Влияние ненативных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы на функционирование шаперонина GroEL тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Полякова, Оксана Валентиновна

• Полякова, Оксана Валентиновна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Полякова, Оксана Валентиновна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

МЕХАНИЗМ СВОРАЧИВАНИЯ БЕЛКОВ И ВЛИЯНИЕ

ШАЦЕРОНОВ НА ЭТОТ ПРОЦЕСС.

СЕМЕЙСТВО ШАПЕРОНИНОВ/Hsp 60.

Структура шаперонина.

Структура кошаперонина.

Механизм сворачивания белков при участии GroEL-GroES системы.

Взаимодействие полипептидов с шаперонином.

Константы связывания белков с шаперонином.

Конформационные изменения в структуре белка при его взаимодействии с шаперонином.

Значение связывания и гидролиза АТР в реакционном цикле системы шаперонина.

Третичный комплекс GroEL-GroES-полипептид.

Значение центральной полости шаперонина в сворачивании белков.

Высвобождение ненативных форм белка из комплекса

GroEL-GroES.

Взаимодействие шаперонина с большими и олигомерными белками.

Новые функции шаперонина GroEL.

D-ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА.

Общая характеристика фермента.

Термостабильная ГАФД Bacillus stearothermophilus.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Методы выделения белков.

Аналитические методы.

Метод иммобилизации.

Получение иммобилизованных форм ГАФД различной нативности и степени олигомерности.

Электрофорез белков в ПААГ.

Иммунобл оттинг.

Модификация SH-групп ГАФД из мышц кролика

5,5 '-дитиобис-2-нитробензойной кислотой.

Измерение АТФазной активности GroEL.

Определение коэффициента седиментации.

Дифференциальная сканирующая калориметрия.

Регистрация спектров кругового дихроизма.

Денатурация ГАФД В.

Исследование рефолдинга ГАФД B.st.

Процедура инкубации иммобилизованных белков с растворимыми партнерами реакции.

Получение и очистка антител.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Выделение и характеристика шаперонина СгоЕЬ.

2. Взаимодействие СгоЕЬ с модифицированной ГАФДцтнб

2.1. Модификация БН-групп ГАФД из мышц кролика с помощью ДТНБ.

2.2. Взаимодействие СгоЕЬ с модифицированной ГАФД из мышц кролика.

2.3. Определение параметров связывания СгоЕЬ с иммобилизованной ГАФДдтнб.

3. Взаимодействие СгоЕЬ с мутантными димерами термостабильной ГАФД В^.

3.1. Характеристика мутантных димеров термостабильной ГАФД В^.

3.2. Взаимодействие СгоЕЬ с мутантными димерами термостабильной ГАФД ВМ.

3.3. Исследование взаимодействия СгоЕЬ с О-Я-димерами в растворе методом нативного электрофореза.

3.4. Получение высокоспецифичных поликлональных антител к СгоЕЬ и термостабильной ГАФД В. ^.

3.5. Анализ комплекса СгоЕЬ-О-Я-димер в растворе методом нативного электрофореза и последующего имму нобл оттинга.

3.6. Анализ комплекса СгоЕЬ-О-Я-димер в растворе при помощи метода иммунопреципитации.

4. Влияние модифицированной ГАФДдтнб и мутантных О-Я-димеров на СгоЕЬ-зависимый рефолдинг денатурированной термостабильной ГАФД В.м.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Влияние ненативных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы на функционирование шаперонина GroEL»

Традиционно исследование функционирования шаперонов ведется в аспекте изучения их влияния на судьбу белка-мишени. Известно, что 20 % вновь синтезированных полипептидов в клетке ассоциированы с шаперонами. Примерно такое же количество вновь синтезируемых белков подвергается деградации вследствие ошибок в процессе транскрипции и трансляции. Пострансляционные повреждения белков, происходящие вследствие химических модификаций или из-за структурных повреждений, полученных во время теплового или других стрессов, а также из-за некорректной ассоциации в олигомеры и мультибелковые комплексы, могут приводить к инактивации белков и в некоторых случаях к последующей агрегации (Wickner et al., 1999). Для предотвращения нарушений функционирования клетки при увеличении внутриклеточной агрегации белков запускается ответ на тепловой шок и активируется синтез шаперонов. Однако существует ряд патологических состояний (нейродегенеративные заболевания, амилоидозы), при которых все-таки происходит накопление неправильно свернутых белков. Предполагается, что к прогрессии подобных патологий могут приводить нарушения функционирования системы шаперонов (Welch and Gambetti, 1998).

Мы предположили, что одной из возможных причин нарушений в работе шаперонов может быть их перегрузка такими ненативными формами белков-субстратов, которые из-за неспособности в принципе достигнуть своего нативного состояния препятствуют шаперонам в выполнении их функций, связанных с облегчением сворачивания (фолдинга) нормальных субстратов. В связи с этим было бы целесообразным создание модельной системы для исследования взаимодействия таких белков-субстратов с шаперонами (особенно с шаперонинами, ответственными за пострансляционный фолдинг белков), а также изучение оказываемых ими эффектов на функционирование шаперонов. В качестве объекта исследования был выбран шаперонин GroEL из Е. coli, обладающий высокой степенью гомологии с Hsp 60 человека (Wiek et al., 2001).

В связи с этим целью нашей работы было изучение взаимодействия ненативных форм белков с шаперонином из Е. coli и исследование их влияния на работу GroEL.

Ранее в нашей лаборатории были получены данные о взаимодействии GroEL с ненативными формами D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы (ГАФД). Это позволило предположить, что при помощи химической модификации и сайт-специфического мутагенеза можно получить формы фермента, неспособные к формированию нативной структуры, и использовать их в качестве модельного субстрата для GroEL. В соответствии с целью работы нами были поставлены следующие задачи:

1. Получить формы ГАФД, неспособные формировать нативную структуру.

2. Исследовать способность полученных форм взаимодействовать с шаперонином GroEL и определить параметры связывания.

3. Изучить влияние таких форм на GroEL-зависимое сворачивание обратимо денатурированной ГАФД Bacillus stearothermophilus

В соответствии с целью настоящей работы обзор литературы в основном посвящен сведениям о функционировании шаперонов и шаперонинов. Отдельно рассмотрены последние данные о возможном участии шаперонов в развитии ряда патологических процессов. В связи с тем, что в качестве модельного белка-мишени для шаперонина мы использовали глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (нативную из

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МЕХАНИЗМ СВОРАЧИВАНИЯ БЕЖОВ И ВЛИЯНИЕ ШАПЕРОНОВ

НА ЭТОТ ПРОЦЕСС

В процессе синтеза белков результатом трансляции является появление в клетке новой полипептидной цепи. Для того чтобы вновь синтезируемый белок приобрел присущие ему функциональные свойства, цепь должна свернуться в пространстве определенным образом, сформировав тем самым нативную структуру. Согласно данным, полученным в экспериментах по изучению процесса сворачивания белков in vitro, пространственная структура белка определяется его аминокислотной последовательностью (Anfinsen, 1973). В настоящее время процесс сворачивания белка (фолдинг) представляется следующим образом. В начале формируются элементы вторичной структуры, являющиеся затравками для образования более сложных мотивов супервторичной структуры. Далее происходит формирование компактного интермедиата за счет образования специфических контактов между значительно удаленными в первичной последовательности участками. Основной движущей силой этого процесса является удаление из водного окружения белка его гидрофобных аминокислотных остатков и образование гидрофобного ядра молекулы. На данном этапе молекула имеет пространственную структуру близкую к нативной, но еще не обладает функциональной активностью, присущей данному белку. В этом состоянии, получившем название «расплавленная глобула», молекула имеет меньшую степень упорядоченности и более лабильную, чем нативный белок структуру и склонна к агрегации (Yon, 1997; Ewbank et al., 1995).

Обычно исследования по изучению процесса сворачивания белков in vitro проводятся в «идеальных» условиях: при низких температуре и концентрации белка. Условия, существующие в клетке, сильно отличаются по этим параметрам. Внутриклеточная концентрация бежа составляет более 300 мг/мл. В таком высококонцентрированном окружении сильно изменяются параметры многих биологических процессов. Значительно увеличиваются (более чем на несколько порядков) константы скоростей реакций ассоциации, например агрегации и заметно изменяются свойства интермедиатов сворачивания (Minton, 2000; Zimmerman and Minton, 1993). Так, исследуя in vitro сворачивание денатурированных белков, было показано, что белки, способные спонтанно формировать нативную структуру в разбавленных водных растворах, агрегируют в условиях максимально приближенных к клеточным (van den Berg et al., 1999). Тем не менее in vivo вновь синтезированные полипептиды быстро и эффективно сворачиваются вследствие существования в клетке специальных механизмов, обеспечивающих регуляцию этого процесса. В середине 80-х годов были обнаружены белки, основной функцией которых является обеспечение правильного сворачивания полипептидных цепей в нативную структуру. Такие белки получили название шаперонов. Экспрессия этих белков резко увеличивается в условиях стресса, в том числе и при повышении температуры. Поэтому другое их название - белки теплового шока (Heat shock proteins / Hsp) (Yura and Nakahigashi, 1999; Nover and Scharf, 1997). Было показано, что эти белки связываются с частично развернутой полипептидной цепью, тем самым не позволяя ей образовывать неправильные структуры. Они удерживают частично развернутый белок, препятствуя его агрегации с другими белками, способствуют его переносу в различные субклеточные структуры и создают условия для оптимального сворачивания (Saibil, 2000). Шапероны встречаются во всех типах клеток и клеточных компартментах и необходимы для обеспечения жизнедеятельности клетки в нормальных и в стрессовых условиях. В настоящее время описано несколько классов шаперонов, различающихся по структуре и функциям. Обозначать эти белки принято по величине молекулярных масс, составляющих их полипептидных цепей. Существует два больших класса АТР-зависимых шаперонов, осуществляющих регуляцию процессов фолдинга на ко- и посттрансляционном уровне - Hsp70 (или DnaK в клетках E.coli) и Hsp 60, соответственно. Не останавливаясь подробно на рассмотрении цикла функционирования системы Hsp 70, которая включает DnaK, DnaJ и GrpE следует сказать, что за способность связывать N-конец растущего полипептида, отвечает Hsp40 (или DnaJ в клетках E.coli) за счет наличия консервативного J-домена.

СЕМЕЙСТВО ШАПЕРОНИНОВ/HSP 60

Шаперонины представляют собой класс белков, основной функцией которых является обеспечение посттрансляционного фолдинга белков. Связывание шаперонинов с несвернувшимися белками облегчает сворачивание в нативную структуру большого числа вновь транслирующихся и вновь транслоцирующихся полипептидов.

Известно два семейства шаперонинов: семейство GroEL/Hsp 60, обнаруженное в цитоплазме эубактерий и в растворимом матриксе митохондрий и хлоропластов и семейство TriC или ССТ найденное в цитоплазме архебактерий и в цитозоле эукариот (Bukau and Horwich, 1998; Hartl, 1996; Gutsche et al., 1999; Gottesman and Hendrickson, 2000; Frydman, 2001).

GroEL из E.coli наиболее изученный шаперонин. Его действие обеспечивает так называемый шаперонин-зависимый фолдинг белков. Делеция гена GroEL является летальной для клетки E.coli, поскольку среди субстратов шаперонина есть белки, наличие которых в клетке в функционально активном состоянии является критичным для ее жизнедеятельности. Для идентификации белков, являющихся субстратами GroEL, экстракт клеток E.coli, выращенных в среде, содержащей 358-метионин, обрабатывали специфичными к шаперонину антителами и преципитированные белки анализировали затем методом двумерного электрофореза (Houry et al., 1999; Ewalt et al., 1997). Так было обнаружено, что GroEL связывает приблизительно 1000 полипептидных цепей из 4300, кодируемых в геноме E.coli. Дополнительными методами было доказано, что в данном эксперименте связывание белков с шаперонином происходит внутри клетки, а не в процессе экстракции. Было обнаружено также, что треть субстратов, многие из которых представляют собой зрелые белки постоянно находятся в состоянии связанном с GroEL. По-видимому, нативная структура подобных белков является недостаточно стабильной и легко переходит в частично развернутое состояние, узнаваемое шаперонином, особенно в условиях стресса.

Структурное и функциональное изучение GroEL показало, что его роль в клетке - это предоставление микрокомпартмента, где происходит облегченное правильное сворачивание белков. Для обеспечения фолдинга белков GroEL выполняет две функции, причем каждая связана со специфическим состоянием шаперонина. Одна из них - это связывание белковых интермедиатов, образуемых в процессе неправильного сворачивания и предотвращение, тем самым, их агрегации. Такое связывание основано на узнавании гидрофобных участков, экспонированных наружу у частично развернутых белков. Другая функция - это облегчение процесса сворачивания, которое происходит внутри центрального канала шаперонина после присоединения к GroEL кошаперонина GroES в присутствии АТР. В течение существования этого тройного комлекса полипептид начинает сворачивание и может достигнуть своего нативного состояния или принять конформацию близкую к нативной. В результате последующего гидролиза АТР и диссоциации GroES нативный белок или частично свернувшаяся полипептидная цепь высвобождаются в раствор (Fenton and Horwich, 1997). Для более полного понимания механизма сворачивания бежов при участии системы Hsp 60 необходимо детальное рассмотрение молекулярного строения шаперонина.

Структура шаперонина.

Согласно данным рентгено-структурного анализа шаперонин представляет собой цилиндр диаметром 135 А и высотой 145 А. Цилиндр образован двумя кольцами, каждое из которых состоит из семи одинаковых субъединиц с молекулярной массой 57 кДа (Svensson et al., 1994; Spangfort et al., 1993).

