Метаболическая инженерия актинобактерий рода Mycolicibacterium, экспрессирующих чужеродные системы стероидогенеза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Карпов Михаил Владимирович

• Карпов Михаил Владимирович
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Карпов Михаил Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Стероидные соединения

1.2 Микробиологическая трансформация стероидных соединений

1.2.1 Поступление стероидных молекул в клетки актинобактерий

1.2.2 Деградация боковой цепи стеринов

1.2.3 Окисление стероидного ядра

1.2.4 Деструкция стероидного ядра

1.2.5 Генетический контроль катаболизма стеринов

1.2.6 Регуляция катаболизма стеринов

1.3 Цитохромы P450

1.3.1 Бактериальные цитохромы P450, гидроксилирующие стероиды

1.3.2 Холестерингидроксилазная/С20-С22-лиазная ферментная система

1.3.3 Реконструкция ферментной системы цитохрома P450scc

1.4 Гидроксистероиддегидрогеназы

1.4.1 Характеристика и номенклатура 17ß-гидроксистероиддегидрогеназ

1.4.2 Микробные 17ß-гидроксистероиддегидрогеназы

1.4.3 17ß-гидроксистероиддегидрогеназы в биотехнологии стероидов

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Основные реактивы

2.2 Штаммы бактерий и условия культивирования

2.3 Основные буферы и растворы

2.4 Методы работы с ДНК

2.4.1 Выделение плазмидной ДНК

2.4.2 Клонирование ДНК

2.4.3 ПЦР-амплификация ДНК и сайт-направленный мутагенез

2.4.4 Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.5 Модификация бактерий экзогенной ДНК

2.5.1 Получение хемокомпетентных клеток E. coli

2.5.2 Трансформация E. coli методом теплового шока

2.5.3 Получение электрокомпетентных клеток миколицибактерий

2.5.4 Трансформация миколицибактерий электропорацией

2.5.5 Конъюгативный перенос плазмид

2.6 Индукция синтеза рекомбинантных белков в клетках E. coli

2.7 Индукция синтеза рекомбинантных белков в клетках M. smegmatis mc2

2.8 Ультразвуковая дезинтеграция бактериальных клеток

2.9 Методы анализа белков

2.9.1 Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле

2.9.2 Western-блоттинг

2.9.3 Очистка белков с использованием Ni-NTA агарозы

2.10 Получение и сравнительная характеристика мутантных миколицибактерий

2.10.1 Создание конструкций для мутагенеза

2.10.2 Получение делеционных мутантов миколицибактерий

2.1 0.3 Анализ роста мутантных штаммов миколицибактерий

2.10.4 Трансформация стеринов мутантными миколицибактериями

2.11 Определение ферментативной активности рекомбинантных белков

2.1 1.1 Определение ферментативной активности 17ß-ГСД in vitro

2.11.2 Определение ^ß-редуктазной активности in vivo

2.11.3 Определение холестерингидроксилазной/C20-C22-лиазной активности in vivo

2.1 1.4 Определение стероидгидроксилирующей активности in vivo

2.12 Процессы биоконверсии стеринов рекомбинантными миколицибактериями

2.12.1 Биоконверсия фитостерина в тестостерон

2.12.2 Биоконверсия стеринов в прогестерон

2.12.3 Биоконверсия МОМ-стеринов в МОМ-прегненолон

2.12.4 Гидроксилирование АД

2.13 Методы выделения и очистки стероидов

2.13.1 Очистка МОМ-прегненолона

Получение кристаллического прегненолона

2,13.3 Очистка 15ß-гидроксиандрост-4-ен-3,17-диона

2.14 Методы анализа стероидов

2.14.1 Тонкослойная хроматография

2.14.2 Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.14.3 Масс-спектрометрия, 1H и 13C-ЯMР-спектроскопия

2.15 Статистическая обработка результатов

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Инженерия штаммов-продуцентов тестостерона

3.1.1 Разработка генетических конструкций, кодирующих эукариотические 17ß-ГСД

3.1.2 Экспрессия рекомбинантных генов ^ß-ГСД в клетках E. coli

3.1.3 Анализ активности рекомбинантных 17ß-ГСД

3.1.4 Экспрессия рекомбинантных генов ^ß-ГСД в клетках миколицибактерий

3.1.5 Оценка ^ß-редуктазной активности рекомбинантныхM. smegmatis

3.1.6 Конструирование тестостерон-продуцирующих штаммовМ. smegmatis с делециями в генах деструкции стероидного ядра

3.1.7 Биоконверсия фитостерина в тестостерон рекомбинантными миколицибактериями

3.2 Инженерия штаммов-продуцентов С21-стероидов

3.2.1 Разработка генетических конструкций, кодирующих компоненты ХГС

3.2.2 Экспрессия рекомбинантных генов в клетках миколицибактерий

3.2.3 Анализ активности гетерологичной системы ХГС в клеткахM. smegmatis

3.2.4 Конструирование прогестерон-продуцирующих штаммовM. smegmatis с делециями в генах деградации стероидного ядра

Биоконверсия холестерина в прогестерон рекомбинантными миколицибактериями с

делециями в генах окисления стероидного ядра

3.2.6 Биоконверсия 3-замещенных стеринов рекомбинантными миколицибактериями

3.3 Инженерия штаммов-продуцентов гидроксилированных стероидов

Разработка генетических конструкций для экспрессии генов, кодирующих гидроксилазы

CYP106A1 и CYP106A2

3.3.2 Оценка гидроксилирующей активности рекомбинантных миколицибактерий

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Метаболическая инженерия актинобактерий рода Mycolicibacterium, экспрессирующих чужеродные системы стероидогенеза»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования и состояние вопроса

Биологически активные стероидные соединения являются регуляторами важнейших жизненных процессов в организме человека и животных. Стероидные препараты находят свое применение в качестве противовоспалительных, противоревматических, прогестагенных, седативных, нейропротекторных, анаболических и контрацептивных средств, а также используются при лечении некоторых форм рака, остеопороза, вирусных инфекций (Al-Mosawi, Alebadi, 2023; Ye et al, 2024).

Традиционно стероидные фармацевтические субстанции производились с помощью технологий химического синтеза, которые характеризуются трудоемкостью, многостадийностью и низкой эффективностью, им сопутствуют высокие экологические риски (Herráiz, 2017; Fernández-Cabezón et al., 2018). К тому же, химически сложно или невозможно реализовать многие востребованные реакции стероидной модификации, такие как регио- и стереоселективное гидроксилирование стероидного ядра (Zheng et al, 2024).

Более экологичной и производительной альтернативой химической модификации стало промышленное получение стероидных интермедиатов, основанное на микробной биотрансформации стеринов, характеризующейся высокой регио- и стереоселективностью, а также мягкими условиями проводимых реакций (Feng et al., 2022; Zhang et al., 2023).

Основным сырьем для биотрансформации являются возобновляемые стерины растительного и животного происхождения, получаемые из отходов хозяйственной деятельности человека. Использование фитостеринов более предпочтительно в силу их дешевизны и высокой доступности (Fernández-Cabezón et al., 2018; Zhao et al., 2021). В производстве стероидов используются сапротрофные актинобактерии, в особенности, принадлежащие роду Mycolicibacterium, которые осуществляют окислительную деградацию стеринов. Миколицибактерии имеют клеточную стенку уникальной структуры, которая способствует растворению гидрофобного стероидного субстрата, а также характеризуются наличием системы активного транспорта стероидных молекул (Chen et al., 2023). С помощью стеринтранформирующих штаммов миколицибактерий Mycolicibacterium neoaurum, M. fortuitum или M. smegmatis получают целый спектр C19- и С22-стероидных продуктов (Zheng et al., 2024). Их биокаталитические возможности распространяются в отношении целого ряда реакций модификации стероидов благодаря наличию полиферментного аппарата катаболизма стеринов (Olivera et al, 2019).

Однако, используя только природный метаболический потенциал отдельных микроорганизмов, на сегодняшний день невозможно производить подавляющее большинство ценных стероидных соединений микробиологическим способом (Donova, 2023; Zhao et al., 2023).

Проблемой, тормозящей прогресс в разработке эффективных штаммов-биокатализаторов на основе миколицибактерий, является наличие у них побочных реакций, приводящих к деструкции или необратимой модификации стероидных субстратов или синтезируемых продуктов (Zhou et al., 2018). Наблюдается недостаток практических знаний о метаболических особенностях различных групп актинобактерий, а также острый дефицит инструментария, адаптированного для их генетической модификации (Wang et al., 2022; Donova, 2023).

Особый исследовательский интерес представляет конструирование гибридных метаболических систем, сочетающих высокую субстратную специфичность гетерологичных ферментов с уникальными катаболическими возможностями актинобактерий. Реконструкция гетерологичных систем стероидогенеза, особенно эукариотических, в бактериальных хозяевах имеет как практическую, так и фундаментальную научную ценность (Liu et al., 2022; Galân et al., 2023). Инженерия химерных путей метаболизма стероидов в клетках миколицибактерий открывает перспективы разработки биокатализаторов нового поколения для потенциального использования в микробиологическом производстве стероидных субстанций, таких как таких как высоковостребованные в медицине тестостерон, прогестерон и прегненолон, ежегодные мировые потребности в которых исчисляются десятками тонн.

Таким образом, существующий на сегодняшний день дисбаланс между растущей востребованностью в эффективных биотехнологиях микробного синтеза, ограниченным арсеналом бактериальных биокатализаторов и недостатком научных знаний о генетической модификации стеринтрансформирующих актинобактерий определяет актуальность исследований в области генной инженерии миколицибактерий для их практического использования в биоконверсии стероидов.

Степень разработанности темы исследования

Исследования процессов биосинтеза и биотрансформации стероидов в цельноклеточных системах с использованием генно-модифицированных штаммов микроорганизмов в настоящее время проводятся во многих биологических лабораториях Китая, США и Европы. В первую очередь исследователи затрагивают фундаментальные вопросы функционирования ферментов стероидной модификации в гетерологичных хозяевах с применением экспрессионных систем на основе бактерий Escherichia coli.

Так, в присутствии суррогатных редокс-партнеров продемонстрирована in vivo активность гетерологичных монооксигеназ бактериального происхождения, катализирующих реакции гидроксилирования стероидного ядра, таких как CYP106A1 и CYP109E1 из Bacillus megaterium DSM319 (Kiss et al, 2015a; Jozwik et al, 2016) и CYP106A2 из Bacillus megaterium ATCC 13368 (Hanneman et al., 2006; Kiss et al., 2015b) или CYP107D1 из Streptomyces antibioticus (Grobe et al,

2020). Показаны способы гидроксилирования стероидов рекомбинантными клетками E. coli, которые синтезируют мутантные варианты цитохрома P450 BM3 из Bacillus megaterium ATCC 14581 (Poshekhontseva et al., 2025). При использовании штамма E. coli с коэкспрессией генов, кодирующих мутантную карбонилредуктазу PmCR из Pseudomonas monteilii и формиатдегидрогеназу из BstFDH_m из Burkholderia stabilis 15516, была продемонстрирована конверсия андростендиона в тестостерон (Su et al., 2022).

В клетках E. coli также были реконструированы ферментные системы стероидогенеза высших эукариот, такие как холестерингидроксилазная/С20-С22-лиазная система (ХГС) цитохрома P450scc коры надпочечников быка (Makeeva et al., 2013; Efimova et al., 2019), системы стероид-11-гидроксилазы CYP11B2 (Schiffer et al., 2015) и стероид-21-гидроксилазы CYP21A2 человека (Brixius-Anderko et al., 2015). Реконструкция комплекса Р450-ферментных систем стероидогенеза эукариот позволила осуществить цельноклеточный синтез гидрокортизона из прогестерона (Pan et al., 2023).

Подобно модели E. coli, экспрессия генов ХГС в клетках штамма B. megaterium MS941 также обеспечивала отщепление боковой цепи холестерина с образованием прегненолона (Gerber et al., 2015). А штаммы Corynebacterium glutamicum, несущие гетерологичные цитохромы P450 из микромицетов Cochliobolus lunatus и Rhizopus oryzae, катализировали соответственно 11а- и Hß-гидроксилирование стероидов (Felpeto-Santero et al., 2015; Galán et al, 2023).

Отдельная группа микробных продуцентов представлена инженерными штаммами дрожжей. В лабораторных условиях показаны одностадийные и каскадные биопроцессы получения биологически активных андрогенных стероидов (тестостерон, болденон) с использованием Pichia pastoris GS115, экспрессирующих гены, кодирующие эукариотические17ß-гидроксистероиддегидрогеназы (Shao et al., 2016; Tang et al., 2019). Коэкспрессия кДНК компонентов ХГС в клетках Yarrowia lipolytica и Saccharomyces cerevisiae позволила осуществить микробный синтез прегненолона de novo (Zhang et al., 2019; Chen et al., 2025). Показан путь биосинтеза прогестерона, основанный на воспроизводстве в S. cerevisiae цитохромов P450 растительного происхождения (Li et al., 2025).

Описанные исследования предполагают использование традиционных и широко используемых микробных платформ, эволюционно и биохимически не связанных с модификацией стероидов, что может обусловливать низкую эффективность создаваемых штаммов-биокатализаторов.

Описаны примеры метаболической инженерии эффективных биокатализаторов на основе актинобактерий, которые характеризуются наличием активного транспорта и полиферментного комплекса катаболизма стероидов. Получен модифицированный штамм Rhodococcus erythropolis RG9, который осуществлял специфическое 16ß-гидроксилирование норандростендиона в

результате экспрессии гена, кодирующего мутантный цитохром P450 BM3-M02 (Venkataraman et al., 2015). На модели мутантных бактерий M. smegmatis продемонстрирован способ получения тестостерона из холестерина в результате комбинированного действия собственных ферментов окисления боковой цепи стеринов и гетерологичных 17-гидроксистероиддегидрогеназ из гриба C. lunatus или из бактерий Comamonas testosteroni (Fernández-Cabezón et al., 2017). Активность рекомбинантной 17-кеторедуктазы из C. lunatus также была показана in vivo в клетках актинобактерий Rhodococcus ruber Chol-4 (Guevara et al., 2019). С помощью рекомбинантных бактерий M. neoaurum MNR, несущих мутантный цитохром P450scc, показан способ получения прогестерона из стеринов (Liu et al., 2022).

