Кислородные метаболиты в иммунном ответе насекомых тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 01.04.17, кандидат химических наук Комаров, Денис Александрович

• Комаров, Денис Александрович
• кандидат химических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат химических наук Комаров, Денис Александрович

Введение.

1. Литературный обзор. Кислородные метаболиты в биологических системах.б

1.1. Молекулярные механизмы токсичности кислорода.б

1.2. Молекулярные механизмы токсичности хиноновых соединений.

1.3. Методические подходы к изучению кислородных метаболитов в биологических системах.

1.3.1. Регистрация супероксидного радикала.

1.3.2. Регистрация перекиси водорода.

1.3.3. Регистрация гидроксильного радикала.

1.3.4. Регистрация семихиноновых радикалов. Метод спиновой стабилизации орто-семихинонов.

1.4. Цитотоксические частицы в иммунном ответе насекомых.

2. Материалы и методы.

3. Экспериментальная часть. Цитотоксические интермедиаты процесса меланизации.

3.1. Регистрация супероксидного радикала в процессе меланизации.

3.2. Регистрация ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона в гемолимфе насекомых.

3.3. Изучение взаимодействия ДОФА с супероксидным радикалом.

3.4. Регистрация перекиси водорода в процессе меланизации.

3.5. Регистрация гидроксильного радикала в гемолимфе насекомых.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кислородные метаболиты в иммунном ответе насекомых»

На сегодняшний день достоверно известно, что интермедиаты восстановления молекулярного кислорода до воды, такие как супероксидный радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал, принимают участие в иммунных реакциях многих живых организмов в качестве цитотоксических частиц против патогенных организмов. В литературе обсуждается также возможность участия кислородных метаболитов в иммунных реакциях насекомых. Однако существующие на сегодняшний день исследования в этой области ограничиваются лишь единичными работами, которые не позволяют сделать однозначный вывод об образовании и участии этих частиц в защитных реакциях насекомых.

Актуальность проблемы. Одним из основных механизмов защиты насекомых является процесс инкапсуляции, во время которого вокруг патогенного организма происходит формирование меланиновой капсулы. Ключевой фермент меланизации, фенолоксидаза, окисляет тирозин до 3,4-дигидроксифенилаланина (ДОФА) и далее до соответствующего ДОФА-хинона. Цепь последующих превращений приводит к образованию нерастворимого полимера меланина. Предполагается, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием потенциально токсичных семихиноновых радикалов, в частности ДОФА-семихинонового радикала. Однако до сих пор не существует экспериментальных доказательств образования этих частиц в процессе меланизации у насекомых. Некоторые исследователи полагают, что гипотетические семихиноновые интермедиаты меланизации могут взаимодействовать с молекулярным кислородом, восстанавливая его до супероксидного радикала. Существует ряд работ, в которых сообщается об образовании супероксидного радикала в процессе меланизации у насекомых. В этих работах супероксидному радикалу приписывается роль цитотоксичной частицы, ответственной за разрушение чужеродного организма в процессе его инкапсуляции. Однако, так как авторы этих работ для регистрации супероксидного радикала применили недостоверный метод, полученные ими результаты вызывают сомнения. С другой стороны существуют работы, в которых авторам не удалось зарегистрировать образование супероксидного радикала в процессе меланизации у насекомых.

Таким образом, на сегодняшний день не существует достоверных доказательств образования и участия супероксидного радикала в иммунных реакциях насекомых, и механизмы, приводящие к разрушению чужеродного материала в процессе иммунного ответа, остаются изученными недостаточно.

Основной целью настоящей работы являлось определение природы частиц, образующихся в процессе меланизации, которые могли бы выступать в качестве цитотоксических против патогенных организмов в процессе иммунного ответа насекомых. Для успешного выполнения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Выяснить, сопровождается ли процесс меланизации у насекомых образованием супероксидного радикала.

2. Зарегистрировать образование семихиноновых радикалов в процессе меланизации у насекомых.

3. Изучить роль супероксидного и семихиноновых радикалов в иммунных реакциях насекомых.

Научная новизна. В настоящей работе впервые было показано, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием такой цитотоксической частицы, как ДОФА-семихиноновый радикал. Была изучена роль ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона в иммунном ответе насекомых.

Впервые было показано, что в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой происходит образование перекиси водорода. Зарегистрировать образование супероксидного радикала при окислении ДОФА фенолоксидазой прямыми методами не удалось. Однако, учитывая влияние супероксид дисмутазы на выход перекиси в этом процессе, был сделан вывод, что процесс окисления ДОФА фенолоксидазой сопровождается образованием супероксидного радикала.

Было обнаружено взаимодействие между ДОФА и супероксидным радикалом, в результате которого происходит образование ДОФА-семихинонового радикала и перекиси водорода. Определена константа скорости этого взаимодействия, к = (3.4 ± 0.б)*105 М^с"1.

Показано, что процесс меланизации у насекомых сопровождается образованием перекиси водорода, при этом скорость генерации перекиси увеличивается в ответ на инъекцию иммунного стимулятора. Было также показано, что генерация перекиси водорода в процессе меланизации у насекомых приводит к образованию высоко токсичного гидроксильного радикала.

