Исследование путей транспорта и катаболизма глюкозы в клетках Pantoea ananatis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Андреева, Ирина Георгиевна

• Андреева, Ирина Георгиевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Андреева, Ирина Георгиевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность.

Цели и задачи.

Научная новизна и практическая значимость работы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Реконструкция метаболизма в масштабах генома.

1.1.1 Аннотация генома.

1.1.1.1 Картирование генов.

1.1.1.2 Базы данных аннотированных геномов.

1.1.1.3 Функциональная аннотация.

1.1.2 Метаболическая реконструкция.

1.1.2.1 Анализ пробелов в метаболической реконструкции.

1.1.2.2 Метаболические модели.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование путей транспорта и катаболизма глюкозы в клетках Pantoea ananatis»

Актуальность

РаМоеа стапаШ - один из представителей семейства энтеробактерий, различные штаммы которого известны как растительные патогены либо эпифиты. В последние десять лет данный вид привлекает к себе всё большее внимание исследователей поскольку, с одной стороны, он оказался распространённым и опасным патогеном растений, а с другой его природные штаммы способны продуцировать целый ряд полезных веществ (например, каротиноиды, 2,3-бутандиол и т.д.). Учитывая способность Р. апапаИь быстро расти на простых минимальных средах, содержащих глюкозу, сахарозу и другие углеводы и углеводороды (Мопуа е/ а1., 1999), данный вид можно рассматривать как перспективный объект биотехнологии.

На момент окончания экспериментов данной работы были секвенированы и аннотированы геномы только четырёх штаммов рода РаМоеа, два из которых относятся к виду Р. апапаИБ. При этом два генома (РаШоеа хр. А1-9Ь и Р. апапаШ ЬМС20103) принадлежат патогенным штаммам и один геном принадлежит штамму Рап1оеа уа%ат С9-1, используемому в сельском хозяйстве в качестве биопротектора. За период подготовки работы к публикации геномы ещё двух штаммов Р. апапаШ были секвенированы и аннотированы.

Объект настоящего исследования - штамм Р. апапаШ АЛ3355, относящийся к первому уровню биобезопасности (непатогенный штамм), на базе которого в настоящее время создаётся ряд штаммов-продуцентов, часть из которых уже находится на стадии промышленного внедрения. Составление подробной аннотации генома данного штамма и реконструкция его центрального метаболизма, несомненно, является актуальной и практически значимой задачей. С другой стороны, сравнение геномов Р. апапаШ АД 13355 и Ь]УЮ20103 могло бы пролить свет на генетическую природу патогенности последнего штамма.

Современные методы секвенирования, доступные программные средства и обширные базы данных, содержащие последовательности ДНК и белков позволяют быстро определять полные нуклеотидные последовательности бактериальных геномов, составлять их аннотации и реконструировать метаболические пути.

Однако экспериментальная проверка предсказанных моделей зачастую не проводится или существенно задерживается, что определяется отсутствием эффективных генноинженерных методов для конкретного исследуемого организма. Поэтому экспериментальная проверка функционирования предсказанных метаболических путей, поиск новых ферментов, специфических для данного вида или рода, представляет большой научный и практический интерес.

Цели и задачи

Диссертационная работа посвящена реконструкции путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Pantoea ananatis и экспериментальной проверке их функционирования.

В процессе работы решались следующие задачи:

• аннотация генома и теоретическая реконструкция путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Р. ananatis;

• экспериментальное подтверждение функционирования и оценка относительного вклада и взаимозаменяемости предсказанных путей транспорта и катаболизма D-глюкозы клетками Р. ananatis;

• изучение генов Р. ananatis, представляющих потенциальный интерес с точки зрения их использования в метаболической инженерии штаммов-продуцентов на базе Е. coli и других энтеробактерий.

Научная новизна и практическая значимость работы

• В диссертационной работе составлена подробная аннотация генома Р. ananatis AJ13355 и проведена теоретическая реконструкция центрального углеродного метаболизма для данной бактерии.

