Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из Escherichia coli K12 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Самсонова, Наталья Николаевна

• Самсонова, Наталья Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Самсонова, Наталья Николаевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клонирование и функциональная характеристика гена ygjG из Escherichia coli K12»

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ.6

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ.7

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.8

1.1. Полиамины в Escherichia coli.8

1.1.1. Эффекты полиаминов in vivo и in vitro.8

1.1.2. Полиамины, представленные в E.coli.11

1.1.3. Влияние полиаминов на адаптацию Е. coli в условиях стрессов.12

1.1.4. Биосинтез полиаминов.15

1.1.5. Катаболизм полиаминов.20

1.1.6. Транспортные системы полиаминов.27

1.2. Ntr-ответ E.coli.30

1.2.1. Два пути ассимиляция азота в Е. coli.30

1.2.2. GS активность. Механизм регуляции Ntr-ответа.32

1.2.3. Роль глутамина и а-кетоглутарата.33

1.2.4. Вклад GlnK и AmtB в регуляцию Ntr-ответа.35

1.2.5. Особенности а54 - зависимой транскрипции.36

1.2.6. Последовательности ст54-зависимых промоторов и сайтов связывания NRI39

1.3. PLP-зависимые аминотрансф еразы.41

1.3.1. Группы PLP-зависимых аминотрансфераз.42

1.3.2. Инвариантные аминокислотные остатки аминотрансфераз.44

1.3.3. Эволюционные взаимосвязи между PLP - зависимыми ферментами.45

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.48

2.1 Бактериальные штаммы.48

2.1.1 Получение штамма MG1655 ptr+.48

2.1.2 Получение штаммов MG1655 ygjG и MG1655 ptr+ ygjG.48

2.2 Среды, условия культивирования штаммов и приготовление лизатов клеток.49

2.3 Эксперименты с рекомбинантной ДНК.50

2.3.1 Генно-инженерные мето дики.50

•

2.3.2 Конструирование рекомбинантных плазмид.51

2.4 Определение старта транскрипции мРНК гена ygjG.54

2.5 Выделение и очистка белков.55

2.5.1 Основные методики оценки препаратов белков.55

2.5.2 Выделение препаратов Ht-ORF 1 и Ht-ORF2.55

2.5.3 Выделение нативного препарата YgjG.56

2.5.4 Определение олигомерной структуры нативного YgjG.57

2.6 Измерение энзиматических активностей.57

2.6.1 Методы измерения энзиматических активностей.57

2.6.2 Определение основных физических и кинетических параметров препаратов ПАТаз .58

2.7 Программы, использованные для компьютерного анализа.59

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.61

3.1 Идентификация и клонирование гена pat Escherichia coli К12, кодирующего путресцин:а-кетоглутарат аминотрансферазу.61

3.1.1 Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме Е. coli К12.61

3.1.2 Амплификация 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего структурную последовательность гена ygjG, в составе мультикопийной плазмиды.63

3.2 Изучение структурной организации 1,8-т.п.н. фрагмента, содержащего регуляторную область и кодирующую последовательность гена ПАТазы.65

3.2.1 Анализ нуклеотидной последовательности ygjG и aer-ygjG межцистронного района .65

3.2.2 Изучение регуляции экспрессии гена ПАТазы.68

3.2.3 Определение старта инициации транскрипции гена ПАТазы.71

3.2.4 Анализ продуктов трансляции orfl и orf2.74

3.3 Характеристика каталитической активности YgjG (ПАТазы) E.coli.77

3.3.1 Экспрессия и разработка метода выделения белка YgjG.78

3.3.2 Определение олигомерной структуры ПАТазы Е. coli.80

3.3.3 Характеристика субстратной специфичности и основных физических и кинетических параметров препаратов Ht-YgjG и YgjG.81

3.4 Влияние аллельного состояния гена ygjG на утилизацию путресцина.88

3.5 Поиск гомологов белка YgjG.90

ВЫВОДЫ.95

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.96

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ ptr - путресцин п.н. - пара нуклеохидов а.к.о. - аминокислотный остаток

RNAP - РНК-полимераза

RBS - участок связывания рибосом

SD последовательность Shine-Dalgarno

ORF - открытая рамка считывания а-КГ - а-кетоглуторат

GABA - у-аминобутират

ABAD - аминобутиральдегид

PLP - пиридоксальфосфат

АТаза - аминотрансфераза

ПАТаза - путресцин аминотрансфераза

ABADDHa3a - аминобутиральдегид дегидрогеназа

GABAATa3a - у-аминобутират трансаминаза

SDHa3a - сукцинат дегидрогеназа

IPTG - изопропил - p-D-тиогалактопиранозид

Мг-молекулярная масса

SDS - додедилсульфат натрия

АТР - аденозин 5'- трифосфат

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

EDTA - этилендиаминтетрауксусная кислота

PMSF - фенилметилсульфонилфторид

DTT - дитиотреитол (трео-2,3-дигидрокси-1,4-димеркаптобутан) dNTP - дизоксинуклеотид сАМР - циклоаденозинмонофосфат

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Полиамины присутствуют практически во всех видах биологических организмов, от бактерий и вирусов до человека, и участвуют в огромном количестве разнообразных биологических и биохимических реакций, включая синтез ДНК, РНК и белков [1-3]. Исследование клеток прокариот и эукариот показало, что в различных организмах функционируют не только одинаковые соединения полиаминов (чаще всего это путресцин, спермидин, спермин и, существенно реже, кадаверин), но также универсальны и многие этапы биосинтеза этих поликатионов [4,5]. Хотя не вызывает сомнений тот факт, что полиамины выполняют важные физиологические функции и совершенно необходимы для обеспечения нормального клеточного роста, показано, что избыточное накопление полиаминов в клетке ингибирует синтез белков, вызывает замедление роста, а в некоторых случаях приводит к гибели организма [6]. Ацетилирование полиаминов по так называемому ацетилазному пути деградации, помогает предотвратить эффект токсичности полиаминов как в про-, так и в эукариотах [4,7]. Образующиеся при этом ацетилпроизводные полиаминов далее окисляются полиаминоксидазами, деацетилируются, либо экскретируются из клетки [4,8]. У некоторых микроорганизмов охарактеризован также альтернативный аминотрансферазный путь деградации полиаминов.

