1038/ng.857

83. Hark AT, Schoenherr CJ, Katz DJ, Ingram RS, Levorse JM, Tilghman SM (2000) CTCF

mediates methylation-sensitive enhancer-blocking activity at the H19/Igf2 locus Nature 405:486-489 doi:10.1038/35013106

84. Harrison DA, Gdula DA, Coyne RS, Corces VG (1993) A leucine zipper domain of the

suppressor of Hairy-wing protein mediates its repressive effect on enhancer function Genes & development 7:1966-1978

85. Hart CM, Zhao K, Laemmli UK (1997) The scs' boundary element: characterization of

boundary element-associated factors Molecular and cellular biology 17:999-1009 doi:10.1128/mcb.17.2.999

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

Heath H et al. (2008) CTCF regulates cell cycle progression of alphabeta T cells in the thymus

The EMBO journal 27:2839-2850 doi:10.1038/emboj.2008.214 Herold M, Bartkuhn M, Renkawitz R (2012) CTCF: insights into insulator function during

development Development 139:1045-1057 doi:10.1242/dev.065268 Hogga I, Mihaly J, Barges S, Karch F (2001) Replacement of Fab-7 by the gypsy or scs insulator disrupts long-distance regulatory interactions in the Abd-B gene of the bithorax complex Molecular cell 8:1145-1151 doi:10.1016/s1097-2765(01 )003 77-x Holdridge C, Dorsett D (1991) Repression of hsp70 heat shock gene transcription by the

suppressor of hairy-wing protein of Drosophila melanogaster Mol Cell Biol 11: 1894-1900 Holohan EE et al. (2007) CTCF genomic binding sites in Drosophila and the organisation of

the bithorax complex PLoS genetics 3:e112 doi:10.1371/journal.pgen.0030112 Hons MT et al. (2016) Topology and structure of an engineered human cohesin complex bound

to Pds5B Nature communications 7:12523 doi:10.1038/ncomms12523 Hoover KK, Gerasimova TI, Chien AJ, Corces VG (1992) Dominant effects of suppressor of Hairy-wing mutations on gypsy-induced alleles of forked and cut in Drosophila melanogaster Genetics 132:691-697 Hug CB, Grimaldi AG, Kruse K, Vaquerizas JM (2017) Chromatin Architecture Emerges during Zygotic Genome Activation Independent of Transcription Cell 169:216-228 e219 doi:10.1016/j.cell.2017.03.024 Iampietro C, Cleard F, Gyurkovics H, Maeda RK, Karch F (2008) Boundary swapping in the

Drosophila Bithorax complex Development 135:3983-3987 doi:10.1242/dev.025700 Iampietro C, Gummalla M, Mutero A, Karch F, Maeda RK (2010) Initiator elements function to determine the activity state of BX-C enhancers PLoS genetics 6:e1001260 doi:10.1371/journal.pgen.1001260 Iuchi S (2001) Three classes of C2H2 zinc finger proteins Cellular and molecular life sciences :

CMLS 58:625-635 doi:10.1007/PL00000885 Jack J, Dorsett D, Delotto Y, Liu S (1991) Expression of the cut locus in the Drosophila wing margin is required for cell type specification and is regulated by a distant enhancer Development 113:735-747 Jiang F, Doudna JA (2017) CRISPR-Cas9 Structures and Mechanisms Annual review of

biophysics 46:505-529 doi:10.1146/annurev-biophys-062215-010822 Jiang N, Emberly E, Cuvier O, Hart CM (2009) Genome-wide mapping of boundary element-associated factor (BEAF) binding sites in Drosophila melanogaster links BEAF to transcription Molecular and cellular biology 29:3556-3568 doi:10.1128/MCB.01748-08

100. Kanduri C et al. (2000) Functional association of CTCF with the insulator upstream of the H19

gene is parent of origin-specific and methylation-sensitive Current biology : CB 10:853856 doi:10.1016/s0960-9822(00)00597-2

101. Kaushal, A., Dorier, J., Wang, B., Mohana, G., Taschner, M., Cousin, P., Waridel, P., Iseli, C.,

Semenova, A., Restrepo, S., Guex, N., Aiden, E.L., Gambetta, M.C., 2022. Essential role of Cp190 in physical and regulatory boundary formation. Sci Adv 8, eabl8834. https://doi.org/10.1126/sciadv.abl8834

