Роль белок-белковых взаимодействий в стабилизации АПО- и холоформ глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из Bacillus Stearothermophilus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Ивинова, Ольга Николаевна

• Ивинова, Ольга Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ивинова, Ольга Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. D-Г ЛИДЕР АЛЬ ДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА. 9 1.1. Основные свойства и функции в клетке.

2. ПРОСТРАНСТВЕННАЯ СТРУКТУРА ГАФД.

2.1. Олигомерное строение дегидрогеназы.

2.2. Роль междоменных взаимодействий в связывании кофактора.

2.3. Межсубъединичная кооперативность дегидрогеназы.

2.4. Полуцентровая реактивность дегидрогеназы.

3. ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ СКАНИРУЮЩАЯ КАЛОРИМЕТРИЯ КАК МЕТОД ИЗУЧЕНИЯ СТРУКТУРЫ БЕЛКОВ.

3.1. Техника сканирующей калориметрии.

3.2. Калориметрические измерения.

3.3. Анализ результатов.

3.3.1. Термодинамический анализ данных.

3.3.2. Кинетический анализ данных.

3.3.3. Анализ термоденатурации мультидоменных белков 48 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

4.1. Получение нативных препаратов ГАФД дикого типа и мутантных форм.

4.1.1. Получение компетентных клеток XL-1 E.coli.

4.1.2. Трансформация плазмид.

4.1.3. Выделение ГАФД B.st. дикого типа и мутантных форм.

4.1.4. Выделение ГАФД из скелетных мышц кролика.

4.1.5. Получение апоформ ГАФД.

4.2. Аналитические методы.

4.2.1. Определение концентраций реагентов.

4.2.2. Определение концентрации белка в растворе.

4.2.3. Определение концентрации белка, иммобилизованного на 56 сеарозе.

4.2.4. Электрофорез белков и клеток в ПААГ в 57 денатурирующих условиях.

4.2.5. Определение ферментативной активности лизоцима.

4.2.6. Определение ферментативной активности ГАФД.

4.2.7. Изучение быстрой кинетики реакции образования ацил- 58 фермента.

4.2.8. Изучение связывания NAD+ апоформой ГАФД дикого 59 типа и мутантов.

4.2.9. Определение коэффициента седиментации.

4.2.10. Дифференциальная сканирующая калориметрия.

4.2.11. Регистрация спектров кругового дихроизма.

4.2.12. Турбидиметрическое титрование полиэлектролитов белком.

4.2.13. Термоинактивация лизоцима свободного и в присутствии 61 полиэлектролита.

4.3. Метод иммобилизации.

4.3.1. Активация сефарозы.

4.3.2. Иммобилизация ГАФД B.st.

4.4. Получение иммобилизованных форм ГАФД различной 63 степени нативности и олигомерности.

4.4.1 Получение денатурированных мономерных форм ГАФД

B.st.

4.4.2. Получение иммобилизованных на сефарозе активных 64 димеров дикого типа ГАФД B.st.

4.4.3. Реассоциация иммобилизованных димерных форм ГАФД 64 B.st. с субъединицами из раствора.

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

5.1. Получение и характеристика термостабильных ГАФД дикого типа и мутантных форм.

5.1.1. Трансформация плазмид в штамм-суперпродуцент XL-1 E.coli.

5.1.2. Выделение и характеристика ГАФД В.st. дикого типа и мутантых форм.

5.2. Роль внутрисубъединичных взаимодействий в стабилизации апо- и холотетрамерной ГАФД B.st.

5.3. Роль межсубъединичных взаимодействий в стабилизации апо- и холотетрамеров ГАФД B.st.

5.4. Роль межсубъединичных взаимодействий в стабилизации апо- и холодимеров ГАФД B.st.

5.5. Роль белок-полиэлектролит взаимодействий в стабилизации белков.

5.5.1. Анализ термостабильности комплексов белок-полианион методом ДСК, обратимость воздействия полиэлектролитов на белки.

5.5.2. Получение нерастворимых белок-полиэлектролитных комплексов и их изучение методом турбидиметрического титрования.

5.5.3. Термоинактивация фермент-полианион комплекса при температурах близких к максимуму тепловой 104 денатурации.

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль белок-белковых взаимодействий в стабилизации АПО- и холоформ глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из Bacillus Stearothermophilus»

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа является одним из самых хорошо изученных ферментов гликолиза. На протяжении 50 лет были проведены исследования всевозможных аспектов функционирования и регуляции этого фермента. Тем не менее, вопрос о понимании структурных основ стабилизации различных конформационных состояний олигомера все еще является актуальным. В этой связи интересно определить вклад отдельных типов белок-белковых взаимодействий, как внутри- так и межсубъединичных, а также междоменных в такую стабилизацию. Как известно, каждая субъединица тетрамерной молекулы ГАФД построена из двух доменов - NAD'-связывающего и каталитического. Было показано, что кофактор-связывающий домен может сворачиваться в структуру, близкую к нативной и существовать относительно независимо от каталитического домена. Тем не менее, расположение активного центра в районе междоменной области обеспечивает тесную зависимость его конформационного состояния от характера взаимодействия NAD+-связывающего и каталитического доменов в составе каждого мономера.