На основании результатов, полученных в настоящей работе, а также анализа литературных данных, был предложен механизм уникального, направленного на патогенный организм, цитотоксического действия, согласно которому частицами, ответственными за разрушение чужеродного материала при иммунном ответе насекомых, могут являться такие интермедиа™ процесса меланизации, как ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекись водорода и гидроксильный радикал.

Заключение диссертации по теме «Химическая физика, в том числе физика горения и взрыва», Комаров, Денис Александрович

Выводы.

1. Показано, что процесс меланизации в гемолимфе насекомых сопровождается образованием цитотоксичного ДОФА-семихинонового радикала. Была изучена генерация ДОФА-семихинона, а также ДОФА-хинона в гемолимфе нативных и инфицированных насекомых. Сделан вывод об участии этих частиц в реализации цитотоксического действия при инкапсуляции патогенных организмов в гемолимфе насекомых.

2. Обнаружено взаимодействие между ДОФА и супероксидным радикалом, в результате которого происходит образование ДОФА-семихинонового радикала и перекиси водорода. Определена константа скорости этого взаимодействия, которая составила к = (3.4 ± 0.б)*105 М^с"1.

3. Показано, что в процессе окисления ДОФА фенолоксидазой происходит образование перекиси водорода, при этом часть перекиси образуется в результате взаимодействия ДОФА с супероксидным радикалом, другая часть - в результате двухэлектронного восстановления молекулярного кислорода на ферменте.

4. Показано, что зарегистрировать образование супероксидного радикала при окислении ДОФА фенолоксидазой прямыми методами не удается. Однако, учитывая, что супероксид дисмутаза ингибирует выход перекиси водорода в этом процессе, сделан вывод, что окисление ДОФА фенолоксидазой сопровождается образованием супероксидного радикала.

5. Показано, что процесс меланизации в гемолимфе насекомых сопровождается образованием перекиси водорода, при этом скорость генерации перекиси увеличивается в ответ на инъекцию иммунного стимулятора. Генерация перекиси водорода в гемолимфе насекомых приводит к образованию высоко токсичного гидроксильного радикала. б. На основании полученных результатов, а также анализа литературных данных, предложен механизм направленного на патогенный организм цитотоксического действия, в основе которого лежит генерация таких интермедиатов процесса меланизации, как ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекиси водорода и гидроксильного радикала.

Благодарности.

Автор глубоко признателен своим научным руководителям -Слепневой Ирине Алексеевне и Храмцову Валерию Владимировичу. Признателен Бобко Андрею Александровичу, Глазачеву Юрию Ивановичу, Шолоховой Лине Федоровне за всестороннюю поддержку и помощь на всех этапах выполнения работы. Автор выражает благодарность сотрудникам лаборатории патологии насекомых Института Систематики и Экологии Животных СО РАН: Дубовскому Ивану Михайловичу, Лозинской Яне Леонидовне, Хвощевской Марине Федоровне, Глупову Виктору Вячеславовичу - за предоставленных насекомых, обсуждение и помощь в проведении ряда экспериментальных работ.

Заключение.

В настоящей работе было показано, что на начальной стадии процесса меланизации в гемолимфе насекомых протекают следующие реакции: QH2 + Oz ФО ) Q + Н202 QH2 + 02 ф0 > Q- +0\+2 Н+

QH2+0|->Q'+H202

Н202 Red >НО'+НО

Впервые было показано, что процесс меланизации в гемолимфе насекомых сопровождается образованиемтаких- цитотоксических частиц, как ДОФА-семихиноновый радикал и> гидроксильный радикал. Зарегистрировать образование супероксидного радикала при окислении ДОФА фенолоксидазой прямыми методами нам не удалось. Однако, учитывая, что супероксид дисмутаза ингибировала выход перекиси водорода в этом процессе, можно сделать вывод, что окисление ДОФА фенолоксидазой сопровождается образованием супероксидного радикала.

Существуют работы, в которых сообщается об образовании перекиси водорода в гемолимфе насекомых в процессе иммунного ответа [136, 137]. Однако механизм образования Н202 до сих пор оставался неизученным. Полученные нами результаты показывают, что перекись водорода в гемолимфе насекомых может образовываться в результате двухэлектронного восстановления молекулярного кислорода фенолоксидазой, а также при взаимодействии ДОФА с супероксидным радикалом.

До сих пор считалось, что частицей, ответственной за разрушение чужеродного материала в гемолимфе насекомых, является супероксидный' радикал. Нами было обнаружено, что супероксидный радикал эффективно взаимодействует с ДОФА (к = 3.4*105 М^с"1). Учитывая этот факт, а также известную из литературы способность меланина взаимодействовать с Or (k ~ 106 М^с"1 [138]), можно сделать вывод, что супероксидный радикал сам по себе не принимает участия в цитотоксических реакциях против патогенных организмов. Полученные в настоящей работе результаты показывают, что частицами, ответственными за разрушение чужеродного материала в гемолимфе насекомых, могут являться ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекись водорода и гидроксильный радикал.