Тем не менее, многие аспекты конструирования рекомбинантных стероидтрансформирующих штаммов с целевой функцией остаются недостаточно изученными. Это касается выбора оптимальной микробной платформы и подходящих систем экспрессии генов, особенностей функционирования эукариотических ферментов в бактериальных хозяевах. Наиболее перспективным направлением является реконструкция систем стероидогенеза в актинобактериях, в частности, бактериях рода Mycolicibacterium в связи с их эволюционной приспособленностью эффективно поглощать и метаболизировать стероидные субстраты.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы - экспрессия гетерологичных генов стероидогенеза в бактериях рода Mycolicibacterium и конструирование на их основе рекомбинантных штаммов для биопродукции физиологически активных стероидных соединений. Основные задачи исследования:

1. Осуществить экспрессию генов, кодирующих эукариотические 17Р-гидроксистероиддегидрогеназы из разных источников, в клетках актинобактерий Mycolicibacterium smegmatis и Mycolicibacterium neoaurum. Провести сопоставительный анализ полученных штаммов трансформированных миколицибактерий.

2. Изучить особенности биоконверсии растительных стеринов с использованием полученных рекомбинантных штаммов миколицибактерий, продуцирующих гетерологичные ферменты, катализирующие восстановление 17-карбонильной группы стероидов.

3. Осуществить функциональную реконструкцию холестерингидроксилазной/С20-С22-лиазной ферментной системы начального этапа стероидогенеза эукариот в бактериях M. smegmatis.

4. Оценить каталитические свойства сконструированных рекомбинантных миколицибактерий, экспрессирующих кДНК компонентов

холестерингидроксилазной/С20-С22-лиазной ферментной системы, в процессах биоконверсии природных и химически модифицированных стеринов.

5. Экспрессировать в клетках актинобактерий M. smegmatis гены, кодирующие бактериальные монооксигеназы CYP106A1 и CYP106A2. Исследовать стероидгидроксилирующую функцию гетерологичных оксигеназ in vivo при участии суррогатных редокс-партнеров.

Научная новизна. Получены новые фундаментальные знания о гетерологической экспрессии чужеродных генов в миколицибактериях, в том числе, с применением современных подходов синтетической биологии, а также о механизмах совместного функционирования миколицибактериальных и рекомбинантных систем стероидогенеза.

Впервые синтетические гены, кодирующие 17ß-гидроксистероиддегидрогеназы (17ß-ГСД) эукариот: Cochliobolus lunatus, Homo sapiens и Mus musculus - были экспрессированы в клетках бактерий M. smegmatis как отдельно, так и составе общих оперонов совместно с геном глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы 2 типа (Г6ФД2) из Mycobacterium tuberculosis. Введение бицистронной конструкции pNS25, кодирующей 17ß-ГСД из C. lunatus и Г6ФД2 из M. tuberculosis, в клетки штамма M. neoaurum ВКМ Ас-1816Д позволило получить уникальный рекомбинантный штамм, эффективно продуцирующий тестостерон из фитостерина в результате совместного действия миколицибактериальных ферментов стероидного катаболизма и гетерологичной грибной ^ß-ГСД, синтезируемой в совместно с микобактериальной Г6ФД2.

Созданы плазмидные конструкции, содержащие кДНК белков холестерингидроксилазной/С20-С22-лиазной ферментной системы (ХГС) бычьей коры надпочечников, включающей цитохром P450scc, адренодоксин (Adx) и адренодоксинредуктазу (AdR). Коэкспрессией генов компонентов ХГС в клетках миколицибактерий впервые осуществлена реконструкция ключевого этапа стероидогенеза млекопитающих: образование прегненолона из холестерина. Получены уникальные рекомбинантные штаммы, продуцирующие прогестерон из природных стеринов в результате комбинированного действия гетерологичной ферментной системы и собственных бактериальных ферментов. Показано, что нокаут гена hsdD, кодирующего 3ß-гидроксистероиддегидрогеназу приводит к увеличению продукции прогестерона. С использованием рекомбинантного штамма M. smegmatis (pNS11) реализован процесс биоконверсии 3-метоксиметил-замещенных стеринов (МОМ-холестерина и МОМ-фитостерина) с образованием МОМ-прегненолона с высокой эффективностью, не имеющий аналогов в мировой практике.

На основе бактерий M. smegmatis сконструированы оригинальные рекомбинантные штаммы, экспрессирующие гены, кодирующие цитохромы P450 из Bacillus megaterium:

СУР106Л1 и СУР106Л2. Рекомбинанты осуществляли специфическое 15Р-гидроксилирование андростендиона (АД). Впервые установлено, что собственные миколицибактериальные системы транспорта электронов способны снабжать электронами гетерологичные цитохромы бактерий, обеспечивая их гидроксилазную активность.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные результаты расширяют представления о функционировании гетерологичных ферментов стероидогенеза в актинобактериях и открывают перспективы создания нового поколения биопроцессов для фармацевтической промышленности и биомедицины. Показаны варианты комбинированного действия гетерологичных систем стероидогенеза и биохимического окружения миколицибактерий, обеспечивающих продукцию целевых стероидных соединений. Сконструированы уникальные рекомбинантные штаммы миколицибактерий, перспективные для биотехнологического получения высоковостребованных стероидных гормонов (тестостерон, прогестерон, прегненолон) из стеринов. Предложены новые подходы для повышения селективности и производительности биопроцессов трансформации стероидов.

Разработан подход, позволяющий использовать рекомбинантный штамм M. neoaurum (рКБ25) для микробиологического получения тестостерона из растительных стеринов при высокой начальной концентрации субстрата (20 г/л). Сконструированный рекомбинантный штамм M. neoaurum (рКБ25) депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером Ас-3073Д. Штамм-продуцент и результаты его испытаний использованы при разработке технологии получения тестостерона, переданной промышленному партнеру в соответствии с договором № 117/21 в рамках Проекта № 21-64-00024.

Экспрессия генов, кодирующих компоненты ХГС в бактериях M. smegmatis открывает возможности конструирования эффективных штаммов-продуцентов ценных С21-стероидов из животных и растительных стеринов, а также их 3-замещенных аналогов. Штамм M. smegmatis (рКБ11), сконструированный для получения прогестерона и прегненолона из стеринов, депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером Ас-3072Д.

Продемонстрирована эффективность использования миколицибактерий в качестве платформы для конструирования микробных продуцентов гидроксистероидов ряда андростана методом экспрессии генов прокариотических стероид-монооксигеназ. Полученный штамм M. smegmatis AkshBAksЮ (р№32) депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под номером Ас-2891Д и используется для пополнения лабораторной хемотеки оксистероидов.

Методология и методы исследования. В ходе выполнения диссертационной работы использованы классические и современные методы биохимии, микробиологии, биоинформатики, молекулярной биологии и метаболической инженерии.

Генетические конструкции получали с использованием полимеразной цепной реакции, рестрикционного расщепления, лигазозависимого и безлигазного клонирования ДНК. Генетическая модификация бактерий-реципиентов включала хемо- и электротрансформацию бактерий-реципиентов с последующим отбором трансформантов на селективных средах. Ростовые характеристики бактерий оценивали по выходу сырой биомассы и фотометрически по изменению оптической плотности культур. Изучение свойств рекомбинантных белков проводили с применением методов электрофоретического разделения в полиакриламидном геле, Western-блоттинга, препаративного выделения с помощью Ni-NTA агарозы. Активность гетерологичных ферментов определяли в реакциях биоконверсии стероидов in vitro и in vivo. Стероидные субстраты и продукты биотрансформации анализировали методами тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, масс-спектрометрии, спектроскопии ядерного магнитного резонанса.

Положения, выносимые на защиту:

1. Штаммы миколицибактерий с экспрессией синтетических генов, кодирующих эукариотические 17ß-гидроксистероиддегидрогеназы, характеризуются повышенной 17ß-восстановительной активностью в отношении 3,17-дикетостероидов: андростендиона (АД) и андростадиендиона (АДД).

2. Коэкспрессия в миколицибактериях гетерологичных генов, кодирующих 17ß-гидроксистероиддегидрогеназу из гриба Cochliobolus lunatus и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу из Mycobacterium tuberculosis, обеспечивает эффективное образование тестостерона из фитостерина.

3. Рекомбинантные бактерии Mycolicibacterium smegmatis с реконструированной холестерингидроксилазной/лиазной ферментной системой коры надпочечников быка способны осуществлять С20-С22-отщепление боковой цепи стеринов растительного и животного происхождения, а также их 3-метоксиметил-замещенных аналогов.

4. Прегненолон, образуемый из холестерина в клетках рекомбинантных M. smegmatis под действием гетерологичной холестерингидроксилазной/лиазной системы, подвергается дальнейшему окислению собственными ферментами актинобактерий с образованием прогестерона и 1(2)-дегидропрогестерона.

5. Бактерии M. smegmatis с экспрессией генов, кодирующих гидроксилазы CYP106A1 и CYP106A2 из Bacillus megaterium, осуществляют специфическое 15ß-гидроксилирование андростендиона.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов подтверждена использованием современных методов исследования, сертифицированного лабораторного оборудования и специализированных компьютерных программ для обработки данных.

Результаты диссертации представлены и обсуждены на российских и международных конференциях: The 16th European Congress on Biotechnology (Эдинбург, Шотландия, 2014), The 17th European Congress on Biotechnology (Краков, Польша, 2016), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2014), 19-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2015), 20-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2016), 23rd Conference on Isoprenoids (Минск, Беларусь, 2016), III Пущинской школе-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» (Пущино, 2016), Первом Российском кристаллографическом конгрессе (Москва, 2016), IV Пущинской школе-конференции «Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов» (Пущино, 2017), 1-м Российском Микробиологическом конгрессе (Пущино, 2017), Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2019), 3-м Российском Микробиологическом конгрессе (Псков, 2021), 5-м Российском Микробиологическом конгрессе (Волгоград, 2025), Global Exchange on Next-Gen Engineering and Life Sciences Research and Applications (Олюдениз, Турция, 2025).

Связь работы с научными программами и личный вклад автора. Исследования проводили в соответствии с научным направлением Лаборатории микробиологической трансформации органических соединений Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина Российской академии наук - обособленного подразделения ФИЦ «Пущинский научный центр биологических исследований Российской академии наук» (ИБФМ РАН). Работа является частью исследований, выполненных в рамках Государственных заданий Министерства науки и высшего образования РФ (темы № АААА-А16-116062110077-6 и № 122040500054-3), частично поддержана грантами Российского научного фонда (проекты 18-14-00361 и 21-6400024).

Результаты, представленные в диссертационной работе, получены автором лично, либо при его непосредственном участии на каждом из этапов исследований. Персональный вклад

автора заключался в анализе научной литературы, планировании и проведении экспериментов, обработке и опубликовании результатов. Научные положения и выводы работы базируются на результатах собственных исследований автора. Масс-спектрометрический анализ стероидов был проведен в Лаборатории масс-спектрометрии ИБФМ РАН. ЯМР-спектроскопический анализ стероидов был проведен с участием сотрудников НИЛ элементоорганических соединений химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Ше 81егп-блоттинг рекомбинантных белков проводили на базе Лаборатории топогенеза белков Научно-исследовательского института физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 25 работ, из них 6 научных статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК и индексируемых в международных реферативных базах ШоБ/Бсорш.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемых источников литературы, списка опубликованных по теме диссертации работ, двух приложений. Работа изложена на 153 страницах, содержит 7 таблиц и 49 рисунков. Список цитируемой литературы включает 259 источников, включая 249 публикаций в иностранных изданиях.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность и искреннюю благодарность научному руководителю г.н.с., д.б.н. Марине Викторовне Доновой за внимание и чуткое руководство, а также коллективу лаборатории микробиологической трансформации органических соединений ИБФМ РАН (ФИЦ ПНЦБИ РАН) за практическую помощь и поддержку при выполнении экспериментальных работ и опубликовании результатов.

Отдельно автор выражает благодарность сотрудникам ИБФМ РАН: с.н.с., к.б.н. Стрижову Н.И. за руководство при проведении отдельных этапов исследований и переданные навыки в области генной инженерии и синтетической биологии; с.н.с., к.б.н. Суходольской Г.В., с.н.с., к.х.н. Николаевой В.М., с.н.с., к.б.н. Фокиной В.В., н.с., к.б.н. Лобастовой Т.Г., с.н.с., к.х.н. Хомутову С.М., н.с. Довбне Д.В., с.н.с., к.б.н. Текучевой Д.Н., в.н.с., к.б.н. Ивашиной Т.В., с.н.с., к.б.н. Сазоновой О.И. за неоценимую помощь в проведении экспериментов, а также м.н.с. Шутову А.А. за ВЭЖХ-анализ и н.с. Баскунову Б.П. за масс-спектрометрический анализ стероидов. Автор также благодарит сотрудников МГУ им. Ломоносова: в.н.с., д.б.н. Новикову Л.А. за предоставление генетических конструкций и помощь в анализе белков и н.с., к.х.н. Казанцева А.В. за помощь в проведении ЯМР-спектроскопического анализа стероидных соединений.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Стероидные соединения

Стероиды - класс терпеноидных липидов, представляющие по своей структуре производные циклопентанпергидрофенантрена и характеризующиеся наличием трех шестичленных (А, В, С) и одно пятичленного (D) циклоалкановых колец. Образующийся из сквалена путём его циклизации ланостерол является предшественником стероидов у животных и грибов; стероиды растений образуются из циклоартенола, который также синтезируется из сквалена (Schaller, 2003). Функции стероидов зависят от их структурных особенностей: регио- и стереоположения функциональных групп, связанных со стероидным ядром, типа заместителей, степени окисления определенного углеродного атома, наличия и структуры боковой цепи. Всё многообразие стероидов в зависимости от структуры классифицируют на стерины, желчные кислоты, стероидные гормоны (эстрогены, андрогены, кортикостероиды, гестагены), а также их многочисленные производные (Джафаров с соавт, 2010). Действуя в качестве факторов регуляции экспрессии генов (Rupprecht, Holsboer, 1999), стероидные гормоны обладают широким спектром физиологических активностей: осуществляют контроль над процессами развития и функционирования организма, участвуют в регуляции клеточного роста и дифференциации, размножении, поддержании гомеостаза, обеспечении энергией (Wollam, Antebi, 2011). Некоторые стероиды выполняют роль нейромодуляторов и нейромедиаторов, влияя на развитие и реализацию когнитивных функций человека (Maurice et al., 2006).