По данным кристаллографических исследований пространственной структуры ГАФД можно представить как димер димеров с тремя неэквивалентными поверхностями по осям Р, R, и Q. В этой связи остается неясным вопрос о роли неэквивалентности межсубъединичных контактов в стабилизации дегидрогеназы. В тетрамере межсубъединичные взаимодействия существуют по R- и Q-осям между КАО+-связывающим и каталитическим доменами. По оси Р субъединицы О и Р, а также Q и R, образуют контакты только при участии своих каталитических доменов. Такая сложная система междоменных взаимодействий создает предпосылки для различных проявлений функционального взаимодействия субъединиц в составе олигомера, важнейшими из которых являются кооперативность по связыванию NAD+ и, так называемая, полуцентровая реактивность неэквивалентность активных центров при взаимодействии с некоторыми аналогами субстрата или ингибиторами).

Выяснению молекулярных механизмов этих эффектов посвящен ряд основополагающих энзимологических работ (Bernhard S.A., and McQuarrie R.A., 1973; Koshland D.E., et al., 1966; Cardon J.W. and Boyer P.D., 1982; Malhotra O.P., et al., 1981), которые привели к возникновению ряда альтернативных моделей - предсуществующей и лиганд-индуцированной асимметрии.

Представляется очевидным, что это во многом обусловлено недостаточностью наших знаний о конформационных состояниях активного центра на разных стадиях катализа и о факторах, способных влиять на эти состояния. Это связано с относительной ограниченностью имеющейся структурной информации. Например, на данный момент нет структурных данных высокого разрешения для тройного комплекса фермент-КАБ+-аналог субстрата. При этом результаты, полученные при рентгеноструктурном анализе различных форм белка, должны дополняться исследованиями, проведенными в растворе. Вместе с тем, совершенствование метода рентгеноструктурного анализа и расширение круга исследуемых объектов способствуют углублению уже накопленных знаний, а появление чувствительных методов оценки конформационного состояния белка (например, метода дифференциальной сканирующей калориметрии) открывает возможность определить вклад конкретного внутримолекулярного взаимодействия в стабилизацию того или иного состояния. Таким образом, получение информации о структурных особенностях активного центра ГАФД является необходимым для понимания молекулярных механизмов, определяющих функционирование дегидрогеназ.

Хорошо известно, что ферменты и другие белки находятся в клетке, как правило, не в свободном, а в связанном состоянии. Причем большинство партнеров, с которыми взаимодействуют белки являются полианионами, как например РНК, ДНК, кислые белки и т.д. О взаимодействиях такого рода существует немногочисленная и весьма противоречивая информация.

Вероятно, это связано со сложностью изучения механизма взаимодействия этих природных полианионов с ферментами. В этой связи мы использовали комплексы белок-синтетический полианион, как более простую модельную систему для исследования вклада электростатических взаимодействий в комплексе в стабильность белков.

Таким образом, целью настоящей работы являлось изучение влияния междоменных взаимодействий (внутрисубъединичных и межсубъединичных), а также взаимодействий белок-полианион, на стабильность апо- и холоформ ГАФД из Bacillus stearothermophilus (ГАФД B.st.). В соответствии с целью работы нами были поставлены следующие задачи:

• исследование влияния введенных мутаций, нарушающих различные типы взаимодействий в белке, на термостабильность мутантных форм ГАФДЯ.я?.

• изучение влияния связывания кофактора на характер тепловой денатурации мутантных тетрамеров и димеров в сравнении с диким типом ГАФД B.st.

• исследование влияния синтетических полианионов на термоденатурацию апо- и холоформ ГАФД B.st., ГАФД из мышц кролика, химотрипсиногена и лизоцима.

В соответствии с целью настоящей работы обзор литературы в основном посвящен характеристике ГАФД B.st. а также основам метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. D-ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗА 1.1. Основные свойства и функции в клетке

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (D-глицеральдегид-З-фосфат: NAD+ оксидоредуктаза фосфорилируюгцая - КФ 1.2.1.12) (ГАФД) катализирует центральную стадию гликолиза - реакцию гликолитической оксидоредукции, сопряженную с фосфорилированием. Согласно сложившимся представлениям (Stallcup W.B., and Koshland D.E., 1973; Trentham D.R, 1971; Duggleby R.G., Dennis D.T., 1974) реакция окисления D-глицеральдегид-3-фосфата (ФГА) включает следующие стадии (Схема 1).