Отличительной особенностью строения насекомых является открытая кровеносная система. В отличие от млекопитающих, гемолимфа насекомых циркулирует не по замкнутым сосудам, а непосредственно в полости тела. Такая особенность в строении требует наличия механизмов локализации образования цитотоксических частиц, так как их свободное распространение в условиях открытой кровеносной системы могло бы привести к повреждению не только клеток чужеродного организма, но и собственных органов насекомого. Свободное распространение хиноновых/семихиноновых интермедиатов процесса меланизации, в том числе ДОФА-семихинонового радикала и ДОФА-хинона, в гемолимфе насекомых затруднено, так как они будут взаимодействовать с образующейся меланиновой капсулой. В то же время в литературе есть данные что, у насекомых различных видов регистрируется высокая активность каталазы [139, 140]. По всей видимости, каталаза служит для эффективного разложения перекиси водорода, образующейся в гемолимфе в процессе меланизации, таким образом защищая от повреждения собственные органы насекомого. При этом цитотоксическая активность перекиси водорода может быть локализована внутри меланиновой капсулы, так что ее восстановление до высоко токсичного гидроксильного радикала протекает в непосредственной близости к поверхности патогенного организма. Таким образом, генерация таких интермедиатов процесса меланизации, как ДОФА-семихиноновый радикал и ДОФА-хинон, а также перекиси водорода и гидроксильного радикала в процессе иммунного ответа в гемолимфе насекомых, может представлять собой уникальный механизм локального и направленного на патогенный организм цитотоксического действия.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Комаров, Денис Александрович, 2008 год

1. Sono М. Heme-containing oxygenases /M.Sono, М.P.Roach, E.D.Coulter, J.H.Dawson //Chem. Rev.- 1996.- V.96.- P.2841-2887.

2. Misra H.P. The univalent reduction of oxygen by reduced flavins and quinones /Н.P.Misra, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1972.- V.247.-P.188-192.

3. Misra H.P. The role of superoxide anion in the autoxidation of epinephrine and a simple assay for superoxide dismutase /Н.P.Misra, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1972.- V.247.- P.3170-3175.

4. Patel K.B. Semiquinone free radicals and oxygen. Pulse radiolysis study of one electron transfer equilibria /К.В.Patel, R.L.Willson //J. Chem. Soc.- Faraday Trans.- 1973.- V.69.- P.814-825.

5. Klebanoff S.J. Oxygen-based free radical generation by ferrous ions and deferoxamine /S.J. Klebanoff, A.M.Waltersdorph, B.R.Michel, H.Rosen//J. Biol. Chem.- 1989.-V.264.- P.19765-19771.

6. Qian S.Y. Iron and dioxygen chemistry is an important route to initiation of biological free radical oxidations: an electron paramagnetic resonance spin trapping study /S.Y.Qian, G.R.Buettner //Free Radic. Biol. Med.- 1999.- V.26.- P.1447-1456.

7. Fridovich I. Quantitative aspects of the production of superoxide anion radical by* milk xanthine oxidase /I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1970.-V.245.- P.4053-4057.

8. Babior B.M. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes (first of two parts)/В.М.Babior//New Engl. J. Med.- 1978.-V.298.- P.659-668.

9. Babior B.M. Oxygen-dependent microbial killing by phagocytes (second of two parts) /В.М.Babior//New Engl. J. Med.- 1978.- V.298.- P.721-725.

10. Bielski B.H.J. Reactivity of HO2/O2" radicals in aqueous solution /B.H.J.Bielski, D.E.Cabelli, R.L.Arudi, A.B.Ross //J. Phys. Chem. Ref. Data- 1985.- V.14.- P.1041-1100.

11. Bielski B.H.J. Mechanism of disproportionation of superoxide radicals /B.H.J.Bielski, A.O.Allen //J. Phys. Chem.- 1977.- V.81.- P.1048-1050.

12. McCord J.M. The reduction of cytochrome с by milk xanthine oxidase /J.M.McCord, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1968.- V.243.- P.5753-5760.

13. McCord J.M. Superoxide dismutase. An enzymic function for erythrocuprein (hemocuprein) /J.M.McCord, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1969.- V.244.- P.6049-6055.

14. Winterbourn C.C. Reactions involving superoxide and normal and unstable haemoglobins /С.С.Winterbourn, B.M.McGrath, R.W.Carrell //Biochem. J.- 1976.- V.155.- P.493-502.

15. Sutton H.C. The rate of reaction of superoxide radical ion with oxyhaemoglobin and methaemoglobin- /H.C.Sutton, P.B.Roberts,

16. C.C.Winterbourn //Biochem. J.- 1976.- V.155.- P.503-510.

17. Nanni E.J. Does superoxide ion oxidize catechol, a-tocopherol, and ascorbic acid by direct electron transfer? /E.J.Nanni, M.D.Stallings,

18. D.T.Sawyer//J. Am. Chem. Soc.- 1980.- V.102.- P.4481-4485.

19. Winterbourn C.C. Reactivity of biologically important thiol compounds with superoxide and hydrogen peroxide /C.C.Winterbourn, D.Metodiewa //Free Radic. Biol. Med.- 1999.- V.27.- P.322-328.