102. Kaushal, A., Mohana, G., Dorier, J., Özdemir, I., Omer, A., Cousin, P., Semenova, A.,

Taschner, M., Dergai, O., Marzetta, F., Iseli, C., Eliaz, Y., Weisz, D., Shamim, M.S., Guex, N., Lieberman Aiden, E., Gambetta, M.C., 2021. CTCF loss has limited effects on global genome architecture in Drosophila despite critical regulatory functions. Nat Commun 12, 1011. https://doi. org/10.103 8/s41467-021-21366-2

103. Kaufman PD, Doll RF, Rio DC (1989) Drosophila P element transposase recognizes internal P

element DNA sequences Cell 59:359-371 doi:10.1016/0092-8674(89)90297-3

104. Kellum R, Schedl P (1991) A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal

domains Cell 64:941-950 doi:10.1016/0092-8674(91)90318-s

105. Kellum R, Schedl P (1992) A group of scs elements function as domain boundaries in an

enhancer-blocking assay Molecular and cellular biology 12:2424-2431 doi:10.1128/mcb.12.5.2424

106. Kim J, Shen B, Rosen C, Dorsett D (1996) The DNA-binding and enhancer-blocking domains

of the Drosophila suppressor of Hairy-wing protein Molecular and cellular biology 16:3381-3392

107. King MR, Matzat LH, Dale RK, Lim SJ, Lei EP (2014) The RNA-binding protein

Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner Journal of cell science 127:2956-2966 doi:10.1242/jcs.151126

108. Kostyuchenko M, Savitskaya E, Koryagina E, Melnikova L, Karakozova M, Georgiev P (2009)

Zeste can facilitate long-range enhancer-promoter communication and insulator bypass in Drosophila melanogaster Chromosoma 118:665-674 doi:10.1007/s00412-009-0226-4

109. Krivega M, Savitskaya E, Krivega I, Karakozova M, Parshikov A, Golovnin A, Georgiev P

(2010) Interaction between a pair of gypsy insulators or between heterologous gypsy and Wari insulators modulates Flp site-specific recombination in Drosophila melanogaster Chromosoma 119:425-434 doi:10.1007/s00412-010-0268-7

110. Kuhn EJ, Viering MM, Rhodes KM, Geyer PK (2003) A test of insulator interactions in

Drosophila The EMBO journal 22:2463-2471 doi:10.1093/emboj/cdg241

111. Kurshakova M, Maksimenko O, Golovnin A, Pulina M, Georgieva S, Georgiev P, Krasnov A

(2007) Evolutionarily conserved E(y)2/Sus1 protein is essential for the barrier activity of Su(Hw)-dependent insulators in Drosophila Molecular cell 27:332-338 doi:10.1016/j.molcel.2007.05.035

112. Kurukuti S et al. (2006) CTCF binding at the H19 imprinting control region mediates

maternally inherited higher-order chromatin conformation to restrict enhancer access to Igf2 Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 103:10684-10689 doi:10.1073/pnas.0600326103

113. Kwon, S.Y., Grisan, V., Jang, B., Herbert, J., Badenhorst, P., 2016. Genome-Wide Mapping

Targets of the Metazoan Chromatin Remodeling Factor NURF Reveals Nucleosome Remodeling at Enhancers, Core Promoters and Gene Insulators. PLoS Genet 12, e1005969. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1005969

114. Kyrchanova O, Chetverina D, Maksimenko O, Kullyev A, Georgiev P (2008a) Orientation-

dependent interaction between Drosophila insulators is a property of this class of regulatory elements Nucleic acids research 36:7019-7028 doi:10.1093/nar/gkn781

115. Kyrchanova O, Georgiev P (2014) Chromatin insulators and long-distance interactions in

Drosophila FEBS letters 588:8-14 doi:10.1016/j.febslet.2013.10.039

116. Kyrchanova O, Ivlieva T, Toshchakov S, Parshikov A, Maksimenko O, Georgiev P (2011)

Selective interactions of boundaries with upstream region of Abd-B promoter in Drosophila bithorax complex and role of dCTCF in this process Nucleic acids research 39:3042-3052 doi:10.1093/nar/gkq1248

