Конструирование эндонуклеаз рестрикции с фоторегулируемой активностью тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Ле Тхи Хиен

• Ле Тхи Хиен
• кандидат химических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат химических наук Ле Тхи Хиен

Условные сокращения

Введение

Глава 1. Регулирование активности белков под действием света 9 (Обзор литературы)

1.1. Подходы к управлению активностью белков при облучении светом

1.1.1. Необратимая фотоактивация белков

1.1.2. Обратимое фоторегулирование белков

1.2. Методы введения остатка азобензола в состав пептидов и белков

1.2.1. Химическая модификация пептидов и белков

1.2.1.1. Синтез симметричных реакционноспособных производных азобензола

1.2.1.2. Синтез асимметричных реакционноспособных производных 22 азобензола

1.2.2. Введение азобензольного остатка в состав пептида в процессе пептидного 24 синтеза

1.2.3. Введение азобензольного остатка в состав белка в процессе трансляции 26 in vitro

1.2.4. Введение азобензольного остатка в состав белка в процессе трансляции 27 in vivo

1.3. Регулирование активности белков при облучении светом различной длины 28 волны

1.3.1. Фоторегулирование активности белков путем их модификации 29 производными азобензола

1.3.1.1. Метод «молекулярной пружины»

1.3.1.2. Влияние облучения на формирование р -шпильки в пептиде

1.3.1.3. Связывание ДНК с пептидом, содержащим мотив «цинковый палец»

1.3.1.4. Связывание активатора транскрипции САР с 3',5'-аденозин- 36 циклофосфатом

1.3.1.5. Эндонуклеаза рестрикции BamHI

1.3.1.6. Неспецифическое воздействие на различные области в структуре 37 белковой глобулы

1.3.2. Косвенное регулирование активности белков под действием света 38 различной длины волны

1.3.2.1. Фоторегулируемые ингибиторы

1.3.2.2. Фоторегулируемые субстраты ферментов

1.3.2.3. Расщепление РНК рибонуклеазой Н с использованием ДНК, 44 содержащей остаток азобензола

1.3.2.4. Взаимодействие антигена, содержащего азобензол, с антителом

1.3.3. Фоторегулирование активности белков путем их модификации 46 производными азобензола, содержащими лиганд для связывания с данным белком

1.3.3.1. Фоторегулирование калиевого канала

1.3.3.2. Фоторегулирование активности карбоангидразы

1.3.3.3. Фоторегулирование глутаматного рецептора

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование эндонуклеаз рестрикции с фоторегулируемой активностью»

Человеческий геном включает около 30000 различных генов. Нуклеотидные замены в геноме могут привести к различным болезням. Коррекция мутаций эффективно возвращает фенотип болезни в первоначальную форму. Одна из самых многообещающих стратегий исправления мутаций основана на гомологичной рекомбинации. Главная проблема при исправлении нарушений генома путем замены дефектного участка генов заключается в том, чтобы стимулировать рекомбинацию, так как ее эффективность очень низка. Известно, что гидролиз целевой нуклеотидной последовательности приводит к появлению концов ДНК, склонных к рекомбинации, последовательно увеличивая частоту гомологичной рекомбинации в десятки тысяч раз.

В «хирургии» генома в качестве молекулярных инструментов для расщепления ДНК вблизи дефектного гена находят применение различные ферменты, в том числе эндонуклеазы рестрикции (ЭР), нуклеазы, содержащие структурный модуль «цинковые пальцы», и эндонуклеазы генной конверсии. Специфическое расщепление ДНК в нужном участке является ключевым требованием этого метода. Для точечного гидролиза ДНК в геноме человека, содержащем приблизительно 3 миллиарда пар нуклеотидов, используют мегануклеазы - сиквенс-специфические эндонуклеазы с протяженным участком узнавания. Однако в процессе поиска целевого субстрата ферменты, направлено гидролизующие ДНК, могут проявлять неспецифическую активность. Поэтому актуальной задачей является регулирование их действия. Процесс нежелательного расщепления ДНК можно попытаться минимизировать, «включая» и «выключая» активность фермента в определенные моменты времени посредством внешних воздействий, таких как свет.

Свет обладает неоспоримыми преимуществами перед другими источниками внешних воздействий. Свет может с высокой эффективностью мгновенно оказывать влияние только на целевой объект в клетке, вызывая минимальные разрушения клеточных органелл.

Цель работы заключалась в модификации мутантных форм эндонуклеаз рестрикции SsoII и PvuII производными азобензола для конструирования ферментов с фоторегулируемой активностью.

При конструировании фоторегулируемого белка требуется, прежде всего, селективно присоединить к нему светочувствительные соединения. Для управления активностью белков посредством света все большее применение находят 7 фотопереключатели» - производные азобензола [1-4]. Цис-транс-томерпзацт азобензола протекает быстро под действием света с длиной волны более 300 нм и, следовательно, позволяет активировать/инактивировать белки in vivo. На сегодняшний день сконструировано лишь небольшое количество модифицированных белков, функционирование которых можно изменять под действием света, и не существует общей стратегии, позволяющей эффективно регулировать активность различных классов белков. В настоящем исследовании в качестве объектов для разработки подходов к регулированию ферментативной активности использованы гомодимерные эндонуклеазы рестрикции Н-го типа SsoII (R.SsoII) и PvuII (R.PvuII).

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.

1. На основании данных рентгеноструктурного анализа выбрать аминокислотные остатки в R.SsoII для их замены на цистеин для последующей модификации производными азобензола.

2. Получить мутантные формы R.SsoII, содержащие остаток (остатки) цистеина в выбранной позиции.

3. Синтезировать производные азобензола, подтвердить их структуру, исследовать их химические и оптические свойства.

4. Модифицировать мутантные формы R.SsoII производными азобензола.

5. Исследовать гидролитическую активность набора мутантных форм R.SsoII, модифицированных производными азобензола, при облучении светом определенной длины волны.

6. Сравнить эффективность и возможность применения метода «молекулярных ворот», разработанного для R.SsoII, и метода «молекулярной пружины», предложенного для R.PvuII, для фоторегулирования активности белков.