20. Klug-Roth D. Pulse radiolytic investigations of superoxide catalyzed disproportionation. Mechanism for bovine superoxide dismutase /D.Klug-Roth, I.Fridovich, J.Rabani //J. Am. Chem. Soc.- 1973.- V.95.-P.2786-2790.

21. Panayiotidis M. Glucose oxidase-produced H202 induces Ca2+-dependent DNA damage in human peripheral blood lymphocytes /М.Panayiotidis, O.Tsolas, D.Galaris //Free Radic. Biol. Med.- 1999.-V.26.- P.548-556.

22. Cohen G. The Fenton reaction /G.Cohen //Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. Edited by R.A.Greenwald.- Boca Raton, Florida, The United States: CRC Press, Inc.-1986.- P.55-64.

23. Kehrer J.P. The Haber-Weiss reaction and mechanisms of toxicity /J.P.Kehrer //Toxicology- 2000'.- V.149.- P.43-50.

24. Czapski G. Reaction of 'OH /G.Czapski //Method. Enzymol.- 1984.-V.105.- P.209-215.

25. Oxidative damage to DNA /J.Cadet, M.Berger, B.Morin et al. //Analysis of Free Radicals in Biological Systems. Edited by A.E.Favier, J.Cadet, B.Kalyanaraman, M.Fontecave and J.-L.Pierre.- Basel, Switzerland: Birkhauser Verlag.- 1995.- P.51-64.

26. Dizdaroglu M. Free radical-induced' damage to DNA: mechanisms and measurement /М.Dizdaroglu, P.Jaruga, M.Birincioglu, H.Rodriguez //Free Radic. Biol. Med.- 2002.- V.32.- P.1102-1115.

27. Halliwell B. Lipid peroxidation: its mechanism, measurement, and significance /В.Halliwell, S.Chirico //Am. J. Clin. Nutr.- 1993.- V.57.-P.715S-725S.

28. VanGinkel G. Lipid peroxidation-induced membrane structural alterations /G.VanGinkel, A.Sevanian //Method. Enzymolt- 1994.-V.233.- P.273-288.

29. Cohen G. Glutathione peroxidase: the primary agent for the elimination of hydrogen peroxide in erythrocytes /G.Cohen, P.Hochstein //Biochemistry- 1963.- V.2.- P.1420-1428.

30. Babior B.M. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent /В.М.Babior, R.S.Kipnes, J.T.Curnutte //J. Clin. Invest.- 1973.- V.52.- P.741-744.

31. Antimicrobial properties of milk: dependence on presence of xanthine oxidase and nitrite /J.T.Hancock, V.Salisbury, M.C.Ovejero-Boglione et al. //Antimicrob. Agents Chemother.- 2002.- V.46.- P.3308-3310.

32. Klebanoff S.J. Role of the superoxide anion in the myeloperoxidase-mediated-antimicrobial system /S.J. Klebanoff //J. Biol. Chem.- 1974.-V.249.- P.3724-3728.

33. DiGuiseppi J. Oxygen toxicity in Streptococcus sanguis. The relative importance of superoxide and hydroxyl radicals /J.DiGuiseppi, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1982.-V.257.- P.4046-4051.

34. Permeability of bilayer lipid membranes for superoxide (02") radicals: /R.A.Gus'kova, I.I.Ivanov, V.K.Kol'tover et al. //Biochim. Biophys. Acta- 1984.- V.778.- P.579-585.

35. Bienert G.P. Membrane transport of hydrogen peroxide /G.P.Bienert, J.K.Schjoerring, T.P.Jahn //Biochim. Biophys. Acta- 2006.- V.1758.-P.994-1003.

36. O'Brien P.J. Molecular mechanisms of quinone cytotoxicity /P.J.O'Brien //Chem.-Biol. Interact.- 1991.- V.80.- P.l-41.

37. Stokes, A.H. Cytotoxic and genotoxic potential, of dopamine-/A.H.Stokes, T.G.Hastings, K.E.Vrana //J. Neurosci. Res.- 1999.-V.55.- P.659-665.

38. Tse D.C. Potential1 oxidative pathways of, brain catecholamines /D.C.Tse, R.L.McCreery, R.N.Adams //J. Med. Chem.- 1976.- V.19.-P.37-40.

39. A pulse radiolysis ' investigation of the oxidation of the melanin precursors 3,4-dihydroxyphenylalanine (dopa) and' the cysteinyldopas /A.Thompson, EJ.Land, M.R.Chedekel et al. //Biochim. Biophys. Acta-1985.- V.843.- P:49-57.

40. Tyrosinase enhances the covalent modification» of DNA^by dopamine /A.H.Stokes, B.G.Brown, C.K.Lee et al. //Mol. Brain Res.- 1996.- V.42.-P. 167-170.