На первой стадии происходит связывание кофермента NAD+ в активном центре, которое сопровождается появлением полосы поглощения при 345-360 нм, так называемой полосы Рэкера, за счет образования комплекса с переносом заряда между SH-группой 149 остатка Цис, как донора электрона, и пиридиновым кольцом NAD+, действующим, как акцептор (Racker I., Krimsky J., 1952). Связывание субстрата сульфгидрильной группой фермента приводит к полному исчезновению полосы поглощения, вследствие образования тиополуацеталя.

Затем происходит перенос гидрид-иона от связанного субстрата ФГА на NAD+ с образованием макроэргического промежуточного продукта -тиоэфира и востановленного NADH, так называемый акт оксидоредукции. Для осуществления следующего этапа реакции, фосфоролиза, необходима замена NADH на NAD+ в активном центре фермента, и эта стадия катализа является скорость-лимитирующей для реакции в целом.

Далее происходит фосфоролиз с образованием 1,3-дифосфоглицериновой кислоты, которая в следующей реакции гликолиза, катализируемой фосфоглицераткиназой, используется для генерации АТР.

S-CH(OH)R

NAD

SH(3-OFA) i

WD

SH / л Ф

NAD иш ■j 1 вши

3-ФГА

-j—* Ь s—с = о

SH

NADH

NAD

NAD

1,3 -ДФГ

NAD

Схема 1. Схема реакции, катализируемой ГАФД 1 - связывание холофермента с ФГА; 2 - образование полуацеталя; 3 -восстановление NAD+ и образование ацил-фермента; 4 - высвобождение NADH; 5 - связывание NAD+ с ацилферментом; 6 - связывание фосфатного остатка; 7 - выход 1,3 - дифосфоглицерата.

R = СН(0Н)СН20Р032" (Corbier С., et al., 1994).

Необходимо обратить внимание на тот факт, что перенос ацильной группы не происходит до тех пор, пока не произойдет диссоциация NADH и связывание NAD+. По-видимому, связывание NAD+ приводит к конформационным перестройкам, необходимым как для гидролиза, так и для фосфоролиза ацилфермента (Trentham D.R., 1971). Именно поэтому ацилфермент является наиболее стабильным в отсутствие кофермента.

Каталитические свойства дегидрогеназ из различных источников сильно отличаются. Для ГАФД из дрожжей рН - оптимум активности находится в щелочной области и равен 7,9 (Velick S.F., et al., 1963), а для ГАФД из скелетных мышц крысы - 8,9 (Наградова Н.К., et al., 1974). рН -оптимум активности для термостабильной ГАФД находится в еще более щелочной области и равен 9,9 (Mougin A., et al., 1988).

Нативная молекула фермента состоит из 4-х химически идентичных субъединиц, каждая из которых формирует свой активный центр. Рентгеноструктурный анализ позволил выявить в составе каждой субъединицы два домена: кофактор-связывающий (1-148) и каталитический (149-333), содержащий неструктурированную S-петлю (178-201) (Рис.1). Междоменное взаимодействие играет ключевую роль в функционировании фермента, так как известно, что каталитический акт происходит на границе двух доменов.

Молекулярная масса тетрамера ГАФД составляет 144 кДа. Полипептидные цепи, из которых состоит дегидрогеназа, содержат около 330 остатков аминокислот и имеют молекулярную массу 36 кДа. Для многих ГАФД определена полная аминокислотная последовательность: из скелетных мышц свиньи (Harris J.I., and Perham R.N., 1968), мышц человека (Novak К., et al., 1981), мышц кролика (ГАФДк) (Applequist S.E., et al., 1995), омара (Davidson В.Е., et al., 1967), мышц курицы (Ganter С, and Pluckthun A., 1990), электрического органа Electrophorus electricus (Giovanni-De-Simone S., et al., 1998), пекарских дрожжей (Jones G.M.T., and Harris J.I., 1972), E.coli (Yun M., et al., 2000), Bacillus stearothermophilus (ГАФД 5.^.)(Leslie, A.G.W. and

Рис. 1. Структура мономера холодегидрогеназы из Bacillus stearothermophilus (Skarzynski Т., et al., 1987).

Wonacott A.J., 1983, 1984; Branlant С., et al., 1989), Thermus aquaticus (Harris J.I., and Walker J.E., 1977).

Для первичной структуры дегидрогеназ, выделенных из различных источников, характерна высокая степень гомологии - 70-95% (Skarzynski Т., et al., 1987). Наиболее консервативным является 17-звенный фрагмент, содержащий высокореакционноспособный Цис 149 активного центра. У дегидрогеназ, выделенных из 14 источников, в том числе, отдаленных филогенетически (мышцы человека, мышцы омара, пекарские дрожжи), не обнаружено ни одной замены аминокислотных остатков в этом пептиде (Perham, R.N., 1969).