Полипептидная цепь субъединицы шаперонина образована 547 аминокислотными остатками и свернута в три домена (Braig et al., 1994) (рис. 1).

Апикальный домен образует верхушку цилиндра GroEL и содержит участки для связывания полипептида и кошаперонина. Он образован Р-складками, ограниченными снаружи и изнутри а-спиралями. Апикальный домен обладает высокой конформационной подвижностью, что является адаптивным фактором необходимым при связывании шапиронина с широким спектром его бежов-субстратов.

Экваториальный домен формирует структурную основу цилиндра и обеспечивает взаимодействие между субъединицами внутри и между кольцами. Домен образован длинными близкорасположенными параллельными а-спиралями. АТР-связывающий участок каждой субъединицы расположен на вершине внутренней поверхности экваториального домена. Он состоит из нескольких длинных

Рис. 1. Структура субъединицы GroEL. высококонсервативных петель, включающих аминокислотную последовательность GDGTT обязательную для всех шаперонинов. Было установлено, что эта последовательность принадлежит фосфат-связывающей петле и взаимодействует напрямую или посредством ионов Mg с молекулами кислорода всех трех фосфатных остатков нуклеотида (Boisvert et al., 1996).

Промежуточный домен GroEL самый маленький. Он формирует шарнироподобное сочленение между апикальным и экваториальным доменами. В результате исследования методом электронной микроскопии различных конформационных состояний GroEL и сравнения структур GroEL и бинарного комплекса GroEL-GroES, полученных методом рентгено-структурного анализа, было предположено, что шарнироподобный участок этого домена главная линия аллостерических сообщений (Roseman et al., 1996). Нековалентное взаимодействие между соседними субъединицами промежуточного и апикального доменов является критичным для наблюдаемой положительной кооперативное™: при связывании и гидролизе АТР внутри колец шаперонина и отрицательной кооперативности между кольцами (Yifrach and Horovitz, 1994).

Структура кошаперонина.

GroES представляет собой куполоподобную структуру диаметром 70-80 А, высотой 30 Ä и внутренней полостью 30 Ä. Кошаперонин состоит из семи одинаковых субъединиц с молекулярной массой 10 кДа (Fenton et al., 1996; Hunt et al., 1996). Каждая субъединица имеет ядро, состоящее из ß-складок, и две ß-шпильки. Одна из них участвует в формировании вершины купола, а другая, экспонированная наружу, так называемая мобильная петля взаимодействует с субъединицей GroEL. Методом электронной микроскопии бинарного комплекса GroEL-GroES установлено, что внутренняя полость кошаперонина является продолжением центрального канала GroEL. Петля, принимающая участие во взаимодействии GroES и шаперонина, в свободном состоянии подвижна (Landry et al., 1993), однако становится структурированной при связывании GroEL. Предположение, что участок связывания GroEL с полипептидом частично перекрывается с участком взаимодействия шаперонина и мобильной петли GroES подтверждается методом электронной микроскопии (Chen et al., 1994). С помощью введения мутаций в данный участок было показано, что аминокислотные остатки критичные для связывания полипептида также необходимы для взаимодействия с GroES (Fenton et al., 1994). При образовании комплекса GroEL-полипептид с GroES в присутствии АТР происходит вытеснение полипептида из участка связывания с апикальным доменом в центральный канал шаперонина, где происходит инициация его продуктивного сворачивания (Weissman et al., 1995).

Механизм сворачивания белков при участии CroEL-GroES системы.

Современные представления о механизме сворачивания для большинства белков при участии системы шаперонина приведены на рис. 2. При физиологическом соотношении концентраций [ATP]/[ADP] несвернувшийся белок взаимодействует с ассиметричным комплексом GroEL-GroES, где центральный канал с одной стороны закрыт кошаперонином, а с другой - остается доступным для полипептида. В результате формируется так называемый транс-третичный комплекс. Затем может образоваться продуктивный цис-третичный комплекс, или в случае присоединения еще одного кошаперонина, симметричный комплекс (Corrales and Fersht, 1996). Хотя такой комплекс наблюдали, его образование не является обязательным in vitro. С другой стороны, формирование симметричного комплекса может быть предпочтительно в клетке. Связывание GroEL с GroES приводит к увеличению полости центрального канала того кольца шаперонина, которое взаимодействует с GroES в результате открытия апикального домена GroEL. Таким образом, несвернувшийся полипептид с молекулярной массой до 60 кДа может находиться в этой центральной полости, закрытой GroES. В присутствии АТР полипептид, связанный в цис-третичный комплекс, высвобождается из связывающего участка, начиная свое сворачивание внутри замкнутой полости цилиндра. Гидролиз семи молекул АТР на субъединицах в экваториальном домене кольца, противоположного GroES и полипептиду, приводит к диссоциации GroES от цис-третичного комплекса через 15-30 с (Ellis, 1994). Это время отведено полипептиду на принятие одной из возможных пространственных конформаций: нативной структуры, промежуточного состояния на пути к правильной пространственной организации данного белка или ненативной формы. Неправильно свернувшийся полипептид может снова быть вовлечен во взаимодействие с системой шаперонина для следующей попытки правильного сворачивания.

Взаимодействие полипептидов с шаперонином.

В отличие от системы Hsp 70, где Dna J может взаимодействовать с полипептидной цепью, трансляция которой еще не завершена, GroEL действует посттрансляционно, связываясь с полипептидом, свободным от рибосомы или других компонентов, возможно, и от белков Hsp 70. Предложенная Хартлом модель последовательного взаимодействия полипептида в процессе сворачивания сначала с белками системы Hsp 70, а затем с системой шаперонина (Hard, 1996), по-видимому, не обязательна для всех белков. В настоящее время преобладает мнение о том, что основная роль шаперонинов в клетке E.coli заключается в облегчении фолдинга вновь синтезированных белков, в то время как функция белков семейства Hsp 70 состоит в предотвращении агрегации белков при тепловом шоке. В тоже время допускается возможность перекрывания функций шаперонов и шаперонинов. Были проведены эксперименты, которые показали возможное использование клеткой параллельного способа функционирования шаперонов. Были изучены мутанты E.coli, в которых был дефектным транскрипционный регулятор белков теплового шока 832 (Gragerov et al., 1992). В результате недостаток в клетке белков теплового шока GroEL и Dna К приводит к полной агрегации белков. В то же время суперэкспрессия GroEL-GroES или DnaK/DnaJ в другой линии мутантов предотвращет агрегацию. Посттрансляционное взаимодействие белков с GroEL имеет место, как в нормальных условиях, так и в условиях температурного и химического стресса. В этом случае белки начинают денатурировать, а склонные к агрегации интермедиаты связываются с GroEL. В условиях шока GroEL снижает свою активность по облегчению фолдинга и начинает функционировать как «хранилище» белков. Молекулярная основа такого поведения заключается в отсутствии аллостерического сообщения между кольцами шаперонина. Вследствие этого затрудняется высвобождение из комплекса с GroEL кошаперонина и полипептида (Llorca et al., 1996). При снижении температуры нормальное функционирование шаперонина восстанавливается и белки высвобождаются из комплекса с GroEL. При этом они могут принять свою нативную конформацию, а также могут быть переданы другим шаперонам или в систему протеолитической деградации. а) Изучение связывания полипептидов in vitro.

При изучении in vitro сворачивания белков, подвергшихся предварительно денатурации (рефолдинг бежа), было обнаружено, что в процессе рефолдинга может образовываться тот же спектр интермедиатов, что и при освобождении белка из бактериальной рибосомы. Поскольку GroEL связывается с белками посттрансляционно, то при изучении сворачивание белков in vitro и влиянии на этот процесс шаперонов его добавляют в среду для рефолдинга. Так было показано, что связывание GroEL с рибулоз-бисфосфаткарбоксилазой при разведении денатурированного фермента конкурирует с его агрегацией (GoloubinofF et al., 1989). В случае митохондриальной родоназы агрегация предотвращается не только шаперонином, но и добавлением в среду для рефолдинга неденатурирующих детергентов (Mendoza et al., 1991). Такие вещества, получившие название искусственных шаперонов, взаимодействуют с экспонированными гидрофобными остатаками на поверхности сворачивающегося белка и часто используются для исследования механизмов рефолдинга (Kurganov and Topchieva, 1998). б) Роль гидрофобности в узнавании белков шаперонином.

Одной из отличительных особенностей интермедиата «расплавленная глобула» является увеличение числа гидрофобных участков, экспонированных растворителю. В связи с этом существовало предположение о важной роли гидрофобных взаимодействий в узнавании и образовании комплекса белков-мишеней с шаперонином. Структурное и функциональное изучение GroEL подтвердило данную гипотезу. Так, каждая субъединица апикальной части центрального канала, образованная двумя a-спиралями и распрямленным сегментом петли, в значительной степени состоит из гидрофобных аминокислотных остатков. В результате формируется гидрофобная поверхность вокруг входа в центральный канал высотой около 30 Á. Замена гидрофобных аминокислот в этой области на гидрофильные или заряженные лишает GroEL способности связывать полипептид (Fenton et al., 1994).

Были сделаны наблюдения о том, что добавление гидрофобных аминокислот увеличивает АТРазную активность GroEL в два-три раза. Этот эффект обратим в присутствии GroES. В случае ограниченного протеолиза роданазы в комплексе с GroEL защищенными оказались пептиды (мол. масса 7 и 14 кДа), которые соответствуют двум гидрофобным а-спиральным участкам нативной роданазы. В связи с этим было предположено, что данные участки фермента непосредственно взаимодействуют с GroEL и, возможно, являются местами узнавания для шаперонина (Hlodan et al., 1995). В других экспериментах влияние гидрофобных или заряженных участков белка на связывание его с шаперонином изучали, исследуя взаимодействие GroEL с ингибитором химотрипсина-2 и его мутантами (Itzhaki et al., 1995). Было показано, что мутации, в результате которых уменьшается размер экспонированной гидрофобной поверхности в белке-мишени, ослабляет связывание его с шаперонином.

Таким образом, бесспорным является важное значение гидрофобных контактов при взаимодействии шаперонина с белками. Однако существуют данные о влиянии электростатических взаимодействий на узнавание и инициирование процесса связывания GroEL с некоторыми белками-субстратами (Pack et al., 2000). в) Узнавание гомологичных белков: влияние отличий в аминокислотной последовательности на процесс сворачивания.

Данные о возможном влиянии аминокислотной последовательности белка на связывание с GroEL были получены из сравнения специфичности связывания шаперонина с гомологичными белками, выделенными из. различных организмов или клеточных компартментов. Например, дегидрофолатредукгуза (ДГФР) человека во время своего рефолдинга in vitro узнается и связывается GroEL, а белок из E.coli, имеющий схожую пространственную организацию и 30 % гомологии аминокислотной последовательности, не узнается (Clark et al., 1996). В процессе сворачивания ДГФР человека склонна к агрегации в отсутствие GroEL, в то же время сворачивающийся фермент из E.coli достаточно хорошо растворим даже при больших концентрациях белка. Исследование структуры ДГФР из E.coli показало, что некоторые петли фермента короче по сравнению с гомологичными ферментами из млекопитающих. В связи с этим было предположено, что они могут быть специфичными участками узнавания для GroEL. Для проверки этого предположения в соответствующие участки белка из E.coli была помещена последовательность идентичная петлям фермента из мыши. Полученный белок взаимодействовал с GroEL. Однако интерпретация данных результатов неоднозначна. Хотя вставленная петля может являться специфическим участком узнавания для GroEL, она, вероятно, может влиять и на кинетику фолдинга. В результате в процессе сворачивания белка могут образовываться интермедиаты с экспонированной гидрофобной поверхностью и узнаваться шаперонином. Хотя кинетические исследования полученного белка не проводились, было замечено, что его нативное состояние нестабильно и напоминает состояние ДГФР человека, связанную с GroEL в отсутствие лигандов (Viitanen et al., 1991). Предположение о том, что узнавание ДГФР происходит не просто за счет наличия в ферменте прямого участка связывания, было проверено в эксперименте, в котором большие петли ДГФР человека укорачивались до размера соответствующей петли белка E.coli. Все полученные белки связывались с GroEL также эффективно, как и дикий тип фермента человека. Это подтверждает то, что образующиеся в процессе сворачивания интермедиаты узнаются шаперонином независимо от наличия петель. Влияние отличий в первичной структуре белка на сродство к GroEL было обнаружено также в случае аспартатаминотрансферазы (ААТ) и малатдегидрогеназы (МДГ), выделенных из различных источников. Так, проводилось сравнение митохондриальной и цитозольной ААТ эукариот и фермента из E.coli. Эти белки имеют сходную пространственную структуру, а гомология первичной последовательности составляет 40 %. Было показано, что эти белки отличаются по способности спонтанной ренатурации после обработки 6 М раствором гуанидин-хлорида: фермент из митохондрий«цитозоля<£'. coli. При взаимодействии данных белков с GroEL значительно увеличивался выход ренатурированой формы митохондриального фермента и, в меньшей степени, цитозольной формы. Выход ренатурированой формы не изменялся в случае бежа из E.coli. Также было обнаружено, что митохондриальная ААТ связывается прочнее, чем цитозольный изофермент, хотя последний имеет больше гидрофобных остатков в первичной структуре (Widmann and Christen, 1995). Митохондриальная МДГ взаимодействует лучше, чем МДГ из цитозоля, но в данном случае митохондриальный гомолог значительно более гидрофобен. Кроме того, комплекс GroEL-митихондриальная МДГ значительно прочнее и для своей диссоциации требует две молекулы GroES и АТР, в то время как комплекс с цитозольным ферментом только ATP (Staniforth et al., 1994).