Наиболее подробно изучен аминотрансферазный путь деградации путресцина в клетках Escherichia coli. Показано, что трансаминирование путресцина, катализируемое путресцин аминотрансферазой (КФ 2.6.1.29), и последующее декарбоксилирование образующегося аминобутиральдегида приводят к образованию у-аминобутирата (GABA), который в дальнейшем преобразуется в сукцинат, включаясь в цикл Кребса [9]. Совокупность реакций биосинтеза путресцина из аргинина и его деградации до сукцината образуют так называемый аргинин декарбоксилазный путь деградации аргинина (ADC) E.coli. Было показано, что все ферменты ADC пути, за исключением аргинин декарбоксилазы, индуцируются в условиях азотного голодания. Однако, несмотря на то, что ADC путь деградации E.coli достаточно хорошо охарактеризован как биохимически, так и генетически, еще не все гены этого пути картированы. Так до сих пор не были локализованы гены, кодирующие ключевые ферменты деградации путресцина -пиридоксальфосфат (PLP) - зависимую путресцин:а-кетоглутарат (а-КГ) аминотрансферазу (ПАТазу) и аминобутиральдегид дегидрогеназу (ABADDHa3y). Вследствие того, что уровень активности ПАТазы даже в индуцирующих условиях азотного голодания чрезвычайно низкий, изучение этого фермента до сих пор проводилось только в мутантных по утилизации полиаминов и GABA штаммах E.coli. Возможно, по этой причине в независимо выполненных работах Kim [10] и Prieto-Santos [11] приведены противоречивые биохимические характеристики частично очищенных препаратов ПАТаз.

В этой связи актуальной является задача идентификации гена E.coli, кодирующего ПАТазу, с использованием методов биоинформатики и генетической инженерии, выделение нативного фермента и изучение его свойств современными методами молекулярной биологии

ЦЕЛЬ И ЗАДА ЧИ РАБОТЫ

Целью представленной работы являлась идентификация гена E.coli, кодирующего ПАТазу, а также конструирование плазмид, обеспечивающих достаточно высокий уровень продукции этого фермента и определение основных физических и кинетических параметров очищенного препарата ПАТазы. В процессе работы были решены следующие задачи:

Идентификация гена, кодирующего ПАТазу, в хромосоме штамма E.coli К12 (ген ygjG)-,

Изучение Ntr-зависимой регуляции экспрессии генаygjG;

Конструирование экспрессионных плазмид, обеспечивающих эффективную продукцию ПАТазы как в виде слитого белка с his6-tag лидерным пептидом (Ht-YgjG), так и нативного белка (YgjG);

Разработка лабораторного метода выделение белка YgjG из растворимой фракции клеточных лизатов рекомбинантного штамма E.coli;

Исследование и сравнительная характеристика каталитических активностей и некоторых основных физических и кинетических параметров очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Впервые идентифицирован и клонирован ген (ygjG), кодирующий путресцин аминотрансферазу в клетках Escherichia coli К12. Изучена его структурная организация и выявлены регуляторные последовательности, обеспечивающие о54 -зависимую индукцию экспрессии ygjG в условиях азотного голодания.

Разработана методика получения высокоочшценного препарата каталитически активного белка YgjG из биомассы рекомбинантного штамма E.coli.

Показано, что фермент эффективно катализирует путресцин :а-КГ аминотрансферазную реакцию, а также может использовать кадаверин и, с меньшей эффективностью, спермидин в качестве доноров аминогрупп. Фермент термостабилен, активен в щелочном диапазоне значений рН и проявляет максимум активности при рН 9.0 и температуре 70 °С. Интересной особенностью фермента является его способность катализировать глутамат:пируват (GPT, КФ 2.6.1.2) аминотрансферазную реакцию. Ни одна из известных к настоящему времени полиамин аминотрансфераз не проявляет GPT активности. Субстратная специфичность и рН зависимость активности YgjG совпадают с параметрами ПАТ азы, выделенной Kim [10] из мутантного по утилизации путресцина штамма E.coli В6.

Сравнение свойств очищенных препаратов YgjG и Ht-YgjG, несущего дополнительную his6-tag лидерную последовательность на N-конце белка, показало, что данная модификация N-концевой последовательности влияет на субстратную специфичность и ферментативную активность препарата. Также, элиминация первых 30 аминокислот YgjG приводит к практически полной потере активности фермента.

Полученные в работе данные могут быть использованы для исследования полиамин аминотрансфераз других микроорганизмов и для дальнейшего изучения путей метаболизма полиаминов в E.coli.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Самсонова, Наталья Николаевна

выводы

1. Клонирован ген ygjG E.coli К12 MG1655 и показано, что аннотированная как орнитин аминотранефераза ORF ygjG кодирует ПАТазу - белок, обладающий путресцин:а-кетоглутарат аминотрансферазной активностью и эффективно катализирующий реакцию переаминирования кадаверина.

2. Показано, что а54 -зависимая экспрессия ygjG индуцируется в условиях азотного голодания. Определен старт транскрипции мРНК ygjG и стартовый кодон (UUG) трансляции YgjG.

3. Сконструированы рекомбинантные плазмиды, обеспечивающие эффективную продукцию YgjG как в виде слитого с his6-tag лидером полипептида (Ht-YgjG) так и в виде нативного белка. Разработан метод выделения и очистки нативного белка и получены высокоочищенные препараты YgjG и Ht-YgjG.