Функции дегидрогеназы в организме не ограничиваются ее участием в гликолизе. На настоящий момент накопилось множество данных о том, что этот фермент, составляющий значительную долю (10-20%) от всего растворимого белка клетки, осуществляет в клетке самые разнообразные функции. Фермент играет важную роль в мембранном транспорте и в процессе слияния мембран, сборке микротрубочек, экспорте ядерной РНК, трансляционном контроле экспрессии генов, репликации и репарации ДНК, а также может катализировать фосфотрансферазную и киназную реакции. ГАФД является важнейшим элементом в выполнении программы экпрессии генов, запускающей апоптоз, нейродегенеративные заболевания (Sirover М.А., 1996, 1997, 1999).

Существует ряд данных об образовании биферментных комплексов с участием ГАФД. Фермент из различных источников взаимодействует с 3-фосфоглицераткиназой (D'Allesio D., and Josse J., 1971; Ashmarina L.I., et al., 1984). Показано образование комплекса ГАФД с альдолазой (Ovadi J., and Keleti Т., 1978). Было обнаружено взаимодействие ГАФД из эритроцитов человека с 3-фосфоглицераткиназой или 2,3-дифосфоглицератмутазой (связывание ГАФД с тем или иным партнером зависело от рН среды ) (Fokina К.V., et al., 1997; Фокина К.В., et al., 2000). Причем было установлено, что ферментный комплекс образуется не с тетрамерной, а с димерной формой

ГАФД, что предполагает возможную роль различных олигомерных состояний фермента в регуляции гликолиза. Дальнейшее изучение ГАФД in vivo и in vitro показало, что олигомерное состояние фермента, наряду с его внутриклеточной локализацией, играет решающую роль в регуляции участия белка в жизнедеятельности клетки.

В рамках нашей работы нам кажется интересным более подробно рассмотреть вопрос о функциональном значении связывания ГАФД природными полиэлектролитами клетки. Так, в эритроцитах 60-70% от общего содержания ГАФД находится в связанном с мембраной состоянии, а именно в виде комплекса с белком полосы 3 (Yu J., and Steck T.L., 1975; Ercolani L., et al., 1992; von Ruckmann В., and Schubert D., 2002). Также было показано, что фермент активно участвует в процессе слияния мембран, то есть обладает фузогенной активностью. Мореро и соавторы (Morero R.D., et al., 1985) установили, что ГАФД из мышц кролика проявляет наибольшую фузогенную активность по сравнению с целым рядом других клеточных белков. Участие ГАФД в эндоцитозе было подтверждено независимо в опытах Роббинса и коллег (Robbins A.R., et al., 1995). Выяснилось, что после воздействия мутагена (этилметансульфоната) на клетки, у некоторых из них нарушается эндоцитоз. Дальнейший анализ мембранных белков выявил, что мутантный фенотип обусловлен единичной заменой Сер 234 на Про в молекуле ГАФД. Другие исследователи (Glaser Р.Е., and Gross R.W., 1995) при попытке выделить фузогенный белок крипт из цитозоля мозга крысы обнаружили, что эту функцию выполняет ГАФД, причем были выделены две изоформы белка: первая (pi = 7-8) обладала энзиматической, но не фузогенной активностью; вторая (pi = 8,5) проявляла фузогенную активность, но не катализировала реакцию с ФГА. Для ГАФД из различных источников установлено участие в формировании цитоскелета (сборке микротрубочек) (Huitorel P., and Pantaloni D., 1985). Установлено, что ГАФД специфически связывается с тубулином в соотношении 1 ГАФД/10 молекул тубулина (Durrieu С., et al., 1987; Somers М, et al., 1990), причем влияние такого взаимодействия на тубулин зависит от олигомерной структуры фермента. Было установлено, что с тубулином связываются димеры и тетрамеры белка, обнако сборка микротрубочек происходит только при взаимодействии с тетрамерами и полностью ингибируется добавлением в среду 1 мМ АТР. Известно, что в присутствии АТР происходит диссоциация ГАФД на димеры и мономеры, сопровождающаяся потерей активности (Constantinides S.M., and Deal W.C., 1969). В этой связи представляется вероятным предположение, что в зависимости от присутствия АТР в клетке происходит переключение ГАФД с выполнения одной функции на другую. Было показано связывание ГАФД с F-актином (Ouporov I.Y., et al., 2000, Ouporov I.Y., et al., 2001).