Наряду с антибиотиками, стероиды входят в группу самых продаваемых лекарств и используются практически во всех областях медицины (Fernandes et al., 2003; Donova, 2017; Al-Mosawi, Alebadi, 2023). Этот список включает более 400 продуктов с мировой рыночной стоимостью более 17 миллиардов долларов США (Zheng et al., 2024). Различные стероидные соединения и их производные используются в качестве противовоспалительных (Singh et al., 2016; Peters et al., 2016; Fontaine-Carbonnel et al, 2016), противоаллергических; (Liyanage et al, 2017; Suratman et al., 2023), противораковых (Lynggaard et al., 2016; Mendoza Lara et al., 2025) препаратов или гормональных средств при заместительной терапии (Debono et al., 2009; Lang et al., 2015). Многие препараты на основе стероидов входят в Перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов, утвержденный Правительством Российской Федерации (Распоряжение Правительства РФ, 2019), и применяются по жизненно-важным показаниям. Высокая важность применения стероидных препаратов обусловливает необходимость проведения исследований в области биохимии и биотехнологии стероидов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Карпов Михаил Владимирович, 2026 год

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ахрем А.А., Титов Ю.А. Стероиды и микроорганизмы. М.: Наука, 1970. - 525 с.

2. Войшвилло Н.Е., Парнес Я.А. Селективное расщепление стеринов микроорганизмами // Биол. Науки. - 1981. - Т. 2. - С. 32-46.

3. Джафаров М.Х., Зайцев С.Ю., Максимов В.И. Стероиды: строение, получение, свойства и биологическое значение, применение в медицине и ветеринарии. - СПб.: Лань, 2010. - 288 с.

4. Егорова О.В. 17ß-восстановление 3,17-дикетостероидов стеринтрансформирующими микобактериями. - 2004. Дис. ... канд. биол. наук. 136 с.

5. Карпов М.В., Николаева В.М., Фокина В.В., Шутов А.А., Казанцев А.В., Стрижов Н.И., Донова М.В. Конструирование и функциональный анализ рекомбинантных штаммов Mycolicibacterium smegmatis, несущих гены бациллярных цитохромов CYP106A1 и CYP106A2 // Биотехнология. - 2021. - Т. 37. - № 6. - С. 34-47.

6. Карпов М.В., Суходольская Г.В., Николаева В.М., Фокина В.В., Шутов А.А., Донова М.В., Стрижов Н.И. Создание рекомбинантных микобактерий, продуцирующих тестостерон // Биохимия, физиология и биосферная роль микроорганизмов: сб. тез. III Пущинской школы-конференции. Пущино, 2016. - С. 102-105.

7. Новикова Л.А., Фалетров Я.В., Ковалева И.Е., Мауерсбергер Ш., Лузиков В.Н., Шкуматов В.М. От структуры и функции ферментов биосинтеза стероидов к новым генно-инженерным технологиям // Успехи биологической химии. - 2009. - Т. 49. - С. 159-210.

8. Об утверждении перечня жизненно необходимых и важнейших лекарственных препаратов, а также перечней лекарственных препаратов для медицинского применения и минимального ассортимента лекарственных препаратов, необходимых для оказания медицинской помощи: Распоряжение Правительства РФ от 12.10.2019 N 2406-р (ред. от 15.01.2025) // Справочно-правовая система «КонсультантПлюс». - URL: http://www.consultant.ru/document/cons_doc_LAW_335635/ (дата обращения: 19.11.2025).

9. Пошехонцева В.Ю., Стрижов Н.И., Карпов М.В., Николаева В.М., Казанцев А.В., Сазонова О.И., Шутов А.А., Донова М.В. Экспрессия синтетического гена cyp102A1-LG23 и функциональный анализ рекомбинантного цитохрома P450 BM3-LG23 в актинобактериях Mycolicibacterium smegmatis // Биохимия. - 2023. - Т. 88. - № 9. - С. 1631-1641.

10. Радбиль Б.А., Кочев Д.М., Золин Б.А., Климанский В.И., Крепкий Е.Н., Лобанова Л.В. Способ получения ситостерина из таллового пека. 1999. Патент РФ N.2128662.

11. Adamski J., Normand T., Leenders F., Monte D., Begue A., Stehelin D., Jungblut P.W., de Launoit Y., Molecular cloning of a novel widely expressed human 80 kDa 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase IV // Biochem. J. - 1995. - V. 311. - P. 437-443.

12. Agematu H., Matsumoto N., Fujii Y., Kabumoto H, Doi S, Machida K., Ishikawa J., Arisawa A. Hydroxylation of testosterone by bacterial cytochromes P450 using the Escherichia coli expression system // Biosci. Biotech. Biochem. - 2006. - V. 70. - P. 307-311.

13. Al Jasem Y., Khan M., Taha A. Thiemann T. Preparation of steroidal hormones with an emphasis on transformations of phytosterols and cholesterol - a review // Mediterr. J.Chem. - 2014. - V. 3. - No. 2. - P. 796-830.

14. Al-Mosawi R.H., Alebadi N.A.M. Usage of corticosteroids as therapeutic agents in diseases // Med. J. Babylon. - 2023. - V. 20. - P. 447-450.

15. Ambrus G., Ilkoy E., Jekkel A., Horvath G., Bocskei Z. Microbial transformation of ß-sitosterol and stigmasterol into 26-oxygenated derivatives // Steroids. - 1995. - V. 60. - P. 621-625.

16. Andor A., Jekkel A., Hopwood D.A., Jeanplong F., Ilkoy E., Konya A., Kurucz I., Ambrus G. Generation of useful insertionally blocked sterol degradation pathway mutants of fast-growing mycobacteria and cloning, characterization, and expression of the terminal oxygenase of the 3-ketosteroid 9alpha-hydroxylase in Mycobacterium smegmatis mc(2)155 // Appl. Environ. Microbiol. -2006. - V. 72. - P. 6554-6559.

17. Andryushina V.A., Morozova L.S., Grinenko G.S. Synthesis of testosterone from androst-4-ene-3,17-dione // Pharm. Chem. J. - 1987. V. 21. P. 883-884.

18. Arruda S., Bomfim G., Knights R., Huima-Byron T., Riley L.W. Cloning of an M. tuberculosis DNA fragment associated with entry and survival inside cells // Science. - 1993. - V. 261. - P. 14541457.

19. Atrat P., Hösel P., Richter W., Meyer H., Hörhold C. Interactions of Mycobacterium fortuitum with solid sterol substrate particles // J. Basic microbiol. - 1991. - V. 31. - P. 413-422.

20. Bansal-Mutalik R., Nikaido H. Quantitative lipid composition of cell envelopes of Corynebacterium glutamicum elucidated through reverse micelle extraction // PNAS. - 2011. - V. 108. - P. 15360-15365.

21. Beyer H.M., Gonschorek P., Samodelov S.L., Meier M., Weber W., Zurbriggen M.D. AQUA cloning: a versatile and simple enzyme-free cloning approach // PLoS ONE. - 2015. - V. 10. - No. e0137652.

22. Benites C.I., Concha V.O.C., Reis S.M.P.M., de Oliveira A.C. Physiochemical characterization of soybean oil deodorizer distillate // Chem. Eng. Trans. - 2009. - V. 17. - P. 903-908.

23. Bergstrand L.H., Cardenas E., Holert J., Van Hamme J.D., Mohn W.W. Delineation of steroid-degrading microorganisms through comparative genomic analysis // mBio. - 2016. - V. 7. - No. e00166.

24. Bernhardt R. Cytochromes P450 as versatile biocatalysts // J. Biotechnol. - 2006. - V. 124. - P. 128-145.

25. Biswas M.G., Russell D.W. Expression cloning and characterization of oxidative 17beta- and 3alpha-hydroxysteroid dehydrogenases from rat and human prostate // J. Biol. Chem. - 1997. - V. 272.

- P. 15959-15966.

26. Bracco P., Janssen D.B., Schallmey A. Selective steroid oxyfunctionalisation by CYP154C5, a bacterial cytochrome P450 // Microb. Cell Fact. - 2013. - V. 12. - No. 95.

27. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Anal. Biochem. - 1976. - V. 72. - P. 248-254.

28. Bragin E.Yu., Shtratnikova V.Yu., Dovbny D.V., Schelkunov M.I., Pekov Yu.A., Malakho S.G., Egorova O.V., Ivashina T.V., Sokolov S.L., Ashapkina V.V., Donova M.V. Comparative analysis of genes encoding key steroid core oxidation enzymes in fast-growing Mycobacterium spp. strains // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. - 2013. - V. 138. - P. 41-53.

29. Brixius-Anderko S., Schiffer L., Hannemann F., Janocha B., Bernhardt R. A CYP21A2 based whole-cell system in Escherichia coli for the biotechnological production of premedrol. Microb. Cell Fact. - 2015. - V. 14. - No. 135.

30. Brzostek A., Rumijowska-Galewicz A., Dziadek B., Wojcik E.A., Dziadek J. ChoD and HsdD can be dispensable for cholesterol degradation in mycobacteria // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 2013.

- V. 134. - P. 1-7.

31. Brzostek A. Identification and targeted disruption of the geneencoding the main 3-ketosteroid dehydrogenase in Mycobacterium smegmatis // Microbiol. - 2005. - V. 151. - P. 2393-2402.

32. Brzostek A., Pawelczyk J., Rumijowska-Galewicz A., Dziadek B., Dziadek J. Mycobacterium tuberculosis is able to accumulate and utilize cholesterol // J. Bacteriol. - 2009. - V. 191. - P. 65846591.

33. Byakov A., Karpov M., Strizhov N., Donova M. Creation and characterization of Mycolicibacterium smegmatis mc2155 with deletions in genes encoding sterol oxidation enzymes // BIO Web Conf. - 2023. - V. 57. - No. 03004.

34. Capyk J.K., Kalscheuer R., Stewart G.R., Liu J., Kwon H., Zhao R, Okamoto S., Jr. W.R.J., Eltis L.D., Mohn W.W. Mycobacterial cytochrome P450 125 (Cyp125) catalyzes the terminal hydroxylation of C27-steroids // J. Biol. Chem. - 2009. - V. 284. - P. 35534-35542.

35. Carere J., McKenna S.E., Kimber M.S., Seah S.Y. Characterization of an aldolase-dehydrogenase complex from the cholesterol degradation pathway of Mycobacterium tuberculosis // Biochemistry. - 2013. - V. 52. - P. 3502-3511.

36. Carroll E., Ravi Gopal B., Raghavan I., Minakshi M., Wang Z.Q. A cytochrome P450 CYP87A4 imparts sterol side-chain cleavage in digoxin biosynthesis // Nat. Commun. - 2023. - V. 14. - No. 4042.

37. Casabon I., Swain K., Crowe A.M., Eltis L.D., Mohn W.W. Actinobacterial acyl coenzyme A synthetases involved in steroid side-chain catabolism // J. Bacteriol. - 2014. - V. 196. - P. 579-587.

38. Casabon I., Zhu S.H., Otani H., Liu J., Mohn W.W., Eltis L.D. Regulation of the KstR2 regulon of Mycobacterium tuberculosis by a cholesterol catabolite // Mol. Microbiol. - 2013. - V. 89. - P. 12011212.

39. Casali N., Riley L. A phylogenomic analysis of the Actinomycetales mce operons // BMC Genomics. - 2007. - V. 8. - No. 60.

40. Chang J.C., Miner M.D., Pandey A.K., Gill W.P., Harik, N.S., Sassetti C.M. igr genes and Mycobacterium tuberculosis cholesterol metabolism // J. Bacteriol. - 2009. - V. 191. - P. 5232-5239.

41. Chen J., Fruhauf A., Fan C., Ponce J., Ueberheide B., Bhabha G., Ekiert D. Structure of an endogenous mycobacterial MCE lipid transporter // Nature. - 2023. - V. 620. - P. 445-452.

42. Chen Q., Wei W., Chao Z., Qi R., He J., Chen H., Wang K., Wang X., Rao Y., Zhou J. Electron transfer engineering of artificially designed cell factory for complete biosynthesis of steroids // Nat. Commun. - 2025. - V. 16. - No. 3740.

43. Clarke T.R., Bain P.A., Sha L., Payne A.H. Enzyme characteristics of two distinct forms of mouse 3-hydroxysteroid dehydrogenase/5-4-isomerase complementary deoxyribonucleic acids expressed in COS-1 cells // Endocrinology. - 1993. - V. 132. - P. 1971-1976.

44. Cook D.J., Finnigan J.D., Cook K., Black G.W., Charnock S.J. Cytochromes P450: history, classes, catalytic mechanism, and industrial application // Adv. Protein Chem. Struct. Biol. - 2016. - V. 105. - P. 105-126.

45. Dangi B., Kim K.H., Kang S.H., Oh T.J. Tracking down a novel steroid hydroxylating promiscuous cytochrome P450, CYP154C8 from Streptomyces sp. W2233-SM // Chembiochem. - 2018.

- V. 19. - P. 1066-1077.

46. Debono M, Price JN, Ross RJ. Novel strategies for hydrocortisone replacement // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. - 2009. - V. 23. - P. 221-232.

47. Denisov I.G., Makris T.M., Sligar S.G., Schlichting I. Structure and chemistry of cytochrome P450 // Chem. Rev. - 2005. - V. 105. - P. 2253-2277.

48. Donova M., Dovbnya D., Shtratnikova V., Strizhov N., Karpov M., Khomutov S., Bragin, E., Ivashina T., Sukhodolskaya G. Novel bioprocesses for valuable steroid production from phytosterol // New Biotechnol. - 2016. - V. 33. - P. S39.

49. Donova M.V. Current trends and perspectives in microbial bioconversions of steroids // Microbial Steroids. Methods in Molecular Biology / ed. by C.J. Barreiro, L. Barredo. Humana Press, New York, 2023. - V. 2704. - P. 3-21.

50. Donova M.V. Steroid bioconversions // Microbial Steroids. Methods in Molecular Biology / ed. by J.L. Barredo, I. Herraiz. Humana Press, New York, 2017. - V. 1645. - P. 1-13.

51. Donova M.V. Transformation steroid compounds by actinobacteria // Appl. Biochem. Microbiol.

- 2007. - V. 43. - P. 1-14

52. Donova M.V., Egorova O.V. Microbial steroid transformations: current state and prospects // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2012. - V. 94. - P. 1423-1447.

53. Donova M.V., Egorova O.V., Nikolayeva V.M. Steroid 17ß-reduction by microorganisms - a review // Process Biochem. - 2005a. - V. 40. - P. 2253-2262.

54. Donova M.V., Gulevskaya S.A., Dovbnya D.V., Puntus I.F. Mycobacterium sp. mutant strain producing 9a-hydroxyandrostenedione from sitosterol // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2005b. - V. 67.

- P. 671-678.

55. Dovbnya D.V., Egorova O.V., Donova M.V. Microbial side-chain degradation of ergosterol and its 3-substituted derivatives: a new route for obtaining of deltanoids // Steroids. - 2010. - V. 75. - P. 653-658.

56. Dresen C., Lin L. Y.-C., D'Angelo I., Tocheva E. I., Strynadka N., Eltis L. D. A flavin-dependent monooxygenase from Mycobacterium tuberculosis involved in cholesterol catabolism // J. Biol. Chem.