4. Исследованы субстратная специфичность обоих белков и их основные кинетические параметры в реакциях трансаминирования с использованием путресцина, кадаверина и спермидина в качестве доноров и а-кетоглутарата в качестве акцептора аминогрупп. Определены рН и температурная зависимости ферментативной активности ПАТазы YgjG.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Самсонова, Наталья Николаевна, 2004 год

1. Abraham КА: Studies on DNA-dependent RNA polymerase from Escherichia coli. 1. The mechanism of polyamine induced stimulation of enzyme activity.

2. Eur JBiochem 1968, 5: 143-146.

3. Frydman L, Rossomando PC, Frydman V, Fernandez CO, Frydman B, Samejima K; Interactions between natural polyamines and tRNA: an 15N NMR analysis. Proc Natl Acad Sci USA 1992,1: 9186-9190.

4. Igarashi K, Kashiwagi K: Polyamines: mysterious modulators of cellularfunctions. Biochem Biophys Res Commun 2000, 271: 559-564.

5. Pegg AE: Recent advances in the biochemistry of polyamines in eukaryotes.

6. Biochem J1986,234: 249-262.

7. Tabor CW, Tabor H: Polyamines in microorganisms. Microbiol Rev 1985, 49: 81-99.

8. He Y, Kashiwagi K, Fnkuchi J, Terao K, Shirahata A, Igarashi K: Correlation between the inhibition of cell growth by accumulated polyamines and the decrease of magnesium and ATP. Eur J Biochem 1993, 217: 89-96.

9. Matsui I, Kamei M, Otani S, Morisawa S, Pegg AE: Occurence and induction of spermidine iVl-acetyltransferase in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 1982, 106: 1155-1160.

10. Ignatenko NA, Fish JL, Shassetz DP, Woolridge DP, Gerner EW: Expression of the human spermidine/spermine iVl-acetyltransferase in spermidine acetylation-deficient Escherichia coli. Biochem J1996, 319: 435-440.

11. Snaibe E, Metzer E, Halpern YS: Metabolic pathway for the utilization of L-arginine, L-ornithine, agmathine, and putrescine as nitrogen sourses in

12. Escherichia coliK-12. JBacteriol 1985,163: 933-937.

13. Kim KH: Purification and properties of a diamine a-ketoglutarate transaminase from Escherichia coli. J Biol Chem 1964, 239: 783-786.

14. Prieto-Santos MI, Martin-Checa J, Balana-Force R, Garrido-Pertierra A: A pathway for putrescine catabolism in Escherichia coli. Biochim Biophys Acta 1986, 880: 242-244.

15. Tabor H, Tabor CW: Biosynthesis and metabolism of 1,4-diaminobutane, spermidine, spermine and related amines. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 1972, 36: 203-268.

16. Капо K, Oka T: Polyamine transport and metabolism in mouse mammary gland. General properties and hormonal regulation. J Biol Chem 1976, 10: 2795-2800.

17. Kakinuma Y, Hoshino K, Igarashi K: Characterization of the inducible polyamine transporter in bovine lymphocytes. Eur JBiochem 1988,15: 409414.

18. Tabor H, Hafner EW, Tabor CW.: Construction of an Escherichia coli strain unable to synthesize putrescine, spermidine, or cadaverine: characterization of two genes controlling lysine decarboxylase. JBacteriol 1980,144: 952-956.

19. Tabor H, Hafner EW, Tabor CW: Mutants of Escherichia coli that do not contain 1,4-diaminobutane (putrescine) or spermidine. J Biol Chern 1979, 254: 12419-12426.

20. Algranati ID, Echandi G, Goldemberg SH, Cunningham-Rundles S, Maas WK: Ribosomal distribution in a polyamine auxotroph of Escherichia coli. J

21. Bacteriol 1975,124: 1122-1127.

22. Algranati ID, Goldemberg SH: Initiation, elongation and termination of polypeptide synthesis in cell-free systems from polyamine-deficient bacteria.

23. Biochem Biophys Res Commun 1981,103: 8-15.

24. Goldemberg SH, Fernandez-Velasсо JG, Algranati ID: Differential binding of streptomycin to ribosomes of polyamine-deficient bacteria grown in the absence and presence of putrescine. FEBSLet 1982,142: 275-279.

25. Goldemberg SH, Algranati ID: Polyamine requirement for streptomycin action on protein synthesis in bacteria. Eur J Biochem 1981,117: 251-255.

26. Mitsui K, Igarashi K, Kakegawa T, Hirose S: Preferential stimulation of the in vivo synthesis of a protein by polyamines in Escherichia coli'. purification and properties of the specific protein. Biochemistry 1984, 23: 2679-2683.

27. Mitsui K, Ohnishi R, Hirose S, Igarashi K: Necessity of polyamines for maximum in vivo synthesis of beta beta' subunits of RNA polymerase.

28. Biochem Biophys Res Commun 1984,123: 528-534.

29. Raina A, Janne J: Polyamines as cellular regulators. Med Biol 1981, 59: 461.

30. Sakai TT, Cohen SS: Effects of polyamines on the structure and reactivity of tRNA. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1976,17: 15-42.

31. Abraham AK: Effect of polyamines on the fidelity of macromolecular synthesis. Med Biol 1981, 59: 368-373.

32. Geiger LE, Morris DR: Stimulation of deoxyribonucleic acid replication fork movement by spermidine analogs in polyamine-deficient Escherichia coli. J

33. Bacteriol 1980,141: 1192-8-1198.

34. Jorstad CM, Harada JJ, Morris DR: Structural specificity of the spermidine requirement of an Escherichia coli auxotroph. J Вacteriol 1980,141: 456-463.

35. Gorini L: The contrasting role of strA and ram gene products in ribosomal functioning. Quant Biol. 101-109.

36. Schiller D, Kruse D, Kneifel H, Kramer R, Burkovski A.: Polyamine transport and role of potE in response to osmotic stress in Escherichia coli. JBacteriol 2000,182: 6247-6249.