Таким образом, отличия в аминокислотной последовательности скорее определяют способ сворачивания белка или кинетику фолдинга, а не изменения специфичности связывающих участков. г) Значение конформации белка в узнавании его GroEL.

Как уже говорилось выше, в узнавании шаперонином белка-субстрата не вовлечены какие-то специфические аминокислотные последовательности последнего, а значение имеют общая топология белка и распределение гидрофобных участков на его поверхности. Так, среди промежуточных структур, образующихся в процессе сворачивания белка, многие могут взаимодействовать с GroEL, хотя с разным сродством и скоростью. Возможно, размер экспонированной гидрофобной поверхности у белка-мишени определяет относительную стабильность таких комплексов. Считается, что конформацией предпочтительной для связывания GroEL обладает структура в состоянии коллапса, т.е. свободно упакованная, имеющая нативно-подобную вторичную структуру и, в некоторых случаях, обладающая общей топологией близкой к нативной. Для выяснения структуры или конформации белка, предпочтительной для связывания шаперонином, было проведено множество экспериментов на разных белках с использованием различных методических подходов.

Так, среди структур, образующихся при разведении денатурированного белка, ранние интермедиаты в состоянии коллапса могут быть связаны GroEL. Например, при разведении npe-ß-лактамазы, денатурированной в мочевине, белок связывался с шаперонином и фолдинг останавливался (Zahn and Pluckthun, 1992). На кривой, отражающей процесс рефолдинга, в этом случае обнаруживается два кинетических интермедиата, возможно представляющих собой цис-транс-пролиновые изомеры, которые взаимодействуют с GroEL. Эти интермедиаты сворачиваются с одинаковой скоростью и зависимостью от pH как при высвобождении из комплекса с шаперонином, так и при сворачивании в его отсутствие. В связи с этим был сделан вывод о том, что способ сворачивания как в присутствии GroEL, так и в его отсутствие одинаков. Спектр флуоресценции исследованных интермедиатов похож на таковой для нативного белка и значительно отличается от спектра флуоресценции белка, денатурированного в мочевине. По-видимому, в состоянии коллапса близкая к нативной структура формируется достаточно быстро и узнается шаперонином.

Интересно, что денатурированная в мочевине зрелая ß-лактамаза (лишенная сигнального пептида) после разведения не взаимодействует с GroEL. Однако при увеличении температуры выше 37°С зрелый белок разворачивается до состояния, которое узнается GroEL и прочно им связывается (Zahn et al., 1994). Спектр флуоресценции такой структуры похож на спектр для комплекса GroEL-npe-ß-лактамаза. Обнаружено, что константа диссоциации такого комплекса уменьшается с повышением температуры, что указывает на большое значение гидрофобных взаимодействий для связывания развернутой ß-лактамазы и GroEL (Zahn and Pluckthun, 1992). Интересные данные были получены при изучении связывания GroEL с нативной ß-лактамазой и мутантным белком, в котором два остатка цистеина, образующие дисульфидный мостик, заменены на аланин. Оказалось, что шаперонин образует комплекс только с ранними интермедиатами фолдинга мутантной ß-лактамазы и не взаимодействует ни с какими формами нативного бежа (Gervasoni and Pluckthun, 1997). В других работах при изучении рефолдинга термофильной ЛДГ было обнаружено, что при разведении фермента, денатурированного в различных концентрациях гуанидин-хлорида, образуются разные интермедиаты. Но в процессе рефолдинга с GroEL могут взаимодействовать только полностью денатурированные формы или ранние интермедиаты сворачивания, а также структуры в состоянии коллапса и «расплавленной глобулы» (Badcoe et al., 1991). Ни поздние интермедиаты с более развитой вторичной структурой, ни свернувшиеся мономеры не связываются с шаперонином. При исследовании быстрой кинетики рефолдинга ДГФР человека (Goldberg et al., 1997) в отсутствие GroEL показано увеличение триптофановой флуоресценции в течение первых 100 мс, происходящее в две стадии. Первая быстрая стадия (менее 5 мс), сопровождающаяся появлением способности связывать аминонафталиносульфонат (АНС), вероятно, является результатом быстрого коллапса структуры, с экспонированием неполярной поверхности. Вторая стадия, сопровождающаяся увеличением собственной триптофановой флуоресценции, связана с изменением окружения ароматических остатков, что отражает, по-видимому, формирование вторичных и третичных контактов. Последующее уменьшение флуоресценции, происходящее в течение нескольких минут, относится, по-видимому, к образованию нативного состояния. Эти изменения, исследованные кинетически, отражают два параллельных пути сворачивания белка от независимых промежуточных состояний. В присутствии 1 мкМ GroEL (1 мкМ ДГФР) только два поздних интермедиата были связаны, на что указывает остановка роста флуоресценции. При увеличении концентрации GroEL до 10 мкМ даже интермедиаты быстрой фазы связывались с шаперонином, что подтверждает существование конкуренции между процессами связывания и сворачивания.

Независимым подходом к анализу структур, узнаваемых GroEL, является выяснение способности связывания шаперонина с метастабильными интермедиатами, образующимися в процессе сворачивания белков. Ранние работы по изучению взаимодействия интермедиатов а-лактальбумина с GroEL указывали на то, что относительно компактная расплавленная глобула а-лактальбумина не связывается с шаперонином. В более поздних экспериментах было показано, что такое взаимодействие происходит, но с очень маленькой константой ассоциации (Katsumata et al., 1996). Таким образом, было установлено, что интермедиаты со сформированной вторичной и третичной структурой также могут узнаваться GroEL. Подтверждением этого является взаимодействие GroEL с Fab-фрагментами иммуноглобулинов, имеющими стабильную вторичную и третичную структуру (Schmidt and Buchner, 1992).

Константы связывания белков с шаперонином.

Скорость ассоциации различных промежуточных форм сворачивания с GroEL и их константы связывания определены для небольшого числа белков. Было показано, что их величины определяются структурой интермедиата. Например, ранние интермедиаты ДГФР человека взаимодействуют с GroEL с константой скорости второго порядка хс" (Goldberg et al., 1997).

Интермедиаты мальтозо-связывающего бежа (МСБ) также быстро oil взаимодействует с GroEL (к] составляет более ЮМ" хс" ) (Sparrer et al.,

1996). Взаимодействие развернутой рибулозо-бис-фосфаткарбоксилазы с шаперонином происходит с константой скорости 3,5x107 М^хс"1. Два ранних развернутых интермедиата ЛДГ взаимодействуют с GroEL f i i значительно медленнее, с константой скорости 5x10 М" хс" (Badcoe et al., 1991). Для скоростей ассоциации маленьких развернутых полипептидов с GroEL определены константы 108 М^хс"1 и выше, что приближается к диффузионно контролируемому пределу (например, в случае барназы). Для апо-а-лактальбумина к\ составляют 0,2x106 и 1,0x106 М^хс"1 для востановленной и окисленной формы, соответственно (Katsumata et al., 1996). Было предположено, что некоторые отличия в скорости связывания могут отражать различный вклад электростатических взаимодействий между отрицательно заряженным GroEL и положительно заряженным полипептидом, как в случае барназы (Perrett et al., 1997), или отрицательно заряженным, таким как а-лакгальбумин.

Поздние интермедиаты ДГФР образуют с GroEL (при концентрации обоих компонентов 1,2 мкМ) прочный комплекс с константой диссоциации меньше 10 нМ. Для бинарного комплекса GroEL и ДГФР из E.coli значение Kd составляет приблизительно 85 нМ.

Ранние развернутые интермедиаты ЛДГ формируют комплекс с кажущейся константой диссоциации менее 7нМ. В присутствии АТР константа диссоциации во всех случаях значительно выше.

Значение измеренной константы диссоциации для комплекса GroES-GroEL составляет 0,1-0,2 нМ в присутствии ADP и увеличивается до 17 нМ в присутствии ATP (Hayer et al., 1995).

Конформационные изменения в структуре белка при его взаимодействии с шаперонином.

Известно, что GroEL облегчает продуктивный фолдинг белка-субстрата, однако при этом возникает вопрос, сопровождается ли данный процесс разворачиванием исходной структуры белка и разрушением его конформации. В результате кинетических исследований было показано, что GroEL «захватывает» сворачивающийся белок, когда тот склонен образовывать агрегаты, и в процессе связывания шаперонин возвращает субстрат в исходное менее свернутое состояние (Peralta et al., 1994; Ranson et al., 1995). В подтверждение этих данных Вайсманом и соавт. было обнаружено, что после цикла высвобождения и нового связывания роданазы шаперонином происходит увеличение чувствительности субстрата к протеолизу. Это наблюдение позволяет предположить, что новое связывание сопровождется возвращением к его ненативной конформации (Weissman et al., 1994). Прямое доказательство акта разворачивания, сопровождающего процесс связывания белка с GroEL, было получено для некоторых белков. Нативная ДГФР человека в отсутствие лигандов медленно теряет активность и связывается с GroEL (Viitanen et al., 1991). Было показано также, что в присутствии GroEL инактивируется и пре-Р-лактомаза (Laminet et al., 1990). В каждом случае добавление GroES и АТР способствует сворачиванию полипептида в его нативную структуру. Другой пример - роданаза, транслирующаяся в экстракте клеток E.coli штамма S 30, в мРНК которой отсутствует стоп-кодон. В этом случае вновь синтезирующаяся цепь белка остается связанной с рибосомой и не узнается GroEL. В то же время белок сворачивается котрансляционно, формируя нечувствительный к протеазам N-концевой домен (17 кДа). При добавлении в систему пуромицина происходит высвобождение роданазы из рибосомы, белок связывается с GroEL и принимает конформацию чувствительную к протеолизу. Это указывает на то, что связывание роданазы с GroEL сопровождается, по крайней мере, частичным разворачиванием N-концевого домена (Reid and Flynn, 1996).

Значение связывания и гидролиза АТР в реакционном цикле системы шаперонина.

Как говорилось ранее, GroEL-зависимое сворачивание белков сопровождается конформационными изменениями не только в структуре белка-мишени, но и в молекуле шаперонина. Изменения, происходящие в структуре шаперонина, могут быть разделены на две стадии. Первая сопряжена со связыванием нуклеотида. Связывание и гидролиз АТР в экваториальном домене GroEL приводит к конформационным изменениям в апикальном домене, в результате чего формируются участки связывания для полипептида с высоким и низким сродством (Hayer et al., 1996). В отсутствие кошаперонина GroEL проявляет асимметричность в отношении связывания нуклеотида (Gray and Fersht, 1991). Структурная основа такой асимметрии была установлена различными методами (Ma and Karplus, 1998; de Groot et al., 1999). Было показано, что каталитически активная конформация достигается шаперонином на раннем этапе конформационного перехода, происходящего в процессе функционирования GroEL, и не зависит от

GroES. Так, при связывании Mg-ATP наблюдается движение (« на 25°) промежуточного домена шапреонина вокруг нижнего сочленения, направленное вниз к экватариальному домену. Далее происходит незначительный поворот апикальных доменов по часовой стрелке вокруг верхнего сочленения, вследствие чего происходит увеличение внутренней полости GroEL. Параллельно происходит движение экваториальных доменов против часовой стрелки, что является существенным элементом отрицательной кооперативности в отношении связывания нуклеотида противоположным кольцом шаперонина. На данном этапе гидрофобные спирали апикальных доменов, отвечающие за связывание с белком-субстратом, становятся менее доступными для взаимодействия. Это объясняет уменьшение сродства GroEL к белку после присоединения нуклеотида.

Конформационные изменения, происходящие на следующем этапе, являются существенными для связывания GroEL с кошаперонином. Вследствие дальнейшего поворота апикальных доменов по часовой стрелке происходит переориентация спиралей для взаимодействия с мобильной петлей кошаперонина. В результате таких изменений полипептид переходит из апикальных участков связывания с GroEL в полость его центрального канала, где оказывается в новом для себя гидрофильном окружении. Смена окружения, вероятно, необходима для инициации продуктивного фолдинга. Рассмотренная выше последовательность реакций (связывание полипептида и эффективный фолдинг) может реализоваться в одном кольце GroEL. Однако для завершения реакционного цикла (высвобождения лигандов из комплекса с GroEL) необходимо два кольца. Было показано, что диссоциация GroES требует второго кольца, где происходит связывание и гидролиз семи молекул АТР. Это является аллостерическим сигналом для высвобождения GroES и полипептида из цис-положения шаперонина.

Методом электронной микроскопии было показано, что этот процесс также происходит за счет движения апикальных доменов, в результате которого гидрофобные участки связывания с GroES высвобождаются из контактов с мобильными петлями кошаперонина (Roseman et al., 1996).

Таким образом, кольцо GroEL является функциональной единицей в связывании и гидролизе нуклеотида с сильно выраженной положительной кооперативностью. Два кольца GroEL проявляют отрицательную кооперативность по отношению друг к другу (Yifrach and Horovitz, 1996; Yifrach and Horovitz, 1995), в результате чего в данный момент времени происходит связывание АТР только с одним кольцом GroEL. Это в свою очередь определяет ассиметричность связывания кошаперонина по отношению к кольцу, связанному с нуклеотидом.

Третичный комплекс GroEL-GroES-полипептид. а) Цис- и транс-третичные комплексы.