117. Kyrchanova O, Leman D, Parshikov A, Fedotova A, Studitsky V, Maksimenko O, Georgiev P

(2013a) New properties of Drosophila scs and scs' insulators PloS one 8:e62690 doi:10.1371/journal.pone.0062690

118. Kyrchanova O, Maksimenko O, Stakhov V, Ivlieva T, Parshikov A, Studitsky VM, Georgiev P

(2013b) Effective blocking of the white enhancer requires cooperation between two main mechanisms suggested for the insulator function PLoS genetics 9:e1003606 doi:10.1371/journal.pgen.1003606

119. Kyrchanova O, Toshchakov S, Parshikov A, Georgiev P (2007) Study of the functional

interaction between Mcp insulators from the Drosophila bithorax complex: effects of insulator pairing on enhancer-promoter communication Molecular and cellular biology 27:3035-3043 doi:10.1128/MCB.02203-06

120. Kyrchanova O, Toshchakov S, Podstreshnaya Y, Parshikov A, Georgiev P (2008b) Functional

interaction between the Fab-7 and Fab-8 boundaries and the upstream promoter region in

the Drosophila Abd-B gene Molecular and cellular biology 28:4188-4195 doi:10.1128/MCB.00229-08

121. Kyrchanova O, Zolotarev N, Mogila V, Maksimenko O, Schedl P, Georgiev P (2017)

Architectural protein Pita cooperates with dCTCF in organization of functional boundaries in Bithorax complex Development 144:2663-2672 doi:10.1242/dev.149815

122. Labrador M, Corces VG (2002) Setting the boundaries of chromatin domains and nuclear

organization Cell 111:151-154 doi:10.1016/s0092-8674(02)01004-8

123. Lahn BT, Tang ZL, Zhou J, Barndt RJ, Parvinen M, Allis CD, Page DC (2002) Previously

uncharacterized histone acetyltransferases implicated in mammalian spermatogenesis Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99:8707-8712 doi:10.1073/pnas.082248899

124. Lei EP, Corces VG (2006) RNA interference machinery influences the nuclear organization of

a chromatin insulator Nature genetics 38:936-941 doi:10.1038/ng1850

125. Levis R, Hazelrigg T, Rubin GM (1985) Effects of genomic position on the expression of

transduced copies of the white gene of Drosophila Science 229:558-561 doi:10.1126/science.2992080

126. Lhoumaud, P., Hennion, M., Gamot, A., Cuddapah, S., Queille, S., Liang, J., Micas, G.,

Morillon, P., Urbach, S., Bouchez, O., Severac, D., Emberly, E., Zhao, K., Cuvier, O., 2014. Insulators recruit histone methyltransferase dMes4 to regulate chromatin of flanking genes. The EMBO Journal 33, 1599-1613. https://doi.org/10.15252/embj.201385965

127. Li HB, Muller M, Bahechar IA, Kyrchanova O, Ohno K, Georgiev P, Pirrotta V (2011)

Insulators, not Polycomb response elements, are required for long-range interactions between Polycomb targets in Drosophila melanogaster Molecular and cellular biology 31:616-625 doi:10.1128/MCB.00849-10

128. Li M, Ma Z, Liu JK, Roy S, Patel SK, Lane DC, Cai HN (2015) An Organizational Hub of

Developmentally Regulated Chromatin Loops in the Drosophila Antennapedia Complex Molecular and cellular biology 35:4018-4029 doi:10.1128/MCB.00663-15

129. Li T et al. (2008) CTCF regulates allelic expression of Igf2 by orchestrating a promoter-

polycomb repressive complex 2 intrachromosomal loop Molecular and cellular biology 28:6473-6482 doi:10.1128/MCB.00204-08

130. Liang J et al. (2014) Chromatin immunoprecipitation indirect peaks highlight long-range

interactions of insulator proteins and Pol II pausing Molecular cell 53:672-681 doi:10.1016/j.molcel.2013.12.029