37. Bachrach U, Persky S, Razin S: Metabolism of amines. Biochem J1960, 76: 306310.

38. Tabor H, Tabor CW: Formation of 1,4-diaminobutane and of spermidine by an ornithine auxotroph of Escherichia coli grown on limiting ornithine or arginine. J Biol Chem 1963, 244: 2286-2292.

39. Goldemberg SH: Lysine decarboxylase mutants of Escherichia coli: evidence for two enzyme forms. J Bacteriol 1980,141: 1428-1431.

40. Dover S, Halpern YS: Utilization of y-aminobutyric acid as the sole carbon and nitrogen source by Escherichia coli K-12 mutants. J Bacteriol 1972,109: 835-843.

41. Tkachenko AG, Salakhetdinova Ola, Pshenichnov MR: Role of putrescine and potassium transport in the adaptation of Escherichia coli to ammonium starvation. Mikrobiologiia 1996, 65: 740-744.

42. Balke VL, Gralla JD: Changes in the linking number of supercoiled DNA accompany growth transitions in Escherichia coli. J Bacteriol 1987,169: 44994506.

43. Tkachenko AG, Pshenichnov MR, Nesterova Liu: Putrescine as an oxidative stress protecting factor in Escherichia coli. Mikrobiologiia 2001, 70: 487-494.

44. Tkachenko AG, Nesterova Liu: The role of putrescine in of oxidative stress defense genes expression regulation in Escherichia coli. Mikrobiologiia 2001, 70: 168-173.

45. Ha HC, Yager JD, Woster PA, Casero RA Jr: Structural specificity of polyamines and polyamine analogues in the protection of DNA from strand breaks induced by reactive oxygen species. Biochem Biophys Res Commun 1998, 244: 298-303.

46. Lin J, Smith MP, Chapin КС, Baik HS, Bennett GN, Foster JW: Mechanisms of acid resistance in enterohemorrhagic Escherichia coli. Appl Environ Microbiol 1996, 62: 3094-3100.

47. Blankenhorn D, Phillips J, Slonczewski JL: Acid- and base-induced proteins during aerobic and anaerobic growth of Escherichia coli revealed by two-dimensional gel electrophoresis. J Bacterial 1999,181: 2209-2216.

48. Stancik LM, Stancik DM, Schmidt B, Barnhart DM, Yoncheva YN, Slonczewski JL: pH-dependent expression of periplasmic proteins and amino acid catabolism in Escherichia coli. J Вacteriol 2002,184: 4246-4258.

49. Zilberstein D, Agmon V, Schuldiner S, Padan E: Escherichia coli intracellular pH, membrane potential, and cell growth. J В acteriol 1984,158: 246-252.

50. Booth IR: Regulation of cytoplasmic pH in bacteria. Microbiol Rev 1985, 49: 359-378.

51. Tkachenko AG, Chudinov AA, Nagorskikh TG: Role of the energy status and putrescine transport in the maintenance of the intracellular pH homeostasis in the course of alkaline and acidic shifts in Escherichia coli. Mikrobiologiia 1993, 62: 37-45.

52. Meng SY, Bennett GN: Regulation of the Escherichia coli cad operon: location of a site required for acid induction. J В acteriol 1992,174: 2670-2678.

53. Samartzidou H, Delcour AH.: Excretion of endogenous cadaverine leads to a decrease in porin-mediated outer membrane permeability. JBacteriol 1999, 181: 791-798.

54. Samartzidou H, Delcour AH: Distinct sensitivities of OmpF and PhoE porins to charged modulators. FEBS Lett 1999, 444: 65-70.

55. Glansdorff N: Biosynthesis of arginine and polyamines. In Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Edited by Neidhardt FC, Curtiss R, Ingraham JL, Lin EC, Low KB, Magasanik В et al. Washington, DC: ASM Press; 1996.

56. Morris DR, Boeker EA: Biosynthetic and biodegradative ornithine and arginine decarboxylases from Escherichia coli. Methods Enzymol 1983, 94: 134.

57. Davis RH, Morris DR, Coffino P: Sequestered end products and enzyme regulation: the case of ornithine decarboxylase. Microbiol Rev 1992, 56: 280290.

58. Blethen SL, Boeker EA, Snell EE: Arginine decarboxylase from Escherichia coli. I. Purification and specificity for substrates and coenzyme. J Biol Chem 1968, 243: 1671-1677.

59. Nowak S, Boeker EA: The inducible arginine decarboxylase of Escherichia coli B: activity of the dimer and the decamer. Arch Biochem Biophys 2003, 207: 110-116.

60. Morris DR, Fillingame RH: Regulation of amino acid decarboxylation. Anna Rev Biochem 1974, 43: 303-325.

61. Boeker EA, Fischer EH, Snell EE: Arginine decarboxylase from Escherichia coli. 3. Subunit structure. J Biol Chem 1969, 244: 5239-5245.

62. Boyle SM, Markham GD, Hafner EW, Wright JM, Tabor H, Tabor CW: Expression of the cloned genes encoding the putrescine biosynthetic enzymes and methionine adenosyltransferase of Escherichia coli (speA, speB, speC and metK). Gene 1984, 30: 129-136.

63. Wu WH, Morris DR: Biosynthetic arginine decarboxylase from Escherichia coli. Purification and properties. J Biol Chem 2003, 248: 1687-1695.

64. Wu WH, Morris DR: Biosynthetic arginine decarboxylase from Escherichia coli. Subunit interactions and the role of magnesium ion. J Biol Chem 1973, 248: 1696-1699.

65. Morris DR, Jorstad CM: Growth and macromolecular composition of a mutant of Escherichia coli during polyamine limitation. JBacteriol 1973,113: 271277.