В представленной работе предложены и разработаны два подхода к регулированию активности эндонуклеаз рестрикции П-го типа при облучении светом определенной длины волны: метод «молекулярных ворот» на примере R.SsoII и метод «молекулярной пружины», примененный для R.PvuII.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Ле Тхи Хиен

выводы

1. Разработан метод регулирования активности гомодимерной эндонуклеазы рестрикции П-го типа SsoII, основанный на модификации белка производными азобензола, — метод «молекулярных ворот».

2. Для реализации метода «молекулярных ворот» предложены новые методики синтеза разнообразных асимметричных производных азобензола, содержащих малеимидную группировку в одном из бензольных ядер для модификации цистеина белка, в другом - гидроксильную, амино-, одну или две карбоксильные группы, остаток цистеина, а также олигонуклеотиды.

3. Получено 11 мутантных форм эндонуклеазы рестрикции SsoII, содержащих остаток (остатки) цистеина в выбранных позициях, проведена их модификация различными производными малеимидазобензола и протестирована способность белков с «фотопереключаемыми» молекулами гидролизовать ДНК при облучении светом с длиной волны 365 и 470 нм.

4. Впервые продемонстрировано двукратное изменение ферментативной активности эндонуклеазы рестрикции SsoII при альтернативном облучении в случае, когда два азобензольных «фотопереключателя» с гидроксильной или хелатообразующей группой селективно присоединены к мутантной форме белка в непосредственной близости от его ДНК-связывающего центра.

5. Найдены положения в структуре мутантных форм эндонуклеазы рестрикции PvuII, модификация которых симметричными производными азобензола приводит к 16-кратному различию в начальной скорости гидролиза ДНК-субстрата при изменении длины волны возбуждающего света.

БЛАГОДАРНОСТЬ

Автор выражает благодарность своим научным руководителям профессору Т.С. Орецкой и ведущему научному сотруднику Е.А.Кубаревой, а также профессору Университета имени Ю. Либиха (г. Гиссен, Германия) Альфреду Пингуду за руководство и помощь при выполнении работы.

Автор благодарит своих коллег по лаборатории за постоянную помощь и поддержку, а также Т.С. Зацепина, Е.М. Волкова за консультации по синтезу замещенных азобензолов, В.Н. Ташлицкого - за помощь в анализе полученных в работе соединений, Е.А. Романову, А.В. Судьину - за полезные советы при обсуждении диссертационной работы. Автор благодарен аспиранту Бенно Ширлингу за плодотворное сотрудничество во время совместной работы в Университете имени Ю. Либиха (г. Гиссен, Германия). Автор также благодарит членов своей семьи, родственников и друзей за помощь и поддержку.

Автор выражает благодарность правительству Социалистической Республики Вьетнам за предоставленную возможность обучения в аспирантуре Химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

1.4. Заключение

Таким образом, рассмотрены 3 основные стратегии регулирования активности белков под действием света различной длины волны: 1) направленная модификация белков производными азобензола; 2) создание фоторегулируемых ингибиторов, субстратов ферментов и 3) направленная модификация белков производными азобензола, содержащими лиганд для связывания с данным белком. Каждая стратегия имеет свои достоинства и недостатки. Определяющим фактором для применения рассмотренных методов является цель регулирования активности белка, структура самого белка и его лиганда или ингибитора. При выборе того или иного подхода нужно учитывать не только конечный результат (разница в активности белка при специфическом облучении), но и совокупность факторов, приводящих к получаемому эффекту.

Стратегия создания фоторегулируемых ингибиторов или субстратов ферментов находит практическое применение, например, в области очистки ферментов для упрощения техники аффинной хроматографии белков. При аффинной сорбции ингибиторы фермента могут использоваться как лиганды, которые при облучении будут переходить из конфигурации с сильным сродством к целевому ферменту в конфигурацию со слабым сродством к нему. Эту процедуру можно рассматривать как новый подход к очистке фермента в мягких условиях. Кроме того, возможность регулировать взаимодействия биомолекул с поверхностью с помощью света позволяет конструировать новые обратимые биосенсоры, улучшенные медицинские имплантанты и др.

Направленная модификация белков производными азобензола, содержащими лиганд для связывания с данным белком, применяется в большинстве случаев для белков, образующих ионные каналы, и рецепторов с известными лигандами. Включение подходящей группы в качестве лиганда в состав «фотопереключателей» позволяет модифицировать разные типы ионных каналов и рецепторов, что дает возможность контролировать различные физиологические функции белков посредством света.

Для применения стратегии направленной модификации белков производными азобензола необходимо, чтобы структура фермента была известна. Для введения производных азобензола обычно выбираются положения в таких структурных элементах пептидов или белков, которые играют важную роль в белок-белковом и/или ДНК-белковом узнавании и связывании белка с лигандом.

На основании данных, представленных в обзоре литературы, можно сделать вывод, что для ферментов известно лишь ограниченное число примеров, когда модификация производными азобензола позволяла регулировать их активность при облучении. Поиск фотохромных соединений для регулирования активности ферментов является актуальной задачей. В данной работе в качестве основного подхода для введения «фотопереключателя» в эндонуклеазы рестрикции была выбрана химическая модификация остатков цистеина белков симметричными и несимметричными производными азобензола.

Глава 2. Конструирование эндонуклеаз рестрикции с фоторегулируемой активностью

Обсуждение результатов)

В клетке существует сложный механизм регулирования активности ДНК-связывающих белков, сопровождающийся перестройками ДНК-белковых комплексов и их разрушением. Во многих случаях возникает необходимость временного контроля активности белка. Так, в генетической инженерии широко используются эндонуклеазы рестрикции, нуклеазы, содержащие структурный модуль «цинковые пальцы», и эндонуклеазы генной конверсии. Несмотря на их высокую специфичность в процессе поиска целевого субстрата, ферменты, направлено гидролизующие ДНК, могут проявлять неспецифическую активность. Поэтому актуальной задачей является регулирование их действия. Процесс нежелательного расщепления ДНК можно попытаться минимизировать, «включая» и «выключая» активность фермента в определенные моменты времени посредством внешних воздействий, таких, например, как свет. Свет обладает неоспоримыми преимуществами перед другими источниками внешних воздействий. С высокой эффективностью свет может мгновенно оказывать влияние только на целевой объект в клетке с минимальным разрушением оставшихся частей клетки.