- 2010. - V. 285. - P. 22264-22275.

57. Driscoll M.D., McLean K.J., Levy C., Mast N., Pikuleva I.A., Lafite P., Rigby S.E.J., Leys D. and Munro A.W. Structural and biochemical characterization of Mycobacterium tuberculosis CYP142 // J. Biol. Chem. - 2010. - V. 285. - P. 38270-38282.

58. Dufourc E.J. Sterols and membrane dynamics // J. Chem. Biol. - 2008. - V 1. - P. 63-77.

59. Efimova V.S., Isaeva L.V., Rubtsov M.A., Novikova L.A. Analysis of in vivo activity of the bovine cholesterol hydroxylase/lyase system proteins expressed in Escherichia coli // Mol. Biotechnol.

- 2019. - V. 61. - P. 261-273.

60. Egorova O., Nikolayeva V., Donova M. 17-Hydroxysteroid dehydrogenases of Mycobacterium sp VKM Ac-1815D mutant strain // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. - 2002. - V. 81. - P. 273-279.

61. Egorova O.V., Nikolayeva V.M., Suzina N.E., Donova M.V. Localization of 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase in Mycobacterium sp. VKM Ac-1815D mutant strain. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 2005. - V. 94. - P. 519-525.

62. Epiktetov D.O., Karpov M.V., Donova M.V. Identification of electron transfer in the system of ferredoxins and ferredoxin reductases from Mycolicibacterium smegmatis // Microbiology. - 2024. - V. 93. - P. 149-153.

63. Ercoli A., Ruggierii P.D. An improved method of preparing testosterone, dihydrotestosterone and some of their esters // J. Am. Chem. Soc. - 1953. - V. 75. - P. 650-653.

64. Felpeto-Santero C., Galán B., Luengo J.M., Fernández-Cañon J.M., Del Cerro C., Medrano F.J., García J.L. Identification and expression of the 11ß-steroid hydroxylase from Cochliobolus lunatus in Corynebacterium glutamicum // Microb. Biotechnol. - 2019. - V. 12. - P. 856-868.

65. Feng J., Wu Q., Zhu D., Ma Y. Biotransformation enables innovations toward green synthesis of steroidal pharmaceuticals // ChemSusChem. - 2022. - V. 15. - No. e202102399.

66. Fernandes P., Cruz A., Angelova B., Pinheiro H.M., Cabral J.M.S. Microbial conversion of steroid compounds: recent developments // Enzyme Microb. Technol. - 2003. - V. 32. - P. 688-705.

67. Fernandes P., Cabral J.M. Phytosterols: applications and recovery methods // Bioresour Technol.

- 2007. - V. 98. - P. 2335-2350.

68. Fernández-Cabezón L, Galán B. García J.L. Engineering Mycobacterium smegmatis for testosterone production // Microb. Biotechnol. - 2017. - V. 10. - P. 151-161.

69. Fernández-Cabezón L, Galán B. García J.L. New insights on steroid biotechnology // Front. Microbiol. -2018. - V. 9. - No. 958.

70. Fieweger R.A., Wilburn K.M., Montague C.R., Roszkowski E.K., Kelly C.M., Southard T.L., Sondermann H., Nazarova E.V., VanderVen B.C. MceG stabilizes the Mce1 and Mce4 transporters in Mycobacterium tuberculosis // J. Biol. Chem. - 2023. - V. 299. - P. 102910.

71. Finnigan J.D., Young C., Cook D.J., Charnock S.J., Black G.W. Cytochromes P450 (P450s): A review of the class system with a focus on prokaryotic P450s // Adv. Protein Chem. Struct. Biol. - 2020.

- V. 122. - P. 289-320.

72. Fogal S., Bergantino E., Motterle R., Castellin A. and Arvotti, A. Process for the preparation of testosterone. 2013. Patent US 2013/8592178B2.

73. Fokina V.V., Karpov M.V., Kollerov V.V., Bragin E.Y., Epiktetov D.O., Sviridov A.V., Kazantsev A.V., Shutov A.A., Donova M.V. Recombinant extracellular cholesterol oxidase from Nocardioides simplex. Biochemistry (Moscow). - 2022. - V. 87. - P. 903-915.

74. Fontaine-Carbonnel S., Rippert P., Poirot I., Gachet D., Lattre C. de, Vuillerot C. 2005-2015: Ten years clinical experience in treating DMD patients by corticosteroids in Lyon // Ann. Phys. Rehabil. Med. - 2016. - V.59. - P. e82.

75. Frank D.J., Waddling C.A., La M., Ortiz de Montellano P R. Cytochrome P450 125A4, the Third Cholesterol C-26 Hydroxylase from Mycobacterium smegmatis. Biochemistry. - 2015. - V. 54. - P. 6909-6916.

76. Galán B., Felpeto-Santero C., García J.L. Production of 11a-hydroxysteroid derivatives by Corynebacterium glutamicum expressing the Rhizopus oryzae hydroxylating system // Methods Mol. Biol. - 2023. - V. 2704. - P. 277-289.

77. Galán B., Uhía I., García-Fernández E., Martínez I., Bahíllo E., de la Fuente J.L., Barredo J.L., Fernández-Cabezón L., García J.L. Mycobacterium smegmatis is a suitable cell factory for the production of steroidic synthons // Microb. Biotechnol. - 2017. - V. 10. - P. 138-150.

78. García J.L., Uhía I., Galán B. Catabolism and biotechnological applications of cholesterol degrading bacteria // Microb. Biotechnol. - 2012. - V. 5. - P. 679-699.

79. García J.L., Uhía I., García E., Galán B. Bacterial degradation of cholesterol and other contaminant steroids // Microbial Bioremediation of Non-metals: Current Research / ed. by A.-I. Koukkou. Caister Academic Press, Poole, U.K, 2011. - P. 23-43.

80. García-Fernández E., Frank D.J., Galán B., Kells P.M., Podust L.M., García J.L., Ortiz de Montellano P.R. A highly conserved mycobacterial cholesterol catabolic pathway // Environ. Microbiol.

- 2013. - V 15. - P. 2342-2359.

81. García-Fernández E., Medrano F.J., Galán B., García J.L. Deciphering the transcriptional regulation of cholesterol catabolic pathway in mycobacteria: identification of the inducer of KstR repressor // J. Biol. Chem. - 2014. - V. 289. - P. 17576-17588.

82. García-Fernández J., Galán B., Medrano F.J., García J.L. Characterization of the KstR2 regulator responsible of the lower cholesterol degradative pathway in Mycobacterium smegmatis // Environ. Microbiol. Rep. - 2015. - V. 7. - P. 155-163.

83. van der Geize R., Hessels G.I., van Gerwen R., van der Meijden,P., and Dijkhuizen L. Unmarked gene deletion mutagenesis of kstD, encoding 3-ketosteroid A1-dehydrogenase, in Rhodococcus erythropolis SQ1 using sacB as counter-selectable marker // FEMS Microbiol. Lett. - 2001. - V. 205. -P. 197-202.

84. van der Geize R., Hessels G.I., Dijkhuizen L. Molecular and functional characterization of the ktsD2 gene of Rhodococcus erythropolis strain SQ1 encoding a second 3-ketosteroid delta(1)-dehydrogenase isoenzyme // Microbiology. - 2002a. - V. 48. - P. 3285-3293.

85. van der Geize R. Targeted distruption of kstD gene encoding a 3-ketocteroid delta(1)-dehydrogenase isoensyme of Rhodococcus erythropolis strain SQ1 // Appl. Environ. Microbiol. - 2000.

- V. 66. - P. 236-237.

86. van der Geize R., Yam K, Heuser T, Wilbrink M.H., Hara H., Anderton M.C., Sim E., Dijkhuizen L., Davies J.E., Mohn W.W., Eltis L.D. A gene cluster encoding cholesterol catabolism in a soil actinomycete provides insight into Mycobacterium tuberculosis survival in macrophages // PNAS. -2007. - V. 104. P. - 1947-1952.

87. van der Gieze R., Hessels G.I., van Gerwen R., van der Meijden P., Dijkhuizen L. Molecular and functional characterization of kshA and kshB, encoding two components of 3-ketosteroid 9a-hydroxylase, a class IA monooxygenase, in Rhodococcus erythropolis strain SQ1 // Mol. Microbiol. -2002b. - V. 45. - P. 1007-1018.

88. Gerber A., Kleser M., Biedendieck R., Bernhardt R., Hannemann F. Functionalized PHB granules provide the basis for the efficient side-chain cleavage of cholesterol and analogs in recombinant Bacillus megaterium // Microb. Cell Fact. - 2015. - V. 14. - No. 107.

89. Girhard M., Klaus T., Khatri Y., Bernhardt R., Urlacher V.B. Characterizationof the versatile monooxygenase CYP109B1 from Bacillus subtilis. Appl. Microbiol. Biot. - 2010. - V. 87. - P. 595607.

90. Goetschel R., Bar R. Formation of mixed crystals in microbial conversion of sterols and steroids // Enzyme Microb. Technol. - 1992. - V. 14. - P. 462-469.

91. Goren T., Harnik M., Rimon S., Aharanowitz Y. 1-Ene-steroid reductase of Mycobacterium sp NRRL B-3805 // J. Steroid. Biochem. - 1983. - V. 19. - P. 1789-1797.

92. Green M.T., Dawson J.H., Gray H.B. Oxoiron(IV) in chloroperoxidase compound II is basic: implications for P450 chemistry // Science. - 2004. - V. 304. - P. 1653-1656.

93. Grobe S., Wszolek A., Brundiek H., Fekete M., Bornscheuer U.T. Highly selective bile acid hydroxylation by the multifunctional bacterial P450 monooxygenase CYP107D1 (OleP) // Biotechnol. Lett. - 2020. - V. 42. - P. 819-824.

94. Guengerich F.P. Uncommon P450-catalyzed reactions // Current Drug Metab. - 2001. - V. 2. -P. 93-115.

95. Guevara G., Olortegui Flores Y., Fernández de Las Heras L., Perera J., Navarro Llorens J.M. Metabolic engineering of Rhodococcus ruber Chol-4: A cell factory for testosterone production // PLoS One. - 2019. - V. 14. - No. e0220492.

96. Gulla V., Banerjee T., Patil S. Bioconversion of soysterols to androstenedione by Mycobacterium fortuitum subsp fortuitum NCIM 5239, a mutant derived from total sterol degrader strain // J. Chem. Technol. Biotechnol. - 2010. - V. 85. - No. 8. - P. 1135-1141.

97. Gupta R.S., Lo B., Son J. Phylogenomics and comparative genomic studies robustly support division of the genus Mycobacterium into an emended genus Mycobacterium and four novel genera. Front Microbiol. - 2018. - V.9. - No. 67.

98. Hannemann F, Bichet A, Ewen K.M., Bernhardt R. Cytochrome P450 systems - biological variations of electron transport chains // Biochim. Biophys. Acta. - 2007. - V. 1770. - P. 330-344.

99. Hannemann F, Virus C, Bernhardt R. Design of an Escherichia coli system for whole cell mediated steroid synthesis and molecular evolution of steroid hydroxylases // J. Biotechnol. - 2006. -V. 124. - P. 172-181.

100. Herráiz I. Chemical pathways of corticosteroids, industrial synthesis from sapogenins. Methods Mol. Biol. - 2017. -V. 1645. - P. 15-27.

101. Hartz P., Strohmaier S.J., El-Gayar B.M., Abdulmughni A., Hutter M.C., Hannemann F., Gillam E.M.J., Bernhardt R. Resurrection and characterization of ancestral CYP11A1 enzymes. FEBS J. - 2021. - V. 288. - P. 6510-6527.

102. de las Heras F.L, Mascaraque V., García-Fernández E., Navarro-Llorens J.M., Perera J., Drzyzga O. ChoG is the main inducible extracellular cholesterol oxidase of Rhodococcus sp. strain CECT3014 // Microbiol. Res. - 2011. - V. 166. - P. 403-418.

103. Ho N.A., Dawes S.S., Crowe A.M., Casabon I., Gao C., Kendall S.L., Baker E.N., Eltis L.D., Lott J.S. The structure of the transcriptional repressor KstR in complex with CoA thioester cholesterol metabolites sheds light on the regulation of cholesterol catabolism in Mycobacterium tuberculosis // J. Biol. Chem. - 2016. - V. 291. - P. 7256-7266.

104. Holert J., Cardenas E., Bergstrand L.H., Zaikova E., Hahn A.S., Hallam S.J., Mohn W.W. Metagenomes reveal global distribution of bacterial steroid catabolism in natural, engineered, and host environments. mBio9. - 2018. - V. 9. - No. 1.

105. Horinouchi M. A new bacterial steroid degradation gene cluster which consists of aromatic compound degradation genes for seco-steroids and 3-ketosteroid dehydrogenase genes in Comamonas testosteroni TA441 // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. - V. 69. - P. 4421-4430.

106. Horinouchi M., Hayashi T., Koshino H., Kurita T., Kudo T. Identification of 9,17-dioxo-1,2,3,4,10,19-hexanorandrostan-5-oic acid, 4-hydroxy-2-oxohexanoic acid, and 2-hydroxyhexa-2,4-dienoic acid and related enzymes involved in testosterone degradation in Comamonas testosteroni TA441 // Appl. Environ. Microbiol. - 2005. - V. 71. - P. 5275-5281.

107. Horinouchi M., Kurita T., Yamamoto T., Hatori E., Hayashi T., Kudo T. Steroid degradation gene cluster of Comamonas testosteroni consisting of 18 putative genes from meta-cleavage enzyme gene tesB to regulator gene tesR // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2004. - V. 324. - P. 597-604.

108. Horinouchi M., Yamamoto T., Taguchi K., Arai H., Kudo, T. Meta-cleavage enzyme gene tesB is necessary for testosterone degradation in Comamonas testosteroni TA441 // Microbiology. - 2001. -V. 147. - P. 3367-3375.

109. Horinouchi M. Steroid degradation in Comamonas testosteroni // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 2012. - V. 129. - P. 4-14.

110. Ihara M., Tokunaga Y., Taniguchi N., Fukumoto K. Stereoselective synthesis of (+)-testosterone via intramolecular 13-dipolar cycloadditxon of nitrile oxide // Tetrahedron. - 1991. - V. 47. - P. 66356648

111. Ivanova E.G., Doronina N.V., Trotsenko Y.A. Aerobic methylobacteria are capable of synthesizing auxins // Microbiology. - 2001. - V. 70. - P. 392-397.