66. Satishchandran C, Boyle SM: Purification and properties of agmatine ureohydrolyase, a putrescine biosynthetic enzyme in Escherichia coli. J

67. Bacteriol 1986,165: 843-848.

68. Morris DR, Koffron KL: Urea production and putrescine biosynthesis by Escherichia coli. J Bacteriol 1967, 94: 1516-1519.

69. Tabor CW, Tabor H: Methionine adenosyltransferase (S-adenosylmethionine synthetase) and S-adenosylmethionine decarboxylase. Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol 1984, 56: 282.

70. Tabor CW, Tabor H: Putrescine aminopropyltransferase (Escherichia coli).

71. Methods Enzymol 1983, 94: 265-270.

72. Sabo DL, Boeker EA, Byers B, Waron H, Fischer EH: Purification and physical properties of inducible Escherichia coli lysine decarboxylase. Biochemistry 1974,13: 662-670.

73. Igarashi K, Kashiwagi K, Hamasaki H, Miura A, Kakegawa T, Hirose S et al.: Formation of a compensatory polyamine by Escherichia coli polyamine-requiring mutants during growth in the absence of polyamines. J Bacteriol 1986,166: 128-134.

74. Dubin DT, Rosenthal SM: 1960. The acetylation of polyamines in E.coli. J Biol Chem 1960, 235: 776-782.

75. Tabor CW, Dobbs LG: Metabolism of 1,4-diaminobutane and spermidine in Escherichia coli: the effects of low temperature during storage and harvesting of cultures. J Biol Chem 2003, 245: 2086-2091.

76. Kashiwagi K, Hosokawa N, Furuchi T, Kobayashi H, Sasakawa C, Yoshikawa M et ah: Isolation of polyamine transport-deficient mutants of Escherichia coli and cloning of the genes for polyamine transport proteins. J Biol Chem 1990, 165: 20893-20897.

77. Matsui I, Kamei M, Otani S, Morisawa S, Pegg AE; Occurrence and induction of spermidine-Nl-acetyltransferase in Escherichia coli. Biochem Biophys Res Commun 1982, 106: 1155-1160.

78. Fukuchi J, Kashiwagi K, Takio K, Igarashi K: Properties and structure of spermidine acetyltransferase in Escherichia coli. J Biol Chem 1994, 269: 22581-22585.

79. Kwon DS, Lin CH, Chen S, Coward JK, Walsh CT, Bollinger JM Jr: Dissection of glutathionylspermidine synthetase/amidase from Escherichia coli into autonomously folding and functional synthetase and amidase domains. J Biol Chem 1997, 272: 2429-2436.

80. Smith K, Borges A, Ariyanayagam MR, Fairlamb AH: Glutathionylspermidine metabolism in Escherichia coli. Biochem J1995, 312: 465-469.

81. Dover S, Halpern YS: Utilization of y-aminobutyric acid as the sole carbon and nitrogen source by Escherichia coli K-12 mutants. J Вacteriol 1972,109: 835-843.

82. Michaels R, Kim KH: Comparative studies of putrescine degradation by microorganisms. Biochim Biophys Acta 1966,115: 59-64.

83. Friedrich B, Magasanik B: Enzymes of agmatine degradation and the control of their synthesis in Klebsiella aerogenes. JBacteriol 1979,137: 1127-1133.

84. Yonaha K, Suzuki K, Minei H, Toyama S: Distribution of «-amino acid: pyruvate transaminase and aminobutyrate: a-ketoglutarate transaminase in microorganisms. Agric Biol Chem 1983, 47: 2257-2265.

85. Lu CD, Itoh Y, Nakada Y, Jiang Y: Functional analysis and regulation of the divergent spuABCDEFGH-spul operons for polyamine uptake and utilization in Pseudomonas aeruginosa PAOl. J В acteriol 2002,184: 3765-3773.

86. Yorifuji T, Kondo S, Shimizu E, Naka T, Ishihara T: Purification and characterization of polyamine aminotransferase of Arthrobacter sp. TMP-1. J

87. Biochem (Tokyo) 1997,122(3):537-43.

88. Prieto MI, Martin J, Balana-Fouce R., Garrido-Pertierra A.: Properties of y-aminobutyraldehyde dehydrogenase from Escherichia coli. Biochimie 1987, 69: 1161-1168.

89. Cooper RA, Skinner MA: Catabolism of 3- and 4-hydroxyphenylacetate by the 3,4-dihydroxyphenylacetate pathway in Escherichia coli. J В acteriol 1980, 143: 302-306.

90. Metzer E, Levitz R, Halpern YS: Isolation and properties of Escherichia coli К-12 mutants impaired in the utilization of gamma-aminobutyrate. JBacteriol 1979,137: 1111-1118.

91. Donnelly MI, Cooper RA: Succinic semialdehyde dehydrogenases of Escherichia coli'. their role in the degradation of hydroxyphenylacetate and gamma-aminobutyrate. Eur J В iochem 1981,113: 555-561.

92. Bacteriol 1990,172: 7035-7042.

93. Niegemann E, Scliulz A, Bartsch K: Molecular organization of the Escherichia coli gab cluster: nucleotide sequence of the structural genes gabD and gabP and expression of the GABA permease gene.Arch Microbiol 1993,160: 454460.

94. Schneider BL, Ruback S, Kiupakis AK, Kasbarian H, Pybus C, Reitzer L: The Escherichia coli gabDTPC operon: specific gamma-aminobutyrate catabolism and nonspecific induction. J Bacteriol 2002, 184: 6976-6986.

95. Snaibe E, Metzer E, Halpern YS: Control of utilization of L-arginine, L-ornithine, agmathine, and putrescine as nitrogen sources in Escherichia coli K-12. J Bacteriol 1985,163: 938-942.