Цель данной работы заключалась в модификации мутантных форм эндонуклеаз рестрикции SsoII и PvuII производными азобензола для конструирования ферментов с фоторегулируемой активностью.

Для конструирования фоторегулируемого белка требуется прежде всего селективно присоединить к нему светочувствительные соединения. Для модификации белка различными реагентами наиболее удобными являются сульфгидрильные группы остатков цистеина, которые могут быть введены в состав белка методом сайт-направленного мутагенеза. Среди существующих светочувствительных соединений [16-20] наиболее широко используются производные азобензола. 7рд//с-конфигурация азобензола переходит в г/мс-конфигурацию при облучении УФ-светом (365 нм), а обратный переход осуществляется при облучении голубым светом (470 нм) или при термической релаксации (схема 2.1). Цис-транс-юомъртация азобензола при специфическом облучении протекает быстро, эффективно и практически не зависит от окружающей среды. Значительный интерес к производными азобензола вызван тем, что изомеризация этих соединений протекает быстро под действием света с длиной волны более 300 нм, а, следовательно, позволяет активировать/инактивировать белки in vivo.

470 нм или термическая релаксация

365 нм r' г/ис-конфигурация мранс-конфигурация

Схема 2.1.

В работе предлагаются два подхода к регулированию активности эндонуклеаз рестрикции при специфическом облучении. Идея первого подхода основана на том, что большинство эндонуклеаз рестрикции в активном состоянии представляют собой гомодимеры. Многие из них при взаимодействии с субстратом подвергаются конформационным изменениям, что позволяет ДНК подойти к ДНК-связывающему центру фермента, который находится в интерфейсе между двумя субъединицами гомодимера [104, 105]. Модифицируя белок асимметричными производными азобензола вблизи от ДНК-связывающего или каталитического центра, можно сделать его недоступным для подхода ДНК из-за стерических препятствий в случае более «вытянутой» /и/юнс-конфигурации производных азобензола. Поскольку транс-форма более стабильна, чем цис-форма, в обычных условиях азобензол существует в основном в транс-форме. То есть модифицированный фермент не может связываться с ДНК-субстратом и, поэтому, неактивен. При облучении УФ-светом происходит переход трансформы азобензола в более компактную г/г/с-форму, расстояние между концами двух молекул азобензола увеличивается, и субстрат может попасть в ДНК-связывающий центр белка. Под действием голубого света г/г/с-конфигурация азобензола быстро переходит в /ярднс-конфигурацию. Следовательно, ДНК-связывающий центр белка «закрывается» вскоре после связывания и расщепления ДНК. Повторное «включение» фермента возможно путем облучения фермента УФ-свстом. Такая тактика регулирования активности белка может быть названа методом фоторегулируемых «молекулярных ворот». На схеме 2.2 в качестве примера изображены «молекулярные ворота», закрытые (а) и открытые (б) для входа субстрата в ДНК-связывающий центр при транс-цис-изомеризации асимметричного производного азобензола в белке.

Согласно этому подходу, только один из концов производного азобензола взаимодействует с остатком цистеина белка. Предполагается, что белок не оказывает влияния на изомеризацию азобензола. Однако заместитель на свободном конце производного азобензола может потенциально повлиять на функционирование белка, контактируя с пространственно сближенными группировками, что также может блокировать активный центр (рис. 2.1). В качестве лигандов в работе использованы различные функциональные группы, которые при определенном расположении друг относительно друга удерживаются в сближенном состоянии за счет комплексообразования в присутствии ионов металла (а), образования водородных связей и кислотно-основных взаимодействий (б) или формирования дуплекса иммобилизованными на белке олигонуклеотидами (в). транс- азобензол цис- азобензол Л

ДНК-связываю: центр R.EcllSkI (R.SsoII)

365 нм

470 нм

ДНК-субстрат

Фермент неактивен

Фермент активен

R - расстояние между концами двух молекул азобензола. а б

Схема 2.2.

Ион металла

Гомодимер белка Производное азобензола с присоединенным олнгонуклеотидом б в

Рис. 2.1. Схематическое изображение метода «молекулярных ворот». Обратимое блокирование активного центра белка с помощью производных азобензола: а -комплексообразование в присутствии иона металла, б - кислотно-основное взаимодействие производного азобензола со сближенной аминокислотой одного из мономеров гомодимера белка, в - формирование ДНК-дуплекса.

Второй подход заключается в использовании симметричных производных азобензола для соединения двух сближенных остатков цистеина белка. При изменении длины волны возбуждающего света происходит изомеризация азобензола и изменяется локальная конформация белка. Это конформационное изменение в свою очередь может привести к изменению его активности. Такая тактика регулирования активности белка может быть названа методом «молекулярной пружины» (схема 2.3).

Существуют следующие подходы для введения остатка азобензола в пептиды или белки: в результате химической модификации пептидов и белков [3, 42, 43], в процессе пептидного синтеза [37, 44, 60], в процессе трансляции in vitro [61, 62] и в процессе трансляции in vivo [48].

Сайт-направленная химическая модификация белка достигается путем взаимодействия соединения, содержащего функциональную группу, которая специфически реагирует с уникальным остатком аминокислоты. Обычно для специфической модификации выбирают остатки цистеина, так как, во-первых, для сульфгидрильной группы цистеина известны специфические реакции с малеимидом и галогенпроизводными (галоген находится у насыщенного атома углерода). Во-вторых, количество остатков цистеина в белке, как правило, невелико, поэтому, сначала можно заменить их на другие аминокислоты, например, аланин или серин методом сайт-направленного мутагенеза гена исходного белка. Затем в полученном мутантном белке, не содержащем остатков цистеина, заменяют одну или несколько аминокислот в заданном положении на цистеин (схема 2.4).

Катал нтич ескнй центр R.P vull

Фермент неактивен

Фермент активен

Схема 2.3.

Схема 2.4.

В данной работе в качестве основного подхода была выбрана химическая модификация остатков цистеина эндонуклеаз рестрикции симметричными и несимметричными производными азобензола.