41. Rao P.S. Ionization constants and spectral characteristics of some semiquinone radicals in aqueous solution /P.S.Rao, E.Hayon //J. Phys. Chem.- 1973.- V.77.- P.2274-2276.

42. Nohl H. The involvement of biological quinones in the formation of hydroxyl radicals via the Haber-Weiss reaction /H.Nohl, W.Jordan //Bioorg. Chem.- 1987.- V.15.- P.374-382.

43. Sushkov D.G. Generation of OH radical during enzymatic reduction ofi 9,10-anthraquinone-2-sulphonate. Can semiquinone decompose hydrogen peroxide? /D.G.Sushkov, N.P.Gritsan, L.M.Weiner //FEBS Lett.- 1987.- V.225.- P.139-144.

44. Reaction between ortho-semiquinones and oxygen: pulse radiolysis, electron spin resonance, and oxygen uptake studies /B.Kalyanaraman,

45. W.Korytowski, В-Pilas et al. //Arch. Biochem. Biophys.- 1988ir V1266.-P.277-284.

46. Bielski; B.H.J: Generation of superoxide radicals by photolysis of oxygenated; ethanob solutions? /B.H.JiBielski, J.MlGebicki //J. Am. Chem. Soc. 1982;-V.104:-P.796-798;

47. Fujii H. Direct measurement of superoxide anion produced in: biological systems; by ESR spectrometry: a pH-jump method /Н.Fujii, KIKakinuma //j;.Biochem;- 1990:- V. 108.- P;983-987.,

48. Auclair C. Nitroblue tetrazolium reduction /C.Auclair, E.Voisin // Handbook of Methods for Oxygen Radical" Research. Edited by R.A.Greenwald:- Boca, Raton; Florida, The United States: CRC Press, Inc.-1986.-P. 123-132.

49. Liochev S.T. Superoxide from glucose oxidase or from nitroblue tetrazolium? /S.I.Liochev, I.Fridovich //Arch. Biochem; Biophys.-1995.- V.318;- P.408-410.

50. Auclair C. Superoxide anion involvement in NBT reduction catalyzed by NADPH-cytochrome P-450 reductase: a pitfall /C.Auclair, M.Torres, J.Hakim //FEBS Lett.- 1978.- V.89.- P.26-28.

51. Bielski B.H.J. Reduction of nitro blue tetrazolium by C02" and 02~ radicals /В.НJ.Bielski, G.G.Shiue, S.Bajuk //J. Phys. Chem.- 1980.-V.84.- P.830-833.

52. Nappi A.J. Superoxide anion generation in Drosophila during melanotic encapsulation of parasites /A.J.Nappi, E.Vass, F.Frey, Y.Carton //Eur. J. Cell Biol.- 1995,- V.68;- P.450-456.

53. Whitten M.M.A. In vitro superoxide activity in the haemolymph of the West Indian leaf cockroach, Blaberus discoidalis /M.'M.A.Whitten, N.A.Ratcliffe //J. Insect Physiol.- 1999.- V.45.- P.667-675.

54. Role of superoxide and reactive nitrogen intermediates in Rhodnius prolixus (Reduviidae)/Trypanosoma rangeli interactions /М.М.А. Whitten, C.B.Mello, S.A.O.Gomes. et al: //Exp. Parasitol.-2001.- V.98.- P.44-57.

55. Choi H.S. A quantitative nitroblue tetrazolium assay for determining intracellular superoxide anion production in phagocytic cells /H.S.Choi, J.W.Kim, Y.-N.Cha, C.Kim //J. Immunoassay Immunochem.- 2006.-V.27.- P.31-44.

56. Tordo P. Spin-trapping: recent developments and applications /P.Tordo //Electron Paramag. Res.- 1998.- V.16.- P.116-144.

57. Timmins G.S. Spin trapping in vivo: facts and artifacts /G.S.Timmins, K.J.Liu, //In Vivo EPR (ESR): Theory and Applications. Edited by L.J.Berliner.- New York, New York, The United States: Kluwer Academic/Plenum Publishers.- 2003.- P.285-308.

58. Cox R.H. Detection and identification of short-lived free radicals by an electron spin resonance trapping technique /R.H.Cox, E.G.Janzen, J.L.Gerlock //J. Am. Chem. Soc.- 1968.- V.90.- P:5909-5910.

59. Janzen E.G. Spin trapping /E.G.Janzen //Accounts Chem. Res.- 1971.-V.4.- P.31-40.

60. Buettner G.R. Spin trapping: ESR parameters of spin adducts /G.R.Buettner //Free Radic. Biol. Med.- 1987.- V.3.- P.259-303.

61. Finkelstein E. Spin trapping kinetics of the reaction of superoxide and hydroxyl radicals with nitrones /Е. Finkelstein, G.M.Rosen, E.J.Rauckman //J. Am. Chem. Soc.- 1980.- V.102.- P.4994-4999.

62. Buettner G.R. Considerations in the spin trapping of superoxide and hydroxyl radical in aqueous systems using 5,5-dimethyl-l-pyrroline-l-oxide /G.R.Buettner, L.W.Oberley //Biochem. Biophys. Res. Commun.-1978.- V.83.- P.69-74.