131. Liu, S., Yu, H., Liu, Y., Liu, Xinhua, Zhang, Y., Bu, C., Yuan, S., Chen, Z., Xie, G., Li, W.,

Xu, B., Yang, J., He, L., Jin, T., Xiong, Y., Sun, L., Liu, Xiaohui, Han, C., Cheng, Z.,

Liang, J., Shang, Y., 2017. Chromodomain Protein CDYL Acts as a Crotonyl-CoA Hydratase to Regulate Histone Crotonylation and Spermatogenesis. Molecular Cell 67, 853-866.e5. https://doi.org/10.1016/j.molcel.2017.07.011

132. Liu, Y., Liu, S., Yuan, S., Yu, H., Zhang, Y., Yang, X., Xie, G., Chen, Z., Li, W., Xu, B., Sun,

L., Shang, Y., Liang, J., 2017. Chromodomain protein CDYL is required for transmission/restoration of repressive histone marks. Journal of Molecular Cell Biology 9, 178-194. https://doi.org/10.1093/jmcb/mjx013

133. Liu Z, Scannell DR, Eisen MB, Tjian R (2011) Control of embryonic stem cell lineage

commitment by core promoter factor, TAF3 Cell 146:720-731 doi:10.1016/j.cell.2011.08.005

134. Lu Q, Wallrath LL, Granok H, Elgin SC (1993) (CT)n (GA)n repeats and heat shock elements

have distinct roles in chromatin structure and transcriptional activation of the Drosophila hsp26 gene Molecular and cellular biology 13:2802-2814 doi:10.1128/mcb.13.5.2802

135. Lupas, A., Van Dyke, M., Stock, J., 1991. Predicting Coiled Coils from Protein Sequences.

Science 252, 1162-1164. https://doi.org/10.1126/science.252.5009.1162

136. Maksimenko O et al. (2015) Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to

chromatin Genome research 25:89-99 doi:10.1101/gr.174169.114

137. Maksimenko O, Georgiev P (2014) Mechanisms and proteins involved in long-distance

interactions Front Genet 5:28 doi:10.3389/fgene.2014.00028

138. Maksimenko O, Golovnin A, Georgiev P (2008) Enhancer-promoter communication is

regulated by insulator pairing in a Drosophila model bigenic locus Molecular and cellular biology 28:5469-5477 doi:10.1128/MCB.00461-08

139. Mallin DR, Myung JS, Patton JS, Geyer PK (1998) Polycomb group repression is blocked by

the Drosophila suppressor of Hairy-wing [su(Hw)] insulator Genetics 148:331-339

140. Matzat LH, Dale RK, Moshkovich N, Lei EP (2012) Tissue-specific regulation of chromatin

insulator function PLoS genetics 8:e1003069 doi:10.1371/journal.pgen.1003069

141. Mazur, A.M., Georgiev, P.G., Golovnin, A.K., 2005. The acid domain located at the C-

terminus of the Su(Hw) protein represses transcription in the yeast two-hybrid system. Dokl Biochem Biophys 400, 1-3. https://doi.org/10.1007/s10628-005-0018-6

142. Melnikova L et al. (2019a) The same domain of Su(Hw) is required for enhancer blocking and

direct promoter repression Scientific reports 9 doi:Artn 5314 10.1038/S41598-019-41761-6

143. Melnikova L, Juge F, Gruzdeva N, Mazur A, Cavalli G, Georgiev P (2004) Interaction between

the GAGA factor and Mod(mdg4) proteins promotes insulator bypass in Drosophila Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 101:14806-14811 doi:10.1073/pnas.0403959101

144. Melnikova L, Kostuchenko M, Silicheva M, Georgiev P (2008) Drosophila gypsy insulator and

yellow enhancers regulate activity of yellow promoter through the same regulatory element Chromosoma 117:137-145 doi:10.1007/s00412-007-0132-6

145. Melnikova L, Kostyuchenko M, Molodina V, Parshikov A, Georgiev P, Golovnin A (2017a)

Multiple interactions are involved in a highly specific association of the Mod(mdg4)-67.2 isoform with the Su(Hw) sites in Drosophila Open biology 7 doi:10.1098/rsob.170150