112. Ivashina T.V., Nikolaeva V.M., Dovbnya D.V., Donova M.V. Cholesterol oxidase ChoD is not a critical enzyme accounting for oxidation of sterols to 3-keto-4-ene steroids in fast-growing Mycobacterium sp. VKM Ac-1815D // Steroid Biochem. Mol. Biol. - 2012. - V. 129. - P. 47-53.

113. Jackson M., Stevens C.M., Zhang L., Zgurskaya H.I., Niederweis M.Transporters involved in the biogenesis and functionalization of the mycobacterial cell envelope // Chem. Rev. - 2020. - V. 121.

- P. 5124-5157.

114. Johnston J.B., Ouellet H., Ortiz de Montellano P.R. Functional redundancy of steroid C26-monooxygenase activity in Mycobacterium tuberculosis revealed by biochemical and genetic analyses // J. Biol. Chem. - 2010. - V. 285. - No. 47. - P. 36352-36360.

115. Jozwik I.K., Kiss F.M., Gricman L., Abdulmughni A., Brill E., Zapp J., Pleiss J., Bernhardt R., Thunnissen A.W. Structural basis of steroid binding and oxidation by the cytochrome P450 CYP109E1 from Bacillus megaterium // FEBS J . - 2016. - V. 283. - P. 4128-4148.

116. Karpov M., Strizhov N., Novikova L., Lobastova T., Khomutov S., Shutov A., Kazantsev A., Donova M. Pregnenolone and progesterone production from natural sterols using recombinant strain of Mycolicibacterium smegmatis mc2 155 expressing mammalian steroidogenesis system // Microb. Cell Fact. - 2024. - V. 23. - No. 105.

117. Karpov M., Sukhodolskaya G., Nikolayeva V., Fokina V., Shutov A., Donova M., Strizhov N. Bio-based testosterone production from phytosterol // Proc. Natl. Acad. Sci. Belarus Chem. Ser. - 2016.

- No. 3. - P. 78.

118. Kavanagh K.L., Jörnvall H., Persson B., Oppermann U., The SDR superfamily: functional and structural diversity within a family of metabolic and regulatory enzymes // Cell. Mol. Life Sci. - 2008.

- V. 65. - P. 3895-3906.

119. Kendall S. L. Cholesterol utilization in mycobacteria is controlled by two TetR-type transcriptional regulators: kstR and kstR2 // Microbiology. - 2010. - V. 156. - P. 1362-1371.

120. Kendall S.L. A highly conserved transcriptional repressor controls a large regulon involved in lipid degradation in Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis // Mol. Microbiol. -2007. - V. 65. - P. 684-699.

121. Kendall S.L. Cholesterol utilization in mycobacteria is controlled by two TetR-type transcriptional regulators: kstR and kstR2 // Microbiology. - 2010. - V. 56. - P. 1362-1371.

122. Kieslich K. Microbial side-chain degradation of sterols // J. Basic Microbiol. - 1985. - V. 25. -P. 461-474.

123. Kim K.H., Lee C.W., Dangi B., Park S.H., Park H., Oh T.J., Lee J.H. Crystal structure and functional characterization of a cytochrome P450 (BaCYP106A2) from Bacillus sp. PAMC 23377 // J. Microbiol. Biotechnol. - 2017. - V. 27. - P. 1472-1482.

124. Kim S.J., Kweon O., Cerniglia C.E. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons by Mycobacterium strains // Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology / ed. by K.N. Timmis. Springer, Berlin, Heidelberg, 2010. - P. 1479-1490.

125. Kiss F.M., Khatri Y., Zapp J., Bernhardt R. Identification of new substrates for the CYP106A1-mediated 11-oxidation and investigation of the reaction mechanism // FEBS Lett. - 2015a - V. 589. -P. 2320-2326.

126. Kiss F.M., Schmitz D., Zapp J., Dier T.K., Volmer D.A., Bernhardt R. Comparison of CYP106A1 and CYP106A2 from Bacillus megaterium - identification of a novel 11-oxidase activity // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2015b. - V. 99. - P. 8495-8514.

127. Klepp L.I., Forrellad M.A., Osella A.V., Blanco F.C., Stella E.J., Bianco M.V., Santangelo M. de L., Sassetti C., Jackson M., Cataldi A.A., Bigi F., Morbidoni H.R. Impact of the deletion of the six mce operons in Mycobacterium smegmatis // Microbes Infect. - 2012. - V. 4. - P. 590-599.

128. Kollerov V.V., Timakova T.A., Shutov A.A., Donova M.V. Boldenone and testosterone production from phytosterol via one-pot cascade biotransformations // J. Fungi (Basel). -2024. - V. 10.

- No. 830.

129. Korycka-Machala M., Ziolkowski A., Rumijowska-Galewicz A., Lisowska K., Sedlaczek L. Polycations increase the permeability of Mycobacterium vaccae cell envelopes to hydrophobic compounds // Microbiology-SGM. - 2001. - V. 147. - P. 2769-2781.

130. Kreit J. Microbial catabolism of sterols: focus on the enzymes that transform the sterol 3ß-hydroxy-5-en into 3-keto-4-en // FEMS Microbiol. Lett. - 2017. - V. 364. - No. fnx007.

131. Kreit J., Sampson N.S. Cholesterol oxidase: physiological functions // FEBS J. - 2009. - V. 276.

- P. 6844-6856.

132. Lack N.A., Lowe E.D., Liu J., Eltis L.D., Noble M.E.M., Sim E., Westwood IM. Structure of HsaD, a steroid-degrading hydrolase, from Mycobacterium tuberculosis // Acta. Crystallogr. Sect. F. Struct. Biol. Cryst. Commun. - 2008. - V. 64. - P. 2-7.

133. Lack N.A., Yam K.C., Lowe E.D., Horsman G.P., Owen R.L., Sim E.,. Eltis L.D. Characterization of a carbon-carbon hydrolase from Mycobacterium tuberculosis involved in cholesterol metabolism // J. Biol. Chem. - 2010. - V. 285. - P. 434-443.

134. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685.

135. Lam T.H.J., Yuen K.Y., Ho P.L., Wong,K.C., Leong W.M., Law H.K.W. Differential fadE28 expression associated with phenotypic virulence of Mycobacterium tuberculosis // Microb. Pathog. -2008. - V. 45. - P. 12-17.

136. Lamb D.C., Jackson C.J., Warrilow A.G., Manning N.J., Kelly D.E., Kelly S.L. Lanosterol biosynthesis in the prokaryote Methylococcus capsulatus: insight into the evolution of sterol biosynthesis // Mol. Biol. Evol. - 2007. - V. 24. - P. 1714-1721.

137. Lambeth J.D. Enzymology of mitochondrial side-chain cleavage by cytochrome P-450scc // Frontiers in Biotransformation. - 1991. - V. 3. - P. 58-100.

138. Lang K., Burger-Stritt S., Hahner S. Is DHEA replacement beneficial in chronic adrenal failure? // Best Pract. Res. Clin. Endocrinol. Metab. - 2015. - V. 29. - P. 25-32.

139. Lanisnik T., Stojan J., Adamski J. Searching for the physiological function of 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase from the fungus Cochliobolus lunatus: studies of substrate specificity and expression analysis // Mol. Cell Endocrinol. - 2001. - V. 22. - P. 193-198.

140. Leenders F., Husen B., Thole H.H., Adamski J. The sequence of porcine 80 kDa 17-estradiol dehydrogenase reveals similarities to the short chain alcohol dehydrogenase family, to actin binding motifs and to sterol carrier protein 2 // Mol. Cell. Endocrinol. - 1994. - V. 104. - P. 127-131.

141. Leenders F., Tesdorpf J.G., Markus M., Engel T., Seedorf U., Adamski J. Porcine 80-kDa protein reveals intrinsic 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase, fatty acyl-CoA-hydratase/dehydrogenase, and sterol transfer activities // J. Biol. Chem. - 1996. - V. 271. - P. 5438-5442.

142. Lefebvre Y., Schultz R., Groman E., Watanabe M. Localization of 3band 17b-hydroxysteroid dehydrogenase in Pseudomonas testosterone // J. Steroid. Biochem. - 1979. - V. 10. - P. 523-528.

143. Li R., Guo S., Wang D., Yang T., Li W., Wang J., Huang L., Zhang X., Dai Z. Elucidation of the plant progesterone biosynthetic pathway and its application in a yeast cell factory // Metab. Eng. - 2025. - V. 90. - P.197-208.

144. Li S., Wilkinson M.F. Site-directed mutagenesis: a two-step method using PCR and DpnI // Biotechniques. - 1997. - V. 23. - P. 588-590.

145. Lin H.L., Kent U.M., Hollenberg P.F. Mechanism-based inactivation of cytochrome P450 3A4 by 17 alpha-ethynylestradiol: evidence for heme destruction and covalent binding to protein // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2002. - V. 301. - P. 160-167.

146. Litzenburger M., Bernhardt R. CYP260B1 acts as 9a-hydroxylase for 11-deoxycorticosterone // Steroids. - 2017. - V. 127. - P. 40-45.

147. Liu K., Wang F.Q., Liu K., Zhao Y., Gao B., Tao X., Wei D. Light-driven progesterone production by InP-(M neoaurum) biohybrid system // Bioresour. Bioprocess. - 2022. - V. 9. - No. 93.

148. Liyanage C.K., Galappatthy P., Seneviratne S.L. Corticosteroids in management of anaphylaxis; a systematic review of evidence // Eur. Ann. Allergy Clin. Immunol. - 2017. - V. 49. - P. 196-207.

149. Lobastova T., Fokina V., Tarlachkov S., Shutov A., Bragin E., Kazantsev A., Donova M. Steroid metabolism in thermophilic actinobacterium Saccharopolyspora hirsuta VKM Ac-666T // Microorganisms. - 2021. - V. 9. - No. 2554.

150. Loraine J.K. and Smith M.C.M. Genetic techniques for manipulation of the phytosterol biotransformation strain Mycobacterium neoaurum NRRL B-3805 // Microbial Steroids Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology / ed. by J.-L. Barredo, I. Herraiz. Humana Press, New York, 2017. - V. 1645. - P. 93-108.

151. Lynggaard L.S., Marquart H.V., Kjeldsen E., Madsen H.O., Hasle H. Acute lymphoblastic leukemia presenting with pancytopenia followed by a 14-month-long period of transient remission possibly supporting the adrenal hypothesis of leukemogenesis // J. Pediatr. Hematol. Oncol. - 2016. -V. 38. - P. e271-e273.

152. Mak P.J., Denisov I.G. Spectroscopic studies of the cytochrome P450 reaction mechanisms // Biochim. Biophys. Acta. - 2018. - V. 1866. - P. 178-204.

153. Makeeva D.S., Dovbnya D.V., Donova M.V., Novikova L.A. Functional reconstruction of bovine P450scc steroidogenic system in Escherichia coli // Amer. J. Mol. Biol. - 2013. - V. 3. - P. 173182.

154. Makino T., Katsuyama Y., Otomatsu T., Misawa N., Ohnishi Y. Regio- and stereospecifc hydroxylation of various steroids at the 16a position of the D ring by the Streptomyces griseus cytochrome P450 CYP154C3 // Appl. Environ. Microb. - 2014. - V. 80. - P. 1371-1379.

155. Malaviya A., Gomes J. Enhanced biotransformation of sitosterol to androstenedione by Mycobacterium sp. using cell wall permeabilizing antibiotics // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 2008. -V. 35. - P. 1235-1239.

156. Marchais-Oberwinkler S., Henn C., Möller G., Klein T., Negri M., Oster A., Spadaro A., Werth R., Wetzel M., Xu K., Frotscher M., Hartmann R.W., Adamski J. 17ß-Hydroxysteroid dehydrogenases (17ß-HSDs) as therapeutic targets: protein structures, functions, and recent progress in inhibitor development // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. - 2011. - V. 125. - P. 66-82.

157. Marcus P.I., Talalay, P. Induction and purification of a- and ß-hydroxysteroid dehydrogenases // J. Biol. Chem. 1956. - V. 218. - P. 661-674.

158. Marrakchi H., Lanéelle M.A., Daffé M. Mycolic acids: structures, biosynthesis, and beyond // Chem. Biol. - 2014. - V. 21. - P. 67-85.

159. Marx C.J., Lidstrom M.E. Development of improved versatile broad-hostrange vectors for use in methylotrophs and other Gram-negative bacteria // Microbiology. - 2001. - V. 147. - P. 2065-2075.

160. Mast N., Annalora A.J., Lodowski D.T., Palczewski K., Stout C.D., Pikuleva I.A. Structural basis for three-step sequential catalysis by the cholesterol side chain cleavage enzyme CYP11A1 // J. Biol. Chem. - 2011. - V. 286. - P. 5607-5613.

161. Matsumoto A.M. Effects of chronic testosterone administration in normal men: safety and efficacy of high dosage testosterone and parallel dose-dependent suppression of luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone, and sperm production // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1990. - V. 70. - P. 282-287.

162. Maurice T., Grégoire C., Espallergues J. Neuro(active) steroids actions at the neuromodulatory sigma1 (g1) receptor: biochemical and physiological evidences consequences in neuroprotection // Pharmacol. Biochem. Behav. - 2006. - V. 84. - P. 581-597.

163. Meharenna Y.T., Slessor K.E., Cavaignac S.M., Poulos T.L., De Voss J.J. The critical role of substrate-protein hydrogen bonding in the control of regioselective hydroxylation in p450cin. The Journal of Biological Chemistry. - 2008. - V. 283. - P. 10804-10812.

164. Mendoza Lara D.F., Hernández-Caballero M.E., Terán J.L., Ramírez J.S., Carrasco-Carballo A. Anticancer activities of natural and synthetic steroids: a review // ACS Omega. - 2025 - V. 10. - P. 7493-7509.

165. Milhim M., Gerber A., Neunzig J., Hannemann F., Bernhardt R. A Novel NADPH-dependent flavoprotein reductase from Bacillus megaterium acts as an efficient cytochrome P450 reductase // J. Biotechnol. - 2016. - V. 231. - P. 83-94.

166. Miller W.L. Mitochondrial specificity of the early steps in steroidogenesis // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. - 1995. - V. 55. - P. 607-616.

167. Möbus E., Jahn M., Schmid R., Jahn D., Maser, E. Testosterone regulated expression of enzymes involved in steroid and hydrocarbon catabolism in Comamonas testosteroni // J. Bacteriol. - 1997. - V. 179. - P. 5951-5955.

168. Mohan A., Padiadpu J., Baloni P., Chandra N. Complete genome sequences of a Mycobacterium smegmatis laboratory strain (MC2 155) and isoniazid-resistant (4XR1/R2) mutant strains // Genome Announc. - 2015. - V. 3. - No. e01520-14.