63. Finkelstein E. Spin trapping of superoxide /Е.Finkelstein, G.M.Rosen, E.J.Rauckman, J.Paxton //Mol. Pharmacol.- 1979.- V.16.- P.676-685.

64. Finkelstein E. Production of hydroxyl radical by decomposition of superoxide spin-trapped adducts /Е.Finkelstein, G.M.Rosen, E.J.Rauckman //Mol. Pharmacol.- 1982.- V.21.- P.262-265.

65. Buettner G.R. The spin trapping of superoxide' and hydroxyl free radicals with DMPO (5,5-dimethylpyrroline-N-oxide): more about iron /G.R.Buettner//Free Radic. Res. Commun.- 1993.- V.19.- P.S79-S87.

66. A comparative study of EPR spin trapping and cytochrome с reduction techniques for the measurement of superoxide anions /S.P.Sanders, S.J.Harrison, P.Kuppusamy et al. //Free Radic. Biol. Med.- 1994.-V.16.- P.753-761.

67. Karoui H. Spin trapping of superoxide in the presence of |3-cyclodextrins /Н.Karoui, A.Rockenbauer, S.Pietri, P.Tordo //Chem. Commun.- 2002.- P.3030-3031.

68. Forrester A.R. Spin traps. A cautionary note /A.R.Forrester, S.P.Hepburn //J. Chem. Soc.- 1971.- V.4.- P.701-703.

69. Finkelstein E. Spin trapping of superoxide and hydroxyl radical: practical aspects /Е.Finkelstein, G.M.Rosen, E.J.Rauckman //Arch. Biochem. Biophys.- 1980.- V.200.- P.l-16.

70. Cautionary note for DMPO spin trapping in the presence of iron ion /K.Makino, T.Hagiwara, A.Hagi et al. //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1990.- V.172.- P.1073-1080.

71. Hanna» P.M. When are metal ion-dependent hydroxyl and alkoxyl radical adducts of 5,5-dimethyl-l-pyrroline N-oxide artifacts? /P.M.Hanna, W.Chamulitrat, R.P.Mason //Arch. Biochem. Biophys.-1992.- V.296.- P.640-644.

72. Nonradical mechanism of (bi)sulfite reaction with DEPMPO: cautionary note for S03" radical spin trapping /D.I.Potapenko, T.L.CIanton, E.G.Bagryanskaya et al. //Free Radic. Biol. Med.- 2003.- V.34.- P.196-206.

73. Rosen G.M. A method for the detection of superoxide in biological systems /G.M.Rosen, E.Finkelstein, E.J.Rauckman //Arch. Biochem. Biophys.- 1982.- V.215.- P.367-378.

74. Dikalov, S. Quantification of superoxide radicals and peroxynitrite in vascular cells using oxidation of sterically hindered hydroxylamines and electron spin resonance /S.Dikalov, M.Skatchkov, B.Fink, E.Bassenge //Nitric Oxide- 1997.- V.I.- P.423-431.

75. Dikalov S. Quantification of peroxynitrite, superoxide, and peroxyl radicals by a new spin trap hydroxylamine l-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-4-oxo-piperidine /S.Dikalov, M.Skatchkov, E.Bassenge //Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1997.- V.230.- P.54-57.

76. Application of a trityl-based radical probe for measuring superoxide /C.Rizzi, A.Samouilov, V.K.Kutala et al. //Free Radic. Biol. Med.-2003.- V.35.- P. 1608-1618.

77. Kuppusamy P. High resolution electron paramagnetic resonance imaging of biological samples with a single line paramagnetic label /Р.Kuppusamy, P.Wang, M.Chzhan, J.L.Zweier //Magn. Reson. Med.-1997.- V.37.- P.479-483.

78. Rothe G. Flow cytometric analysis of respiratory burst activity in phagocytes with hydroethidine and 2',7'-dichlorofluorescin /G.Rothe,

79. G.Valet //J. Leukocyte Biol.- 1990.- V.47.- P.440-448.

80. Benov L. Critical evaluation of the use of hydroethidine as a measure of superoxide anion radical /L.Benov, L.Sztejnberg, I.Fridovich //Free Radic. Biol. Med.- 1998.- V.25.- P.826-831.

81. Superoxide reacts with hydroethidine but forms a fluorescent product that is distinctly different from ethidium: potential implications in intracellular fluorescence detection of superoxide /H.Zhao, S.Kalivendi,

82. H.Zhang etal. //Free Radic. Biol. Med.- 2003.- V.34.- P.1359-1368.

83. Detection and characterization of the product of hydroethidine and intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence

84. H.Zhao, J.Joseph, H.M.Fales et al. //Proc. Natl. Acad, Sci. U. S. A.-2005.- V.102.- P.5727-5732.

85. Zielonka J. Mechanistic similarities between oxidation of hydroethidine by Fremy's salt and superoxide: stopped-flow optical and EPR studies /J.Zielonka, H.Zhao, Y.Xu, B.Kalyanaraman //Free Radic. Biol. Med.-2005.- V.39.- P.853-863.