Эксперименты, проведенные in vitro и in vivo, показали, что продуктивное сворачивание полипептида, по крайней мере, в условиях, когда сворачивание белка невозможно без участия шаперонина, требует обязательного присутствия GroES (Schmidt et al., 1994). При смешивании эквимолярных количеств GroEL и GroES с развернутым полипептидом (например, роданазой) половину из образовавшихся комплексов составляли транс-третичные комплексы, где GroES и полипептид занимали противоположные кольца шаперонина, а другую часть - цис-третичные комплексы. В связи с этим было предположено, что строгой кинетики, направляющей предпочтительное формирование того или иного комплекса, не существует. При этом специфическая роль транскомплекса не ясна. Белки с молекулярной массой более 60 кДа (метилмалонил-СоА-мутаза, белок фага р22) способны образовывать только транс-комплексы, вероятно, потому, что не соответствуют по размеру центрального канала GroEL, закрытого кошаперонином (Brunschier et al., 1993; Gordon et al., 1994). Для небольших полипептидов, например, орнитин-транскарбамоилазы (ОТК, Мг 36 кДа) показано, что транс-комплекс является неэффективным в образовании нативной структуры (Weissman et al., 1995). В настоящий момент окончательно не установлено, высвобождается ли из транс-комплекса ненативная форма, хотя некоторые данные указывают на то, что выход несвернувшегося полипептида может происходить in vitro (Mayhew et al., 1996). В клетке это, возможно, дает шанс полипептиду заново связаться с GroEL для следующей попытки сворачивания или быть узнанным протеазами и подвергнуться деградации. б) Симметричный комплекс.

Еще одна возможность формирования третичного комплекса - это образование симметричного комплекса, в котором GroES связываются с двумя кольцами шаперонина (Schmidt et al., 1994) (Azem et al., 1994). Хотя формирование такой структуры в некоторой степени коррелирует с эффективным фолдингом полипептида (Llorca et al., 1996; Azem et al., 1995), его роль в функционировании цикла остается неизвестной. Считается, что его образование не является обязательным в реакции сворачивания. Так, в экспериментах по титрованию GroEL кошаперонином (Langer et al., 1992), а также при ингибировании АТРазной активности GroEL кошаперонином (Todd et al., 1994), была определена стехиометрия комплекса GroEL-GroES равная 1:1. Однако гипотеза о том, что симметричная структура может быть промежуточным состоянием при переходе от транс- к цис-третичному комплексу, остается привлекательной. Можно ожидать, что симметричный комплекс нестабилен в присутствии АТР и в результате гидролиза нуклеотида GroES будет диссоциировать от противоположного кольца. в) Продуктивные интермедиаты, образующиеся в реакционном цикле GroEL: цис-третичный комплекс.

Экспериментальные данные позволяют сделать вывод о том, что главным интермедиатом в процессе функционирования системы шаперонина является цис-третичный комплекс. Ряд интересных экспериментов были проведены на орнитин-транскарбамоилазе и мутанте GroEL - SR1. Эффективное сворачивание ОТК (белок с молекулярной массой ЗбкДа) происходит в течение одного цикла связывания и высвобождения из комплекса с GroEL. Мутант SR 1 представляет собой структуру, состоящую из одного кольца GroEL. Он получен в результате замен аминокислот, отвечающих за формирование четырех главных контактов между кольцами шаперонина, на аланин. В результате этого образуются стабильные гептамеры GroEL (Weissman et а!., 1995). Мутантный шаперонин взаимодействует с полипептидом и GroES так же эффективно, как и дикий тип, но SR 1 не способен высвобождать GroES даже в присутствии АТР. В связи с этим SR 1 может функционировать как ловушка для кошаперонина, высвобождающегося из третичного комплекса, и ограничивать реакцию одним оборотом цикла. Изучение процесса рефолдинга ОТК в присутствии SR 1 показало, что в цис-третичном комплексе образование нативного бежа происходит быстро и эффективно, тогда как в транскомплексе это невозможно. Однако существуют данные, что из цис-третичного комплекса могут высвобождаться как нативные, так и ненативные формы бежа (Burston et al., 1996).

Значение центральной полости шаперонина в сворачивании белков.

Ответ на вопрос, что происходит в цис-третичном комплексе для облегчения продуктивного фолдинга, является ключевым в понимании механизма сворачивания белков при участии GroEL. Важно знать, что инициирует фолдинг в таком комплексе, и как далеко продолжается сворачивание белка до диссоциации третичного комплекса.

В некоторых экспериментах для наблюдения за инициацией фолдинга был использован метод флуоресцентной анизотропии, который позволяет по изменению подвижности флуорофора судить в целом о подвижности полипептидной цепи. Так, был образован комплекс между GroEL дикого типа или мутантом GroEL - SR 1 и роданазой, у которой четыре молекулы цистеина были модифицированы пиренмалеимидом. Затем к такому комплексу добавляли АТР в присутствии и отсутствие GroES. Значительное уменьшение анизотропии, свидетельствующее о увеличении подвижности полипептидной цепи, было зафиксировано только при одновременном добавлении GroES и АТР. Важно, что этот процесс происходил с Х\п - 1 с, что значительно меньше времени необходимого для гидролиза АТР и диссоциации GroES. Это указывает на то, что роданаза быстро высвобождается из участков связывания с апикальными доменами GroEL в полость центрального канала, ограниченного GroES. В дальнейших экспериментах к бинарному комплексу роданазы и мутанта GroEL - SR 1 добавляли АТР и кошаперонин, затем проводили разделение компонентов при помощи гель-фильтрации, после чего измеряли активность роданазы. Оказалось, что восстановление ферментативной активности происходит уже в комплексе SR 1-GroES (Weissman et al., 1996). Это указывает на то, что не только инициация продуктивного фолдинга, но и формирование нативной структуры может иметь место в цис-третичном комплексе.

Высвобождение ненативных форм белка из комплекса GroEL-GroES.

Одной из интересных проблем шаперонин-опосредованного фолдинга является возможность высвобождения ненативных форм бежа из комплекса GroEL-GroES. Считается, что данный процесс может иметь место в клетке в определенных условиях. Неспособными к достижению нативной конформации в ходе шаперониновой реакции могут быть белки с измененной нативной стркуктурой вследствие действия протеаз, мутирования, химической модификации или теплового шока. Такие белки, высвободившись из комплекса с GroEL, могут быть переданы другим шаперонинам или подвергнуться деградации в протеосомах (Kandror et al., 1994). Кроме того, существуют белки, интермедиаты фолдинга которых узнаются GroEL, но при этом не могут быть эффективно свернуты. К таким «субстратам» шаперонина относятся белки цитоскелета: актин и тубулин (Tian et al., 1995).

Взаимодействие шаперонина с большими и олигомерными белками.

Наше понимание механизма функционирования шаперониновой системы в большей степени проистекает из изучения принципа его взаимодействия с маленькими белками, молекулярная масса которых соответствует размерам центрального канала шаперонина. Однако, около 15% белков-субстратов имеет размеры превышающие 57-60 кДа (Ellis, 2000). В связи с этим большой интерес представляет характер взаимодействий шаперонина с большими мультидоменными и олигомерными белками. Так, были проведены эксперименты по исследованию взаимодействия GroEL со сконструированным химерным полипептидом МСБ-а (молекулярная масса 86 кДа) на основе мальтозо-связывающего бежа и N-концевой последовательности а-субъединицы декарбоксилазы El (компонента дегидрогеназного комплекса а-кетокислот), экспрессированного в клетках Е. coli (Huang and Chuang, 1999). Было доказано образование бинарного комплекса МСБ-a-GroEL в лизате трансформированных клеток и увеличение на порядок константы скорости сворачивания полипептида в присутствии шаперонина относительно его спонтанного фолдинга. Также было обнаружено, что при инкубации комплекса в присутствии GroES происходит образование только транс-комплекса, что подтверждает предположение о том, что продуктивный фолдинг больших мультидоменных белков может происходить в центральном канале шаперонина, не ограниченного GroES. В других исследованиях было показано, что GroEL-зависимый фолдинг 72 кДа бежа фага Р 22 не требует кошаперонина, при этом также возможно образование тран-комплекса. Очень интересные данные о характере взаимодействия шаперонина с олигомерными белками были получены при исследовании влияния GroEL на фолдинг дегидрогеназы a-кетокислот с разветвленной цепью (Song et al., 2000). Было показано, что связывание интермедиата aß-гетеродимер с GroEL-GroES является необходимым для образования нативного осг$2 комплекса, и подробно охарактеризовано влияние шаперонина на этот процесс. Инкубация комплекса GroEL-aß-гетеродимер с Mg-ATP приводит к высвобождению a-субъединицы. Высвобождение ß-субъдиницы также происходит, но при этом она не способна ассоциировать с а-субъединицей и сразу же повторно связывается с шаперонином. При инкубации комплекса GroEL-aß-гетеродимер с Mg-ATP и GroES происходит высвобождение обоих типов субъединиц. При этом ß-субъединица взаимодействует снова с шаперонином, где в цис-комплексе GroEL-GroES происходит ее эффективный фолдинг. Далее происходит высвобождение ß-субъединицы и формирование правильного гетеродимера.

Появление в клетке белков и поддержание их в функциональном состоянии зависит не только от правильности процессов транскрипции и трансляции. После завершения начального фолдинга и формирования функциональных комплексов белки могут повреждаться в процессе воздействия на клетку различных стрессов: действия активных форм кислорода, теплового и химического стрессов, а также неправильной ассоциация мономеров в олигомер. Результатом этого является нарушение правильной пространственной структуры и экспонирование растворителю гидрофобных поверхностей. Для таких белков, как и для белков, образующихся вследствие мутации гена или ошибок трансляции, существует несколько вариантов их дальнейшей участи: возвращение к нативному, функционально активному состоянию при помощи шаперонов или деградация в системе энергозависимого протеолиза. Считается, что в большинстве случаев судьба поврежденного бежа определяется кинетикой его взаимодействия (связывания и высвобождения) с шапероном или шапероновым компонентом протеазного комплекса и его способностью достигнуть нативного состояния в принципе. В любом случае сложный механизм взаимоотношений между бежами и системой, осуществляющей посттрансляциооный контроль, сводиться к предотвращению агрегации белков как опасного для жизнедеятельности клетки и организма в целом процесса. Так, в последнее время агрегацию, ассоциированную с прионовыми и амилоидными заболеваниями, склонны связывать именно с нарушениями функционирования системы посттрансляционного контроля по исправлению и удалению форм бежов, приводящих к прогрессии этих заболеваний. Актуальным и нерешенным является вопрос о том, как прионо- и амилоидогенные белки избегают действия протез и шаперонов. Предполагается, что либо в процессе фолдинга таких белков образуются структуры, не узнаваемые шаперонами, либо агрегация амилоидогенных форм белков происходит значительно быстрее, чем процесс, в результате которого они могли бы быть исправлены или деградированы (Wickner et al., 1999). С другой стороны, свойство шаперонов стабилизировать интермедиаты фолдинга может способствовать процессу перехода нормального бежа в его патогенную форму (Welch and Gambetti, 1998). Такая гипотеза впервые была высказана Прузинером (Prusiner et al., 1998). Он предположил, что конверсию нормального клеточного прионового бежа РгР° (мономерного, с преобладанием ос-спиралей, протеазо-чувствительного и растворимого в присутствии детергентов) в его инфекционную форму РгР может опосредовать молекулярный шаперон. Действительно, в работах (DebBurman et al., 1997; Edenhofer et al., 1996) было обнаружено взаимодействие Hsp 104, Hsp 60 человека и его близкого гомолога GroEL с прионовым бежом, а также ускорение конверсии в присутствии GroEL и Hsp 104. В более поздних исследованиях Стокера и Хартла (Stockei and Hartl, 2001) была показана способность GroEL катализировать агрегацию химически денатурированного рекомбинантного РгР. При этом агрегаты, образующиеся при АТР-зависимом высвобождении из комплекса с шаперонином прионового белка, обладают определенными свойствами PrPSc, а именно высоким содержанием ß-структур, нерастворимостью в присутствии детергента и увеличением устойчивости к протеазам.

Внутриклеточное увеличение содержания неправильно свернутых белков имеет своим следствием активацию так называемого Heat-shock/stress ответа. Однако было обнаружено, что клетки, п экспрессирующие форму РгР , не могут активировать ответ, в отличие от клеток, содержащих нормальную форму белка (Tatzelt et al., 1995). Потеря клетками способности отвечать на стресс является также признаком стареющих клеток.

Новые функции шаперонина GroEL.

Изложенные выше данные убедительно свидетельствуют о важной роли, которую играют шаперонины в биогенезе белков и поддержании клеточного гомеостаза. Рассмотренная выше деятельность шаперонина связана с его участием в процессах сворачивания белков-субстратов, поддержания их нативной структуры и предотвращении агрегации. В последнее время появились неожиданные данные об участии Hsp 60 человека и его бактериального гомолога GroEL в процессах, не связанных с его основной функцией - фолдингом белков.

Так, например, появилась концепция аутоиммунной причины возникновения атеросклероза (Wick, 2000; Wick et al., 2001). Эта концепция основана на наблюдении о наличии у человека клеточного и гуморального иммунитета к бактериальному Hsp 60. Вследствие высокой степени антигенной гомологии между бактериальными шаперонинами, в частности GroEL и Hsp 60 человека, высока опасность перекрестной иммунной реакции с человеческим Hsp 60, экспрессирующимся в эндотелиальных клетках престрессованных артерий. В исследованиях группы Вика было обнаружено увеличение уровня экспрессии Hsp 60 в эндотелиальных клетках интимы аорты с атеросклеротическими повреждениями, а также повышение содержания антител к шаперонинам, обладающих эндотелиальной цитотоксичностъю (Mayr et al., 1999). Изменение экспрессии и клеточной локализации (появление на мембране клетки) Hsp 60 наблюдается при запуске апоптоза клетки (Soltys and Gupta, 1996; Soltys and Gupta, 1997; Poccia et al., 1996). Bee больше данных появляется об участии бежов семейства GroEL-GroES в патогенезе некоторых инфекционных заболеваний (Sasu et al., 2001). Еще более неожиданными оказались данные о том, что Hsp 60 являются эндогенным лигандом для То11-подобного рецептора, принимающего участие в реакциях вражденного иммунитета (Vabulas et al., 2001; Ohashi et al., 2000).