Как известно, для ГАФД характерна самая разнообразная локализация в клетке: в цитозоле, в ассоциации с мембранами, а также в ядре. Впервые предположения о выполнении ферментом роли транспортного белка тРНК были высказаны в работе Сигна и Грина (Signh R., and Green M.R., 1993). Далнейшее изучение вопроса подтвердило эти данные. Выяснилось также, что связывание тРНК (Фен) ГАФД из мышц кролика не приводит к существенным изменениям вторичной структуры белка. По-видимому, нуклеиновая кислота погружается в полость тетрамера вдоль осей R и Р. При этом происходит нековалентное взаимодействие между остатками ароматических аминокислот и нуклеотидными основаниями, а также ионные взаимодействия положительно заряженных аминокислотных остатков с фосфатными группировками РНК (Carmona P., et al., 1999).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Ивинова, Ольга Николаевна

выводы

1. С помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) показано, что нарушение внутрисубъединичных взаимодействий при заменах Асн 313, Тир 283, и Три 310 приводит к уменьшению термостабильности апоформ глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы Bacillus stearothermophilus (ГАФД B.st.). При этом для мутантной формы N31ЗТ не обнаружено влияния связывания кофактора на термостабильность белка, тогда как для остальных мутантных форм связывание NAD+ приводит к увеличению их термостабильности.

2. Показано, что при нарушении межсубъединичных взаимодействий (у мутантной формы D282G и формы с тремя заменами T34Q/T39S/L43G) значительно уменьшается термостабильность апотетрамера ГАФД и снижается эффективность связывания NAD+. Двойные мутации Тир 46 и Сер 48 (или Apr 52) приводят к полному разрушению междимерных контактов и образованию стабильных димеров.

3. Показано, что при термоденатурации аподимеров OR-типа (мутантная форма Y46G/R52G) наблюдается один пик теплопоглощения, а аподимеров ОР-типа (мутантная форма D282G) - два пика, и, следовательно, данные ДСК можно использовать для идентификации типа димеров, образующихся при распаде тетрамера.

4. С помощью метода иммобилизации на нерастворимом носителе были получены активные мутантные димеры Y283V, которые реассоциировали с димерами дикого типа ГАФД B.st. с образованием активных тетрамеров, что свидетельствует о том, что «стэкинг» взаимодействия между Тир 283 и Три 310 не влияют на прочность контактов между димерами.

5. Показано, что в присутствии синтетических полианионов наблюдается уменьшение термостабильности глицеральдешд-3-фосфат дегидрогеназы из мышц кролика, химотрипсиногена, лизоцима, а термостабильность апоГАФД B.st. значительно возрастает.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ивинова, Ольга Николаевна, 2003 год

1. Асриянц Р.А., Бенкевич Н.В., Наградова Н.К. Модификация аргининовых остатков D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы. Биохимия. 1983, Т.48. №2, 193-200.

2. Новохатный В.В., Медведь Л.В., Кудинов С.А., Привалов П.Л. Доменная организация молекул Lys-плазминогена. Молекулярная биология. 1983, Т. 17, вып.5, 976-982.

3. Потехин С.А., Ковригин Е.Л. Влияние кинетических факторов на тепловую денатурацию и ренатурацию биополимеров. Биофизика. 1998, Т.43, вып.2, 223-232.

4. Привалов П.Л. Энергетика структуры белковых молекул. Биофизика. 1985, Т.ХХХ, 4, 722-733.

5. Ahern T.J., Klibanov A.M. The mechanisms of irreversible enzymeinactivation at 100C. Science. 1985, 14, 228(4705), 1280-1284.

6. Allen G., Harris JI. The binding of nicotinamide-adenine dimucleotide toglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from Bacillusstearothermophilus. Biochem. J. 1975, 151(3), 747-749.

7. Applequist S.E., Keyna U., Calvin M.R., Beck-Engeser G.B., Raman C., Jack

8. H.M. Sequence of the rabbit glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenaseencoding cDNA. Gene. 1995, 163(2), 325-326.

9. Austin J.C., Wharton C.W., Hester R.E. An ultraviolet resonance Raman study of dehydrogenase enzymes and their interaction with coenzymes and substrates. Biochemistry. 1989, V.28(4), 1533-1538.

10. Bernhard S.A., MacQuarrie R.A. Half-site reactivity and the "induced-fit" hypothesis. J. Mol. Biol. 1973, 15, 74(1), 73-78.

11. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quotation of microgram quantities of" protein utilizing the principle of protein-due binding. Anal. Biochem., 1976, V.72, 248-254.

12. Brandts J.F, Hu C.Q, Lin L.N. A simple model for proteins with interacting domains. Applications to scanning calorimetry data. Mos. MT. Biochemistry. 1989, 17, 28(21), 8588-8596.

13. Buehner M, Ford G.C, Olsen K.W, Moras D, Rossman M.G. Three-dimensional structure of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Mol. Biol, 1974, V.90(l), 25-49.

14. Cardon J.W, Boyer P.D. Subunit interaction in catalysis. Some experimental and theoretical approaches with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Biol. Chem. 1982, 10,257(13), 7615-7622.

15. Cherednikova T.V, Muronetz V.I, Nagradova N.K. Study of subunit interaction in immobilized D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta. 1980, Y.613, 292-308.