146. Melnikova L, Kostyuchenko M, Molodina V, Parshikov A, Georgiev P, Golovnin A (2018a)

Interactions between BTB domain of CP190 and two adjacent regions in Su(Hw) are required for the insulator complex formation Chromosoma 127:59-71 doi:10.1007/s00412-017-0645-6

147. Melnikova L, Kostyuchenko M, Parshikov A, Georgiev P, Golovnin A (2018b) Role of

Su(Hw) zinc finger 10 and interaction with CP190 and Mod(mdg4) proteins in recruiting the Su(Hw) complex to chromatin sites in Drosophila PloS one 13:e0193497 doi:10.1371/journal.pone.0193497

148. Melnikova L, Molodina V, Erokhin M, Georgiev P, Golovnin A (2019b) HIPP1 stabilizes the

interaction between CP190 and Su(Hw) in the Drosophila insulator complex Scientific reports 9:19102 doi:10.1038/s41598-019-55617-6

149. Melnikova L, Shapovalov I, Kostyuchenko M, Georgiev P, Golovnin A (2017b) EAST affects

the activity of Su(Hw) insulators by two different mechanisms in Drosophila melanogaster Chromosoma 126:299-311 doi:10.1007/s00412-016-0596-3

150. Melnikova, L.S., Georgiev, P.G., Golovnin, A.K., 2020. The Functions and Mechanisms of

Action of Insulators in the Genomes of Higher Eukaryotes. Acta Naturae 12, 15-33. https://doi.org/10.32607/actanaturae. 11144

151. Merkenschlager M, Odom DT (2013) CTCF and cohesin: linking gene regulatory elements

with their targets Cell 152:1285-1297 doi:10.1016/j.cell.2013.02.029

152. Modolell J, Bender W, Meselson M (1983) Drosophila melanogaster mutations suppressible by

the suppressor of Hairy-wing are insertions of a 7.3-kilobase mobile element Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80:1678-1682 doi:10.1073/pnas.80.6.1678

153. Mohan M et al. (2007) The Drosophila insulator proteins CTCF and CP190 link enhancer

blocking to body patterning EMBO J 26:4203-4214 doi:10.1038/sj.emboj.7601851

154. Moon H et al. (2005) CTCF is conserved from Drosophila to humans and confers enhancer

blocking of the Fab-8 insulator EMBO Rep 6:165-170 doi:10.1038/sj.embor.7400334

155. Morcillo P, Rosen C, Baylies MK, Dorsett D (1997) Chip, a widely expressed chromosomal

protein required for segmentation and activity of a remote wing margin enhancer in Drosophila Genes & development 11:2729-2740 doi:10.1101/gad. 11.20.2729

156. Muravyova E, Golovnin A, Gracheva E, Parshikov A, Belenkaya T, Pirrotta V, Georgiev P

(2001) Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators Science 291:495498 doi:10.1126/science.291.5503.495

157. Najafabadi HS et al. (2015) C2H2 zinc finger proteins greatly expand the human regulatory

lexicon Nature biotechnology 33:555-562 doi:10.1038/nbt.3128

158. Nakahashi H et al. (2013) A genome-wide map of CTCF multivalency redefines the CTCF

code Cell reports 3:1678-1689 doi:10.1016/j.celrep.2013.04.024

159. Narendra V, Rocha PP, An D, Raviram R, Skok JA, Mazzoni EO, Reinberg D (2015) CTCF

establishes discrete functional chromatin domains at the Hox clusters during differentiation Science 347:1017-1021 doi:10.1126/science.1262088

160. Negre N et al. (2011) A cis-regulatory map of the Drosophila genome Nature 471:527-531

doi:10.103 8/nature09990

161. Negre N et al. (2010) A comprehensive map of insulator elements for the Drosophila genome

PLoS genetics 6:e1000814 doi:10.1371/journal.pgen.1000814

162. Nora EP et al. (2017) Targeted Degradation of CTCF Decouples Local Insulation of

Chromosome Domains from Genomic Compartmentalization Cell 169:930-944 e922 doi:10.1016/j.cell.2017.05.004

163. Ohlsson R, Lobanenkov V, Klenova E (2010) Does CTCF mediate between nuclear

organization and gene expression? BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology 32:37-50 doi:10.1002/bies.200900118

