Химико-ферментативный способ получения аффинного сорбента на основе рекомбинантного аналога белка А тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Терешин Михаил Николаевич

• Терешин Михаил Николаевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Терешин Михаил Николаевич

Оглавление

Введение

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы

Цели и задачи исследования

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Публикации

Апробация результатов работы

Личный вклад автора

Структура диссертации и объем работы

Глава 1. Литературный обзор

1. Аффинные сорбенты для выделения иммуноглобулинов: принцип действия и направления развития

1.1. Белок А как основной лиганд в аффинной хроматографии ^

1.2. Специфичность связывания белка А

1.3. Основные направления инженерии белка А

1.3.1. Увеличение значений рН при элюции

1.3.2. Увеличение устойчивости сорбента к щелочным условиям

1.3.3. Увеличение динамической связывающей емкости

1.4. Подложка / носитель

1.5. Коммерчески доступные сорбенты с модифицированным белком А

2. Способы конъюгации белка А к сорбенту

2.1. Образование ковалетной связи через КШ-группы

2.2. ВВВ-лиганд к целлюлозе через реакцию с образованием основания Шиффа

2.3. Образование ковалентной связи через SH-группу

2.3.1. ZZZ-Cys-His(x6)-лиганд к агарозе Sepharose 6FF

2.3.2. Z-Cys, ZZ-Cys и ZZZZZ-Cys к тиопропил-сефарозе Sepharose 6B

2.4. Альтернативные методы иммобилизации белков на носитель

2.4.1. Введение неприродных аминокислот

2.4.2. SpyCatcher/SpyTag conjugation

2.4.3. SNAP-tag

2.4.4. Белковый сплайсинг

2.4.5. Ферментативные подходы

3. Сортаза А S. aureus

3.1. Структура и свойства Сортазы А

3.2. Биокаталитическая иммобилизация белков осуществляемая сортазой А

4. Заключение по литературному обзору

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Материалы и реагенты

2.1.1. Реактивы

2.1.2. Оборудование

2.2 Получение рекомбинантных белков BsrtA-C и BsrtA

2.2.1. Создание штаммов-продуцентов E. coli BL21(DE3)/pET32a-PDBA-1 и E. coli BL21 (DE3)/pKanR-par101 -BDPA

2.2.2. Получение биомассы штаммов E. coli BL21(DE3)/pET32a-PDBA-1 и E. coli BL21 (DE3)/pKanR-par101 -BDPA

2.2.3. Получение клеточного лизата при помощи ультразвукового (УЗ) дезинтегратора

2.2.4. Получение клеточного лизата при помощи проточного дезинтегратора типа пресса Френча

2.2.5. Обогащение клеточного лизата по целевому белку

2.2.6. Очистка на катионообменном сорбенте Macroprep High S

2.2.7. Очистка на аффинном сорбенте Ni IMAC Sepfast

2.2.8. Обессоливание на катионообменном сорбенте Macroprep High S

2.3. Получение рекомбинантной Сортазы А

2.3.1. Создание штамма-продуцента E. coli BL21(DE3)/pET21a-Sort6

2.3.2. Получение биомассы штамма E. coli BL21(DE3)/pET21a-Sort6

2.3.3. Получение клеточного лизата

2.3.4. Очистка на аффинном сорбенте Ni IMAC Sepfast

2.4. Получение активированных полиглициновых спейсеров для модификации сефарозы

2.4.1. Синтез сукцинимидного эфира диглицина Boc-Gly-Gly-OSu)

2.4.2. Общая методика синтеза Boc-защищенных полиглицинов (n =3, 4, 5)

2.5. Получение модифицированных матриц для получения аффинных сорбентов69

2.5.1. Эпоксиактивация гидроксильных групп агарозы диглицидиловым эфиром 1,4-бутандиола (BDDE) или эпихлоргидрином (ECH)

2.5.2. Получение аминоэтил- и аминобутил-сефарозы

2.6. Химическая иммобилизация BsrtA-C через терминальный цистеин на 6% кросс-сшитой агарозе Fast Flow

2.7. Ферментативная иммобилизация белка BsrtA-С (или BsrtA) на сорбент при помощи сортазы А

2.8. Определение количества иммобилизованного белка

2.9. Определение динамической связывающей способности сорбента (DBC) на модельных антителах