96. Zimmer DP, Soupene E, Lee HL, Wendisch VF, Khodursky AB, Peter В J et al.: Nitrogen regulatory protein C-controlled genes of Escherichia coli: scavenging as a defense against nitrogen limitation. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97: 14674-14679.

97. Zaboura M, Halpern YS: Regulation of gamma-aminobutyric acid degradation in Escherichia coli by nitrogen metabolism enzymes. J Bacteriol 1978,133: 447-451.

98. Ullman A, Danchin A: Role of cyclic AMP in bacteria. Adv Cycl Nucl Rec 1983, 15: 1-53.

99. McFall E, Newman EB: Amino acids as carbon sources. In Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Edited by Lin EC, Low KB, Magasanik B, Reznikoff WS, Riley M, Schaechter M et al. Washington, D. C.: ASM Press; 1996.

100. Large PJ: Enzymes and pathways of polyamine breakdown in microorganisms. FEMS Microbiol Rev 1992, 88: 249-262.

101. Kashiwagi K, Igarashi K: Adjustment of polyamine contents in Escherichia coli. J Bacteriol 1988,170: 3131-3135.

102. Kashiwagi K, Hosokawa N, Furuchi T, Kobayashi H, Sasakawa C, Yoshikawa M et al.: Isolation of polyamine transport-deficient mutants of Escherichia coli and cloning of the genes for polyamine transport proteins. J Biol Chem 1990, 265: 20893-20897.

103. Pistocchi R, Kashiwagi K, Miyamoto S, Nukui E, Sadakata Y, Kobayashi H et al.: Characteristics of the operon for a putrescine transport system that maps at 19 minutes on the Escherichia coli chromosome. J Biol Chem 1993, 268: 146152.

104. Furuchi T, Kashiwagi K, Kobayashi H, Igarashi K: Characteristics of the gene for a spermidine and putrescine transport system that maps at 15 min on the

105. Escherichia coli chromosome. J Biol Chem 1992, 266: 20928-20933.

106. Igarashi K, Kashiwagi K: Polyamine transport in bacteria and yeast. Biochem J 1999, 344: 633-642.

107. Kashiwagi K, Miyamoto S, Suzuki F, Kobayashi H, Igarashi K: Excretion of putrescine by the putrescine-ornithine antiporter encoded by thepotE gene of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 1992, 89: 4529-4533.

108. Kashiwagi K, Suzuki T, Suzuki F, Furuchi T, Kobayashi H, Igarashi K: Coexistence of the genes for putrescine transport protein and ornithine decarboxylase at 16 min on Escherichia coli chromosome. J Biol Chem 2003, 266: 20922-20927.

109. Vassylyev DG, Tomitori H, Kashiwagi K, Morikawa K, Igarashi K: Crystal structure and mutational analysis of the Escherichia coli putrescine receptor. Structural basis for substrate specificity. J Biol Chem 1998, 273: 17604-17609.

110. Kashiwagi K, Kuraishi A, Tomitori H, Igarashi A, Nishimura K, Shirahata A et al.: Identification of the putrescine recognition site on polyamine transport protein PotE. J Biol Chem 2000,275: 36007-36012.

111. Meng SY, Bennett GN: Regulation of the Escherichia coli cad operon: location of a site required for acid induction. J Bacteriol 1992,174: 2670-2678.

112. Gong S, Richard H, Foster JW: YjdE (AdiC) is the arginine:agmatine antiporter essential for arginine-dependent acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol 2003,185: 4402-4409.

113. Iyer R, Williams C, Miller C: Arginine-agmatine antiporter in extreme acid resistance in Escherichia coli. J Bacteriol 2003,185: 6556-6561.

114. Molenaar D, Bosscher JS, ten Brink B, Driessen AJ, Konings W: Generation of a proton motive force by histidine decarboxylation and electrogenic histidine/histamine antiport in Lactobacillus buchneri. J Bacteriol 1993,175: 2864-2870.

115. Meng SY, Bennett GN: Nucleotide sequence of the Escherichia coli cad operon: a system for neutralization of low extracellular pH. J Bacteriol 1992, 174: 2659-2669.

116. Takayama M, Ohyama T, Igarashi K, Kobayashi H: Escherichia coli cad operon functions as a supplier of carbon dioxide. Mol Microbiol 1994,11: 913-918.

117. Reitzer LJ: Sources of nitrogen and their utilization. In Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology . Edited by Lin EC, Low KB, Magasanik B, Reznikoff WS, Riley M, Schaechter M et al. Washington, D.C.: ASM Press; 1996.

118. Magasanik В: Regulation of nitrogen utilization. In Escherichia coli and Salmonella: cellular and molecular biology. Edited by Lin EC, Low KB, Magasanik B, Reznikoff WS, Riley M, Schaechter M et al. Washington, D.C.: ASM Press; 1996:1344-1356.

119. Reitzer L, Schneider BL: Metabolic context and possible phisiological thermesof c54-dependent genes in Escherichia coli. Microbiology and molecular biology reviews 2001, 65: 422-444.

120. Meers JL, Tempest DW, Brown CM: Glutamine(amide):2-oxogIutarate amino transferase oxido-reductase (NADP); an enzyme involved in the synthesis of glutamate by some bacteria. J Gen Microbiol 1970, 64: 187-194.

121. Jiang P, Peliska JA, Ninfa AJ: The regulation of Escherichia coli glutamine synthetase revisited: role of a-ketoglutarate in the regulation of glutamine synthetase adenylylation state. Biochemistry 1998, 37: 12802-12810.

122. Rustu S, Hirschman J, Burton D, Jelesko J, Meeks JC: Covalent modification of bacterial glutamine synthetase: physiological significance. Mol Gen Genet 1984, 197: 309-317.

123. Adler SP, Punch D, Stadtman ER: Cascade control of Escherichia coli glutamine synthetase. Properties of the PII regulatory protein and the uridylyltransferase-uridylyl-removing enzyme. J Biol Chem 1975, 250: 62646272.