D-ГЛИЦЕРАЛЬ ДЕГИД-3 -ФОСФАТ-ДЕГИДРОГЕНАЗА Общая характеристика фермента.

D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.2.1.12; ГАФД) -фермент гликолиза, катализирующий реакцию окисления D-глицеральдегид-3 -фосфата, сопряженную с фосфорилированием: 3-ФГА + НАД" + НР042' ГЛФ\ 1,3-ДФГ + НАДН + Н+, где 3-ФГА - глицеральдегид-3-фосфат; 1,3-ДФГ - 1,3-дифосфоглицериновая кислота.

ГАФД способна также катализировать ряд побочных реакций: гидролиз n-нитрофенилацетата (в отсутствие НАД4), диафоразную реакцию, окисление 3-ФГА, сопряженное с переносом ацильного остатка на коэнзим А, ацилфосфатазную и некоторые другие реакции.

Хорошо исследована структура глицеральдегид-3 -фосфатдегидрогеназы. Нативный фермент представляет собой тетрамер (мол. масса 144 кДа), образованный одинаковыми субъединицами с молекулярной массой 36 кДа каждая. Первичная структура ГАФД, выделенной из разных источников, характеризуется высокой консервативностью. Обнаружено, что приблизительно 70 % аминокислотных остатков, составляющих полипептидную цепь фермента из эволюционно далеких источников, консервативно. Пространственная структура ГАФД установлена для фермента из мышц омара (Murthy et al., 1980), термофильных бактерий (Skarzyaski et al., 1987), для бежа из скелетных мышц человека (Mercer et al., 1976). Полипептидная цепь складывается в два домена: коэнзим-связывающий (остатки 1-148) и каталитический (остатки 148-330) (рис. 3). Структура НАД+-связывающего домена сходна у всех изученных НАД^-зависимых

Рис. 3. Структура субъединицы ГАФД Bacillus stearothremophilus. рогг' ' ГОСУД .Ajf

БШШ^дегвдрогеназ. Домен образован двумя складками Россмана (6 (3-тяжей и 4 ос-спирали), причем важной особенностью является наличие гибкой S-петли, образованной 178-201 аминокислотными остатками. Активный центр каждой субъединицы формируется на границе между НАД4-связывающим и каталитическим доменами. Связывание коэнзима сопровождается конформационными изменениями, в ходе которых тетрамер становится более компактным. При переходе в холо-конформацию происходит реорганизация структуры активного центра, важным следствием которой является уменьшение расстояния между аминокислотными остатками, принимающими участие в катализе (Cys 149, образующим в ходе катализа связь с субстратом, и His 176, выполняющим роль кислотно-основного катализатора). Современные представления о механизме реакции, катализируемой ГАФД, приведены на рис. 4.

Характерным свойством ГАФД является кооперативность активных центров тетрамерной молекулы. Так, отрицательная кооперативность по связыванию коэнзима была обнаружена для фермента из мышц и ряда других источников, а смешанная выявлена в случае связывания НАД+ белком из дрожжей. Другая особенность фермента - это так называемая «полуцентровая реактивность», которая также является проявлением взаимодействия активных центров. Характер «полуцентровой реактивности» зависит от происхождения ГАФД и от химического строения модифицирующего агента. Во многих случаях модификация половины субъединиц тетрамера ведет к полной инактивации всей молекулы. «Полуцентровая реактивность» указывает на взаимодействие активных центров субъединиц в составе димера ГАФД. Возможно «полуцентровая реактивность» связана с согласованным действием активных центров в ходе катализа. Однако такое взаимодействие не исключает способность каждого активного центра функционировать независимо. Использование иммобилизованных на нерастворимом носителе форм ГАФД различной олигомерности показало, что размыкание межсубъединичных контактов существенным образом не влияет на ферментативную активность отдельного мономера (Ashmarina et al., 1982; Levashov et al., 1998).

Термостабильная ГАФД Bacilus.stearothermophilus.

Как и у всех глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ структура термостабильного фермента имеет 222-симметрию, т.е. ее тетрамерная структура может быть представлена как димер димеров с тремя неэквивалентными поверхостями относительно осей: Р-оси (между О и Р и между Q и R субъединицами), Q-оси (между О и Q и между Р и R субъудиницами) и R-оси (между О и R и между Р и Q субъудиницами) (рис. 5). Межсубъединичная поверхность относительно Р-оси самая протяженная (2400 А), менее протяженна поверхность относительно R-оси (1700 А) и самая маленькая вдоль Q-оси (600 A) (Skarzyaski and Wonacott, 1988). Молекулярное моделирование показало, что в случае диссоциации нативного тетрамера ГАФД B.st. могут образовываться димеры неодинаковые по количеству экспонированных растворителю гидрофобных остатков. Так максимальным (300 остатков) оно будет в случае O-g-димера, на 5 % меньше (286 остатков) в случае 0-Я-димера и на 19 % меньше при образовании 0-Р-димера (245 остатков) (Duee et al., 1996). Не смотря на наличие высокой гомологии в первичной и пространственной структурах ферментов из различных источников существует ряд особенностей в молекуле ГАФД B.st., обуславливающих ее термостабильность I

Рис.5. Структура холо-формы ГАФД Bacillus stearothermophilus. температурный оптимум для роста Bacillus stearothermophilus 60-65 °С). Так, в молекуле ГАФД В. st. изменен характер водородных связей и взаимодействие между ß-складками каталитического домена, что приводит к тому, что Asp 293 оказывается внутри глобулы. В результате изменяется окружение Arg 194 в одной субъединице и Asp 293 в другой (соседней по оси Р) и между этими аминокислотными остатками образуется дополнительная скрытая ионная связь, существенная для термостабильности фермента (Walker et al., 1980). Еще одна (двойная) ионная пара, отсутствующая в мезофильных белках, образуется при взаимодействии между Arg 281 двух соседних по оси Q субъединиц и Glu201 субъединиц, сближенных по осям Р и Q. Эти взаимодействия защищены от воздействия внешней среды и вносят важный вклад в термостабильность фермента. Значительные отличия наблюдаются также в аминокислотном составе S-петли, которая формирует внутреннюю область тетрамера ГАФД и формирует важные нековалентные связи с соседними субъединицами. Во всех мезофильных ферментах S-петля высококонсервативна. Также очень сходны эти участки в молекулах ГАФД из термофильных бактерий Bacillus stearothermophilus и Thermus aquaticus, однако последовательности в мезофильных и термофильных белках различны. Во втором случае наблюдается замена четырех аминокислотных остатков на более гидрофобные, что приводит к усилению контактов по R-оси, а также возникает еще одна дополнительная водородная связь между Туг 178 и карбонильной группой Ala 200. Заметим, что возникновение феномена термостабильности обеспечивается увеличением свободной энергии активации денатурации на 9кДж/моль и не требует очень больших изменений в четверичной структуре белков. Энергия стабилизации соответствует нескольким дополнительным солевым мостикам или водородным связям. Однако эти несколько дополнительных связей позволяют термостабильным организмам существовать при температурах 60-100°С, а ферментам, выделенным из них, не диссоциировать даже в присутствии умеренных концентрации денатурирующих агентов (Suzuki and Imahori, 1973). Вместе с тем, следует подчеркнуть еще раз, что данные кристаллографических исследований, а также результаты экспериментов по гибридизации субъединиц фермента (Suzuki and Imahori, 1973) и выявлению поверхностных остатков с помощью химической модификации (Lambert and Perham, 1977) подтверждают принципиальное близкое сходство третичной и четвертичной структуры ГАФД из различных источников, в частности ферментов из В. stearothermophilus и из мышц кролика.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе были использованы Трис, ДТТ фирмы «Fluka»; NAD+, ATP, ЭДТА, ДТНБ, Кумасси бриллиантовый синий, Сефароза 4В, ДСН, MgCl2, DAB, АСА-34, Фенил-Сефароза, Q-Сефароза фирмы «Sigma»; Сефадекс G-50, Сефадекс G-100, ДЭАЭ-Сефацел фирмы «Pharmacia»; Tween-20 фирмы «Ferak». Глицеральдегид-3-фосфат получали из фруктозо-6 фосфата по методике Шевчука и соавт. (Szewczuk et al., 1961) и хранили в виде Са2+-соли. Перед использованием Са2+-соль глицеральдегид-3-фосфата переводили в Н+-форму с помощью ионообменной смолы марки «Дауэкс». Мочевину квалификации осч перекристаллизовывали из этанола. BrCN синтезировали из KCN и Вг2 перед активацией Сефарозы. Плазмида, содержащая ген GroEL, была любезно предоставлена проф. В.В. Месянжиновым из института биохимии им. Баха РАН. Плазмиды, содержащие гены термостабильной ГАФД Bacillus stearothermophilus мутантных и дикого типов, предоставлены проф. Бранло из лаборатории энзимологии и генетики университета г. Нанси, Франция.

Методы выделения белков.

Выделение шаперонина GroEL.

Клетки E.coli штамма W3110 трансформировали плазмидой pOF39, содержащей ген GroEL. Очистку шаперонина проводили по методике Корралеса и Фернгга с некоторыми модификациями (Corrales and Fersht, 1996). 8-10 г осадка клеток суспендировали в равном объеме буфера А (50 мМ Трис-HCl, pH 7,2 (4°С), 0,1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ) и суспензию обрабатывали ультразвуком пять раз при частоте 22 кГц в течение 45 с. Фрагменты разрушенных клеток удаляли центрифугированием в течение 30 мин при 12000 g. Полученный белковый раствор фракционировали с помощью (NH4)2S04 в диапазоне 65-90 % насыщения. Сформировавшийся белковый осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 29000 g, растворяли в 5-7 мл буфера А и диализовали в течение ночи против 6 литров этого же буфера. Дальнейшую очистку шаперонина проводили методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Сефацеле. На колонку (3x8 см), уравновешенную буфером А, наносили 15-25 мл раствора белка с концентрацией 6-8 мг/мл. От несвязавшегося бежа сорбент промывали двукратным объемом буфера А. Сорбировавшиеся белки элюировали линейным градиентом NaCL (0-0,5 М). GroEL элюировался в диапазоне 0,31-0,37 М NaCl. Степень очистки шаперонина анализировали методом ДСН-электрофореза в 12,5 % ПААГ. Фракции, содержащие частично очищенный GroEL, объединяли и подвергали дополнительной очистке с помощью хроматографии на ДЭАЭ-Сефацеле.

Выделение ГАФД Bacillus stearothermophillus.

Термостабильную ГАФД Bacillus stearothermophillus (ГАФД В.st.) и ее мутантные формы выделяли из клеток E.coli (штамм GM 109), трансформированных плазмидой pskll, содержащей ген фермента дикого или мутантного типа по методике (Mougin et al., 1988). 14 г клеточной биомассы суспендировали в двукратном объеме буфера Б (50 мМ Трис-НС1, pH 8,0, 2 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ). Клетки разрушали, обрабатывая суспензию ультразвуком в течение 45 с 5-7 раз при 22 кГц. Полученный раствор белка фракционировали с помощью (NH4)2S04 в диапазоне 6692 % насыщения. Полученный осадок белка растворяли в 5 мл буфера Б и наносили на колонку (0,75x56 см) с АСА-34, уравновешенную этим же буфером. Элюцию проводили уравновешивающим буфером со скоростью 1,5 мл/мин. Фракции с максимальной активностью ГАФД объединяли и наносили на колонку (1,5x4 см) с Q-Сефарозой, уравновешенную буфером Б. Белки элюировали линейным градиентом KCl (0-0,2 М в случае фермента дикого типа и 0-0,3 М при выделении мутантных форм белка). На этой стадии происходило разделение эндогенной ГАФД из E.coli и экспрессированной ГАФД В. st. Дальнейшую очистку фермента дикого типа проводили методом гидрофобной хроматографии. Фракции, содержащие ГАФД В.st., объединяли и наносили на колонку (2x4 см) с Фенил-Сефарозой, уравновешенную буфером Б, содержащим 1,7 М (NH4)2S04. ГАФД В.st. элюировали градиентом (NH4)2S04 (1,7-ОМ). Полученный препарат белка был электрофоретически гомогенным и удельная активность составляла 100-140 ед/мг бежа.

Выделение ГАФД из скелетных мышц кролика.

ГАФД из скелетных мышц кролика выделяли по методу Хилла (Hill et al., 1975). Все стадии выделения проводили при 4°С. От задних конечностей и спины кролика отделяли мышцы, очищали от соединительной и жировой ткани, измельчали при помощи мясорубки, добавляли 1,5-кратный объем буфера (10 мМ КН2Р04, pH 7,5, 5 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ), гомогенизировали и экстрагировали 20 минут. Осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 5500 g и отбрасывали. Для удаления большинства балластных белков к полученному супернатанту медленно при перемешивании добавляли сухой (NH4)2S04 (50,5 г на 100 мл экстракта), pH раствора поддерживали около 7,0, добавляя раствор 35 %-го аммиака. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием в течение 30 мин при 29000 g. Затем проводили изоэлектрическое осаждение ГАФД, доводя pH в супернатанте до значения 8,0. Осадок формировался в течение ночи при 4°С. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием и растворяли в водном растворе 5 мМ ЭДТА, pH 7,8, содержащем 1 мМ

ДТТ, до конечной концентрации белка 18-20 мг/мл. Далее проводили высаливание ГАФД насыщенным раствором (N114)2804 до появления характерного перламутрового помутнения. Осадок собирали центрифугированием, растворяли и повторяли процедуру перекристаллизации 3-4 раза. Примесь миоглобина из препарата ГАФД удаляли при помощи гель-фильтрации на колонке с Сефадексом в-100. Выделенный фермент имел удельную активность 120 ед/мг бежа и отношение Агво/Агбо^,05-1,1. Белок хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (N114)2804.