2.10. Определение устойчивости сорбентов к щелочной регенерации

2.11. Определение пропускной способности сорбента RUselect-P при различных скоростях потока

2.12. Выделение антител из культуральной жидкости

2.13. Определение чистоты белков методом аналитической ОФ ВЭЖХ

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Разработка технологии получения лиганда

3.1.1. Дизайн последовательности и создание штамма-продуцента

3.1.2. Разработка методики хроматографической очистки BsrtA-C

3.2. Разработка технологии получения сортазы А

3.2.2. Создание штамма-продуцента Srta-7M

3.2.3. Выделение и очистка сортазы А

3.2.4. Подтверждение активности сортазы А в эксперименте с модельным

субстратом

3.3. Химическая иммобилизация BsrtA-С

3.4. Иммобилизация BsrtA-С под действием сортазы А

3.4.1. Апробация ферментативного способа иммобилизации и сравнение с химическим способом

3.4.2. Поиск условий ферментативной реакции

3.4.3. Подбор матрицы и линкера

3.5. Характеристика сорбентов RUselect-P и RUselect-A

3.6. Использование RUselect-P и RUselect-A в биотехнологическом процессе выделения IgG

3.7. Заключение

Выводы

Список литературы

Приложение 1. ЯМР-спектры

6

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Химико-ферментативный способ получения аффинного сорбента на основе рекомбинантного аналога белка А»

Введение Актуальность темы исследования

Моноклональные антитела (mAbs, от англ. monoclonal antibodies) широко применяются в качестве терапевтических молекул для лечения различных заболеваний (онкология, рассеянный склероз, ревматоидный артрит, болезнь Крона и др.). К 2023 году около 140 mAbs одобрены для использования в медицинской практике или находятся на 2-3 этапах клинических исследований в США и странах Европы [1].

Получение mAbs отличается высокой сложностью. Помимо этапа культивирования клеток-продуцентов, процесс включает в себя многостадийную хроматографическую очистку. Ключевым этапом очистки является аффинная хроматография на сорбентах с иммобилизованным белком А Staphylococcus aureus [2]. Себестоимость данного этапа очистки достигает 60% от общей стоимости получения mAbs. Белок А используется в качестве лиганда, поскольку он характеризуется высокой специфичностью к Fc-фрагменту иммуноглобулинов класса G (IgG) подклассов IgG1, IgG2 и IgG4. Аффинность белка А к IgG достигается за счёт взаимодействия как с антиген-связывающими регионами (Fab), так и с кристаллизующимся фрагментом (Fc) иммуноглобулинов. Комплексы между белком А и Fc-фрагментом иммуноглобулина образуются при нейтральных значениях рН, тогда как при кислых значениях pH при смене заряда боковыми цепями гистидина обоих взаимодействующих белков происходит отталкивание молекул, что приводит к диссоциации комплекса белка А и антитела. Элюция при хроматографии на аффинном сорбенте с иммобилизованным белком А достигается путем снижения pH до кислых значений (pH <4). Однако слишком низкие значения pH могут приводить к олигомеризации антител в элюате, что снижает чистоту конечного продукта [3]. Высокая стоимость сорбентов данного типа обусловлена целым рядом недостатков белка А: относительно высокой стоимостью производства, низкой ёмкостью сорбента, ограниченным количеством циклов использования, устойчивостью к регенерации растворами щелочей, «утечкой» аффинного

лиганда. Учитывая, что сорбенты чаще всего используются многократно, ключевыми характеристиками сорбента наравне с его стоимостью являются удельная емкость сорбента и количество циклов, при которых эффективность сорбента сохраняется. При этом, с одной стороны, необходима высокая связывающая способность лиганда, с другой стороны, в случае высокой аффинности возникает необходимость использовать довольно жесткие условия для диссоциации комплекса «лиганд-целевой продукт», например, элюцию при низком значении рН (pH <3). В связи с вышеизложенным, используемый лиганд должен одновременно эффективно связывать антитела и обеспечивать элюцию в более щадящих условиях, например, при pH >4. Вследствие чего, разработка сорбентов, обладающих необходимыми операционными свойствами, является актуальной задачей.