86. Detection of intracellular superoxide formation in endothelial cells and intact tissues using dihydroethidium and an HPLC-based assay /B.Fink, K.Laude, L.McCann et al. //Am. J. Physiol.-Cell Physiol.- 2004.- V.287.-P.C895-C902.

87. An ultrasensitive fluorescent assay for the in vivo quantification of superoxide radical in organisms* /C.D.Georgiou, I.Papapostolou, N.Patsoukis et al. //Anal. Biochem.- 2005.- V.347.- P.144-151.

88. Olmsted 3rd J. Mechanism of ethidium bromide fluorescence enhancement on binding to nucleic acids /J.Olmsted 3rd, D.R.Kearns //Biochemistry- 1977.- V.16.- P.3647-3654.

89. Keston A.S. The fluorometric analysis of ultramicro quantities of hydrogen peroxide /A.S.Keston, R.Brandt //Anal. Biochem.- 1965.-V.ll.- P.1-5.

90. Cathcart R. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay /R.Cathcart, E.Schwiers, B.N.Ames//Anal. Biochem.- 1983.-V.134.- P.111-116.

91. LeBel C.P. Evaluation of the probe 2',7'-dichlorofluorescin as an indicator of reactive oxygen species formation and oxidative stress /С.P.LeBel, H.Ischiropoulos, S.C.Bondy-//Chem. Res. Toxicol.- 1992.-V.5.- P.227-231.

92. Jiang Z.-Y. Hydrogen peroxide production during experimental protein glycation /Z.-Y.Jiang, A.C.S.Woollard, S.P.Wolff //FEBS Lett.- 1990.-V.268.- P.69-71.

93. Beauchamp C. A mechanism for the production of ethylene from methional. The generation of the hydroxyl radical by xanthine oxidase /C.Beauchamp, I.Fridovich //J. Biol. Chem.- 1970.- V.245.- P.4641-4646.

94. Lawrence G.D. Ethylene formation1 from methionine and its analogs /G.D.Lawrence // Handbook of Methods for Oxygen Radical Research. Edited by R.A.Greenwald.- Boca Raton, Florida, The United States: CRC Press, Inc.-1986.- P.157-163.

95. Terephthalic acid г a dosimeter for the detection of hydroxyl radicals in vitro /J.C.Barreto, G.S.Smith, N.H.P.Strobel et al. //Life Sci.- 1995.-V.56.- P.PL89-PL96.

96. Saran M. Assaying for hydroxyl radicals: hydroxylated terephthalate is a superior fluorescence marker than hydroxylated benzoate /М.Saran, K.H.Summer //Free Radic. Res.- 1999.- V.31.- P.429-436.

97. Buettner G.R. Spin-trapping methods for detecting superoxide and hydroxyl free radicals in vitro and in vivo /G.R.Buettner, R.P.Mason //Method. Enzymol.- 1990.- V.186.- P.127-133.

98. Kasai H. Analysis of a form'of oxidative DNA damage, 8-hydroxy-2'-deoxyguanosine, as a marker of cellular oxidative stress during carcinogenesis/Н.Kasai//Mutat. Res.- 1997.- V.387.- P.147-163.

99. Hydroxyl free radical adduct of deoxyguanosine: sensitive detection and mechanisms of formation /R.A.Floyd, J J.Watson, P.K.Wong et al. //Free Radic. Res. Commun.- 1986.- V.I.- P.163-172.

100. Yoshioka M. Semiquinone radicals generated from catecholamines by ultraviolet irradiation /M.Yoshioka, Y.Kirino, Z.Tamura, T.Kwan //Chem. Pharm. Bull. (Tokyo)- 1977.- V.25.- P.75-78.

101. Felix C.C. Electron spin resonance characterization of radicals from 3,4-dihydroxyphenylalanine semiquinone anions and their metalchelates /C.C.Felix, R.C.Sealy //J. Am. Chem. Soc.- 1981.- V.103.-P.2831-2836.

102. Tomkiewicz M. Photooxidation and decarboxylation of tyrosine studied by EPR and CIDNP techniques /М .Tomkiewicz, R.D.McAlpine, M.Cocivera //Can. J. Chem.- 1972.- V.50.- P.3849-3856.

103. Sealy R.C. Identification by electron spin resonance spectroscopy of free radicals, produced during autoxidative melanogenesis /R.C.Sealy, W.Puzyna, B.Kalyanaraman, C.C.Felix //Biochim. Biophys. Acta- 1984.-V.800.- P.269-276.

104. Kalyanaraman B. Characterization of o-semiquinone radicals in biological systems /B.Kalyanaraman //Method. Enzymol.- 1990.-V.186.- P.333-343.

105. Eaton D.R. Complexing of metal ions with semiquinones. An electron spin resonance study /D.R.Eaton //Inorg. Chem.- 1964.- V.3.- P. 12681271.