Для конструирования ферментов с фоторегулируемой активностью с применением подхода «молекулярных ворот», предложено модифицировать эндонуклеазу рестрикции SsoII производными азобензола, которые содержат в одном бензольном кольце малеимидную группировку для присоединения к остатку цистеина белка, а в другом кольце различные заместители. Для того чтобы сравнить подходы «молекулярных ворот» и «молекулярной пружины» для конструирования ферментов с фоторегулируемой активностью, была выбрана и модифицирована симметричным «сшивающим» реагентом, содержащим азобензольный остаток, эндонуклеаза рестрикции PvuII.

2.1. Конструирование и характеристика мутантных форм эндонуклеазы рестрикции SsoII

Эндонуклеаза рестрикции SsoII входит в систему рестрикции-модификации П-го типа бактерии Shigella sonnei 47 [106]. Белок имеет в своем составе 305 аминокислотных остатков (а.о.), его молекулярная масса составляет 35,9 кДа. Это гомодимерный фермент, который узнаёт в двутяжевой ДНК последовательность нуклеотидов 5-J.CCNGG-373'-GGNCCT-5' (N = А, Т, G или С) и гидролизует ДНК на границах этого участка в местах, указанных стрелками. В связывании ДНК участвуют аминокислотные остатки R186, R187,

R188 (контакты с гетероциклическими основаниями) и R116, R117, R119 (контакты с углеводофосфатным остовом), в катализе гидролиза ДНК-субстрата - Е125, D160, К182, Е195 [107].

Ранее был получен штамм-суперпродуцент фермента и разработан способ выделения гомогенного препарата R.SsoII, пригодного для молекулярно-биологических исследований [108]. Фермент содержит на N-конце полипептидную последовательность MetArgGlySer(His)6GlySerSerGln. Наличие в ней блока из шести остатков гистидина позволяет выделять R.SsoII методом аффинной хроматографии. Степень очистки фермента составляла более 95%, концентрация белка более - 4 мкг/мкл, активность -более 300 ед./мкл. Молекулярная масса рекомбинантного белка, вычисленная по программе, предложенной на ExPASy Proteomics Server http://au.expasy.org/tools/pitool.html), равна 37,2 кДа.

2.1.1. Выбор положений аминокислот в эндонуклеазе рестрикции SsoII для модификации азобензольными производными

На первом этапе работы для создания фоторегулируемой R.SsoII необходимо было выбрать положения аминокислот, которые находятся недалеко от «входа» субстрата в ДНК-связывающий и каталитический центры фермента, и заменить эти аминокислоты на цистеин. При этом нужно учитывать, что остатки цистеина должны располагаться на поверхности белка (они должны быть доступны для модифицирующих реагентов) и находиться достаточно далеко от каталитического центра для того, чтобы присутствие и изомеризация хромофора непосредственно не влияли на функционирование фермента. Основой для конструирования мутантных форм R.SsoII послужили результаты рентгеноструктурного анализа комплекса эндонуклеазы рестрикции Ecll8kl (R.Ecll8kl) с субстратом [109] (рис. 2.2). R.Ecll8kI является изошизомером и ближайшим гомологом R.SsoII (ферменты отличаются одной аминокислотой — Val232 в R.Ecll8kI соответствует Не в R.SsoII).

В структуре R.SsoII дикого типа (wtR.SsoII) имеется 2 остатка цистеина в позиции 33 и 60. В качестве исходного фермента использовали мутантную форму R.SsoII(C33S/C60S), не содержащую остатков цистеина - cfR.SsoII (или 2CS), предоставленную доктором В. Пингоуд (Университет им. Ю. Либиха, Германия). Белок сfR.SsoII также эффективно гидролизует ДНК-субстраты, как и природный фермент.

Рис. 2.2. Структура комплекса гомодимера эндонуклеазы рестрикции Ecll 8kl с ДНК-субстратом (PDB-код 2FQZ) [109].

1 - Внутренние «зажимы»

2 - Внешние «зажимы»

S171C а

Рис. 2.3. Структура гомодимера фермента R. SsoII (на основе данных PC А для R.Ecll8kI [109]. а - Аминокислоты, замененные на цистеин (S171, R174, R198, 1220, А224). б - Аминокислоты, участвующие в связывании (контакт с гетероциклическими основаниями - R186, R187, R188; контакт с углеводофосфатным остовом - R116, R117, R119). в -Аминокислоты, участвующие в катализе (Е125, D160, К182, Е195).

R1S6.R187.R188 16.R117.R119

К182 б в

Мы предположили, что чем больше молекул азобензола находится вблизи от «входа» в ДНК-связывающий центр белка, тем больше стерический эффект и тем больше влияние облучения на активность белка. Поэтому были получены ещё 6 мутантных форм cfR.SsoII с 2, 3 или 4 остатками цистеина в положениях 171, 174, 198, 220 и 224 в различных комбинациях (табл. 2.1)

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Ле Тхи Хиен, 2010 год

1. Banghart М., Borges К., Isacoff Е., Trauner D., Kramer R. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. //Nature Neuroscience. 2004. V. 7. P. 1381-1386.

2. Nakayama K., Endo M., Majima T. Photochemical regulation of the activity of an endonuclease BamHI using an azobenzene moiety incorporated site-selectively into the dimer interface. // Chem. Commun. 2004. V. 21. P. 2386-2387.

3. Volgraf M., Gorostiza P., Numano R., Kramer R., Isacoff E., Trauner D. Allosteric control of an ionotropic glutamate receptor with an optical switch. //Nat. Chem. Biol. 2006. V. 2. P. 47-52.

4. Harvey J. H., Trauner D. Regulating enzymatic activity with a photoswitchable affinity label. // ChemBioChem. 2008. V. 9. P. 191-193.

5. Yemul S., Berger C., Estabrook A., Suarez S., Edelson R., Bayley H. Selective killing of T lymphocytes by phototoxic liposomes. // Proc.Natl.Acad.Sci. USA. 1987. V. 84. P. 246-250.

6. Chang C.Y., Fernandez Т., Panchal R., Bayley H. Caged catalytic subunit of cAMP-dependent protein kinase. // J. Am. Chem. Soc. 1998. V. 120. P. 7661-7662.