Степень разработанности темы

В литературе описаны различные подходы к модификации белка А и его фрагментов. Как правило, используют домен B белка А, поскольку он обладает максимальной аффинностью к Fc-фрагменту IgG. Получены мутантные формы домена B, направленные на повышение устойчивости к щелочному гидролизу, увеличение аффинности, а также обеспечивающие возможность проводить элюцию в более мягких условиях [3]. Также разработаны различные способы иммобилизации лиганда. Например, за счет ковалентного присоединения аминогрупп остатков лизина к активированным группам на носителе. Такое неспецифическое образование амидной связи может приводить к частичной потере активности белка в результате неправильной ориентации на поверхности. Сайт-специфическая конъюгация белка А может быть достигнута, если белок обладает единственным доступным реакционноспособным цистеином (Cys) на С-конце. Тиоловая группа аминокислоты подвергается реакции нуклеофильного замещения с образованием стабильных тиоэфирных связей. Данный подход обеспечивает ориентированную иммобилизацию, однако требует многостадийной активации матрицы [4].

В качестве альтернативы химическому способу иммобилизации или конъюгации белков и пептидов используют специфические ферменты. К подобным биотехнологическим инструментам относят сортазу А из S. aureus. Применение сортазы А позволяет лигировать белки и пептиды in vitro для широкого спектра задач, в том числе для сайт-специфичной иммобилизации на твердых носителях [5, 6]. Однако в литературе не описано применение данного фермента для получения аффинных сорбентов в препаративных количествах. Настоящая работа направлена на разработку альтернативного подхода к иммобилизации рекомбинантного белка А при помощи сортазы А.

Цели и задачи исследования

Целью настоящей работы было создание биокаталитического подхода к получению аффинных сорбентов, в том числе на основе белка А. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Получить мутантную форму аналога бактериального белка А, содержащую сайт распознавания сортазы А;

2. Показать принципиальную возможность иммобилизации аналога белка А на поверхности хроматографической смолы под действием сортазы А;

3. Выполнить поиск оптимальной матрицы и условий для иммобилизации, обеспечивающих получение сорбента, сопоставимого по эффективности с существующими коммерческими образцами;

4. Масштабировать полученную методику для получения опытно -промышленных партий сорбента.

Научная новизна работы

Впервые получена новая мутантная форма аналога бактериального белка А, содержащая сайт распознавания сортазы А. Впервые показана возможность иммобилизации аналога белка А на поверхности твердых частиц под действием сортазы А.

Для активации сорбентов были синтезированы не описанные ранее линкеры различной структуры, содержащие олигоглицины, а также впервые показано, что иммобилизация эффективно протекает и в отсутствии олигоглициновых линкеров, при достаточной плотности первичных аминогрупп на поверхности матрицы. Полученные результаты демонстрируют потенциальную возможность получения при помощи сортазы не только аффинных сорбентов с белком А, но и других лигандов, содержащий сайт распознавания сортазы А (LPETG).

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты работы пополняют спектр применения сортазы А в качестве биотехнологического инструмента. Полученные аффинные сорбенты для выделения IgG продемонстрировали устойчивость к щелочному гидролизу (более 150 циклов использования), высокую ёмкость (до 55 мг IgG на 1 мл сорбента), а также способность к элюции в более мягких условиях (при значениях pH до 4,0). Разработанная технология синтеза была масштабирована (до 5 л сорбента за серию). Эффективная иммобилизация аналога белка А свидетельствует о том, что при помощи сортазы А можно получать и другие аффинные сорбенты, содержащие белки и пептиды в качестве лиганда. При этом обеспечивается плотность посадки, сопоставимая с результатами, достигаемыми при помощи классических химических способов иммобилизации. Проведена апробация использования продуктов на площадках отечественных производителей фармацевтической продукции. Сорбенты RUselect были внедрены в ООО «ГЕРОФАРМ» и ФБУН ГНЦ ВБ Вектор Роспотребнадзора.

Методология и методы исследования

Проведен анализ литературных данных по тематике исследования с применением различных баз данных научных публикаций. Экспериментальная часть работы выполнена с использованием современных принципов и методов биотехнологии и молекулярной биологии. Получение лиганда и сортазы А осуществлялась при помощи прокариотической системы экспрессии. Был использован штамм Escherichia coli BL21(DE3). Ферментация штаммов-

продуцентов осуществлялась при помощи ферментёров объемом до 300 л. Очистку лиганда и сортазы А проводили хроматографическими методами (аффинная хроматография, ионообменная хроматография, гель-фильтрационная хроматография). Чистоту белков определяли при помощи электрофореза в ПААГ и аналитической ОФ ВЭЖХ. Тестирование эффективности полученных сорбентов осуществляли так же при помощи хроматографии, с использованием соответствующего программного обеспечения.