124. Jiang P, Peliska JA, Ninfa AJ.: Reconstitution of the signal-transduction bicyclic cascade responsible for the regulation of Ntr gene transcription in

125. Escherichia coli. Biochemistry 1998, 37: 12795-12801.

126. Microbiol 1996, 21: 133-146.

127. Atkinson MR, Ninfa AJ: Characterization of the GlnK protein of Escherichia coli. Mol Microbiol 1999, 32: 301-313.

128. Atkinson MR, Blauwkamp ТА, Bondarenko V, Studitsky V, Ninfa AJ: Activation of the glnA, glnK, and nac promoters as Escherichia coli undergoes the transition from nitrogen excess growth to nitrogen starvation. J В acteriol 2002,184: 5358-5363.

129. Blauwkamp ТА, Ninfa AJ: Physiological role of the GlnK signal transduction protein of Escherichia coli: survival of nitrogen starvation. Mol Microbiol 2002, 46: 203-214.

130. Soupene E, Lee H, Kustu S: Ammonium/methylammonium transport (Amt) proteins facilitate diffusion of NH3 bidirectionally. Proc Natl Acad Sci USA 2002, 99: 3926-3931.

131. Blauwkamp ТА, Ninfa AJ: Antagonism of PII signalling by the AmtB protein of Escherichia coli. Mol Microbiol 2003, 48: 1017-1028.

132. Coutts G, Thomas G, Blakey D, Merrick M. Membrane sequestration of the signal transduction protein GlnK by the ammonium transporter AmtB.1. EMBO J 21, 536-545. 2002.

133. Buck M, Gallegos M-T, Studholme DJ, Guo Y, Gralla JD: The bacterial enhancer-dependent o54 (oN) transcription factor. JBacteriol 2000,182: 41294136.

134. Wang YP, Kolb A, Buck M, Wen J, O'Gara F, Buc H: CRP interacts with promoter-bound sigma54 RNA polymerase and blocks transcriptional activation of the dctA promoter. EMBOJ1998,17: 786-796.

135. Popham DL, Szeto D, Keener J, Kustu S: Function of a bacterial activator protein that binds to transcriptional enhancers. Science 1989, 243: 629-635.

136. Wang L, Gralla JD: Multiple in vivo roles for the -12-region elements of o54promoters. J Bacteriol 1998,180: 5626-5631.

137. Guo Y, Gralla JD: Promoter opening via a DNA fork junction binding activity.

138. Proc Natl Acad Sci USA 1998, 95: 11655-11660.

139. Barrios H, Valderrama B, Morett E: Compilation and analysis of sigma(54)-dependent promoter sequences. Nucleic Acids Res 1999, 27: 4305-4313.

140. John RA: Pyridoxal phosphate-dependent enzymes. Biochim Biophys Acta 1995,1248: 81-96.

141. Alexander FW, Sandmeier E, Mehta PK, Christen P: Evolutionary relationships among pyridoxal-5'-phosphate-dependent enzymes. Regio-specific alpha, beta and gamma families. Eur J Biochem 1994, 219: 953-960.

142. Gribskov M, McLachlan AD, Eisenberg D: Profile analysis: detection of distantly related proteins. Proc Natl Acad Sci USA 1987, 84: 4355-4358.

143. Mehta PK, Hale TI, Christen P: Aminotransferases: demonstration of homology and division into evolutionary subgroups. Eur J Biochem 1993, 214: 549-561.

144. Luthy R, Xenarios I, Bucher P: Improving the sensitivity of the sequence profile method. Protein Sci 1994, 3: 139-146.

145. Ovchinnikov YA, Egorov CA, Aldanova NA, Feigina MY, Lipkin VM, Abdulaev NG et al.: The complete amino acid sequence of cytoplasmic aspartate aminotransferase from pig heart. FEBS Lett 1973, 29: 31-34.

146. Kirsch JF, Eichele G, Ford GC, Vincent MG, Jansonius JN, Gehring H et al.: Mechanism of action of aspartate aminotransferase proposed on the basis of its spatial structure. JMolBiol 1984,174: 497-525.

147. McPhalen CA, Vincent MG, Picot D, Jansonius JN, Lesk AM, Chothia C: Domain closure in mitochondrial aspartate aminotransferase. J Mol Biol 1992, 227: 197-213.

148. Shen BW, Hennig M, Hohenester E, Jansonius JN, Schirmer T: Crystal structure of human recombinant ornithine aminotransferase. J Mol Biol 1998,227: 81102.

149. Gallagher T, Snell EE, Hackert ML: Pyruvoyl-dependent histidine decarboxylase. Active site structure and mechanistic analysis. J Biol Chem 1989, 264:12737-12743.

150. Ziak M, Jager J, Malashkevich VN, Gehring H, Jaussi R, Jansonius JN et al.: Mutant aspartate aminotransferase (K258H) without pyridoxal-5'-phosphate-binding lysine residue. Structural and catalytic properties. Eur J Biochem 1993, 211: 475-484.

151. Ziak M, Jaussi R, Gehring H, Christen P: Aspartate aminotransferase with the pyridoxal-5'-phosphate-binding lysine residue replaced by histidine retains partial catalytic competence. Eur J Biochem 1990,187: 329-333.

152. Jansonius JN, Eichele G, Ford GC, Kirsch JF, Picot D, Thaller С et al.: Crystallographic studies on the mechanism of action of mitochondrial aspartate aminotransferase. Prog Clin Biol Res 1984,144: 195-203.

153. Picot D, Sandmeier E, Thaller C, Vincent MG, Christen P, Jansonius JN: The open/closed conformational equilibrium of aspartate aminotransferase. Studies in the crystalline state and with a fluorescent probe in solution. Eur J

154. Biochem 1991,196: 329-341.

155. Cronin CN, Kirsch JF: Role of arginine-292 in the substrate specificity of aspartate aminotransferase as examined by site-directed mutagenesis.