169. Mohn W.W., van der Geize R., Stewart G.R., Okamoto S., Liu J. The actinobacterial mce4 locus encodes a steroid transporter // J. Biol. Chem. - 2008. - V. 283. - P. 35368-35374.

170. Morohashi K., Fujii-Kuriyama Y., Okada Y., Sogawa K., Hirose T., Inayama S., Omura T. Molecular cloning and nucleotide sequence of cDNA for mRNA of mitochondrial cytochrome P-450(SCC) of bovine adrenal cortex // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1984. - V. 81. - P. 4647-4651.

171. Morohashi K., Sogawa K., Omura T., Fujii-Kuriyama Y. Gene structure of human cytochrome P-450(SCC), cholesterol desmolase // J. Biochem. - 1987. - V. 101. - P. 879-887.

172. Morisaki M., Duque C., Takane K., Ikekawa N., Shikita M. Substrate specificity of adrenocortical cytochrome P-450scc-II. Effect of structural modification of cholesterol A/B ring on their side chain cleavage reaction // J. Steroid Biochem. - 1982. - V. 16. - P. 101-105.

173. Nazarov P.A., Drutsa, V.L., Miller, W.L., Shkumatov, V.M., Luzikov, V.N., Novikova, LA. Formation and functioning of fused cholesterol side-chain cleavage Enzymes // DNA and Cell Biol. -2003. - V. 22. - P. 243-252.

174. Nikolaeva V.M., Egorova O.V., Dovbnya D.V., Donova M.V. Extracellular 3ß-hydroxysteroid oxidase of Mycobacterium vaccae VKM Ac-1815D // J. Steroid. Biochem. Mol. Biol. - 2004. - V. 90. - P. 182-186.

175. Normand T., Husen B., Leenders F., Pelczar H., Baert J.L., Begue A., Flourens A.C., Adamski J., de Launoit Y. Molecular characterization of mouse 17 beta-hydroxysteroid dehydrogenase IV // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 1995. - V. 55. - P. 541-548.

176. Olivera E.R., Luengo J.M. Steroids as environmental compounds recalcitrant to degradation: genetic mechanisms of bacterial biodegradation pathways // Genes (Basel). - 2019. - V. 10. - No. 512.

177. Ouellet H., Guan S., Johnston J.B., Chow E.D., Kells P.M., Burlingame A.L., Cox J.S., Podust L.M., De Montellano P.R. Mycobacterium tuberculosis CYP125A1, a steroid C27 monooxygenase that detoxifies intracellularly generated cholest-4-en-3-one: CYP125A1 in cholesterol metabolism // Molecular Microbiology. - 2010. - V. 77. - P. 730-742.

178. Pan H., Chang S., Qu Y., Liu M., Tian W., Chang Z. Hydrocortisone production using whole-cell biocatalysts in recombinant Escherichia coli // Biochem. Eng. J. - 2023. - V. 198. - No. 109023.

179. Pandey A.K., Sassetti C.M. Mycobacterial persistence requires the utilization of host cholesterol // PNAS. - 2008. - V. 105. - P. 4376-4380.

180. Payne A.H., Hales D.B. Overview of steroidogenic enzymes in the pathway from cholesterol to active steroid hormones // Endocr. Rev. - 2004. - V. 25. - P. 947-970.

181. Peltoketo H., Luu-The V., Simard J., Adamski J. 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase (HSD)/17-ketosteroid reductase (KSR) family; nomenclature and main characteristics of the 17HSD/KSR enzymes // J. Mol. Endocrinol. - 1999. - V. 23. - P. 1-11.

182. Penning T.M. Molecular endocrinology of hydroxysteroid dehydrogenases // Endocr. Rev. -1997. - V. 18. - P. 281-305.

183. Penning T.M., Steckelbroeck S., Bauman D.R., Miller M.W., Jin Y., Peehl D.M., Fung K.M., Lin H.K., Aldo-keto reductase (AKR) 1C3: role in prostate disease and the development of specific inhibitors // Mol. Cell. Endocrinol. - 2006. - V. 248. - P. 182-191.

184. Peters S.P., Bleecker E.R., Canonica G.W., Park Y.B., Ramirez R., Hollis S., Fjallbrant H., Jorup C., Martin U.J. Serious asthma events with budesonide plus formoterol vs. budesonide alone // N. Engl. J. Med. - 2016. - V. 375. - P. 850-860.

185. Pollegioni L., Wels G., Pilone M.S., Ghisla S. Kinetic mechanisms of cholesterol oxidase from Streptomyces hygroscopicus and Brevibacterium sterolicum // Eur. J. Biochem. - 1999. - V. 264. - P. 140-151.

186. Poshekhontseva V., Nikolaeva V., Shutov A., Kazantsev A., Sazonova O., Strizhov N., Donova M. Steroid hydroxylation by mutant cytochrome P450 BM3-LG23 using two expression chassis // Int. J. Mol. Sci. - 2025. - V. 26. - No. 10728.

187. Poshekhontseva V.Y., Strizhov N.I., Karpov M.V., Nikolaeva V.V., Kazantsev A.V., Sazonova O.I., Shutov A.A., Donova M.V. Expression of synthetic cyp102A1-LG23 gene and functional analysis

of recombinant cytochrome P450 BM3-LG23 in the actinobacterium Mycolicibacterium smegmatis // Biochemistry (Moscow). - 2023. - V. 88. - P. 1347-1355.

188. Prehn C., Möller G., Adamski J. Recent advances in 17beta-hydroxysteroid dehydrogenases // J. Steroid Biochem. Mol. Biol. - 2009. - V. 114. - P. 72-77.

189. Rheaume E., Lachance Y., Zhao H.F., Breton N., Dumont M., deLaunoit Y., Trudel C., Luu-The V., Simard J., Labrie F. Structure and expression of a new complementary DNA encoding the almost exclusive 3 -hydroxysteroid dehydrogenase/5-4-isomerase in human adrenals and gonads // Mol. Endocrinol. - 1991. - V. 5. - P. 1147-1157.

190. Ricagno S., De Rosa M., Aliverti A., Zanetti G., Bolognesi M. The crystal structure of FdxA, a 7Fe ferredoxin from Mycobacterium smegmatis // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - V. 360.

- P. 97-102.

191. Roberts G.A., Celik A., Hunter D.J., Ost T.W., White J.H., Chapman S.K., Turner N.J., Flitsch S.L. A self-sufficient cytochrome p450 with a primary structural organization that includes a flavin domain and a [2Fe-2S] redox center // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. - P. 48914-48920.

192. Robin A., Köhler V., Jones A., Ali A., Kelly P.P., O'Reilly E.., Turner NJ., Flitsch S.L. Chimeric self-sufficient P450cam-RhFRed biocatalysts with broad substrate scope // Beilstein J. Org. Chem. -2011. - V. 7. - P. 1494-1498.

193. Rosloniec K.Z., Wilbrink M.H., Capyk J.K., Mohn W.W., Ostendorf M., van der Geize R., Dijkhuizen L., Eltis L.D. Cytochrome P450 125 (CYP125) catalyzes C26-hydroxylation to initiate sterol side chain degradation in Rhodococcus jostii RHA1 // Mol. Microbiol. - 2009. - V. 74. - P. 1031-1043.

194. Rupprecht R, Holsboer F. Neuroactive steroids: mechanisms of action and neuropsychopharmacological perspectives // Trends Neurosci. - 1999. - V. 22. - P. 410-416.

195. Sabbadin F., Hyde R., Robin A., Hilgarth E.M., Delenne M., Flitsch S., Turner N., Grogan G., Bruce N.C. LICRED: a versatile drop-in vector for rapid generation of redox-self-sufficient cytochrome P450s // Chembiochem. - 2010. - V. 11. - P. 987-994.

196. Sagadin T, Riehm JL, Milhim M, Hutter MC, Bernhardt R. Binding modes of CYP106A2 redox partners determine differences in progesterone hydroxylation product patterns // Commun Biol. - 2018.

- V. 30. - P. 99.

197. Sallam L.A.R., Osman M.E., Hamdy A.A., Zaghlol Gihan M. Microbial transformation of phytosterols mixture from rice bran oil unsaponifiable matter by selected bacteria // World J. Microbiol. Biotechnol. - 2008. - V. 24. - P. 1643-1656.

198. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd ed. - New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - 1659 p.

199. Schaller H. The role of sterols in plant growth and development // Prog. Lipid Res. - 2003. - V. 42. - P. 163-175.

200. Schiffer L., Anderko S., Hobler A., Hannemann F., Kagawa N., Bernhardt R. A recombinant CYP11B1 dependent Escherichia coli biocatalyst for selective cortisol production and optimization towards a preparative scale // Microb. Cell Fact. - 2015. - V. 14. - No. 25.

201. Schmid A., Dordick J., Kiener A., Wubbolts M. Industrial biocatalysis today and tomorrow // Nature. - 2001. - V. 409. - P. 258-260.

202. Schmitz D., Janocha S., Kiss F.M., Bernhardt R. CYP106A2 - A versatile biocatalyst with high potential for biotechnological production of selectively hydroxylated steroid and terpenoid compounds // Biochim. Biophys. Acta Proteins Proteom. - 2018. - V. 1866. - P. 11-22.

203. Schmitz D., Zapp J., Bernhardt R. Steroid conversion with CYP106A2 - production of pharmaceutically interesting DHEA metabolites // Microb. Cell Fact. - 2014. - V. 13. - No. 81.

204. Schultz R., Groman E., Engel L.. 3(17)b-Hydroxysteroid dehydrogenase of Pseudomonas testosteroni. A convenient purification and demonstration of multiple molecular forms // J. Biol. Chem. - 1977. - V. 252. - P. 3775-3783.

205. Sezutsu H., Le Goff G., Feyereisen R.. Origins of P450 diversity // Philos. Trans .R. Soc. Lond. B. - 2013. - V. 368. - No. 20120428.

206. Shao M., Zhang X., Rao Z, Xu M, Yang T., Li H., Xu Z. and Yang S. Efficient testosterone production by engineered Pichiapastoris co-expressing human 17ß-hydroxysteroid dehydrogenase type 3 and Saccharomyces cerevisiae glucose 6-phosphate dehydrogenase with NADPH regeneration // Green Chem. - 2016. - V. 18. - P. 1774.

207. Shashkova T.V., Luzikov V.N., Novikova L.A. Coexpression of all constituents of the cholesterol hydroxylase/lyase system in Escherichia coli cells // Biochemistry (Moscow). - 2006. - V. 71. - P. 810-814.

208. Shtratnikova V.Y., Schelkunov M.I., Fokina V.V., Bragin E.Y., Lobastova T.G., Shutov A.A., Kazantsev A.V., Donova M.V. Genome-wide transcriptome profiling provides insight on cholesterol and lithocholate degradation mechanisms in Nocardioides simplex VKM Ac-2033D // Genes (Basel). -2020. - V. 11. - No. 1229.

209. Simon R., Priefer U., Puhler A. A broad host range mobilization system for invivo genetic-engineering - transposon mutagenesis in gram-negative bacteria // Bio-Technol. - 1983. - V. 1. - P. 784-791.

210. Singer Y., Shity H. and Bar R. Microbial transformations in a cyclodextrin medium. Part 2. Reduction of androstenedione to testosterone by Saccharomyces cerevisiae // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1991. - V. 35. - P. 731-737.

211. Singh D., Papi A., Corradi M., Pavlisova I., Montagna I., Francisco C., Cohuet G., Vezzoli S., Scuri M., Vestbo J. Single inhaler triple therapy versus inhaled corticosteroid plus long-acting ß2-agonist

therapy for chronic obstructive pulmonary disease (TRILOGY): a double-blind, parallel group, randomised controlled trial // Lancet. - 2016. - V. 388. - P. 963-973.

212. Skowasch K., Mobus E., Maser E. Identification of a novel Comamonas testosteroni gene encoding a steroid inducible extradiol dioxegenase // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2002. - V. 294. - P. 560-566.

213. Snapper S.B., Melton R.E., Mustafa S., Kieser T., Jacobs W.R. Jr. Isolation and characterization of efficient plasmid transformation mutants of Mycobacterium smegmatis // Mol. Microbiol. - 1990. -V. 4. - P. 1911-1919.

214. Sono M., Roach M.P., Coulter E.D., Dawson J.H. Heme-containing oxygenases // Chem. Rev. -1996. - V. 96. - P. 2841-2888.

215. Sood U., Singh Y., Shakarad M., Lal R. Highlight on engineering Mycobacterium smegmatis for testosterone production. Microb. Biotechnol. - 2017. - V. 10. - P. 73-75.

216. Stenger B., Gerber A., Bernhardt R., Hannemann F. Functionalized poly(3-hydroxybutyric acid) bodies as new in vitro biocatalysts // Biochim. Biophys. Acta, Proteins Proteom. - 2018. - V. 1866. - P. 52-59.

217. Strijewski A. The steroid 9a-hydroxylation system from Nocardia species // Eur. J. Biochem. -1982. - V. 128. - P. 125-135.

218. Strizhov N., Fokina V., Sukhodolskaya G., Dovbnya D, Karpov M., Shutov A., Novikova L., Donova M. Progesterone biosynthesis by combined action of adrenal steroidogenic and mycobacterial enzymes in fast growing mycobacteria // New Biotechnol. - 2014. - V. 31. - P. S67.

219. Strizhov N., Karpov M., Sukhodolskaya G., Nikolayeva V., Fokina V., Shutov A., Donova M. Development of mycobacterial strains producing testosterone // Proc. Natl. Acad. Sci. Belarus Chem. Ser. - 2016. - No.3. - P. 57-58.

220. Strushkevich N., MacKenzie F., Cherkesova T., Grabovec I., Usanov S., Park H.-W. Structural basis for pregnenolone biosynthesis by the mitochondrial monooxygenase system // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2011. - V. 108. - P. 10139-10143.

221. Su J., Lin M., Napoli J.L., Complementary deoxyribonucleic acid cloning and enzymatic characterization of a novel 17beta/3alpha-hydroxysteroid/retinoid short chain dehydrogenase/reductase // Endocrinology. - 1999. - V. 140. - P. 5275-5284.

222. Suratman R.S., Afriant R., Mulyana R., Miro S., Viotra D. The role of corticosteroids in the management of drug allergy: a narrative literature review // Biosci. Med. J. Biomed. Transl. Res. - 2023. - V. 7. - P. 3091-3096.

223. Szaleniec M., Wojtkiewicz A.M., Bernhardt R., Borowski T., Donova M. Bacterial steroid hydroxylases: enzyme classes, their functions and comparison of their catalytic mechanisms // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2018 - V. 102. - P. 8153-8171.