Положения, выносимые на защиту

1. Получена мутантная форма рекомбинантного аналога домена B белка А S. areus, содержащая сайт распознавания сортазы А (форма получила название BsrtA).

2. Показана возможность иммобилизация BsrtA под действием сортазы А на агарозной и акрилатной матрицах. Получаемые данным путем сорбенты сопоставимы по эффективности с коммерческими аналогами.

3. Продемонстрирована способность сортазы А катализировать иммобилизацию BsrtA не только на матрицы, активированные олигоглициновыми линкерами, но и на коммерческие матрицы, содержащие первичные аминогруппы.

4. Показана возможность масштабирования биокаталитического синтеза до получения 5 л сорбента за серию.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 научных работ, включая 3 статьи в научных журналах, входящих в Перечень ВАК и в международные базы цитирования Scopus и Web of Science, 1 патент РФ и 4 тезиса докладов.

Апробация результатов работы

Материалы работы были представлены на всероссийской конференции XXXIII «Зимняя международная молодёжная научная школа» (Москва, 2021 год), всероссийской конференция «Синтетическая биология и биофармацевтика» (Новосибирск, 2022 год), всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2023 год), саммите разработчиков лекарственных средств

«Сириус-Биотех» (Сочи, 2023 год), на XI Площадке открытых коммуникаций ОРЕМБЮ (Кольцово, 2024 год), а также на Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные научные исследования в условиях современных вызовов и угроз VII» (Москва, 2024). Работа получила премию Правительства Москвы молодым ученым за 2024 год.

Личный вклад автора

Автор диссертационной работы внес определяющий вклад в полученные результаты, в том числе: анализ литературных данных, планирование и проведение экспериментов (в частности, получение и очистка аффинного лиганда и фермента сортазы А, синтез сорбентов и тестирование их эффективности), обработка полученных данных, а также написание научных статей и выступление на конференциях.

Структура диссертации и объем работы

Работа состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы», «Список литературы» и «Приложение». Работа изложена на 125 страницах, включает 59 рисунков и 14 таблиц. Список литературы содержит 90 источников.

Глава 1. Литературный обзор

1. Аффинные сорбенты для выделения иммуноглобулинов: принцип действия и направления развития

В последнее время интерес к шЛЬб неуклонно растет. Так, к 2023 году более 140 моноклональных антител в качестве терапевтических препаратов разрешены к приему или находятся на 2-3 этапах клинических исследований в США и странах Европы, и согласно последним данным, интерес к ним только растет. К примеру, в 2010 году таких препаратов было менее 30 [1, 7, 8].

В 2022 году мировой рынок mAbs оценивался примерно в 229 млрд. долларов и, как ожидается, вырастет до 692 млрд. долларов при среднегодовом темпе роста 11,7 % до 2030 года [9].

Препаративное получение шЛЬб включает в себя следующие стадии: культивирование клеток млекопитающих, отделение культуральной жидкости и последующее выделение целевого продукта методами хроматографии и ультрафильтрации [2]. Как видно из Рисунка 1.1, аффинная хроматография на сорбентах с иммобилизованным белком А является первым этапом в типовой схеме очистки моноклональных антител из осветленной культуральной жидкости. Вследствие чего от эффективности данной стадии зависит конечный выход и чистота продукта, а также рентабельность производства.

Рисунок 1.1. Типовая технологическая схема получения шЛЬб.

Рассмотрим этап аффинной хроматографии подробнее. В природе Fc-регион иммуноглобулина (от англ. fragment crystallizable region - кристаллизующийся фрагмент) взаимодействует с бактериальными белками А (белок А) и G (белок G, соответственно); легкие цепи иммуноглобулина - с белком L (PpL) (Рисунок 1.2) [10].

mAb

Белок L

Белок А и белок G

IgG

Рисунок 1.2. Схематическое изображение сайтов связывания бактериальных белков А, G и L c антителами при аффинной хроматографии

При этом белок А из S. aureus обладает наиболее высоким сродством к Fc-фрагментам иммуноглобулинов различных подклассов (кроме IgG3) [11]. Поэтому именно белок А и его мутантные формы представляют собой наиболее часто используемые аффинные лиганды для очистки моноклональных антител и других молекул, содержащих фрагменты иммуноглобулинов. Впервые коммерческие сорбенты на основе белка А были представлены в конце 1970х годов. Они были синтезированы на сефарозной матрице, а их ёмкость не превышала 10 мг IgG на 1 мл сорбента [12, 13].