16. Carmona P., Rodriguez-Casado A., Molina M. Conformational structure and binding mode of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to tRNA studied by Raman and CD spectroscopy. Biochim. Biophys. Acta. 1999. 13, 1432(2), 222-233.

17. Conejero-Lara F., Sanchez-Ruiz J.M., Mateo P.L., Burgos F.J., Vendrell J., Aviles F.X. Differential scanning calorimetric study of carboxypeptidase B, procarboxypeptidase В and its globular activation domain. Eur. J. Biochem. 1991, 15, 200(3), 663-670.

18. Corbier C., Clermont S., Billard P., Skarzynski Т., Branlant C., Wonacott A., Branlant G. Probing the coenzyme specificity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenases by site-directed mutagenesis. Biochemistry. 1990, 31, 29(30), 7101-7106.

19. Dalziel K., McFerran N.V., Wonacott A.J. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 1981, 26, 293(1063), 105-118.

20. Dinner A.R., Abkevich V., Shakhnovich E., Karplus M. Factors that affect thefolding ability of proteins. Proteins. 1999, 1, 35(1), 34-40.

21. Douzhenkova I.V., Asryants R.A., Nagradova N.K. D-glyceraldehyde-3phosphate dehydrogenase subunit cooperativity studied using immobilizedenzyme forms. Biochim. Biophys. Acta. 1988, 2, 957(1), 60-70.

22. Duee E., Olivier-Deyris L., Fanchon E., Corbier C., Branlant G., Dideberg O.

23. Comparison of the structures of wild-type and aN313T mutant of Escherichiacoli glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenases: implication for NAD+binding and cooperativity. J. Mol. Biol. 1996, 12, 257(4), 814-838.

24. Duggleby R.G., Dennis D.T. Nicotinamide adenine dinucleotide-specificglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Pisum sativum. Assay andsteady state kinetics. J. Biol. Chem. 1974, V.249(l), 167-174.

25. Durrieu C., Bernier-Valentin F., Rousset B. Binding of glyceraldehyde 3phosphate dehydrogenase to microtubules. Mol. Cell. Biochem. 1987, 74(1),55.65.

26. Fenselau A. Nicotinamide adenine dinucleotide as an active site director in glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase modificatio". J. Biol. Chem. 1970, V.245(6), 1239-1246.

27. Francis S.H., Meriwether B.P., Park J.H. Effects of photooxidation of histidine-38 on the various catalytic activities of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry. 1973, 16, 12(2), 346-355.

28. Freire E., Biltonen R.L., Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. I. Theory and application to homogeneous systems. Biopolymers. 1978, Y.17, 463-479.

29. Freire E., Murphy K.P., Sanchez-Ruiz J.M., Galisteo M.L., Privalov P.L. The molecular basis of cooperativity in protein folding. Thermodynamic dissection of interdomain interactions in phosphoglycerate kinase. Biochemistry. 1992, 14, 31(1), 250-256.

30. Freire E., and Biltonen R.L. Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. I. Theory and application to homogeneous systems. Biopolymers. 1978, Y.17, 463-479.

31. Galisteo M.L., Mateo P.L., Sanchez-Ruiz J.M. Kinetic study on the irreversible thermal denaturation of yeast phosphoglycerate kinase. Biochemistry. 1991, 26, 30(8), 2061-2066.

32. Guzman-Casado M., Parody-Morreale A., Mateo P.L., Sanchez-Ruiz J.M. Differential scanning calorimetry of lobster haemocyanin. Eur. J. Biochem. 1990, 22, 188(1), 181-185.

33. Garavito R.M., Berger D., Rossmann M.G. Molecular asymmetry in an abortive ternary complex of lobster glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry. 1977,4, 16(20), 4393-4398.

34. Giovanni-De-Simone S., Hasson-Voloch, Batista-e-Silva C., Nery-da-Matta A. Purification and partial characterization of glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase from electric organ of Electrophorus electricus (L.). Z. Naturforsch. 1998, 53(5-6), 416-420.

35. Goodsell D.S., Olson A.J. Soluble proteins: size, shape and function. Trends. Biochem. Sci. 1993, 18(3), 65-68.

36. Goodsell D.S., Olson A.J. Structural symmetry and protein function. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2000, 29, 105-153.

37. Griffith J.P., Lee В., Murdock A.L., Amelunxen R.E. Molecular symmetry of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus coagulans. J. Mol. Biol. 1983, 5, 169(4), 963-974.

38. Harris J.I., Walker J.E. Structure and properties of in glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase from thermophilic microorganism. In Pyridine-Nucleotide-Dependendent Dehydrogenase (Sund H., ed.) Springer Verlag. Berlin. 1977, 43-46.

39. Ho Y.S., Tsou C.L. Formation of a new fluorophore on irradiation of carboxymethylated D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Nature. 1979, 18,277(5693), 245-246.