7. Short III G.F., Lodder M., Laikhter A.L., Arslan Т., Hecht S.M. Caged HIV-1 protease: dimerization as independent of the ionization state of the active site aspartates. // J. Am. Chem. Soc. 1999. V.121. P. 478-479.

8. Arabaci G., Guo X.C., Beebe K.D., Coggeshall K.M., Pei D. a-Haloacetophenone derivatives as photoreversible covalent inhibitors of protein tyrosine phosphatases. // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121.5085-5086.

9. Jones P.В., Porter N.A. 2-Aroylbenzoyl serine proteases: photoreversible inhibition or photoaffinity labeling. //J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 2753-2761.

10. Zou K., Cheley S., Givens R.S., Bayley H. Catalytic subunit of protein kinase A caged at the activating phosphothreonine. // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 8220-8229.

11. Golan R., Zehavi U., Nairn M, Patchornik A., Smirnoff P. Inhibition of Escherichia coli p-galactosidase by 2-nitro-l-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl)ethyl, a photoreversible thiol label. // Biochim. Biophys. Acta. 1996. V. 1293. P. 238-242.

12. LoudwigS., Nicolel Y., Masson P., Fontecilla-Camps J.C., Bon S., Nachon F., Goeldner M. Photoreversible inhibition of cholinesterases: catalytic serine-labeled caged butyrylcholinesterase. // ChemBioChem. 2003. V. 4. P. 762-767.

13. Hiraoka Т., Hamachi I. Caged RNase: photoactivation of the enzyme from perfect off-state by site-specific incorporation of 2-nitrobenzyl moiety. I I Bioorg. Med. Chem. Lett. 2003. V. 13. P. 13-15.

14. Self C.H., Thompson S. Light activatable antibodies: models for remotely activatable proteins. //Nature Medicine. 1996. V. 2. P. 817-820.

15. Feringa B.L., Delden R.A., Koiimura N. Geertsema E.M. Chiroptical molecular switches. // Chem. Rev. 2000. V. 100. P. 1789-1816.

16. Fujimoto K, AmanoM., Horibe Y., InouyeM. Reversible photoregulation of helical structures in short peptides under indoor lighting/dark conditions. // Org. Lett. 2006. V. 8. P. 285-287.

17. ErdelyiM., Karl A., Gogol A. A new tool in peptide engineering: a photoswitchable stilbene-type P-Hairpin mimetic. // Chem. Eur. J. 2006. V. 12. P. 403^12.

18. Cordes Т., Weinrich D., Kempa S., Riesselmann K, Herre S., Hoppmann C., Riick-Braun K, Zinth. W. Hemithioindigo-based photoswitches as ultrafast light trigger in chromopeptides. // Chem. Phys. Lett. 2006. V. 42. P. 167-173.

19. Cordes Т., Eisner C., Herzog Т. Т., Hoppmann C., Schadendorf Т., Summerer W., Riick-Braun K, Zinth W. Ultrafast hemithioindigo-based peptide-switches. // Chemical Physics. 2009. V. 358. P. 103-110.

20. Schadendorf Т., Hoppmann C, Riick-Braun K. Synthesis of rigid photoswitchable hemithioindigo (o-amino acids. // Tetrahedron Lett. 2007. V 48. P. 9044-9047.

21. Natansohn A., Rochon P. Photoinduced motions in azo-containing polymers. // Chem. Rev. 2002. V. 102. P. 4139-4175.

22. Shibaev V., Bobrovsky A., Boiko N. Photoactive liquid crystalline polymer systems with light-controllable structure and optical properties. // Prog. Polym. Sci. 2003. V. 28. P. 729-836.

23. Harada A. Cyclodextrin-based molecular machines. // Acc. Chem. Res. 2001. V. 34. P. 456464.

24. Pieroni O., Fissi A., Angelini N., Lend F. Photoresponsive polypeptides. // Acc. Chem. Res. 2001. V. 34. P. 9-17.

25. Willner I., Rubin S. Control of the structure and functions of biomaterials by light. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1996. V. 35. P. 367-385.

26. Willner I. Photoswitchable biomaterials: en route to optobioelectronic systems. // Acc. Chem. Res. 1997. V. 30. P. 347-356.

27. Kumar G.S., Neckers D.C. Photochemistry of azobenzene-containing polymers. // Chem. Rev. 1989. V. 89. P. 1915-1925.

28. Rau H. Studies in organic chemistry: photochromism, molecules and systems. // V. 40 (Eds.: Diirr H., Bonas-Laurent H.). Elsevier. Amsterdam. 1990. P. 165-192.

29. Rau H. Photoreactive organic thin films (Eds.: Sekkat Z., Knoll W.). Elsevier. New York. 2002, P. 3.

30. Fujino Т., Arzhantsev Y. S., Tahara T. Femtosecond time-resolved fluorescence study of photoisomerization of/rara-azobenzene. // J. Phys. Chem. A. 2001. V. 105. P. 8123-8129.

31. Nagele R, Hoche R., Zinth W., Wachtveitl J. Femtosecond photoisomerization of cis-azobenzene. // Chem. Phys. Lett. 1997. V. 272. P. 489^195.

32. Crecca C. R, Roitberg A. E. Theoretical study of the isomerization mechanisim of azobenzene and disubstituted azobenzene derivatives. // J. Phys. Chem. A. 2006. V. 110. P. 8188-8203.

33. Fuss W., Kosmidis C., Schmid W.E., Trushin S.A. The photochemical cis-trans isomerization of free stilbene molecules follows a hula-twist pathway. // Angew. Chem. Int. Ed. 2004. V. 43. P. 4178-4182.

34. Tiago M.L., Ismail-Beigi S., Louie S.G. Photoisomerization of azobenzene from first principles constrained density-functional calculations. // J. Chem. Phys. 2005. V. 122. P. 094311-094318.

35. Cembran A., Bernardi F., Garavelli M., Gagliardi L., Orlandi G. On the mechanisim of the cis—trans isomerizationin the lowest electronic states of azobenzene: SO, SI, and Tl. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 3234-3243.

36. James D.A., Burns D.C., Woolley G.A. Kinetic characterization of ribonuclease S mutants containing photoisomerizable phenylazophenylalanine residues. // Protein Engineering. 2001. V. 14. P. 983-991.