За прошедшие полвека аффинная хроматография на сорбентах с белком А в качестве лиганда стала стандартом среди методов выделения моноклональных антител. Популярность подхода объясняется его высокими показателями

эффективности очистки (до <100 ррт для собственных белков клеток-продуцентов и до <10 пг/доза - для ДНК), надежности, высокой селективности и возможности разработки общих платформ очистки антител из различных источников, включая культуры клеток млекопитающих и гено-модифицированные растения [14, 15]. Помимо использования белка А для очистки и выделения антител в процессе биотехнологического производства, из сыворотки крови или асцитной жидкости, конъюгация с белком А также используется для пространственно-ориентированной иммобилизации антител на различных подложках, в том числе и на магнитных частицах [16-19].

Ввиду того, что очистка шЛЬб и их производных с использованием сорбентов с конъюгированным белком А является ключевым этапом их получения, все время предпринимаются попытки снизить себестоимость ввиду его высокой дороговизны (около 55,8% от общей стоимости, в некоторых источниках - 60%, Рисунок 1.3) [3].

Рисунок 1.3. Примерная оценка себестоимости расходных материалов при выделении моноклональных антител [20].

Высокая стоимость подобных сорбентов обуславливается целым рядом недостактов белка А: сложность и многостадийность производства, низкая емкость сорбента, ограниченное количество циклов использования, слабая устойчивость к щелочной регенерации, «утечка» аффинного лиганда. Учитывая, что сорбенты чаще всего используются многократно, ключевыми

характеристиками сорбента наравне с его стоимостью является удельная емкость сорбента и количество циклов, при которых эффективность сорбента сохраняется. При этом, с одной стороны, необходима высокая связывающая способность лиганда, с другой стороны, в случае высокой аффинности возникает необходимость использовать довольно жесткие условия для диссоциации комплекса «лиганд-целевой продукт», например, элюцию при низком значении рН (pH<3). В связи с вышеизложенным, используемый лиганд должен, с одной стороны, эффективно связывать антитела, а с другой стороны, обеспечивать элюцию в более щадящих условиях, например, при pH >3. Под «утечкой» аффинного лиганда с матрицы сорбента подразумевается его элюция вместе с целевым белком [3, 21].

В рамках данного литературного обзора рассмотрим основные ограничения использования аффинного сорбента с иммобилизованным белкам А в качестве лиганда и предложенные решения для увеличения эффективности хроматографии и снижения стоимости процесса.

1.1. Белок А как основной лиганд в аффинной хроматографии Ig

Белок А представляет собой один из белковых компонентов поверхности клеток золотистого стафилококка S. aureus. Молекулярная масса белка составляет 42 кДа, структура белка включает пять высоко-гомологичных доменов A, B, C, D и Е, а также не связывающий иммуноглобулины класса G (IgG) терминальный домен Х. Гомологичные домены располагаются в порядке E-D-A-B-C и включают 51, 61, 58, 58 и 58 аминокислотных остатка, соответственно, в то время как домен Х состоит из 180 аминокислот (Рисунок 1.4) [3].

Аминокислотная последовательность

Домены белка А

I : 3 4 5 6 7 к ч 10 11 12 1314 15 16 17 m 14 20 21 22 2.1 24 25 1627 28 29 30 .11 .12 33.14 35 >6.17 .18 39 40 41 42 4.144 45 46 47 48 44 50 Я 52 53 54 55 56 57 58 54 Ml ьI

NMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPK

ADAQQNKFN ADNNFN ADNKKN ADNKFN

Л О Q N ЛFYQVL KDQQSAFYEIL KEQQNAFYEIL KEQQNAFYEIL

Спираль I Петля I

NMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPK NMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNESQAPK HLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLAEAKKLNDAQAPK HI.PNI. TEEQRNGF1QSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPK

Спираль II Петля II Спираль III

X

Взаимодействие с Fc-фрагментом IgG

Взаимодействие с Fab-фрэгментом IgG

Рисунок 1.4. Аминокислотная последовательность доменов белка А [3].