40. Hoagland V.D., Teller D.C. Influence of substrates on the dissociation of rabbit muscle D-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry. 1969, V.8(2), 594-602.

41. Koshland D.E.J, Nemethy G, Filmer D. Comparison of experimental binding data and theoretical models in proteins containing subunits. Biochemistry. 1966, V.5(l), 365-385.

42. Malhotra O.P., Bernhard S.A, Seydoux F. Structural and functional consequences of subunit interactions in glyceraldehydes 3-phosphate dehydrogenase. Biochimie. 1981, 63(2), 131-141.

43. Malhotra O.P., Bernhard S.A. Activation of a covalent enzyme-substrate bond by noncovalent interaction with an effector. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1973,70(7), 2077-2081.

44. Margolin A.L., Sherstyuk S.F., Izumrudov У.А., Zezin A.B., Kabanov V.A. Enzymes in polyelectrolyte complexes. The effect of phase transition on thermal stability. Eur.J.Biochem. 1985, 146, 625-632.

45. Marmillot P., T. Keith, D.K. Srivastava, H.R. Knull. Effect of tubulin on the activity of the muscle isoenzyme of lactate dehydrogenase. Arch Biochem Biophys. 1994, 315, 2, 467-472.

46. Mercer W.D., Winn S.I., Watson H.C. Twinning in crystals of human skeletal muscle D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Mol. Biol. 1976, 14, 104(1), 277-283.

47. Moras D., Olsen K.W., Sabesan M.N., Buehner M., Ford G.C., Rossmann M.G. Studies of asymmetry in the three-dimensional structure of lobster D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Biol. Chem. 1975, 10, 250(23), 9137-9162.

48. Nagradova N.K. Study of the properties of phosphorylating D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochemistry (Mosc). 2001, 66(10), 1067-1076.

49. Novak K., Wolny M., Banas T. The complete amino acid sequence of human muscle glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase. FEBS Lett. 1981, 134, 2, 143-146.

50. Novokhatny V.Y., Medved L.V. Domain organization of the molecules of Lys-plasminogen. Mol. Biol. (Mosk.). 1983, V.17, №5, 976-982. Novokhatny V.V., Kudinov S.A., Privalov P.L. Domains in human plasminogen. J. Mol. Biol. 1984, 25, 179(2), 215-232.

51. Olsen K.W., Moras D., Rossmann M.G. Sequence variability and structure of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Biol. Chem. 1975, 25, 250(24), 9313-9321.

52. Olsen K.W., Garavito R.M., Sabesan M.N., Rossmann M.G. Anion binding sites in the active center of D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Mol. Biol. 1976, 15, 107(4), 571-576.

53. Osborn H.H., Hollaway M.R. The investigation of substrate-induced changes in subunit interactions of glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase. Biochem. J. 1975, 151, 37-45.

54. Ouporov I.V., Keith T.J., Knull H.R., Thomasson K.A. Computer simulations of glycolytic enzyme interactions with F-actin. J. Biomol. Struct. Dyn. 2000, 18(2), 311-323.

55. Ouporov IV, Knull HR, Lowe SL, Thomasson KA. Interactions ofglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase with G- and F-actin predicted by

56. Brownian dynamics. J. Mol. Recognit. 2001, 14(1), 29-41.

57. Ovadi J., Keleti T. Kinetic evidence for interaction between aldolase and Dglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Eur. J. Biochem. 1978, 85(1),157.161.

58. Park J.M., Muhoberac B.B., Dubin P.L., Xia J. Macromolecules. 1992, V.25, №1,290.

59. Perham R.N. The comparative structure of mammalian glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenases. Biochem. J. 1969, V. 111(1), 17-21. Perham R.N.,. Harris J.I. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from pig muscle. Nature. 1968, V.219(158), 1025-1028.

60. Potekhin S.A., Privalov P.L. Co-operative blocks in tropomyosin. J. Mol. Biol. 1982, 15, 159(3), 519-535.

61. Price N.C., Radda G.K. A fluorescent probe for the coenzyme-induced structural changes in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from rabbit muscle. Biochim. Biophys. Acta. 1974, 102-116.

62. Privalov P.L. Thermodynamic problems of protein structure. Annu. Rev. Biophys. Chem. 1989. V.18. p. 47-69.

63. Privalov P.L. Energy characteristics of the structure of protein molecules. Biofizika (Mosk.). 1985, V.30, №4, 722-733.

64. Privalov P.L., and Potekhin S.A. Scanning microcalorimetry in studying temperature-induced changes in proteins. Methods Enzymol. 1986, V.131, 451.

65. Privalov P.L. Stability of proteins. Proteins which do not present a singlecooperative system. Adv. Protein Chem. 1982, 35, 1-104.

66. Ptitsyn O.B. Molten globule and protein folding. Adv.Prot.Chem. 1995, V.47,83.229.

67. Racker E , Krimsky J. The mechanism of oxidation of aldehydes by D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Biol. Chem. 1952, V.198, 731743.