37. Srinivas O., Mitra N., Surolia A., and Jayaraman N. Photoswitchable multivalent sugar ligands: synthesis, isomerization, and lectin binding studies of azobenzene-glycopyranoside derivatives. // J. Am. Chem. Soc. 2002. V. 124. P. 2124-2125.

38. Renner C., Moroder L. Azobenzene as conformational switchin model peptides. // ChemBioChem. 2006. V. 7. P. 868-878.

39. Dong S., Leweneck M., Schrader Т.Е., Schreier W.J., Zinth W., Moroder L., Renner CA Photocontrolled р-hairpin peptide. // Chem. Eur. J. 2006. V. 12. P. 1114-1120.

40. Burns D.C., Flint D.G., Kumita J.R., Feldman H.J., Serrano L., Zhang Z., Smart O.S., Woolley G.A. Origins of helix-coil switching in a light-sensitive peptide. // Biochemistry. 2004. V. 43. P.15329-15338.

41. Kumita J.R., Smart O.S., Woolley. G.A. Photo-control of helix content in a short peptide. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. P. 3803-3808.

42. Pozhidaeva N., Cormier M., Chaudhari A., Woolley G.A. Reversible photocontrol of peptide helix content: adjusting thermal stability of the cis state. // Bioconjugate Chem. 2004. V. 15. P. 1297-1303.

43. Liu D., Karanicolas J., Yu C., Zhang Z., Woolley G.A. Site-specific incorporation of photoisomerizable azobenzenegroups into ribonuclease S. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1997. V. 7. P. 2677-2680.

44. Ueda Т., Murayama K., Yamamoto Т., Kimura S., Imanishi Y. Photoregulation of hydrolysis activity of semisynthetic mutant phospholipases A2 replaced by non-natural aromatic amino acids. //J. Chem. Soc. Perk. Trans. 1994. V. 1. P. 225-230.

45. Muranaka N., Hohsaka Т., Sisido M. Photoswitching of peroxidase activity by position-specific incorporation of a photoisomerizable non-natural amino acid into horseradish peroxidase. // FEBS Lett. 2002. V. 510. P. 10-12.

46. Hohsaka Т., Kajihara D., Ashizuka Y, Murakami H., Sisido M. Efficient incorporation of nonnatural amino acids with large aromatic groups into streptavidin in vitro protein synthesizing systems. // J. Am. Chem. Soc. 1999. V. 121. P. 34-40.

47. Base M., Groff D., Xie J., Brustad E., Schultz P. The incorporation of a photoisomerizable amino acid into proteins in E. coli. II J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 388-389.

48. Smyth D.G., Nagamatsu A., FrutonJ.S. Reactions of N-ethylmaleimide. // J. Am. Chem. Soc. 1960. V. 82. P. 4600—4604.

49. Brewer C.F., Riehmn J.P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethymaleimide and proteins. //Anal. Biochem. 1967. V. 18. P. 248-255.

50. Lee Y.C., Lee R.T. Carbohydrate-protein interactions: basis of glycobiology. // Acc. Chem. Res. 1995. V. 28. P. 321-327.

51. Zhang Z., Burns D.C., Kumita J.R., Smart O.S., Woolley G.A. A water-soluble azobenzene cross-linker for photocontrol of peptide confirmation. // Bioconjugate Chem. 2003. V. 14. P. 824-829.

52. Sadovski O., Beharry A.A., Zhang F., Woolley G.A. Spectral tuning of azobenzene photoswitches for biological applications. // Angew. Chem. Int. Ed. 2009. V. 48. P. 1484-1486.

53. Menta S.M., Vakihvala M. V. Sodium perborate as a reagent in organicchemistry. Preparation of azo-compounds. // J. Am. Chem. Soc. 1952. V. 74. P. 563-564.

54. CookA.H. The preparation of some c/s-azo-compounds. // J. Chem. Soc. 1938. P. 876-881.

55. Burns D.C., Zhang F., Woolley G.A. Synthesis of 3,3'-bis(sulfonato)-4,4'-bis(chloroacetamido)azobenzene and cysteine cross-linking for photo-control of protein conformation and activity. //Nature Protocols. 2007. V. 2. P. 251-258.

56. Loudwig S., Bayley H. Photoisomerization of an individual azobenzene molecule in water: an on-off switch triggered by light at a fixed wavelength. // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 12404-12405.

57. Goodman M., Kossoy A. Conformational aspects of polypeptide structure. XIX. Azoaromatic side-chain effects. //J. Am. Chem. Soc. 1966.V. 88. P. 5010-5015.

58. Hohsaka, Т., Ashizuka, Y., Murakami, H., and Sisido, M. Incorporation of nonnatural amino acids into streptavidin through in vifro frame-shift suppression. // J. Am.Chem. Soc. 1996 . V. 118. P. 9778-9779.

59. Hohsaka Т., Kawashima K., Sisido M. Photoswitching of N AD+-Mediated enzyme reaction through photoreversible antigen-antibody reaction. // J. Am. Chem. Soc. 1994. V. 116. P. 413414.

60. Flint D.G., Kumita J.R., Smart O.S., Woolley G.A. Using an azobenzene cross-linker to either increase or decrease peptide helix content upon trans-to-cis photoisomerization. // Chem. Biol. 2002. V. 9. P. 391-397.

61. Kusebauch U. Photocontrolled folding and unfolding of a collagen triple helix. // Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2006. V. 45. P. 7015-7018.

62. Woolley G.A., Jaikaran A.S.I., Berezovski M., Calarco J.P., Krylov S.N., Smart O.S., Kumita J.R. Reversible photocontrol of DNA binding by a designed GCN4-bZlP protein. // Biochemistry. 2006. V. 45. P. 6075-6084.

63. Zhang F., Sadovski O., Woolley G.A. Synthesis and characterization of a long, rigid photoswitchable cross-linker or promoting peptide and protein confirmational change. // ChemBioChem. 2008. V. 9. P. 2147-2154.

64. Jog P. V., Gin M.S. A light-gated synthetic ion channel. // Org. Lett. 2008. V. 10. P. 36933696.

65. Muramatsu S., Kinbara K., Taguchi H., Ishii N., Aida T. Semibiological molecular machine with an implemented «AND» logic gate for regulation of protein folding. // J. Am. Chem. Soc. 2006. V. 128. P. 3764-3769.