Третичная структура доменов A-D схожа и представляет из себя три спирали, связанные между собой двумя петлями (Рисунок 1.5). Fc-фрагмент иммуноглобулинов способен связываться с белком А путем взаимодействия с аминокислотными остатками в составе спиралей I и II каждого из доменов, в то время как Fab-фрагмент - через участки в области спиралей II и III

Рисунок 1.5. Схематичное изображение пространственной структуры белка А. А. Взаимодействие доменов белка А и IgG; В. Связывание домена B белка А с Fc-фрагментом IgG; С. Связывание домена B белка А с Fab-фрагментом IgG [3].

1.2. Специфичность связывания белка А

Белок А характеризуется высокой аффинностью к человеческим иммуноглобулинам класса G 0^1, IgG2 и IgG4) (Таблица 1). Другой белок бактериальной природы, который иногда используется в качестве альтернативы белку А - белок G из некоторых штаммов стрептококков. Как видно из таблицы 1, белок G, в отличие от белка А способен связывать IgG3. Однако он уступает белку А по способности связывать IgG1 [22], ввиду чего намного реже используется в качестве лиганда.

Таблица 1.1. Специфичность связывания белка А и белка G с IgG разных видов животных и с разными подклассами IgG человека [22].

Происхождение IgG Константа равновесия*, М-1*10-9

Белок А Белок G

Человек 67,4 44,1

Кролик 69,8 52,3

Коза 14,3 -

Мышь 41,5 (2,0)** 25,7 (2,2)**

Крыса 1,4 (0,20)** 0,018

Человек, IgGl 2,0 1,3

Человек, IgG2 3,1 2,1

Человек, IgG3 6,1 -

Человек, IgG4 4,7 3,4

*определена с использованием IgG, присоединённых к частицам агарозы или полиакриламида и белка A/G с радиоактивной меткой. **получено 2 различные кривые.

Высокая аффинность белка А к IgG достигается за счёт взаимодействия как с антиген-связывающими регионами (Fab), так и с кристаллизующимся фрагментом (Fc) иммуноглобулинов. Домены А, В и С белка А обладают высокой гомологией в аминокислотных последовательностях (~ 90%), в то время как домены D и Е - гомологичны на 70% по отношению к A, B и C. IgG-связывающий сайт высоко-консервативен в доменах А, В и С, которые предпочтительно взаимодействуют с Fc-регионом. Некоторые отличия в спиральном участке III доменов D и Е позволяют им проявлять аффинность к Fab-фрагментами иммуноглобулинов [23].

Связывание A, B и С доменов с Fc-фрагментом IgG происходит за счет гидрофобных взаимодействий. Один из сайтов связывания расположен между гидрофобным участком, образованным двумя ароматическими аминокислотными остатками фенилаланина и тирозина в области спирали I белка А, и аминокислотными остатками в СН2-СН3-регионе иммуноглобулина (CH2-констаный домен №2 тяжелой цепи, CH3-констаный домен №3 тяжелой цепи), что дополнительно стабилизируется четырьмя водородными связями. Второй сайт

связывания образуется при взаимодействии аминокислотных остатков в области спирали II белка А и СН3-домена Fc-региона иммуноглобулина. Данные рентгеноструктурного анализа показали ключевую роль 32 аминокислотных остатков в связывании гидрофобного характера домена В белка А с Fc-регионом иммуноглобулина по поверхности и внутренней области на протяжении 400 А. Основной вклад в гидрофобные взаимодействия со стороны доменов белка А обуславливают аминокислотные остатки в положениях Phe124, Phe132, Tyr133, Leu136, Ш150 и боковой радикал аминокислотного остатка Lys154, которые обеспечивают гидрофобные области взаимодействия с Fc-регионом иммуноглобулина размером 80, 64, 66, 76, 25 и 60 А, соответственно [24].

При взаимодействии Fab-региона иммуноглобулина участвуют все домены белка А посредством взаимодействия С-концевых участков спиралей II и III доменов и консервативных участков региона УИ3 иммуноглобулина без вовлечения антиген-связывающего сайта. Природа взаимодействия носит полярный характер: аминокислоты, участвующие во взаимодействии, имеют отрицательный заряд, и дополнительно стабилизированы водородными связями. Связывание белка А с Fab-фрагментом критически влияет на значение рН элюции, что требует более кислые значения рН для разрушения и последующей диссоциации иммуноглобулина [25, 26].