164. Oliver D, Sheehan B, South H, Akbari O, Pai CY (2010) The chromosomal

association/dissociation of the chromatin insulator protein Cp190 of Drosophila melanogaster is mediated by the BTB/POZ domain and two acidic regions BMC Cell Biol 11:101 doi: 10.1186/1471-2121-11-101

165. Ortabozkoyun, H., Huang, P.-Y., Cho, H., Narendra, V., LeRoy, G., Gonzalez-Buendia, E.,

Skok, J.A., Tsirigos, A., Mazzoni, E.O., Reinberg, D., 2022. CRISPR and biochemical screens identify MAZ as a cofactor in CTCF-mediated insulation at Hox clusters. Nat Genet 54, 202-212. https://doi.org/10.1038/s41588-021-01008-5

166. Pagans S, Ortiz-Lombardia M, Espinas ML, Bernues J, Azorin F (2002) The Drosophila

transcription factor tramtrack (TTK) interacts with Trithorax-like (GAGA) and represses GAGA-mediated activation Nucleic acids research 30:4406-4413

167. Page AR et al. (2005) Spotted-dick, a zinc-finger protein of Drosophila required for expression

of Orc4 and S phase The EMBO journal 24:4304-4315 doi:10.1038/sj.emboj.7600890

168. Pai CY, Lei EP, Ghosh D, Corces VG (2004) The centrosomal protein CP190 is a component

of the gypsy chromatin insulator Molecular cell 16:737-748 doi:10.1016/j.molcel.2004.11.004

169. Parelho V et al. (2008) Cohesins functionally associate with CTCF on mammalian

chromosome arms Cell 132:422-433 doi:10.1016/j.cell.2008.01.011

170. Parkhurst SM, Harrison DA, Remington MP, Spana C, Kelley RL, Coyne RS, Corces VG

(1988) The Drosophila su(Hw) gene, which controls the phenotypic effect of the gypsy transposable element, encodes a putative DNA-binding protein Genes & development 2:1205-1215

171. Parnell TJ, Kuhn EJ, Gilmore BL, Helou C, Wold MS, Geyer PK (2006) Identification of

genomic sites that bind the Drosophila suppressor of Hairy-wing insulator protein Molecular and cellular biology 26:5983-5993 doi:10.1128/MCB.00698-06

172. Parnell TJ, Viering MM, Skjesol A, Helou C, Kuhn EJ, Geyer PK (2003) An endogenous

suppressor of hairy-wing insulator separates regulatory domains in Drosophila Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 100:13436-13441 doi:10.1073/pnas.2333111100

173. Peifer M, Bender W (1986) The anterobithorax and bithorax mutations of the bithorax complex

The EMBO journal 5:2293-2303

174. Perez-Lluch S, Cuartero S, Azorin F, Espinas ML (2008) Characterization of new regulatory

elements within the Drosophila bithorax complex Nucleic acids research 36:6926-6933 doi:10.1093/nar/gkn818

175. Persikov AV, Singh M (2014) De novo prediction of DNA-binding specificities for Cys2His2

zinc finger proteins Nucleic acids research 42:97-108 doi:10.1093/nar/gkt890

176. Phillips-Cremins JE, Corces VG (2013) Chromatin insulators: linking genome organization to

cellular function Molecular cell 50:461-474 doi:10.1016/j.molcel.2013.04.018

177. Phillips-Cremins JE et al. (2013) Architectural protein subclasses shape 3D organization of

genomes during lineage commitment Cell 153:1281-1295 doi:10.1016/j.cell.2013.04.053

178. Pirrotta V, Steller H, Bozzetti MP (1985) Multiple upstream regulatory elements control the

expression of the Drosophila white gene The EMBO journal 4:3501-3508

179. Plevock KM, Galletta BJ, Slep KC, Rusan NM (2015) Newly Characterized Region of CP190

Associates with Microtubules and Mediates Proper Spindle Morphology in Drosophila Stem Cells PloS one 10:e0144174 doi:10.1371/journal.pone.0144174