68. Rao S.T., Rossman M.G. Purification and partial characterization of glyceraldehyde-phosphate Comparison of super-secondary structures in proteins. J.Mol.Biol. 1973, №2, 241-256.

69. Reynolds C.H., Dalziel K. Factors affecting coenzyme binding and subunit interactions in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta. 1979, 12, 567(2), 287-294.

70. Rossman M.G, Liljas A, Branden C.I. Evolutionary and structural relationships among dehydrogenases. In: Enzymes, 3rd ed. 1975, V.lla, 62102.

71. Rossman M.G, Argos P. Protein folding. Annu.Rev.Biochem. 1981, V.50, 497-532.

72. Sirover M.A. Emerging new functions of the glycolytic protein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, in mammalian cells. Life Sci. 1996, V.58, 2271-2277.

73. Sirover M.A. New insights into an old protein: the functional diversity of mammalian glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Biochim. Biophys. Acta. 1999, V. 1432(2), 159-184.

74. Sirover M.A. Role of the glycolytic protein, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in normal cell function and in cell pathology. J. Cell. Biochem. 1997, V.66(2), 133-140.

75. Skarzynski Т., Moody P.C., Wonacott A.J. Structure of holo-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus at 1.8 A resolution. J. Mol. Biol. 1987, 5, 193(1), 171-187.

76. Skarzynski Т., Wonacott A.J. Coenzyme-induced conformational changes inglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillusstearothermophilus. J. Mol. Biol. 1988, 20,203(4), 1097-1118.

77. Somers M., Engelborghs Y., Baert J. Analysis of the binding ofglyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase to microtubules, the mechanismof bundle formation and the linkage effect. Eur. J. Biochem. 1990, 24, 193(2),437.444.

78. Stancel G.M., Deal W.C. Metabolic control and structure of glycolytic enzymes. V. Dissociation of yeast glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase into submits by ATP. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1968, V.31(3), 398-403.

79. Stone E.M., Rothblum K.N., Schwartz R. Intron-dependent evolution of chicken glyceraldehyde phosphate dehydrogenase gene. J. Nature. 1985, 313(6002), 498-500.

80. Sturtevant J.M. Biochemical applications of differential scanning calorimetry. Annuall Rev. Biophys. Bioeng. 1986, Y.38, 463-488.

81. Suresh S., Bressi J.C., Kennedy K.J., Verlinde C.L., Gelb M.H., Hoi W.G. Conformational changes in Leishmania mexicana glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase induced by designed inhibitors. J. Mol. Biol. 2001, 1,309(2), 423-435.

82. Suzuki K., Harris J.I. Hybridization of glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase. J. Biochem. 1975, 77, 587-593.

83. Suzuki K., Imahori K. Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus. Kinetics and physicochemical studies. J. Biochem. (Tokyo). 1973, 74(5), 955-970.

84. Takahashi K. and Sturtevant J.M. Thermal denaturation of streptomyces subtilisin inhibitor, subtilisin BPN', and the inhibitor-subtilisin complex. Biochemistry. 1981, V.20, №21, 6185-6190.

85. Takano K., Yamagata Y., Kubota M., Funahashi J., Fujii S., Yutani K. Contribution of hydrogen bonds to the conformational stability of human lysozyme: calorimetry and X-ray analysis of six Ser --> Ala mutants. Biochemistry. 1999, 18, 38(20), 6623-6629.

86. Trentham D.R. Reactions of D-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase facilitated by oxidized nicotinamide-adenine dinucleotide. Biochem. J., 1971, V. 122(1), p. 59-69.

87. Velicelebi G., Sturtevant J.M. Thermodynamics of the denaturation of lysozyme in alcohol—water mixtures. Biochemistry. 1979, 3, 18(7), 11801186.

88. Walker J.E., Wonacott A.J., Harris J.I. Heat stability of a tetrameric enzyme, D-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Eur. J. Biochem. 1980, 108(2), 581-586.

89. Yi J., Steck T.L. Association of band 3, the predominant polypeptide of the human erythrocyte membrane. J.Biol.Che. 1975, 250, 9176-9184.

90. Yuan A., Mills R.G., Bamburg J.R., Bray J.J. Cotransport of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase and actin in axons of chicken motoneurons. Cell. Mol. Neurobiol. 1999, 19(6), 733-744.

91. Yun M., Park C.G., Kim J.Y., Park H.W. Structural analysis of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from Escherichia coli: direct evidence of substrate binding and cofactor-induced conformational changes. Biochemistry. 2000, 5, 39(35), 10702-10710.

92. Zale S.E., Klibanov A.M. Why does ribonuclease irreversibly inactivate at high temperatures? Biochemistry. 1986, 23, 25(19), 5432-5444.