1.3. Основные направления инженерии белка А 1.3.1. Увеличение значений рН при элюции

Комплексы между белком А и Fc-фрагментом иммуноглобулина образуются при нейтральных значениях рН, тогда как при кислых значениях рН при смене заряда боковыми цепями гистидина обоих взаимодействующих белков, происходит отталкивание молекул, что приводит к диссоциации комплекса белка А и антитела. Элюция при хроматографии на аффинном сорбенте с иммобилизованным белком А достигается путем снижения рН до кислых значений (рН <4,00) [3]. Однако, при низких значениях рН могут формироваться растворимые агрегаты антител, что снижает выход целевого белка и вынуждает

производителя осуществлять дополнительную очистку от родственных целевому белку примесей (агрегатов) на последующих стадиях выделения для достижения показателей чистоты, удовлетворяющих существующим требованиям к качеству биофармацевтических продуктов. В то же время низкие значения рН могут привести к образованию нерастворимых агрегатов из-за осаждения различных белков клетки-хозяина [27].

Образование растворимых и нерастворимых агрегатов усложняет процесс очистки, требуя дополнительные стадии очистки хроматографическими методами, что приводит к снижению выхода продукта и увеличению стоимости процесса. В связи с этим одним из направлений модификации белка А является достижение эффективной элюции связавшихся иммуноглобулинов при более высоких значениях рН. Поскольку взаимодействие Fab-фрагмента иммуноглобулина с доменами Э и Е белка А носит негидрофобную природу и требует кислых значений рН для эффективной диссоциации антитела при элюции, при удалении этих доменов из исходной структуры белка А можно рассчитывать на повышение значения рН диссоциации комплекса «белок А»-«Ес-фрагмент». Показано, что при использовании сорбентов с нативным белком А диапазон рН элюирования сильно варьировался в пределах от 3,0 до 4,0, при этом использование синтетических модификаций белка А включающих только домен В или 7, о котором подробнее будет рассказано ниже, привело к увеличению значений рН элюции от 3,6 до 4,0 [15]. В работе [28] рассмотрены варианты модификации домена С, в котором аминокислотный остаток глицина в положении 29 заменен разными аминокислотными остатками. Показано, что при замене на лизин G29K связывание Fab-фрагмента уменьшается на 96%, при замене на гистидин ^29Н) и цистеин ^29С) - на 95%, аланин ^29А) - 76%. Разработанная модификация белка А в работе [29] в виде пентамерного домена С с заменами аминокислотных остатков глицина и серина в положениях 29 и 33 на аланин и глутаминовую кислоту ^29А и S33E, соответственно) позволила получить улучшенный профиль элюции при значении рН 3,5. Дальнейшие модификации в структуре спирали I домена В путем замены аминокислотных остатков глутамина

и аспарагина с гистидином позволили повысить значения рН при элюции до 4,2 -5,6.

Аминокислотные замены глутамина и аспарагиновой кислоты на гистидины в положениях 9 и 63, соответственно ^9Н и D36H) в домене С изменили значение константы диссоциации (Кф иммуноглобулинов и составили 617 и 16,1 нМ для 1^1, для ^2 - 6720 и 169 нМ, для ^4 - 403 и 10,6 нМ от 7,2 нМ, 129 нМ и 8 нМ при сравнении с данными значениями для домена С дикого типа, соответственно. Увеличение константы диссоциации улучшает эффективность элюции с 90% до 99,5% при значении рН 3,5 по сравнению с диким типом домена C [30].

1.3.2. Увеличение устойчивости сорбента к щелочным условиям

Одним из основных условий многократного использования сорбентов при фармацевтическом производстве является возможность их очистки от загрязнений, которые накапливаются в ходе многократного применения. Часто проблемой при использовании в качестве лиганда белка А является его нестабильность в щелочных значениях рН (рН >13), при которых достигается необходимая степень очистки матрицы от загрязнений и неспецифических примесей [31-33]. Для наибольшей эффективности регенерацию сорбента проводят гидроксидом натрия в концентрации от 0,1 до 1 М. В таких условиях природные белки чаще всего гидролизуются.