Аналитические методы.

Определение концентраций реагентов.

Концентрацию NAD+ определяли спектрофотометрически при А,=260 нм (е = 1,84х104М" см" ) или энзиматически с помощью ГАФД по образованию ^БН (е = 6,22x103 М^см"1) при ?1 = 340нм. При энзиматическом опредеолении реакционная среда (рН9,0), содержала 50 мМ глицин, 100 мМ КН2Р04, 5 мМ ЭДТА, 50 мкг ГАФД, 2 мМ 3-ФГА и 5 мкл исследуемого раствора ЫАО+. Концентрацию 3-ФГА определяли энзиматически в той же среде, добавляя 1 мМ ЫАЕ)+ и 5 мкл исследуемого раствора 3-ФГА.

Определение ферментативной активности ГАФД.

Определение активности ГАФД проводили спектрофотометрически, измеряя образование ИАБН при 25 °С по скорости нарастания оптической плотности при 340 нм в пробе (объем

1 мл) следующего состава: 1,5 мМ 3-ФГА, 1,5 мМ NAD+, 50 мМ глицин,

2 мМ ЭДТА, 100 мМ КН2Р04, рН 9,9, содержащей 0,8-2 мкг бежа. Для ГАФД В. як Использовали буфер с рН 9,9. В случае ГАФД из мышц кролика использовали буфер этого же состава рН 8,9. За единицу активности принимали количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля NAD+ в минуту.

Определение концентрации бежа. а) Определение концентрации белка в растворе.

Концентрации бежов в растворе определяли спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность при А,=280 нм (или для препаратов ГАФД при двух длинах волн: 280 и 260 нм). При этом использовались следующие значения А28о°'1%- холофермент ГАФД из мышц кролика - 1, апофермент ГАФД из мышц кролика - 0,83; холофермент ГАФД B.st. - 0,92, апофермент ГАФД B.st. - 0,83. Соотношение поглощения при двух длин волн А280/А260 для холо-ГАФД составляло 1,07, для апо-ГАФД - 1,7-1,9. А28о°'1% для GroEL принимали равным 0,2, для иммуноглобулинов - 1,5. Молекулярные массы бежов составляют: тетрамер ГАФД 144000 Да (субъединица 36000 Да), IgG 150000 Да, IgM 950000 Да, тетрадекамер GroEL 840000 Да (субьединица 60000 Да)

Также проводили определение концентрации бежов по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Линейность поглощения А595 сохранялась в интервале 0-10 мкг бежа в пробе. б) Определение концентрации белка, иммобилизованного на Сефарозе.

Определение концентрации бежа, иммобилизованного на Сефарозе, проводили, используя модифицированный метод Брэдфорд (Asryants et al., 1985), в пробе следующего состава: 2 мл красителя (Кумасси бриллиантовый синий G-250), 0,05 мл контрольной Сефарозы и 0,05 мл суспензии иммобилизованного бежа. Концентрацию бежа рассчитывали на 1 мл осевшей Сефарозы. Для построения калибровочного графика в пробы добавляли ОД мл контрольной Сефарозы и 1-16 мкг растворимого белка, использовавшегося для иммобилизации. Линейность поглощения при А595 сохранялась в интервале 0-14 мкг белка в пробе.

Метод иммобилизации.

Активация Сефарозы.

Активацию Сефарозы при помощи ВгОЧ проводили по методике (СЬегеёпУшуа е1 а1., 1980). Сефарозу 4В промывали на стеклянном фильтре с водоструйным насосом раствором 0,1 М К3РО4, рН 11, а затем бидистиллированной водой до нейтральных значений рН в элюате и слегка подсушивали током воздуха. Затем Сефарозу взвешивали и заливали охлажденным до 4°С раствором 1,0 М К3Р04, рН 11. (1 мл на 1 г влажной Сефарозы). Последующую процедуру проводили в ледяной бане. К полученной суспензии медленно добавляли 5 %-ный водный раствор ВгСИ (при иммобилизации различных форм ГАФД) или 25 %-ный раствор в случае иммобилизации ОгоЕЬ и перемешивали на магнитной мешалке в течение 7 мин. Затем суспензию промывали на стеклянном фильтре двадцатью объемами буфера (0,1 М КН2Р04, рН 8,3, 5 мМ ЭДТА) и сразу же использовали для иммобилизации белков.

Степень активации Сефарозы составляла 5 мг ВгСЫ/ мл геля при иммобилизации ГАФД из различных источников и 30 мг ВгСЫ/ мл геля в случае ОгоЕЬ.

Иммобилизация ГАФД из различных источников.

К активированной Сефарозе добавляли равный объем раствора бежа с концентрацией 0,8-1 мг/мл в буфере 0,1 М КН2Р04, рН 8,3, 5 мМ

ЭДТА (белок предварительно обессоливали на колонке с Сефадексом в-50). Затем суспензию инкубировали 4 ч при комнатной температуре, медленно перемешивая на магнитной мешалке. После инкубации вносили глицин до конечной концентрации 50 мМ, перемешивали 15 мин и оставляли инкубироваться в течение 10-15 ч при 4°С. По окончании инкубации Сефарозу отмывали от несвязавшегося белка и глицина буфером 0,1 М КН2РО4, рН 8,3, 5 мМ ЭДТА до исчезновения белка в элюате. В экспериментах использовали суспензию Сефарозы в рабочем буфере. Соотношение геля Сефарозы к буферу составляло 1:1 по объему.

Количество иммобилизованного белка составляло 0,2-0,3 мг/мл осевшей Сефарозы. Препараты иммобилизованных за одну субъединицу тетрамеров ГАФД имели удельную активность 10-30 ед/мг бежа.

В качестве контрольной использовали Сефарозу, обработанную описанным выше способом за исключением стадии инкубации с бежом.

Иммобилизация СггоЕЬ.

Процесс иммобилизации СггоЕЬ аналогичен описанному выше. Количество иммобилизованного шаперонина составляло 0,8-0,85 мг белка/мл геля. В работе использовали суспензию 1:1 по объему в буфере: 50мМ Трис-НС1, рН 7,2, 0,1 мМ ЭДТА.

Получение иммобилизованных форм ГАФД различной нативностн и степени олигомерностн.

Получение иммобилизованных на Сефарозе активных димеров ГАФД В. 81

Все процедуры проводили при комнатной температуре. Для приготовления иммобилизованных активных димеров ГАФД Влк использовали препарат иммобилизованного за одну субъединицу

53 активного фермента, полученного, как описано выше. Сефарозу промывали градиентом раствора мочевины (0-5 М) в буфере (50 мМ Трис-НС1, рН 7,3, 0,1 мМ ЭДТА) и затем инкубировали в 5 М растворе мочевины. В процессе инкубации отбирали аликвоты для измерения энзиматической активности иммобилизованной ГАФД. После уменьшения активности фермента до 50 % от исходной гель Сефарозы промывали градиентом раствора мочевины (5 М-0) для предотвращения реассоциации субъединиц в тетрамер, а затем рабочим буфером. Количество белка, связанного с Сефарозой, в полученном препарате уменьшалось в 2 раза, а удельная активность фермента практически не изменялась.

Получение активных иммобилизованных димеров ГАФД из мышц кролика.

При приготовлении препарата активных иммобилизованных димеров ГАФД из мышц кролика использовали иммобилизованный за одну субъединицу активный фермент. Все процедуры проводили при 4°С. Гель Сефарозы промывали раствором 0,5 М ЫаС1, 5 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ, рН 7,4 и инкубировали в этом же растворе, содержащем 25 мМ АТР. После уменьшения активности иммобилизованного белка до 50 % гель промывали буфером 0,1 М КН2Р04, рН 8,3, 2 мМ ДТТ и затем рабочим буфером. Полученный препарат иммобилизованной ГАФД содержал 45-50 % белка по сравнению с иммобилизованным тетрамером и сохранял удельную активность.

Получение иммобилизованной денатурированной ГАФД.

Иммобилизованные за одну субъединицу тетрамеры ГАФД денатурировали до полной инактивации фермента, инкубируя Сефарозу в растворе 8 М мочевины. После 15 часов инкубации гель промывали градиентом мочевины (8-0 М) и затем рабочим буфером. В полученном препарате иммобилизованной ГАФД количество белка уменьшалось в 4 раза (до 25 % от исходного) и отсутствовала энзиматическая активность.

Электрофорез белков в ПААГ.

Электрофорез проводили с использованием прибора для электрофореза «Mini-Protean 3» (BioRad) при напряжении 100 Вольт.

Электрофорез в денатурирующих условиях.

Электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). Гели после электрофореза окрашивали 0,04 % раствором Кумасси бриллиантового синего R-250, приготовленного на смеси изопропанол-этанол-уксусная кислота-вода в соотношении 2:1:1:6. При анализе растворимых белков пробы готовили, инкубируя их в соотношении 1:1 (по объему) с буфером для образцов в течение 3 мин при температуре 100°С в водяной бане. На дорожку геля наносили 1-10 мкг белка.

В случае иммобилизованных белков к порции геля добавляли равный объем буфера для образцов и инкубировали в течение 3 мин при температуре 95°С в водяной бане. В данных условиях происходит частичное разрушение ковалентных связей иммобилизованного белка с Сефарозой, а также переход в раствор нековалентно связанных белков. Непосредственно перед нанесением проб на электрофорез Сефарозу осаждали центрифугированием.

Определение молекулярной массы анализируемых белков проводили по калибровочному графику зависимости логарифма молекулярной массы белков-маркеров от их относительной подвижности.

Электрофорез в неденатурируюших условиях (нативный электрофорез).

Для проведения нативного электрофореза белков с pi менее 7,5 использовали следующие растворы:

1. Для приготовления геля: 0,8 М Трис-глицин, pH 8,6

2. Электродный буфер: 0,08 М Трис-глицин, pH 8,3

3. Раствор для образцов: 40 мМ Трис-глицин, pH 8,6, 40 % глицерин, 0,01 % бромфеноловый синий.

Иммуноблоттинг.

Иммуноблоттинг после разделения белков методом ДСН-электрофореза.

Белки разделяли с помощью ДСН-электрофореза в ПААГ. После электрофореза гель уравновешивали в буфере для электропереноса 25 мМ Трис, 192 мМ глицин, 20 % этанол, 0,05 % ДСН в течение 1015 мин при перемешивании. Электроперенос осуществляли на нитроцеллюлозу, предварительно уравновешенную этим же буфером. Перенос проводили в приборе Mini-Trans-Blot (Bio-Rad) при постоянном напряжении 100 В (30-60 мин) и силе тока 200 мА при 4°С. После переноса мембрану промывали 2-3 мин дистиллированной водой и окрашивали раствором Ponceau S для детекции перенесенных белков. После этого мембрану промывали несколько раз дистиллированной водой для удаления красителя и инкубировали в блокирующем буфере I (Трис-солевой буфер (ТСБ): 20 мМ Трис-НС1, 0,15 М NaCl, pH 7,5, содержащий 2 % обезжиренного молока, 0,05 % Твин-20) в течение 1 ч при 25°С или в течение ночи при 4°С. Все последующие процедуры проводили при 25°С. После блокирования мембрану инкубировали с первыми антителами, разведенными в блокирующем буфере I, в течение 1 ч при перемешивании. От несвязавшихся антител мембрану отмывали в блокирующем буфере I в течение 30 мин, меняя раствор 3-4 раза. Затем мембрану инкубировали со вторыми антителами, разведенными в блокирующем буфере I, в течение 1 ч при перемешивании. В качестве вторых антител использовали антитела козы к иммуноглобулинам мыши или кролика, коньюгированные с пероксидазой хрена (разведение 1:10000, Pierce). От несвязавшихся антител мембрану отмывали в ТСБ, содержащем 0,05 % Твин-20, в течение 30 мин, меняя раствор 3-4 раза. После последней смены раствора мембрану дополнительно промывали ТСБ в течение 10 мин. Детекцию белков осуществляли с помощью хромогенного субстрата - диаминобензидина. Для этого мембрану инкубировали в течение 6 мин в растворе ТСБ, содержащем 0,6 мг/мл диаминобензидина, 0,03 % NiCl2 0,03 % Н202. Полученное на нитроцеллюлозе изображение сканировали с помощью сканера «Mustek 600 П CD». Интенсивность окрашенных полос измеряли, используя компьютерную программу PCBAS 2.08.

Иммуноблоттинг после нативного электрофореза.

Процесс проведения иммуноблотинга после разделения белков методом нативного электрофореза осуществляли аналогично описанному выше методу, за исключением используемого буфера для электропереноса, в составе которого отсутствовали этанол и ДСН.

Модификация SH-групп ГАФД из мышц кролика 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислотой.

ГАФД из мышц кролика, с концентрацией 0,7-0,8 мг/мл инкубировали в фосфатном буфере, рН 7,5, в присутствии 1 мМ ДТНБ до полной модификации всех SH-групп. Реакцию регистрировали

Л 1 1 спектрофотометрически при А,=412 нм (S4i2=13,6xlOJ М'1 см"). По окончании инкубации от продуктов реакции освобождались при помощи гель-фильтрации на колонке с Сефадексом G-50. Концентрацию полученного модифицированного фермента определяли методом Бредфорд.