224. Szentirrnai A. Microbial physiology of sidechain degradation of sterols // J. Ind. Microbiol. -1990. - V. 6. - P. 101-116.

225. Tang R., Shen Y., Xia M., Tu L., Luo J., Geng Y., Gao T., Zhou H., Zhao Y., Wang M. A highly efficient step-wise biotransformation strategy for direct conversion of phytosterol to boldenone // Bioresour. Technol. - 2019. - V. 283. - P. 242-250.

226. Tekucheva D., Poshekhontseva V., Fedorov D., Karpov M., Novikova L., Zamalutdinov A., Donova M. Pregnenolone bioproduction in engineered methylobacteria: Design and elaboration // Int. J. Mol. Sci. - 2025. - M. 26. - No. 10975.

227. Tekucheva D.N., Fokina V.V., Nikolaeva V.M., Shutov A.A., Karpov M.V., Donova M.V. Cascade biotransformation of phytosterol to testosterone by Mycolicibacterium neoaurum VKM Ac-1815D and Nocardioides simplex VKM Ac-2033D strains // Microbiology. - 2022a. - V. 91. - P. 303312.

228. Tekucheva D.N., Nikolayeva V.M.; Karpov M.V., Timakova T.A., Shutov A.V., Donova M.V. Bioproduction of testosterone from phytosterol by Mycolicibacterium neoaurum strains: "one-pot", two modes // Bioresour. Bioprocess. - 2022b. - V. 9. - No. 116.

229. Thomas J.L., Duax W.L., Addlagatta A., Brandt S., Fuller R.R., Norris W. Structure/function relationships responsible for coenzyme specificity and the isomerase activity of human type 1 3-hydroxysteroid dehydrogenase/isomerase // J. Biol. Chem. - 2003. - V. 278. - P. 35483-35490.

230. Tsuge T., Fukui T., Matsusaki H., Taguchi S., Kobayashi G., Ishizaki A. Molecular cloning of two (R)-specific enoyl-CoA hydratase genes from Pseudomonas aeruginosa and their use for polyhydroxyalkanoate synthesis // FEMS Microbiol. Lett. - 2000. - V. 184. - P. 193-198.

231. Uhía I., Galán B., Kendall S.L., Stoker N.G., García J.L. Cholesterol metabolism in Mycobacterium smegmatis // Environ. Microbiol. Rep. - 2012. - V. 4. - P. 168-182.

232. Uhía I., Galán B., Morales V., García J.L. Initial step in the catabolism of cholesterol by Mycobacterium smegmatis mc2 155 // Environ. Microbiol. - 2011. - V. 13. - P. 943-959.

233. Venkataraman H., Te Poele E.M., Rosloniec K.Z., Vermeulen N., Commandeur J.N., van der Geize R., Dijkhuizen L. Biosynthesis of a steroid metabolite by an engineered Rhodococcus erythropolis strain expressing a mutant cytochrome P450 BM3 enzyme // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2015. - V. 99. - P. 4713-4721.

234. Vincent A.T., Nyongesa S., Morneau I., Reed M.B., Tocheva E.I., Veyrier F.J. The mycobacterial cell envelope: a relict from the past or the result of recent evolution? // Front. Microbiol. - 2018. - V.9. - P. 2341.

235. Vogel P., Persson S., Moreno-Pescador G., Noack L.C. Sterols in plant biology - Advances in studying membrane dynamics // Cell Surf. - 2025. - V. 13. - No. 100147.

236. Vrielink, A. Cholesterol oxidase: structure and function // Cholesterol binding and cholesterol transport proteins / ed. by J.R. Harris. Springer, Dordrecht. - 2010. - V. 51. - P. 137-158.

237. Wada A., Mathew PA., Barnes H.J., Sanders D., Estabrook R.W., Waterman M.R. Expression of functional bovine cholesterol side chain cleavage cytochrome P450 (P450scc) in Escherichia coli // Arch. Biochem. Biophys. - 1991. - V. 290. - P. 376-380.

238. Wang F., Yao K., Wei D. From soybean phytosterols to steroid hormones // Soybean and health / ed. by H. El-Shemy. InTech, Rijeka. - 2011. - P. 231-252.

239. Wang X.-X., Ke X., Liu Z.-Q., Zheng Y.-G. Rational development of mycobacteria cell factory for advancing the steroid biomanufacturing / World J. Microbiol. Biotechnol. - 2022. - V. 38. - No.191.

240. Wei J.H., Yin X., Welander P.V. Sterol synthesis in diverse bacteria // Front. Microbiol. - 2016. - V. 7. - P. 990.

241. Wilbrink M.H., Petrusma M., Dijkhuizen L., van der Geize R. FadD19 of Rhodococcus rhodochrous DSM43269, a steroid coenzyme a ligase essential for degradation of C-24 branched sterol side chains // Appl. Envir. Microbiol. - 2011. - V. 77. - P. 4455-4464.

242. Wilbrink M.H., van der Geize R., Dijkhuizen L. Molecular characterization of ltp3 and ltp4, essential for C24-branched chain sterol-side-chain degradation in Rhodococcus rhodochrous DSM 43269 // Microbiology. - 2012. - V. 158. - P. 3054-3062.

243. Wollam J., Antebi A. Sterol regulation of metabolism, homeostasis, and development // Annu. Rev. Biochem, 2011. - V. 80. - P. 885-916.

244. Wovcha M.G., Brooks K.E., Kominek L.A. Evidence for two steroid 1,2-dehydrogenase activities in Mycobacterium fortuitum // Biochim. Biophys. Acta. - 1979. - V. 574. - P. 471-479.

245. Wronska N., Brzostek A., Szewczyk R., Sobon A., Dziadek J., Lisowska K. The role of fadD19 and echA19 in sterol side chain degradation by Mycobacterium smegmatis // Molecules. - 2016. - V. 21. - No. 598.

246. Xiong L.B., Liu H.H.., Xu LQ., Sun W.J., Wang F.Q., Wei D.Z. Improving the production of 22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one from sterols in Mycobacterium neoaurum by increasing cell permeability and modifying multiple genes // Microb. Cell Fact. - 2017. - V. 16. - No. 89.

247. Xu L.Q., Liu Y.J., Yao K., Liu H.H., Tao X.Y., Wang F.Q. and Wei D.Z. Unraveling and engineering the production of 23,24-bisnorcholenic steroids in sterol metabolism // Sci. Rep. - 2016. -V. 6. - No. 21928.

248. Yam K.C., Angelo I., Kalscheuer R., Zhu H., Wang J.-X., Snieckus V., Ly L.H., Converse P.J., Jacobs W.R., Strynadka Jr. N., Eltis L.D. Studies of a ring-cleaving dioxygenase illuminate the role of cholesterol metabolism in the pathogenesis of Mycobacterium tuberculosis // PLoS Pathog. - 2009. - V. 5. - No. e1000344.

249. Yang X. Rv1106c from Mycobacterium tuberculosis is a 3P-hydroxysteroid dehydrogenase // Biochemistry. - 2007. - V. 46. - P. 9058-9067.

250. Yao K., Wang F.Q., Zhang H.C., Wei D.Z. Identification and engineering of cholesterol oxidases involved in the initial step of sterols catabolism in Mycobacterium neoaurum // Metab. Eng. - 2013. -V. 15. - P. 75-87.

251. Ye Z., Wang Y., Colunga-Lozano L.E., Prasad M., Tangamornsuksan W., Rochwerg B., Yao L., Motaghi S., Couban R.J., Ghadimi M., Bala M.M., Gomaa H., Fang F., Xiao Y., Guyatt G.H. Efficacy and safety of corticosteroids in COVID-19 based on evidence for COVID-19, other coronavirus infections, influenza, community-acquired pneumonia and acute respiratory distress syndrome: a systematic review and meta-analysis // CMAJ. - 2020. - V. 192. - P. E756-E767.

252. Zhang R., Zhang Y., Wang Y., Yao M., Zhang J., Liu H., Zhou X., Xiao W., Yuan Y. pregnenolone overproduction in Yarrowia lipolytica by integrative components pairing of the cytochrome P450scc system // ACS Synth. Biol. - 2019. - V. 8. - P. 2666-2678.

253. Zhang X., Peng Y., Zhao J. Li Q., Yu X., Acevedo-Rocha C.G., Li A. Bacterial cytochrome P450-catalyzed regio- and stereoselective steroid hydroxylation enabled by directed evolution and rational design // Bioresour. Bioprocess. - 2020. - V. 7. - No. 2.

254. Zhang Y., Xiao P., Pan D., Zhou X. New insights into the modification of the non-core metabolic pathway of steroids in Mycolicibacterium and the application of fermentation biotechnology in C-19 steroid production // Int. J. Mol. Sci. - 2023. - V. 24. - No. 5236.

255. Zhao A., Zhang X., Li Y., Wang Z., Lv Y., Liu J., Alam M.A., Xiong W., Xu J. Mycolicibacterium cell factory for the production of steroid-based drug intermediates // Biotechnol Adv. - 2021. - V. 53. - No. 107860.

256. Zhao M., Li X., Xiong L., Liu K., Liu Y., Xue Z., Han R. Green manufacturing of steroids via Mycolicbacteria: current status and development trends // Fermentation. - 2023. - V. 9. - No. 890.

257. Zheng M., Lin Z., Lin S., Qu X. Chemoenzymatic synthesis of steroidal products: recent advances // Eur. J. Org. Chem. - 2024 - V. 27. - No. e202301066.

258. Zhou P., Fang Y.K., Yao H.K., Li H., Wang G., Liu Y.P. Efficient biotransformation of phytosterols to dehydroepiandrosterone by Mycobacterium sp. // Appl. Biochem. Biotechnol. - 2018. -V. 186. - P. 496-506.

259. Zhu Y.L., Huang W., Ni J.R., Liu W., Li H. Production of diosgenin from Dioscorea zingiberensis tubers through enzymatic saccharification and microbial transformation // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2010. - V. 85. - P. 1409-1416.

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Синтетические ДНК-последовательности, используемые при конструировании рекомбинантных тестостерон-продуцирующих штаммов миколицибактерий (5'^3').

Подчеркнуты фланкирующие сайты рестрикции: NdeI (catatg) и HindIII (aagctt).

Последовательность №1, FHSD, 822 т.п.н.

Кодируемый фермент: 17Р-ГСД из Cochliobolus lunatus (17Р-ГСДС1).

catatgccccacgtggaaaacgcctccgagacgtacatccccggtcggctggacggtaaagtcgcctt ggtgaccggttcggggcgggggatcggtgccgcggtggccgtgcacctgggccgcctgggcgccaagg tcgtggtgaactatgcgaacagcacgaaggatgcggagaaagtcgtctcggagatcaaggccttgggg tccgacgcgatcgccatcaaggccgacatccgccaggtcccggagatcgtgaaactcttcgaccaggc cgtggcccactttggacacctcgatatcgcggtcagcaactcgggggtcgtgagcttcggtcatttga aggacgtgaccgaggaagaattcgatcgtgtgttcagcctgaacacccgcggccagttttttgtcgcg cgggaagcctaccggcacctgacggagggggggcggattgtcttgaccagcagcaacacctcgaaaga cttttccgtccccaagcactcgctgtactcgggcagcaaaggcgccgtcgactcgtttgtgcggatct tctcgaaagactgcggcgacaaaaagatcaccgtcaacgccgtggcgccaggtggcaccgtgaccgac atgttccatgaagtgagccaccactacatccccaacggcaccagctacaccgcggaacagcggcagca gatggcggcgcatgcctcgccgctgcaccggaacgggtggccgcaggatgtcgccaatgtcgtgggct tcctggtgtcgaaggaaggtgagtgggtgaatggcaaagtgctgaccctggacgggggtgcggcctga aagctt

Последовательность №2, HHSD, 942 т.п.н.

Кодируемый фермент: 17Р-ГСД 3 типа из Homo sapiens (ПР-ГСДНб).

catatgggggacgtgctggagcagttcttcattctcacgggcctgctcgtctgcctggcgtgcctcgc caagtgcgtccgtttctcccgctgcgtcctgctcaactactggaaggtgctgcccaagtcgttcttgc gcagcatgggtcagtgggccgtcatcaccggcgcgggtgatggcatcggaaaagcgtactccttcgaa ctggccaaacggggcctgaatgtggtcctgatctcccggaccctggagaagctggaagcgatcgccac cgaaatcgagcgtaccaccggacggagcgtgaagattatccaagcggacttcacgaaggacgacatct acgagcacatcaaggaaaagctggcgggtttggaaatcggaatcttggtcaacaacgtgggcatgttg ccgaacctgctcccgtcgcactttttgaacgccccagacgagatccagagcctgatccactgcaacat cacctccgtggtgaagatgacccagttgattctcaaacacatggagtcgcggcagaaaggcctgatcc tcaacattagcagcggcattgccctgttcccgtggcccctgtactcgatgtactcggcctcgaaggcg ttcgtctgtgccttctcgaaggcgctgcaagaagagtataaggccaaggaggtcatcatccaggtgtt gaccccgtacgccgtctcgaccgcgatgacgaagtacctcaatacgaacgtgatcaccaagaccgcgg acgagtttgtcaaggagtcgctgaattacgtcaccatcggcggcgagacctgcgggtgcttggcccac

gaaatcctggccggttttctctccctcatccccgcgtgggcgttctacagcggtgcgttccagcgttt gctgttgacccactacgtggcgtatctgaagctcaacaccaaggtccggtgaaagctt

Последовательность №3, MHSD, 981 т.п.н.

Кодируемый фермент: 17Р-ГСД 5 типа из Mus musculus (17Р-ГСДМш).

catatggactcgaaacagcagaccgtgcgcctgtccgacggtcacttcatccccattctgggctttgg cacctacgccccccaggaagtgccgaagtccaaggccacggaggccaccaagattgcgatcgacgccg gctttcggcacatcgactccgcgtcgatgtaccagaacgagaaggaggtgggcctcgcgatccggagc aaaatcgcggacggcaccgtgaagcgcgaggatattttctacacgtcgaaggtgtggtgtacgttcca tcggccggagctggtgcgcgtgtgcctggagcagagcctcaagcagctccagctggactacgtggacc tgtacctgatccacttccccatggcgatgaagcccggcgagaattacctgcccaaagacgaaaacggc aaactgatctacgacgccgtggacatctgcgacacctgggaggccatggaaaaatgcaaggacgcggg cctggccaaaagcatcggggtctcgaacttcaaccggcgccagctggagaagatcctgaagaaacccg gactcaagtataagcccgtgtgcaaccaagtcgagtgccatccgtacctgaaccaggggaagctgctg gacttctgtcgttcgaaggacatcgtgttggtggcctacagcgcgttgggatcccaccgggaaaagca atgggtggatcagagctcgccggtgctgttggacaaccccgtcctgggcagcatggccaaaaagtaca accgcacgccggcgctgatcgccctccgctaccaattgcagcgcggcgtggtcgtcctggcgaagtcg ttcagcgaaaagcgcatcaaggaaaacatgcaggtgttcgaattccagctgacctccgaggacatgaa ggtcttggatgacctgaacaagaacatccgctacatctccggcagcagcttcaaggaccacccggact tcccgttctgggacgaatactgaaagctt

Последовательность №4, G6PD2, 1554 т.п.н.