• Ранее в нашей лаборатории были успешно адаптированы для использования в Р. ananatis все наиболее эффективные методы прецизионной модификации хромосомы Е. coli, основанные на использовании системы гомологичной рекомбинации фага X и систем сайт-специфической рекомбинации. Это позволило нам в данной работе не только теоретически реконструировать центральный метаболизм углерода, но и, впервые для Pantoea, провести полную экспериментальную проверку построенной теоретической схемы. Было экспериментально подтверждено существование предсказанных путей транспорта и катаболизма глюкозы (фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы (PTS), Н^-симпортёров (GalP, XylE, FucP), глюкозодегидрогеназного пути, пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса и пентозофосфатного пути) в клетках Р. ananatis, показаны их одновременное функционирование и взаимная заменяемость, обнаружены интересные особенности регуляции.

• В ходе работы были обнаружены специфические для Pantoea гены транспорта и катаболизма глюкозы (pcylE, fucP, pqq, pz\vf, pgnd) определяющие интересные особенности метаболизма. Использование найденных генов может быть полезным для повышения эффективности штаммов-продуцентов как на базе Р. ananatis, так и на базе E.coli.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

За последние 100 лет благодаря технологическому прогрессу стало возможным изучение механизмов жизнедеятельности клетки на уровне молекулекул и генов. Было накоплено потрясающее количество информации о работе самых разных компонентов клетки. В настоящее время благодаря развитию информационных технологий и системному подходу исследования накопленные массивы информации стало возможным анализировать и систематизировать, в результате чего стал возможным переход от изучения отдельных генов, регуляторных механизмов и метаболических путей к исследованию клетки как единой системы. На сегодняшний день получаемая в результате секвенирования целого генома информация в совокупности с накопленными экспериментальными данными позволяет не только предсказывать функции отдельных генов, но и строить метаболические карты, проясняя физиологию организма в целом и имеющиеся экспериментальные данные, обнаруживать необычные метаболические пути и исследовать происхождение и эволюцию как отдельных генов, так и целых ансамблей генов.

Первая часть Обзора литературы посвящена новым методам, позволяющим на основе результатов секвенирования строить метаболические карты и предсказывать физиологию клетки. Одним из важных практических результатов такого предсказания становится значительное повышение эффективности работы при создании промышленных штаммов продуцентов. На сегодняшний день для культивирования штаммов-продуцентов часто используют среду с глюкозой. Глюкоза представляет собой высокоэнергетический субстрат, используемый большинством биотехнологически интересных штаммов. Вторая часть Обзора посвящена генетике, регуляции экспрессии генов и взаимодействию метаболических путей в центральном метаболизме бактерий, в частности

Е. соИ, использующей глюкозу в качестве источника углерода;

11 рассматриваются описанные в литературе успешные направленные изменения в работе путей транспорта и катаболизма глюкозы с целью повышения продукции отдельных веществ.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Андреева, Ирина Георгиевна

выводы

Аннотирован и охарактеризован геном Р. апапаНя.

Проведена теоретическая реконструкция путей транспорта и катаболизма О-глюкозы клетками Р. апапаИь.

Показана и исследована работа предсказанных путей транспорта и катаболизма глюкозы: фосфоенолпируват-зависимой фосфотрансферазной системы, глкжозодегидрогеназного пути, транспорт глюкозы низкоаффинными Н^-симпортёрами (Оа1Р, Ху1Е, БисР), пути Эмбдена-Мейрхофа-Парнаса и пентозофосфатного пути в клетках Р. апапаНя. Показаны их одновременное функционирование и взаимная заменяемость. Исследована регуляция ¿»и/К1/ оперона системы ОпИ периферического метаболизма глюконовой кислоты.

Экспериментально подтверждены функции теоретически идентифицированных генов катаболизма Э-глюкозы клетками Р. апапайз'. £0(1, рдд, 2гм>/ ргт/, ^ и р^с1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Андреева, Ирина Георгиевна, 2012 год

1. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D.J. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. 215: 403-410.

2. Ameyama M., Matsushita K., Ohno Y., Shinagawa E., Adachi O. (1981) Existence of a novel prosthetic group, PQQ, in membrane-bound, electron transport chain-linked, primary dehydrogenases of oxidative bacteria. FEBS Lett. 130: 179-183.

3. Anderson A., Cooper R.A. (1969) Gluconeogenesis in Escherichia coli. The role of trióse phosphate isomerase. FEBS Lett. 4: 19-20.

4. Andreesen J.R., Gottschalk G. (1969) The occurrence of the modified Entner-Doudoroff pathway in Clostridium aceticum. Arch. Microbiol. 69: 160-170.