В случае модификации сульфгидрильных групп у иммобилизованного за одну субъединицу тетрамера ГАФД, фермент инкубировали в буфере 100 мМ КН2Р04, рН 7,5, содержащем 10-кратный избыток ДТНБ по отношению к количеству SH-групп фермента. Для удаления продуктов реакции Сефарозу многократно промывали буфером, который предполагалось использовать в дальнейших экспериментах.

Измерение АТФазной активности GroEL.

Наличие АТФазной активности в препарате шаперонина определяли по методу Калининой (Kalinina et al., 1996). Измерение проводили в буфере: 20 мМ HEPES/NaOH, рН 7,5, 10 % глицерин, 1 мМ ЭДТА, 5 мМ MgCl2, 0,1 мМ АТР с меченым [у32Р]АТР. Реакцию останавливали добавлением активированного угля, сорбирующего негидролизованный АТР. Затем смесь центрифугировали и регистрировали черенковское излучение в супернатанте.

Определение коэффициента седиментации.

Седиментационный анализ проводили на аналитической ультрацентрифуге Beckman Spinco Е с использованием фотоэлектрической сканирующей приставки. Коэффициент седиментации s 2o,w определяли методом неравновесной седиментации в соответствии с уравнением Сведберга: tor о) At где t - время центрифугирования, (с); со - угловая скорость; со= 2тт, где п - число оборотов/с; г - расстояние от оси вращения до верхней границы перемещения исследуемого вещества. Для расчета молекулярной массы использовали уравнение:

IgM = 1,5 lgS + 3,925

Дифференциальная сканирующая калориметрия.

Анализ препаратов ГАФД методом дифференциальной сканирующей микрокалориметрии проводили на адиабатическом микрокалориметре DASM-4 (Биоприбор, Пущино, Россия) в кювете объемом 0,47 мл при скорости сканирования 1°С/мин. Концентрация белка составляла 0,3 мг/мл. Обработку полученных данных и расчет значений tmax (максимальная температура перехода), используя оригинальную программу Arina, разработанную в НИИФХБ им. А.Н. Белозерского.

Регистрация спектров кругового дихроизма.

Спектры КД регистрировали на дихрографе MARK V «Jobin Ivon» (Франция), управляемом компьютером IBM-PS 1-6, в кювете с длиной оптического пути 0,2 см. Данные обрабатывали с использованием программы RDA. Денатурация ГАФД В.st.

Для денатурации фермент инкубировали в растворе 8 М мочевины, приготовленной на буфере 50 мМ Трис-HCl, pH 7,2, 0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ

ДТТ, в течение ночи. Концентрация белка в денатурирующей среде составляла 0,6-0,9 мг/мл.

Исследование рефолдинга ГАФД ВМ.

Рефолдинг (реактивацию) ГАФД инициировали 50- или 100-кратным разбавлением денатурирующей смеси до конечной концентрации 0,3-0,6 мкМ (концентрация мочевины в реакционной среде при этом составляла 0,08-0,16 М). Рефолдинг проводили в буфере: 50 мМ Трис-НС1, рН 7,5, 0,1 мМ ЭДТА, 2 мМ ДТТ. В зависимости от цели опыта буфер содержал 3,5-5 мМ М^-АТР, эквимолярное количество ОгоЕЬ, мутантных димеров ГАФД В. модифицированной ДТНБ ГАФД из мышц кролика или моноклональных антител клона 6в7, полученных к ГАФД из мышц кролика. В процессе рефолдинга из реакционной среды отбирали аликвоты для определения ферментативной активности ГАФД В.з1. и строили график зависимости активности ГАФД Вж от времени реактивации.

Процедура инкубации иммобилизованных белков с растворимыми партнерами реакции.

Препараты иммобилизованных белков (гель Сефарозы) инкубировали в зависимости от задач эксперимента в присутствии различных растворимых бежов при постоянном перемешивании в течение 40 мин. В качестве контроля инкубировали растворимый белок с контрольной Сефарозой в тех же условиях. По окончании реакции гель промывали рабочим буфером. В полученных препаратах определяли содержание бежа, энзиматическую активность или анализировали бежовый состав методами электрофореза и последующего иммуноблотинга.

Получение и очистка антител.

Иммунизация животных.

Для получения поликлональных антител, специфически взаимодействующих с ГАФД В.б1 и вгоБЬ, нами была использована методика иммунизации кролика одновременно двумя антигенами: вгоБЬ и термостабильной ГАФД В.бЬ. .

Кролики в возрасте 2,5-3 месяцев иммунизировались по следующей схеме: Подкожная иммунизация: в 8-10 точек верхнего отдела спины животного вводили 2 мл однородной эмульсии, содержащей 1 мл полного адъюванта Фрейнда и 0,5-0,8 мг ГАФД и 0,8 мг вгоБЬ, предварительно обессоленных на колонке с Сефадексом в-50. Бустерную (стимулирующую) инъекцию проводили через 3-4 недели, вводя внутривенно 1 мл физиологического раствора, содержащего 0,5 мг ГАФД и 0,5-0,6 мг (ЗгоЕЬ. Забор крови осуществляли в течение 10 дней через полторы недели после реиммунизации животного. Пробы крови объединяли и определяли специфичность и титр антител. В качестве контроля использовали сыворотку крови кролика, взятую до его иммунизации.

Получение фракции иммуноглобулинов в.

Все процедуры проводили при 4°С. К сыворотке крови при постоянном перемешивании добавляли половинный объем насыщенного раствора (ЫТЦ^С^. После 2-4 ч инкубации образующийся осадок собирали центрифугированием в течение 20 мин при 12000 g и ресуспендировали в холодном растворе (ЫТЦ^С^ (степень насыщения 33 %) в объеме равном исходному объему сыворотки. Сформировавшийся осадок отделяли центрифугированием и процедуру повторяли. Затем осадок растворяли в небольшом объеме фосфатносолевого буфера (ФСБ): 10 мМ КН2Р04, рН7,5, 0,14 М ИаС1 и диализовали против этого же буфера в течение ночи. Диализат центрифугировали 30 мин при 18000 § и наносили на иммуносорбент.

Приготовление иммуносорбентов.

Иммобилизацию антигенов проводили аналогично описанной выше методике, за исключением некоторых моментов: для активации Сефарозы использовали буфер: 3,5 М К3Р04, рН 11, а степень активации Сефарозы составляла 100 мг ВгС1Ч/мл геля. По окончании иммобилизации сорбент промывали ФСБ и элюирующим буфером: 0,05 М глицин-НС1, рН2,3, 0,15 М №С1 для удаления нековалентно связанных с носителем субъединиц антигенов и уравновешивали фосфатно-солевым буфером.

Очистка антител.

Для получения высокоспецифичных антител использовали метод иммуноаффинной хроматографии. На сорбент наносили фракцию иммуноглобулинов С в ФСБ и промывали его до исчезновения белка в элюате. Низкоспецифичные антитела элюировали буфером, содержащим 0,05 М СНзСООН, рН4,3, 0,15 М ЫаС1. Высокоаффинные антитела элюировали буфером с рН2,3. Полученный препарат антител немедленно нейтрализовали двукратным объемом буфера: 0,5 М КН2РО4, рН 7,7, замораживали и хранили при -20 °С.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Полякова, Оксана Валентиновна

выводы

1. Показано, что модифицированная ДТНБ ГАФД, неспособная формировать нативную структуру, эффективно связывается с GroEL, причем прочность ассоциации не зависит от присутствия АТР.

2. Получены штаммы Е. coli, экспрессирующие мутантные формы ГАФД Bacillus stearothermophilus с аминокислотными заменами Y283V, Y283V/W84F, Y46G/R52G, Y46G/S48G и выделены мутантные белки, образующие димеры ОР (Y46G/R52G и Y46G/S48G) и OR (Y283V и Y283V/W84F).

3. Показано, что О-Р-димеры не взаимодействуют с GroEL, а нативные димеры и О-Я-димеры связываются с GroEL со сходными параметрами. Добавление Mg-ATP приводит к распаду комплекса GroEL с нативными димерами, но не влияет на его сродство к O-R-димерам.

4. Показано, что формы ГАФД, неспособные к формированию нативных структур (0-Я-димеры и ГАФД, модифицированная ДТНБ), полностью блокируют шаперонин-зависимое сворачивание предварительно денатурированного фермента дикого типа.

5. Разработан метод получения поликлональных антител к GroEL и ГАФД Bacillus stearothermophilus, основанный на одновременной иммунизации двумя антигенами и последующей иммуноаффинной хроматографии на иммобилизованных антигенах.

6. Образование комплексов мутантных О-Я-димеров ГАФД В. st. в растворе доказано методом иммунопреципитации с использованием антител на димеры и субъединицы GroEL.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Полякова, Оксана Валентиновна, 2002 год

1. Anfinsen, С.В. (1973). Principles that govern the folding of protein chains. Science 181, 223-230.

2. Ashmarina, L.I., Muronetz, V.I., and Nagradova, N.K. (1982). Evidence for a change in catalytic properties of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase monomers upon their association in a tetramer. FEBS Lett 144, 43-46.

3. Asryants, R.A., Duszenkova, I.V., and Nagradova, N.K. (1985). Determination of Sepharose-bound protein with Coomassie brilliant blue G-250. Anal Biochem 151, 571-574.

4. Azem, A., Diamant, S., Kessel, M., Weiss, C., and Goloubinoff, P. (1995). The protein-folding activity of chaperonins correlates with the symmetric GroEL 14(GroES7)2 heterooligomer. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 12021-12025.

5. Azem, A., Kessel, M., and Goloubinoff, P. (1994). Characterization of a functional GroEL 14(GroES7)2 chaperonin hetero-oligomer. Science 265, 653-656.

6. Badcoe, I.G., Smith, C.J., Wood, S., Halsall, D.J., Holbrook, J.J., Lund, P., and Clarke, A.R. (1991). Binding of a chaperonin to the folding intermediates of lactate dehydrogenase. Biochemistry 30,9195-9200.

7. Boisvert, D.C., Wang, J., Otwinowski, Z., Horwich, A.L., and Sigler, P.B. (1996). The 2.4 A crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL complexed with ATP gamma S. Nat Struct Biol 3,170-177.

8. Bradford, M.M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72, 248-254.

9. Braig, K., Otwinowski, Z., Hegde, R., Boisvert, D.C., Joachimiak, A., Horwich, A.L., and Sigler, P.B. (1994). The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. Nature 371, 578-586.

10. Brunschier, R., Danner, M., and Seckler, R. (1993). Interactions of phage P22 tailspike protein with GroE molecular chaperones during refolding in vitro. J Biol Chem 268, 2767-2772.

11. Bukau, B. and Horwich, A.L. (1998). The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell 92, 351-366.

12. Burston, S.G., Weissman, J.S., Farr, G.W., Fenton, W.A., and Horwich, A.L. (1996). Release of both native and non-native proteins from a cis-only GroEL ternary complex. Nature 383, 96-99.

13. Chen, S., Roseman, A.M., Hunter, A.S., Wood, S.P., Burston, S.G., Ranson, N.A., Clarke, A.R., and Saibil, H.R. (1994). Location of a folding protein and shape changes in GroEL-GroES complexes imaged by cryo-electron microscopy. Nature 371, 261-264.

14. Cherednikova, T.V., Muronetz, V.I., and Nagradova, N.K. (1980). Study of subunit interactions in immobilized D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochim Biophys Acta 613,292-308.

15. Clark, A.C., Hugo, E., and Frieden, C. (1996). Determination of regions in the dihydrofolate reductase structure that interact with the molecular chaperonin GroEL. Biochemistry 35, 5893-5901.

16. DebBurman, S.K., Raymond, G.J., Caughey, B., and Lindquist, S. (1997). Chaperone-supervised conversion of prion protein to its protease-resistant form. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 13938-13943.

17. Edenhofer, F., Rieger, R., Famulok, M., Wendler, W., Weiss, S., and Winnacker, E.L. (1996). Prion protein PrPc interacts with molecular chaperones of the Hsp60 family. J Virol 70, 4724-4728.

18. Ellis, R.J. (1994). Molecular chaperones. Opening and closing the Anfmsen cage. Curr Biol 4, 633-635.

19. Ellis, RJ. (2000). Chaperone substrates inside the cell. Trends Biochem Sci 25, 210-212.

20. Ewalt, K.L., Hendrick, J.P, Houry, W.A., and Hartl, F.U. (1997). In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system. Cell 90, 491-500.

21. Ewbank, J.J., Creighton, T.E., Hayer, H., and Ulrich, H. (1995). What is the molten globule? Nat Struct Biol 2, 10-11.

22. Fenton, W.A. and Horwich, A.L. (1997). GroEL-mediated protein folding. Protein Sci 6, 743-760.

23. Fenton, W.A., Kashi, Y., Furtak, K., and Horwich, A.L. (1994). Residues in chaperonin GroEL required for polypeptide binding and release. Nature 371,614-619.

24. Fenton, W.A., Weissman, J.S., and Horwich, A.L. (1996). Putting a lid on protein folding: structure and function of the co-chaperonin, GroES. Chem Biol 3,157-161.

25. Frydman, J. (2001). Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annu Rev Biochem JID 2985150R 70, 603647.

26. Gervasoni, P. and Pluckthun, A. (1997). Folding intermediates of beta-lactamase recognized by GroEL. FEBS Lett 401, 138-142.

27. Goldberg, M.S., Zhang, J., Sondek, S., Matthews, C.R., Fox, R.O., and Horwich, A.L. (1997). Native-like structure of a protein-folding intermediate bound to the chaperonin GroEL. Proc Natl Acad Sci U S A 94, 1080-1085.