Повышенной чувствительностью к щелочным условиям характеризуются аспарагин и, в меньшей степени, глутамин. Дезамидирование аспарагина ведет к расщеплению пептидного остова, что является основной причиной потери активности сорбента при обработке щелочными растворами. Также известно, что скорость дезамидирования зависит от пространственной структуры лиганда, а также от наличия и расположения последовательностей аспарагин-глицин и аспарагин-серин, которые обладают самыми короткими периодами полураспада в щелочных условиях. Таким образом, повышение устойчивости сорбента к щелочным условиям путем модификации аминокислотных остатков белка А,

чувствительных к щелочам, крайне перспективно и экономически целесообразно [34].

Одна из таких модификаций [35, 36] подразумевает замену аминокислотного остатка глицин на аланин в дипептидной области аспарагин-глицин в положении 29 домена В белка А. Данная конструкция получила название домена Ъ, а предложенная модификация значительно повысила устойчивость к гидроксиламину. Стоит отметить, что заменен был именно глицин, поскольку боковой радикал полярной аминокислоты аспарагина участвует в образовании водородной связи с боковым радикалом аминокислотного остатка глутамин в положении 311 в последовательности Fc-фрагмента. Синтетический домен Z и одна из его модификаций Zvar (7-домен, содержащий мутации №А, N6D, №3Т) стали отправной точкой для дальнейшего модифицирования аминокислотной последовательности в ряде патентов с целью повышения устойчивости к щелочам. Также было показано, что замена аминокислотного остатка аспарагина треонином в положении 23 дополнительно увеличивает устойчивость лиганда в щелочных условиях, в то время как замены аминокислотных остатков аспарагина в позициях 6, 11, 43 и 52 не приводят к повешению устойчивости в щелочных условиях, поскольку данные аминокислоты находятся внутри спиральной структуры. Мутация №1А в Ъ-домене также оказалась неэффективной, поскольку N21 участвует в стабилизации вторичной структуры белка А. Одна из модификаций домена Ъ, представляющая собой тетрамер Zvar с аминокислотными заменами Q9A и Е15К, характеризуется снижением ёмкости полученного на его основе аффинного сорбента после 100 циклов использования с 49,8 до 41,0 мг IgG на 1 мл сорбента. Другой вариант Zvar с аминокислотными заменами Q9A и Е47Т, демонстрировал значения ёмкости 50,5 и 40,8 мг/мл в начале использования и после 100 циклов при воздействии 500 мМ №ОН, соответственно. Наиболее эффективная модификация Zvar была получена благодаря заменам Q9A, Ш1Е, Q40V, А42К, Ж3А, L44I. Синтезированный на его основе аффинный сорбент продемонстрировал емкость 60,3 мг/мл, при этом после проведения шести четырехчасовых циклов

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Терешин Михаил Николаевич, 2025 год

- 59 с.

87. Verma M., Choi J., Cottrell K.A., Lavagnino Z., Thomas E.N., Pavlovic-Djuranovic S., Szczesny S., Piston D.W., Zaher H.S., Puglisi J.D., Djuranovic S. A short translational ramp determines the efficiency of protein synthesis // Nat. Commun.

- 2019. - V. 10. - P. 5774.

88. Qiu J., Zhai Y., Wei M., Zheng C., Jiao X. Toxin-antitoxin systems: Classification, biological roles, and applications // Microbiol Res. - 2022. - Vol. 264. -127159.

89. Sonika S., Singh S., Mishra S., Verma S. Toxin-antitoxin systems in bacterial pathogenesis // Heliyon. - 2023. - Vol. 9, № 4. - e14220.

90. Chen I., Dorr B.M., Liu D.R. A general strategy for the evolution of bond-forming enzymes using yeast display // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2011. - Vol. 108, № 28. - P. 11399-113404.

Приложение 1. ЯМР-спектры. Спектр Вос-защищенных полиглицинов (п =3, 4, 5). 1. Вос-ауз-ОИ.

Химическая формула СцИ^зОб. Мол. масса 289,29 Да.

Рисунок 1. 1И ЯМР спектр Бое-О1у3-Ои

2. Бое-С1у4-ОИ.

Химическая формула С13И22К407. Мол. масса 346,34 Да.

Рисунок 2. 1И ЯМР спектр Вос-01у4-0И

3. Бое-С1у5-ОИ.

Химическая формула С15И25К508. Мол. масса 403,39 Да.

Рисунок 3. 1И ЯМР спектр Вос-01у5-0И.