156. Biochemistry 1988, 27: 4572-4579.

157. Inoue Y, Kuramitsu S, Inoue K, Kagamiyama H, Hiromi K, Tanase S et al.: Substitution of a lysine residue for arginine 386 of Escherichia coli aspartate aminotransferase. J Biol Chem 1989, 264: 9673-9681.

158. Danishefsky AT, Onnufer JJ, Petsko GA, Ringe D: Activity and structure of the active-site mutants R386Y and R386F of Escherichia coli aspartate aminotransferase. Biochemistry 1991, 30: 1980-1985.

159. Hyde CC, Ahmed SA, Padlan EA, Miles EW, Davies DR: Three-dimensional structure of the tryptophan synthase alpha 2 beta 2 multienzyme complex from Salmonella typhimurium. J Biol Chem 1988, 263: 17857-17871.

160. Pan P, Jaussi R, Gehring H, Giannattasio S, Christen P: Shift in pH-rate profile and enhanced discrimination between dicarboxylic and aromatic substrates in mitochondrial aspartate aminotransferase Y70H. Biochemistry 1994, 33: 2757-2760.

161. Hayashi H, Kuramitsu S, Inoue Y, Morino Y, Kagamiyama H: Arg292—ValJ or [Arg292—Leu. mutation enhances the reactivity of Escherichia coli aspartate aminotransferase with aromatic amino acids. Biochem Biophys Res Commun 1989, 159: 337-342.

162. Pan P, Jakob CA, Sandmeier E, Christen P, Gehring H: Modulation of the activity of mitochondrial aspartate aminotransferase H352C by the redoxstate of the engineered interdomain disulfide bond. J Biol Chem 1994, 269: 25432-25436.

163. Guyer MS, Reed RR, Steitz JA, Low KB: Identification of a sex-factor-affinity site in E. coli as gamma delta. Cold Spring Harb Symp Quant Biol 1981, 45: 135-140.

164. Maniatis T, Fritsch E, Sambrook T: Molecular cloning. Cold Spring Harbor Laboratory; 1982.

165. Studier FM, Rosenberg AH, Dunn JJ, Dubendorff JM: Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned gene. Meth Enzymol 1990,185: 6089.

166. Datsenko KA, Wanner BL: One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proc Natl Acad Sci USA 2000,97: 6640-6645.

167. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T: Moleccular cloning: a laboratory manual., 2nd ed. edn. Cold Spring Harbor, N.Y.; 1989.

168. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR: DNA sequencing with chain-terminatinginhibitors. Proc Natl Acad Sci USA 1977, 74: 5463-5467.

169. Groisman EA, Casadaban MJ: Mini-mu bacteriophage with plasmid replicons for in vivo cloning and lac gene fusing. J Bacteriol 1986, 168: 357-364.

170. Ptitsyn LR, Fatova MA, Stepanov Al: Expression of the bioluminescence system of Photobacterium leiognathi in E. coli. Mol Gen Mikrobiol Virusol Russian 1990,16: 26-29.

171. Laemmli UK: Cleavage of structural proteins during the assemblay of the head of bacteriophage T4. Nature Landon 1970, 227: 680-685.

172. Bradford MM: A rapid and sensitive method of for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.

173. Anal Biochem 1976, 72: 248-254.

174. Miller J: Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor, N. Y: 1972.

175. Brenner M, Niederwieser A, Pataki G: Thin layer chromatography. Aminoacids and derivatives. In Laboratory handbook (E.StahlrEds.). New York: Springer-Verlag; 1969:730-786.

176. SamsonovaN.N., Smirnov S.V., Altman I.B., Ptitsyn L.R.: Molecular cloning and characterization of Escherichia coli K12 ygjG gene. BMC Microbiol 2003, 3:2.

177. Jakoby WB, Fredericks J: Pyrrolidine and putrescine metabolism: j-aminobutyraldehyde dehydrogenase. J Biol Chem 1959, 234: 2145-2150.

178. Madduri К, Stuttard С, Vining LC: Lysine catabolism in Streptomyces spp: is primarily through cadaverine: beta-lactam producers also make alpha-aminoadipate. J Bacteriol 1989,171: 302.

179. Cornish-Bowden A.: Principles of enzyme kinetics. In Lecturer in biochemistry, University of Birmingham. Edited by Phil D. Sydney-Willington-Durban-Toronto: Butterworths.; 1979.

180. Blattner F.R., Plunkett III G., Bloch C.A., Perna Т., Burland V., Riley M. et at.: The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 1997, 277: 1453-1474.

181. Marquardt DW. An algorithm for list squares estimation of parameters. J Soc Ind Appl Math 11, 431-441.1963.

182. Edwards JS, Pals son BO: The Escherichia coli MG1655 in silico metabolic genotype: its definition, characteristics, and capabilities. Proc Natl Acad Sci USA 2000, 97: 5528-5533.

183. Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW, Lipman DJ: Basic local alignment search tool.JMolBiol 1990, 215: 403-410.

184. Riley M., Serres M.H. : Interim report on genomics of Escherichia coli. Annu Rev Microbiol 2000, 54: 341-411.

185. Parsons GD, Donly ВС, Mackie GA: Mutations in the leader sequence and initiation codon of the gene for ribosomal protein S20 (rpsT) affect both translational efficiency and autoregulation. J Bacteriol 1988,170: 2485-2492.

186. Makrides SC: Strategies for achievning high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol Rev 1996, 60: 512-538.

187. Studier FW, Moffatt BA: Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes .JMolBiol 1986,189: 113-130.

188. Wang MD, Buckley L, Berg CM: Cloning of genes that suppress an Escherichia coli K-12 alanine auxotroph when present in multicopy plasmids.

189. J Bacteriol 1987,169: 5610-5614.