28. Goloubinoff, P., Christeller, J.T., Gatenby, A.A., and Lorimer, G.H. (1989). Reconstitution of active dimeric ribulose bisphosphate carboxylase from an unfoleded state depends on two chaperonin proteins and Mg-ATP. Nature 342, 884-889.

29. Gordon, C.L., Sather, S.K., Casjens, S., and King, J. (1994). Selective in vivo rescue by GroEL/ES of thermolabile folding intermediates to phage P22 structural proteins. J Biol Chem 269,27941-27951.

30. Gottesman, M.E. and Hendrickson, W.A. (2000). Protein folding and unfolding by Escherichia coli chaperones and chaperonins. Curr Opin Microbiol 3, 197-202.

31. Gragerov, A., Nudler, E., Komissarova, N., Gaitanaris, G.A., Gottesman, M.E., and Nikiforov, V. (1992). Cooperation of GroEL/GroES and

32. DnaK/DnaJ heat shock proteins in preventing protein misfolding in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A 89, 10341-10344.

33. Grantcharova, V., Aim, E.J., Baker, D., and Horwich, A.L. (2001). Mechanisms of protein folding. Curr Opin Struct Biol 11, 70-82.

34. Gray, T.E. and Fersht, A.R. (1991). Cooperativity in ATP hydrolysis by GroEL is increased by GroES. FEBS Lett 292, 254-258.

35. Gutsche, I., Essen, L.O., and Baumeister, W. (1999). Group II chaperonins: new TRiC(k)s and turns of a protein folding machine. J Mol Biol 293, 295-312.

36. Hartl, F.U. (1996). Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 381, 571-579.

37. Hayer, H., Martin, J., andHartl, F.U. (1995). Asymmetrical interaction of GroEL and GroES in the ATPase cycle of assisted protein folding. Science 269, 836-841.

38. Hayer, H., Weber, F., and Hartl, F.U. (1996). Mechanism of chaperonin action: GroES binding and release can drive GroEL-mediated protein folding in the absence of ATP hydrolysis. EMBO J 15, 6111-6121.

39. Hill, E.J., Meriwether, B.P., and Park, J.H. (1975). Purification of rabbit muscle glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase by gel filtration chromatography. Anal Biochem 63, 175-182.

40. Hlodan, R., Tempst, P., and Hartl, F.U. (1995). Binding of defined regions of a polypeptide to GroEL and its implications for chaperonin-mediated protein folding. Nat Struct Biol 2, 587-595.

41. Houry, W.A., Frishman, D., Eckerskorn, C., Lottspeich, F., and Hartl, F.U. (1999). Identification of in vivo substrates of the chaperonin GroEL. Nature 402, 147-154.

42. Huang, Y.S. and Chuang, D.T. (1999). Mechanisms for GroEL/GroES-mediated folding of a large 86-kDa fusion polypeptide in vitro. J Biol Chem 274, 10405-10412.

43. Kalinina, N.O., Fedorkin, O.N., Samuilova, O.V., Maiss, E., Korpela, T., Morozov, S.Y., and Atabekov, J.G. (1996). Expression and biochemical analyses of the recombinant potato virus X 25K movement protein. FEBS Lett 397, 75-78.

44. Kandror, O., Busconi, L., Sherman, M., and Goldberg, A.L. (1994). Rapid degradation of an abnormal protein in Escherichia coli involves the chaperones GroEL and GroES. J Biol Chem 269, 23575-23582.

45. Katsumata, K., Okazaki, A., and Kuwajima, K. (1996). Effect of GroEL on the re-folding kinetics of alpha-lactalbumin. J Mol Biol 258, 827-838.

46. Kurganov, B.I. and Topchieva, I.N. (1998). Artificial chaperone-assisted refolding of proteins. Biochemistry (Mosc) 63,413-419.

47. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

48. Lambert, J.M. and Perham, R.N. (1977). Folding domains and intramolecular ionic interactions of lysine residues in glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Biochem J 161, 49-62.

49. Laminet, A.A., Ziegelhoffer, T., Georgopoulos, C., and Pluckthun, A. (1990). The Escherichia coli heat shock proteins GroEL and GroES modulate the folding of the beta-lactamase precursor. EMBO J 9, 23152319.

50. Landry, S.J., Zeilstra, R., Fayet, O., Georgopoulos, C., and Gierasch, L.M. (1993). Characterization of a functionally important mobile domain of GroES. Nature 364, 255-258.

51. Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., andHartl, F.U. (1992). Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J 11, 4757-4765.

52. Levashov, P.A., Muronetz, V.I., Klyachko, N.L., and Nagradova, N.K. (1998). Catalytically active monomers of E. coli glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Protein Chem 17, 229-235.

53. Llorca, O., Carrascosa, J.L., and Valpuesta, J.M. (1996). Biochemical characterization of symmetric GroEL-GroES complexes. Evidence for a role in protein folding. J Biol Chem 271, 68-76.

54. Ma, J. and Karplus, M. (1998). The allosteric mechanism of the chaperonin GroEL: a dynamic analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 95, 8502-8507.

55. Mayhew, M., da, S., Martin, J., Erdjument, B., Tempst, P., and Hartl, F.U. (1996). Protein folding in the central cavity of the GroEL-GroES chaperonin complex. Nature 379, 420-426.

56. Mendoza, J.A., Rogers, E., Lorimer, G.H., and Horowitz, P.M. (1991). Chaperonins facilitate the in vitro folding of monomelic mitochondrial rhodanese. J Biol Chem 266, 13044-13049.

57. Mercer, W.D., Winn, S.I., and Watson, H.C. (1976). Twinning in crystals of human skeletal muscle D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J Mol Biol 104, 277-283.

58. Minton, A.P. (2000). Protein folding: Thickening the broth. Curr Biol 10, R97-R99

59. Murthy, M.R., Garavito, R.M., Johnson, J.E., and Rossmann, M.G. (1980). Structure of lobster apo-D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase at 3.0 A resolution. J Mol Biol 138, 859-872.

60. Peralta, D., Hartman, D.J., Hoogenraad, N.J., and Hoj, P.B. (1994). Generation of a stable folding intermediate which can be rescued by the chaperonins GroEL and GroES. FEBS Lett 339, 45-49.

61. Perrett, S., Zahn, R., Stenberg, G., and Fersht, A.R. (1997). Importance of electrostatic interactions in the rapid binding of polypeptides to GroEL. J Mol Biol 269, 892-901.

62. Poccia, F., Piselli, P., Vendetti, S., Bach, S., Amendola, A., Placido, R., and Colizzi, V. (1996). Heat-shock protein expression on the membrane of T cells undergoing apoptosis. Immunology 88, 6-12.

63. Prusiner, S.B., Scott, M.R., DeArmond, S.J., and Cohen, F.E. (1998). Prion protein biology. Cell 93, 337-348.

64. Ranson, N.A., Dunster, NJ., Burston, S.G., and Clarke, A.R. (1995). Chaperonins can catalyse the reversal of early aggregation steps when a protein misfolds. J Mol Biol 250, 581-586.

65. Reid, B.G. and Flynn, G.C. (1996). GroEL binds to and unfolds rhodanese posttranslationally. J Biol Chem 271, 7212-7217.

66. Roseman, A.M., Chen, S., White, H., Braig, K., and Saibil, H.R. (1996). The chaperonin ATPase cycle: mechanism of allosteric switching and movements of substrate-binding domains in GroEL. Cell 57, 241 -251.

67. Saibil, H. (2000). Molecular chaperones: containers and surfaces for folding, stabilising or unfolding proteins. Cuir Opin Struct Biol 10, 251258.

68. Schmidt, M. and Buchner, J. (1992). Interaction of GroE with an all-betaprotein. J Biol Chem 267, 16829-16833.

69. Schmidt, M., Buchner, J., Todd, M.J., Lorimer, G.H., and Viitanen, P.V. (1994). On the role of groES in the chaperonin-assisted folding reaction. Three case studies. J Biol Chem 269, 10304-10311.

70. Schmidt, M., Rutkat, K., Rachel, R., Pfeifer, G., Jaenicke, R., Viitanen, P., Lorimer, G., and Buchner, J. (1994). Symmetric complexes of GroE chaperonins as part of the functional cycle. Science 265, 656-659.

71. Skarzy£ski, T., Moody, P.C., and Wonacott, AJ. (1987). Structure of holo-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus at 1.8 A resolution. J Mol Biol 193, 171-187.

72. Skarzy^ski, T. and Wonacott, A.J. (1988). Coenzyme-induced conformational changes in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus. J Mol Biol 203, 1097-1118.

73. Soltys, B.J. and Gupta, R.S. (1996). Immunoelectron microscopic localization of the 60-kDa heat shock chaperonin protein (Hsp60) in mammalian cells. Exp Cell Res 222,16-27.

74. Soltys, B.J. and Gupta, R.S. (1997). Cell surface localization of the 60 kDa heat shock chaperonin protein (hsp60) in mammalian cells. Cell Biol Int 21, 315-320.

75. Spangfort, M.D., Surin, B.P., Oppentocht, J.E., Weibull, C., Carlemalm, E., Dixon, N.E., and Svensson, L.A. (1993). Crystallization and preliminary X-ray investigation of the Escherichia coli molecular chaperone cpn60 (GroEL). FEBS Lett 320, 160-164.

76. Sparrer, H., Lilie, H., and Buchner, J. (1996). Dynamics of the GroEL-protein complex: effects of nucleotides and folding mutants. J Mol Biol 258, 74-87.

77. Stockel, J. and Hartl, F.U. (2001). Chaperonin-mediated de novo generation of prion protein aggregates. J Mol Biol JID 2985088R 313, 861-872.

78. Suzuki, K. and Imahori, K. (1973). Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus. Kinetics and physicochemical studies. J Biochem (Tokyo) 74, 955-970.

79. Svensson, L.A., Surin, B.P., Dixon, N.E., and Spangfort, M.D. (1994). The symmetry of Escherichia coli cpn60 (GroEL) determined by X-ray crystallography. J Mol Biol 235, 47-52.

80. Tatzelt, J., Zuo, J., Voellmy, R., Scott, M., Hartl, U., Prusiner, S.B., and Welch, W.J. (1995). Scrapie prions selectively modify the stress response in neuroblastoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A 92, 2944-2948.

81. Tian, G., Vainberg, I.E., Tap, W.D., Lewis, S.A., and Cowan, NJ. (1995). Specificity in chaperonin-mediated protein folding. Nature 375, 25G-253.

82. Todd, M.J., Viitanen, P.V., and Lorimer, G.H. (1994). Dynamics of the chaperonin ATPase cycle: implications for facilitated protein folding. Science 265, 659-666.

83. Viitanen, P.Y., Donaldson, G.K., Lorimer, G.H., Lubben, T.H., and Gatenby, A.A. (1991). Complex interactions between the chaperonin 60 molecular chaperone and dihydrofolate reductase. Biochemistry 30, 97169723.

84. Walker, J.E., Wonacott, A.J., and Harris, J.I. (1980). Heat stability of a tetrameric enzyme, D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Eur J Biochem 108, 581-586.

85. Weissman, J.S., Hohl, C.M., Kovalenko, O., Kashi, Y., Chen, S., Braig, K., Saibil, H.R., Fenton, W.A., and Horwich, A.L. (1995). Mechanism of GroEL action: productive release of polypeptide from a sequestered position under GroES. Cell 83, 577-587.

86. Weissman, J.S., Kashi, Y., Fenton, W.A., and Horwich, A.L. (1994). GroEL-mediated protein folding proceeds by multiple rounds of binding and release of normative forms. Cell 78, 693-702.

87. Weissman, J.S., Rye, H.S., Fenton, W.A., Beechem, J.M., and Horwich, A.L. (1996). Characterization of the active intermediate of a GroEL-GroES-mediated protein folding reaction. Cell 84, 481-490.

88. Welch, WJ. and Gambetti, P. (1998). Chaperoning brain diseases. Nature 392, 23-24.

89. Wick, G. (2000). Atherosclerosis~an autoimmune disease due to an immune reaction against heat-shock protein 60. Herz 25, 87-90.

90. Wick, G., Perschinka, H., and Millonig, G. (2001). Atherosclerosis as an autoimmune disease: an update. Trends Immunol JID 100966032 22, 665-669.

91. Wickner, S., Maurizi, M.R., and Gottesman, S. (1999). Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins. Science 286, 1888-1893.

92. Widmann, M. and Christen, P. (1995). Differential effects of molecular chaperones on refolding of homologous proteins. FEBS Lett 377, 481484.

93. Yifrach, O. and Horovitz, A. (1994). Two lines of allosteric communication in the oligomeric chaperonin GroEL are revealed by the single mutation Argl96~>Ala. J Mol Biol 243, 397-401.

94. Yifrach, O. and Horovitz, A. (1995). Nested cooperativity in the ATPase activity of the oligomeric chaperonin GroEL. Biochemistry 34, 5303-5308.

95. Yifrach, O. and Horovitz, A. (1996). Allosteric control by ATP of non-folded protein binding to GroEL. J Mol Biol 255, 356-361.

96. Yon, J.M. (1997). Protein folding: concepts and perspectives. Cell Mol Life Sci 53, 557-567.

97. Yura, T. and Nakahigashi, K. (1999). Regulation of the heat-shock response. Curr Opin Microbiol 2, 153-158.

98. Zahn, R. and Pluckthun, A. (1992). GroE prevents the accumulation of early folding intermediates of pre-beta-lactamase without changing the folding pathway. Biochemistry 31, 3249-3255.

99. Zimmerman, S.B. and Minton, A.P. (1993). Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct 22, 27-65.