5. Andreeva A., Howorth D., Brenner S.E., Hubbard T.J., Chothia C., Murzin A.G. (2004) SCOP database in 2004: refinements integrate structure and sequence family data. Nucleic Acids Res. 32: 226-229.

6. Arai M., Okumura K., Satake M., Shimizu T. (2004) Proteome-wide functional classification and identification of prokaryotic transmembrane proteins by transmembrane topology similarity comparison. Protein Sei. 13:2170-2183.

7. Arthur L.O., Bulla L.A.Jr., Julian G.S., Nakamura L.A. (1973) Carbohydrate Metabolism in Agrobacterium tumefaciens. J Bacteriol. 116(1): 304—313.

8. Báez J.L., Bolívar F., Gösset G. (2001) Determination of 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate productivity and yield from glucose in Escherichia coli devoid of the glucose phosphotransferase system. Biotechnol. Bioeng. 6: 530-535.

9. Bairoch A. (2000) The ENZYME database in 2000. Nucleic Acids Res. 28: 304-305.

10. Blangy D., Buc H., Monod J. (1968) Kinetics of the allosteric interactions of phosphofructokinase from Escherichia coli. J. Mol. Biol. 31: 13-35.

11. Blank L.M., Lehmbeck F., Sauer U. (2005) Metabolic-flux and network analysis in fourteen hemiascomycetous yeasts. FEMS Yeast. Res. 5: 545558.

12. Boden M. and Hawkins J. (2005) Prediction of subcellular localisation using sequence-biased recurrent networks. Bioinformatics. 21: 2279-2286.

13. Boonstra B., French C.E., Wainwright I., Bruce N.C. (1999) The udhA gene of Escherichia coli encodes a soluble pyridine nucleotide transhydrogenase. J. Bacteriol. 181: 1030-1034.

14. Bork P., Dandekar T., Diaz-Lazcoz Y., Eisenhaber F., Huynen M., Yuan Y. (1998) Predicting function: from genes to genomes and back. J. Mol. Biol. 283: 707-725.

15. Botsford J. L. and Drexler M. (1978) The cAMP receptor protein and regulation of cAMP synthesis in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 165:47-56.

16. Botsford J. L. and Harman J. G. (1992) Cyclic AMP in prokaryotes. Microbiol. Rev. 56:100-122.

17. Brenner S.E. (1999) Errors in genome annotation. Trends Genet. 15: 132-133.

18. Bringhurst R. M. and Gage D. J. (2002) Control of inducer accumulation plays a key role in succinate-mediated catabolite repression in Sinorhizobium meliloti. J. Bacteriol. 184:5385-5392.

19. Budgen N., Danson M.J. (1986) Metabolism of glucose via a modified Entner-Doudoroff pathway in the thermoacidophilic archaebacterium Thermoplasma acidophilum. FEBS Lett. 196: 207-210.

20. Bulyk M.L., McGuire A.M., Masuda N., Church G.M. (2004) A motif co-occurrence approach for genomewide prediction of transcription-factor-binding sites in Escherichia coli. Genome Res. 14: 201-208.

21. Burgard A.P. and Maranas C.D. (2001) Probing the performance limits of the Escherichia coli metabolic network subject to gene additions or deletions. Biotechnol. Bioeng. 74: 364-375.

22. Cha J.S., Pujol C., Kado C.I. (1997) Identification and characterization of a Pantoea citrea gene encoding glucose dehydrogenase that is essential for causing pink disease of pineapple. Appl. Environ. Microbiol. 63: 71-76.

23. Chin A.M., Feldheim D.A., Saier M.H. Jr. (1989) Altered transcriptional patterns affecting several metabolic pathways in strains of Salmonella typhimurium which overexpress the fructose regulon. J. Bacteriol. 171:2424-2434.

24. Chou C.H., Bennett G.N., San K.Y. (1994) Effect of modulated glucose uptake on high-level recombinant protein production in a dense Escherichia coli culture. Biotechnol. Prog. 10: 644-647.

25. Clarke D.M., Loo T.W., Gillam S., Bragg P.D. (1986) Nucleotide sequence of the pntA and pntB genes encoding the pyridine nucleotide transhydrogenase of Escherichia coli. Eur. J. Biochem. 158: 647-653.33