66. Gorostiza P., VolgrafM., Numano R., Szobota S., Trauner D., Isacojf E.Y. Mechanisims of photoswitch conjugation and light activation of an ionotropic glutamate receptor. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2007. V. 104. P. 10865-10870.

67. Szobota S. Remote control of neuronal activity with a light-gated glutamate receptor. // Neuron. 2007. V. 54. P. 535-545.

68. Numano R. Nanosculpting reversed wavelength sensitivity into a photoswitchable iGluR. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2009. V. 106. P. 6814-6819.

69. Yamada M.D., Nakajima Y., Maeda II, Maruta S. Photocontrol of kinesin ATPasc activity using an azobenzene derivative. // J. Biochem. 2007. V. 142. P. 691-698.

70. Willner I., Rubin S., Riklin A. Photoregulation of papain activity through anchoring photochromic azo groups to the enzyme backbone. // J. Am. Chem. Soc. 1991. V. 113. P. 33213325.

71. Woolley G. A. Photocontrolling peptide a-helices. // Acc. Chem. Res. 2005. V. 38. P. 486493.

72. Chi L„ Sadovski O., Woolley G.A. A blue-green absorbing cross-linker for rapid photoswitching of peptide helix content. // Bioconjugate Chem. 2006. V. 17. P. 670-676.

73. Kumita J.R., Flint D.G., Woolley G.A., Smart O.S. Achieving photo-control of protein conformation and activity: producing a photo-controlled leucine zipper. // Faraday Discuss. 2002. V. 122. P. 89-103.

74. Guerrero L., Smart O.S., Weston C.J., Burns D.C., Woolley G. A., Allemann R.K. Photochemical regulation of DNA-binding specificity of MyoD. // Angew. Chem. Int. Ed. 2005. V. 44. P. 7778-7782.

75. Cochran A. G., Skelton N.J., Starovasnik MA. Tryptophan zippers: stable, monomeric (3-hairpins. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2001. V 98. P. 5578-5583.

76. Tachikawa К., Schroeder О., Frey G., Briggs S.P., Sera T. Regulation of the endogenous VEGF-A gene by exogenous designed regulatory proteins. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 15225-15230.

77. Segal D.J., Goncealves J., Eberhardy S., Swan C.H., Torbett B.E., Li X., Barbas III C.F. Attenuation of HIV-1 replication in primary human cells with a designed zinc finger transcription factor . // J. Biol. Chem. 2004. V. 279. P. 14509-14519.

78. Sera T. Inhibition of virus DNA replication by artificial zinc-finger proteins. // J. Virol. 2005. V. 79. P. 2614-2619.

79. Patel S.D., Isalan M., Gavory G., Ladame S., Choo Y., Balasubramanian S. Inhibition of human telomerase activity by an engineered zinc finger protein that binds G-quadruplexes. // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 13452-13458.

80. Kim Y.G., Cha J., Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fokl cleavage domain. // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 1156-1160.

81. Nomura W., Barbas III C.F. In vivo site-specific DNA methylation with a designed sequence-enabled DNA methylase. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 8676-8677.

82. Nomura A, Okamoto A. Photoresponsive tandem zinc finger peptid. // Chem. Commun. 2009. P. 1906-1908.

83. Newman M., Strzelecka Т., Dorner L.F., Schildkraut I., Aggarwal A.K. Structure of restriction endonuclease BamHI and its relationship to EcoRl. //Nature. 1994. V. 368. P. 660664.

84. Westmark P. R., Kelly J.P., Smith B.D. Photoregulation of enzyme activity photochromic, transition-state-analogue inhibitors of cysteine and serine proteases. I I J. Am. Chem. Soc. 1993. V. 115. P. 3416-3419.

85. Pearson D., Abell A.D. Photoswitch inhibitors of a-chymotrypsin increased substitution and peptidic character in peptidomimetic boronate esters. // Org. Biomol. Chem. 2006. V. 4. P. 3618-3625.

86. Pearson D., Alexander N., Abell A.D. Improved photocontrol of a-chymotiypsin activity: peptidomimetic trifluoromethylketonc photoswitch enzyme inhibitors. // Chem. Eur. J. 2008. V. 14. P. 7358-7365.

87. Pearson D., Downard A.J., Muscroft-Taylor A., Abell A.D. Reversible photoregulation of binding of a-chymotrypsin to a gold surface. // J. Am. Chem. Soc. 2007. V. 129. P. 1486214863.

88. Auernheimer J. , Dahmen C., Hersel U., Bausch A., Kessler H. Photoswitched cell adhesion on surfaces with RGD peptides. //J. Am. Chem. Soc. 2005. V. 127. P. 16107-16110.

89. Asanuma H., Tamaru D., Yamazawa A., Liu M., Komiyama M. Photoregulation of the transcription reaction of T7 RNA polymerase by tethering an azobenzene to the promoter. // ChemBioChem. 2002. V. 3. P. 786-789.

90. Zhao J., Zhou J., Liu M., Asanuma H., Komiyama M. Photoregulation of in vitro transcription/translation of GFP by tethering an azobenzene to T7 promoter. // Nucleic Acids Symposium Series. N. 48. P. 199-200.

91. Matsunaga D., Asanuma H., Komiyama M. Photoregulation of RNA digestion by RNase H with azobenzene-tethered DNA. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 11452-11453.

92. ParisotJ., Kurz K., HilbrigF., Freitag R. Use of azobenzene amino acids as photoresponsive conformational switches to regulate antibody-antigen interaction. // J. Sep. Sci. 2009. V. 32. P. 1613-1624.

93. MacKinnon R., Yellen G. Mutations affecting TEA blockade and ion permeation in voltage-activated K+ channels. // Science. 1990. V. 150. P. 276-279.

94. Blaustein R.O., Cole P.A., Williams C., Miller C. Tethered blockers as molecular «tape measures» for a voltage-gated K+ channel. // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 309-311.

95. Bartels E., Wassermann N.H., Erlanger B.F. Photochromic activators of the acetylcholine receptor.//Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1971. V. 68. P. 1820-1823.