180. Pokholkova GV, Demakov SA, Andreenkov OV, Andreenkova NG, Volkova EI, Belyaeva ES,

Zhimulev IF (2018) Tethering of CHROMATOR and dCTCF proteins results in decompaction of condensed bands in the Drosophila melanogaster polytene chromosomes but does not affect their transcription and replication timing PloS one 13:e0192634 doi:10.1371/journal.pone.0192634

181. Port, F., Chen, H.-M., Lee, T., Bullock, S.L., 2014. Optimized CRISPR/Cas tools for efficient

germline and somatic genome engineering in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A 111, E2967-2976. https://doi.org/10.1073/pnas. 1405500111

182. Qian S, Varjavand B, Pirrotta V (1992) Molecular analysis of the zeste-white interaction

reveals a promoter-proximal element essential for distant enhancer-promoter communication Genetics 131:79-90

183. Ramirez F et al. (2018) High-resolution TADs reveal DNA sequences underlying genome

organization in flies Nature communications 9:189 doi:10.1038/s41467-017-02525-w

184. Razin SV, Borunova VV, Maksimenko OG, Kantidze OL (2012) Cys2His2 zinc finger protein

family: classification, functions, and major members Biochemistry Biokhimiia 77:217-226 doi:10.1134/S0006297912030017

185. Redolfi J et al. (2019) DamC reveals principles of chromatin folding in vivo without

crosslinking and ligation Nature structural & molecular biology 26:471-480 doi:10.103 8/s41594-019-0231 -0

186. Ren L, Shi M, Wang Y, Yang Z, Wang X, Zhao Z (2012) CTCF and cohesin cooperatively

mediate the cell-type specific interchromatin interaction between Bcl11b and Arhgap6 loci Molecular and cellular biochemistry 360:243-251 doi:10.1007/s11010-011-1063-3

187. Rodin S, Kyrchanova O, Pomerantseva E, Parshikov A, Georgiev P (2007) New properties of

Drosophila fab-7 insulator Genetics 177:113-121 doi:10.1534/genetics.107.075887

188. Roseman RR, Johnson EA, Rodesch CK, Bjerke M, Nagoshi RN, Geyer PK (1995) A P

element containing suppressor of hairy-wing binding regions has novel properties for mutagenesis in Drosophila melanogaster Genetics 141:1061-1074

189. Roseman RR, Pirrotta V, Geyer PK (1993) The su(Hw) protein insulates expression of the

Drosophila melanogaster white gene from chromosomal position-effects The EMBO journal 12:435-442

190. Rowley MJ et al. (2017) Evolutionarily Conserved Principles Predict 3D Chromatin

Organization Molecular cell 67:837-852 e837 doi:10.1016/j.molcel.2017.07.022

191. Sanborn AL et al. (2015) Chromatin extrusion explains key features of loop and domain

formation in wild-type and engineered genomes Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 112:E6456-6465 doi:10.1073/pnas.1518552112

192

193

194

195

196

197

198

199

200

201

202

203

204

205

Sanyal A, Lajoie BR, Jain G, Dekker J (2012) The long-range interaction landscape of gene

promoters Nature 489:109-113 doi:10.103 8/nature 11279 Savitskaya E et al. (2006) Study of long-distance functional interactions between Su(Hw) insulators that can regulate enhancer-promoter communication in Drosophila melanogaster Molecular and cellular biology 26:754-761 doi:10.1128/MCB.26.3.754-761.2006 Schoborg, T., Rickels, R., Barrios, J., Labrador, M., 2013. Chromatin insulator bodies are nuclear structures that form in response to osmotic stress and cell death. Journal of Cell Biology 202, 261-276. https://doi.org/10.1083/jcb.201304181 Schwartz YB et al. (2012) Nature and function of insulator protein binding sites in the

Drosophila genome Genome research 22:2188-2198 doi:10.1101/gr.138156.112 Schwarzer W et al. (2017) Two independent modes of chromatin organization revealed by

cohesin removal Nature 551:51-56 doi:10.1038/nature24281 Schweinsberg S, Hagstrom K, Gohl D, Schedl P, Kumar RP, Mishra R, Karch F (2004) The enhancer-blocking activity of the Fab-7 boundary from the Drosophila bithorax complex requires GAGA-factor-binding sites Genetics 168:1371-1384