106. Kalyanaraman B. Peroxidatic oxidation of catecholamines. A kinetic electron spin resonance investigation using the spin stabilization approach /B.Kalyanaraman, C.C.Felix, R.C.Sealy //J. Biol. Chem.-1984'.- V.259.- P.7584-7589.

107. Глупов В.В. Внутренние защитные системы насекомых /В.В.Глупов, С.А.Бахвалов, Ю.Я.Соколова //Патогены Насекомых: Структурные и Функциональные Аспекты. Под редакцией В.В.Глупова.- Москва: Круглый год.- 2001.- Р.481-501.

108. Lavine M.D. Insect hemocytes and their role in immunity /MtD.Lavine, M.R.Strand//Insect Biochem. Mol. Biol.- 2002.- V.32.- P.1295-1309.

109. Superoxide production in-Galleria mellonella hemocytes: identification of proteins homologous to the NADPH oxidase complex of human neutrophils /D.Bergin, E.P.Reeves, J.Renwick et al. //Infect. Immun.-2005.- V.73.- P.4161-4170.

110. Anderson R.S. Comparative biochemistry of phagocytizing insect hemocytes /R.S.Anderson, B.Holmes, R.A.Good //Сотр. Biochem. Physiol.- 1973.- V.46.- P.595-602.

111. Mazet I. Comparative analysis of phagocytosis of fungal cells by insect hemocytes versus horse neutrophils /I.Mazet, J.Pendland, D.Boucias //Dev. Сотр. Immunol.- 1994'.- V.18.- P.455-466.

112. Akita N. Hemocytes release phenoloxidase upon contact reaction, an allogeneic interaction, in the ascidian Halocynthia roretzi /N.Akita, M.Hoshi //Cell Struct. Funct.- 1995.-V.20.- P.81-87.

113. Sugumaran M. Comparative biochemistry of* eumelanogenesis and the protective roles of phenoloxidase and melanin in insects /М.Sugumaran //Pigment Cell Res.- 2002.- V.15.- P.2-9.

114. Land E.J. Rate constants for the first two chemical steps of eumelanogenesis /E.J.Land, S.Ito, K.Wakamatsu, P.A.Riley //Pigment Cell Res.- 2003.- V.16.- P.487-493.

115. Chedekel M.R. Early steps in the free-radical polymerization of 3,4-dihydroxyphenylalanine (dopa) into melanin /M.R.Chedekel, E.J.Land, A.Thompson, T.G.Truscott //J. Chem. Soc.-Chem. Commun.- 1984.-P.1170-1172.

116. Nappi A.J. Melanogenesis and the generation of cytotoxic molecules during insect cellular immune reactions /A.J.Nappi, E.Vass //Pigment Cell Res.- 1993.- V.6.- P.117-126.

117. Nappi A.J. Melanogenesis and associated cytotoxic reactions: applications to insect innate immunity /A.J.Nappi, B.M.Christensen //Insect Biochem. Mol. Biol.- 2005.- V.35.- P.443-459.

118. Arakawa T. Superoxide generation in vitro in lepidopteran larval haemolymph /T.Arakawa //J. Insect Physiol.- 1994.- V.40.- P.165-171.

119. Arakawa Т. Superoxide generative reaction in insect hemolymph and its mimic model system with surfactants in vitro /T.Arakawa //Insect Biochem. Mol. Biol.- 1995.- V.25.- P.247-253.

120. Pomerantz S.H*. Separation, purification, and properties of two tyrosinases from hamster melanoma /S.H.Pomerantz //J. Biol. Chem.-1963.- V.238.- P.2351-2357.

121. Mason H.S. The chemistry of melanin. Mechanism of the oxidation of dihydroxyphenylalanine by tyrosinase /H.S.Mason //J. Biol. Chem.-1948.- V.172.- P.83-99.

122. Nichol H. Iron metabolism in insects /H.Nichol, J.H.Law, J.J.Winzerling //Annu. Rev. Entomol.- 2002.- V.47.- P.535-559.

123. Nappi A.J. Hydrogen peroxide production in immune-reactive Drosophila melanogaster /A.J.Nappi, E.Vass //J. Parasitol.- 1998.-V.84.- P.1150-1157,

124. The role of reactive oxygen species on Plasmodium melanotic encapsulation in Anopheles gambiae /S.Kumar, G.K.Christophides, R.Cantera et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.- 2003.- V.100.-P.14139-14144.

125. Reaction of superoxide anions with melanins: electron spin resonance and spin trapping studies /W.Korytowski, B.Kalyanaraman, I.A.Menon et al. //Biochim. Biophys. Acta- 1986.- V.882.- P.145-153.

126. Antioxidant enzymes of larvae of the cabbage looper moth, Trichoplusia ni: subcellular distribution and activities of superoxide dismutase, catalase and glutathione reductase /S.Ahmad, C.A.Pritsos,

127. S.M.Bowen et al. //Free Radic. Res. Commun.- 1988.- V.4.- P.403-408.

128. Ahmad S. Mechanisms for regulating oxygen toxicity in phytophagous insects /S.Ahmad, R.S.Pardini //Free Radic. Biol. Med.- 1990.- V.8.-P.401-413.