96. Golovenko D., Manakova E., Tamulaitiene G., Grazulis S., Siksnys V. Structural mechanisms for the 5'-CCWGG sequence recognition by the N- and C-terminal domains of EcoRII. //Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 6613-6624.

97. Упорова T.M., Карташова ИМ., Скрипкин E.A., Jlonapeea E., Никольская НИ. Эндонуклеазы рестрикции из Shigella sonnei 47. П Вопросы медицинской химии. 1985. Т. 31.N2. С. 131-136.

98. Судъина А.Е. Эндонуклеазы рестрикции SsoII, PspGI и Mbol: изучение свойств и определение ДНК-связывающих мотивов. // М.: МГУ им. М.В. Ломоносова. 2004. Дис. . канд. хим. наук. 149 с.

99. Sheflyan G., Kubareva Е.А., Kuznetsova S.A., Karyagina A.S., Nikolskaya L.I., Gromova E.S.,Shabarova Z.A. Cross-linking for SsoII restriction endonuclease to cognate and non-cognate DNAs. // FEBS Lett. 1996. V. 390. N3. P. 307-310.

100. Bochtler M., Szczepanowski R.H., Tamulaitis G., Grazulis S., Czapinska H., Manakova E., Siksnys V. Nucleotide flips determine the specificity of the Ecll8kl restriction endonuclease. // The EMBO Journal. 2006. V. 25. P. 2219-2229.

101. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4. //Nature. 1970. V.227. P. 680-685.

102. Luo Y., WuJ., Li В., Langsetmo K, Gergely J., Tao T. Photocrosslinking of benzophenone-labeled single cysteine troponin I mutants to other thin filament proteins. // J. Mol. Biol. 2000. V. 296. P. 899-910.

103. Лифиц А.Л., Вейцман A.A., Дистанова Л.Я. II Методы получения химических реактивов и препаратов. / Под ред. Ластовского Р.П. М.: НИИТЭХИМ, 1970. Вып. 22. С. 118-122.

104. Лифиц A.JI., Вейцман А.А., Дистанова Л.Я. // Методы получения химических реактивов и препаратов. / Под ред. Ластовского Р.П. М.: НИИТЭХИМ, 1970. Вып. 22. С. 114-117.

105. Derek G.S., Blumenfeld О.О., Konigsberg W. Reactions of N-ethylmaleimide with peptides and amino acids. // Biochem. J. 1964. V. 91. P. 589.

106. Leal N.A., Sukeda M., Benner S.A. Dynamic assembly of primers on nucleic acid template. //Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 4702^1710.

107. Chaberek S., Martell A.E. Stability of metal chelates. Iminodiacetic and iminodipropionic acids. //J. Am. Chem. Soc. 1952. V. 74. P. 5052-505 6.

108. Lenz G.R., Martell A.E. Metal chelates of some sulfur-containing amino acids. // Biochemistry. 1964. V. 3. P. 745-750.

109. Perrin D. D. Organic complexing reagents: structure, behavior, and application to inorganic analysis. New York, Interscience Publishers. 1964. P. 100.

110. Shinkai S., Nakamura S., Nakashima M., Manabe O., Iwamoto M. Photoregulated ion-binding to azobenzen-linked ethylenediamines and iminodiacetic acids. // Bull. Chem. Soc. Jpn. 1985. V. 58. P. 2340-2347.

111. Davies G., Kustin K., PasternackR. F. Reactions of L-cysteine with cobalt (II) and nickel (II). //Trans. Faraday Soc. 1968. V. 64. P. 1006-1013.

112. Vipond В., Baldwin G. S., Halford S. E. Divalent metal ions at the active sites of the EcoRV and EcoRI restriction endonucleases. // Biochemistry. 1995. V. 34. P. 697-704.

113. Baldwin G.S., Sessions R.B., Erskine S.G., Halford S.E. DNA cleavage by the EcoRV restriction endonuclease: roles of divalent metal ions in specificity and catalysis. // J. Mol. Biol. 1999. V. 288. P. 87-103.

114. Pingoud A., Fwcreiter M., Pingoud V., Wende W. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism. // Cell. Mol. Life Sci. 2005. V. 62. P. 685-707.

115. KrezelA., Lesniak W., Jezowska-Bojczuk M„ Mlynarz P., Brasun J., Kozlowski H., Bal. W. Coordination of heavy metals by dithiothreitol, a commonly used thiol group protectant. // J. Inorg. Biochem. 2001. V. 84. P. 77-88.

116. Dias A. R., Piedade E. M., Simoes J. A. M., Simoni J. A., Teixeira C., Diogo H. P. Enthalpies of formation of c/s-azobenzene and trans-azobenzene. // J. Chem. Thermodynamics. 1992. V. 24. P. 439-447.

117. Gingeras T.R., Greenough L., Schildkraut I., Roberts R.J. Two new restriction endonucleases from Proteus Vulgaris. //Nucleic Acids Res. 1981. V. 9. P. 4525—4536.

118. Athanasiadis A., Vlassi M., Kotsifaki D., Tucker P.A., Wilson K.S., Kokkinidis M. Crystal structure of PvuII endonuclease reveals extensive structural homologies to EcoRV. // Nat. Struct. Biol. 1994. V. l.P. 469^75.

119. Simoncsits A., Tjornhammar M.L., Rasko Т., Kiss A., Pongor S. Covalent joining of the subunits of a homodimeric type II restriction endonuclease: single-chain PvuII endonuclease. // J. Mol. Biol. 2001. V. 309. P. 89-97.

120. Woolley G.A., Lee E.S., Zhang F. sGAL: a computational method for finding surface exposed sites in proteins suitable for Cys-mediated cross-linking. // Bioinformatics. 2006. V. 22. P. 3101-3102.

121. Nastri H.G., Evans P.D., Walker I.H., Riggs P.D. Catalytic and DNA binding properties of PvuII restriction endonuclease mutants. Hi. Biol. Chem. 1997. V. 272. P. 25761-25767.

122. Kirsch R.D., Joly E. An improved PCR-mutagenesis strategy for two-site mutagenesis or sequence swapping between related genes. //Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 1848-1850.1. P. 395—406.