Кодируемый фермент: Г6ФД 2 типа из Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Г6ФД2М1:).

catatgaaaccggcccacgccgcggcgtcgtggcgcaacccgctacgagacaagcgggacaagcgatt acccagaatcgccggcccgtgcggcatggtgattttcggcgtcaccggcgacctggcccgcaagaagg tgatgccggccgtctacgatttggccaaccgcggcctgctgccgcccacattctcgctggtggggttt gcccgccgagactggagcacccaggatttcggtcaagtggtgtacaacgccgtccaagagcactgccg aacaccgtttcggcaacagaactgggaccggctggccgagggattccgttttgtgccaggcactttcg acgacgacgacgcgttcgcccaactcgccgagacgctggagaagctcgacgccgagcgcggcaccggc ggcaaccacgccttctacctggcgatcccgcccaaatccttcccggtcgtctgtgagcagctgcacaa gtccggcctggcccgcccgcaaggcgaccggtggagccgagtcgtgatagagaagccgttcggccacg acctggccagcgcacgcgagctgaacaaggcggtcaacgcggtcttcccggaggaagcggtcttccgc atcgaccactacctgggcaaagagacggtgcagaacatcctggcgctgcggttcgccaaccagctgtt cgacccgatctggaatgcgcactacgtcgaccacgtacagatcaccatggccgaagacatcggcctgg gcgggcgcgcgggctattacgacggcatcggcgcggcccgcgatgtcatccagaaccatctcatgcag

ctgctggcgctgaccgcgatggaggagccggtcagcttccacccggcagcgttgcaggccgagaagat caaggtgctctcggccacccgccttgccgagccactcgaccagaccaccagccgcggccagtacgccg ccggctggcaaggcggggagaaggtggttgggctgctcgacgaggaggggttcgccgaggactccacc accgaaaccttcgccgctatcaccctggaagtcgatacgcgccggtgggccggcgtgccgttctatct gcgaacgggaaaacgattgggccgccgggtgaccgagatcgctctggtcttcaggcgggcgccgcatc tgccgttcgacgccaccatgaccgacgagctgggcaccaacgcgatggtcatccgcgtgcagcccgac gaaggtgtcacattgcggttcggctccaaggtgccgggcaccgccatggaagtccgcgacgtcaacat ggacttctcctacggctcggcattcgccgaagattcaccggaggcctacgagcggctcatcctcgacg tcctgctcggcgagccctcgctgtttccggtcaacgcggaggtcgaactggcgtgggagatcctcgat ccagcgttggaacattgggcggcacacgggacgcccgacgcctacgaggcaggtacctggggtccgga atcatccttggagatgctgcgccgcaccggccgggaatggcggcggccatagaagctt

Последовательность №5, FHSD_G6PD2, 2388 т.п.н.

Кодируемые ферменты: 17Р-ГСД из Cochliobolus lunatus (17Р-ГСДС1), Г6ФД 2 типа из Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Г6ФД2М1).

catatgccccacgtggaaaacgcctccgagacgtacatccccggtcggctggacggtaaagtcgcctt ggtgaccggttcggggcgggggatcggtgccgcggtggccgtgcacctgggccgcctgggcgccaagg tcgtggtgaactatgcgaacagcacgaaggatgcggagaaagtcgtctcggagatcaaggccttgggg tccgacgcgatcgccatcaaggccgacatccgccaggtcccggagatcgtgaaactcttcgaccaggc cgtggcccactttggacacctcgatatcgcggtcagcaactcgggggtcgtgagcttcggtcatttga aggacgtgaccgaggaagaattcgatcgtgtgttcagcctgaacacccgcggccagttttttgtcgcg cgggaagcctaccggcacctgacggagggggggcggattgtcttgaccagcagcaacacctcgaaaga cttttccgtccccaagcactcgctgtactcgggcagcaaaggcgccgtcgactcgtttgtgcggatct tctcgaaagactgcggcgacaaaaagatcaccgtcaacgccgtggcgccaggtggcaccgtgaccgac atgttccatgaagtgagccaccactacatccccaacggcaccagctacaccgcggaacagcggcagca gatggcggcgcatgcctcgccgctgcaccggaacgggtggccgcaggatgtcgccaatgtcgtgggct tcctggtgtcgaaggaaggtgagtgggtgaatggcaaagtgctgaccctggacgggggtgcggcctga gttcaaggagacgaaaaggcgatgaaaccggcccacgccgcggcgtcgtggcgcaacccgctacgaga caagcgggacaagcgattacccagaatcgccggcccgtgcggcatggtgattttcggcgtcaccggcg acctggcccgcaagaaggtgatgccggccgtctacgatttggccaaccgcggcctgctgccgcccaca ttctcgctggtggggtttgcccgccgagactggagcacccaggatttcggtcaagtggtgtacaacgc cgtccaagagcactgccgaacaccgtttcggcaacagaactgggaccggctggccgagggattccgtt ttgtgccaggcactttcgacgacgacgacgcgttcgcccaactcgccgagacgctggagaagctcgac gccgagcgcggcaccggcggcaaccacgccttctacctggcgatcccgcccaaatccttcccggtcgt ctgtgagcagctgcacaagtccggcctggcccgcccgcaaggcgaccggtggagccgagtcgtgatag agaagccgttcggccacgacctggccagcgcacgcgagctgaacaaggcggtcaacgcggtcttcccg

gaggaagcggtcttccgcatcgaccactacctgggcaaagagacggtgcagaacatcctggcgctgcg gttcgccaaccagctgttcgacccgatctggaatgcgcactacgtcgaccacgtacagatcaccatgg ccgaagacatcggcctgggcgggcgcgcgggctattacgacggcatcggcgcggcccgcgatgtcatc cagaaccatctcatgcagctgctggcgctgaccgcgatggaggagccggtcagcttccacccggcagc gttgcaggccgagaagatcaaggtgctctcggccacccgccttgccgagccactcgaccagaccacca gccgcggccagtacgccgccggctggcaaggcggggagaaggtggttgggctgctcgacgaggagggg ttcgccgaggactccaccaccgaaaccttcgccgctatcaccctggaagtcgatacgcgccggtgggc cggcgtgccgttctatctgcgaacgggaaaacgattgggccgccgggtgaccgagatcgctctggtct tcaggcgggcgccgcatctgccgttcgacgccaccatgaccgacgagctgggcaccaacgcgatggtc atccgcgtgcagcccgacgaaggtgtcacattgcggttcggctccaaggtgccgggcaccgccatgga agtccgcgacgtcaacatggacttctcctacggctcggcattcgccgaagattcaccggaggcctacg agcggctcatcctcgacgtcctgctcggcgagccctcgctgtttccggtcaacgcggaggtcgaactg gcgtgggagatcctcgatccagcgttggaacattgggcggcacacgggacgcccgacgcctacgaggc aggtacctggggtccggaatcatccttggagatgctgcgccgcaccggccgggaatggcggcggccat agaagctt

Последовательность №6, HHSD_G6PD2, 2508 т.п.н.

Кодируемые ферменты: nß-ГСД 3 типа из Homo sapiens (17ß-rC,nHs), Г6ФД 2 типа из Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Г6ФД2М1:).

catatgggggacgtgctggagcagttcttcattctcacgggcctgctcgtctgcctggcgtgcctcgc caagtgcgtccgtttctcccgctgcgtcctgctcaactactggaaggtgctgcccaagtcgttcttgc gcagcatgggtcagtgggccgtcatcaccggcgcgggtgatggcatcggaaaagcgtactccttcgaa ctggccaaacggggcctgaatgtggtcctgatctcccggaccctggagaagctggaagcgatcgccac cgaaatcgagcgtaccaccggacggagcgtgaagattatccaagcggacttcacgaaggacgacatct acgagcacatcaaggaaaagctggcgggtttggaaatcggaatcttggtcaacaacgtgggcatgttg ccgaacctgctcccgtcgcactttttgaacgccccagacgagatccagagcctgatccactgcaacat cacctccgtggtgaagatgacccagttgattctcaaacacatggagtcgcggcagaaaggcctgatcc tcaacattagcagcggcattgccctgttcccgtggcccctgtactcgatgtactcggcctcgaaggcg ttcgtctgtgccttctcgaaggcgctgcaagaagagtataaggccaaggaggtcatcatccaggtgtt gaccccgtacgccgtctcgaccgcgatgacgaagtacctcaatacgaacgtgatcaccaagaccgcgg acgagtttgtcaaggagtcgctgaattacgtcaccatcggcggcgagacctgcgggtgcttggcccac gaaatcctggccggttttctctccctcatccccgcgtgggcgttctacagcggtgcgttccagcgttt gctgttgacccactacgtggcgtatctgaagctcaacaccaaggtccggtgagttcaaggagacgaaa aggcgatgaaaccggcccacgccgcggcgtcgtggcgcaacccgctacgagacaagcgggacaagcga ttacccagaatcgccggcccgtgcggcatggtgattttcggcgtcaccggcgacctggcccgcaagaa ggtgatgccggccgtctacgatttggccaaccgcggcctgctgccgcccacattctcgctggtggggt

ttgcccgccgagactggagcacccaggatttcggtcaagtggtgtacaacgccgtccaagagcactgc cgaacaccgtttcggcaacagaactgggaccggctggccgagggattccgttttgtgccaggcacttt cgacgacgacgacgcgttcgcccaactcgccgagacgctggagaagctcgacgccgagcgcggcaccg gcggcaaccacgccttctacctggcgatcccgcccaaatccttcccggtcgtctgtgagcagctgcac aagtccggcctggcccgcccgcaaggcgaccggtggagccgagtcgtgatagagaagccgttcggcca cgacctggccagcgcacgcgagctgaacaaggcggtcaacgcggtcttcccggaggaagcggtcttcc gcatcgaccactacctgggcaaagagacggtgcagaacatcctggcgctgcggttcgccaaccagctg ttcgacccgatctggaatgcgcactacgtcgaccacgtacagatcaccatggccgaagacatcggcct gggcgggcgcgcgggctattacgacggcatcggcgcggcccgcgatgtcatccagaaccatctcatgc agctgctggcgctgaccgcgatggaggagccggtcagcttccacccggcagcgttgcaggccgagaag atcaaggtgctctcggccacccgccttgccgagccactcgaccagaccaccagccgcggccagtacgc cgccggctggcaaggcggggagaaggtggttgggctgctcgacgaggaggggttcgccgaggactcca ccaccgaaaccttcgccgctatcaccctggaagtcgatacgcgccggtgggccggcgtgccgttctat ctgcgaacgggaaaacgattgggccgccgggtgaccgagatcgctctggtcttcaggcgggcgccgca tctgccgttcgacgccaccatgaccgacgagctgggcaccaacgcgatggtcatccgcgtgcagcccg acgaaggtgtcacattgcggttcggctccaaggtgccgggcaccgccatggaagtccgcgacgtcaac atggacttctcctacggctcggcattcgccgaagattcaccggaggcctacgagcggctcatcctcga cgtcctgctcggcgagccctcgctgtttccggtcaacgcggaggtcgaactggcgtgggagatcctcg atccagcgttggaacattgggcggcacacgggacgcccgacgcctacgaggcaggtacctggggtccg gaatcatccttggagatgctgcgccgcaccggccgggaatggcggcggccatagaagctt

Последовательность №7, MHSD_G6PD2, 2547 т.п.н.

Кодируемые ферменты: 17ß-ГСД 5 типа из Mus musculus (17ß-rc,nMm), Г6ФД 2 типа из Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Г6ФД2М1:).

catatggactcgaaacagcagaccgtgcgcctgtccgacggtcacttcatccccattctgggctttgg cacctacgccccccaggaagtgccgaagtccaaggccacggaggccaccaagattgcgatcgacgccg gctttcggcacatcgactccgcgtcgatgtaccagaacgagaaggaggtgggcctcgcgatccggagc aaaatcgcggacggcaccgtgaagcgcgaggatattttctacacgtcgaaggtgtggtgtacgttcca tcggccggagctggtgcgcgtgtgcctggagcagagcctcaagcagctccagctggactacgtggacc tgtacctgatccacttccccatggcgatgaagcccggcgagaattacctgcccaaagacgaaaacggc aaactgatctacgacgccgtggacatctgcgacacctgggaggccatggaaaaatgcaaggacgcggg cctggccaaaagcatcggggtctcgaacttcaaccggcgccagctggagaagatcctgaagaaacccg gactcaagtataagcccgtgtgcaaccaagtcgagtgccatccgtacctgaaccaggggaagctgctg gacttctgtcgttcgaaggacatcgtgttggtggcctacagcgcgttgggatcccaccgggaaaagca atgggtggatcagagctcgccggtgctgttggacaaccccgtcctgggcagcatggccaaaaagtaca accgcacgccggcgctgatcgccctccgctaccaattgcagcgcggcgtggtcgtcctggcgaagtcg

ttcagcgaaaagcgcatcaaggaaaacatgcaggtgttcgaattccagctgacctccgaggacatgaa ggtcttggatgacctgaacaagaacatccgctacatctccggcagcagcttcaaggaccacccggact tcccgttctgggacgaatactgagttcaaggagacgaaaaggcgatgaaaccggcccacgccgcggcg tcgtggcgcaacccgctacgagacaagcgggacaagcgattacccagaatcgccggcccgtgcggcat ggtgattttcggcgtcaccggcgacctggcccgcaagaaggtgatgccggccgtctacgatttggcca accgcggcctgctgccgcccacattctcgctggtggggtttgcccgccgagactggagcacccaggat ttcggtcaagtggtgtacaacgccgtccaagagcactgccgaacaccgtttcggcaacagaactggga ccggctggccgagggattccgttttgtgccaggcactttcgacgacgacgacgcgttcgcccaactcg ccgagacgctggagaagctcgacgccgagcgcggcaccggcggcaaccacgccttctacctggcgatc ccgcccaaatccttcccggtcgtctgtgagcagctgcacaagtccggcctggcccgcccgcaaggcga ccggtggagccgagtcgtgatagagaagccgttcggccacgacctggccagcgcacgcgagctgaaca aggcggtcaacgcggtcttcccggaggaagcggtcttccgcatcgaccactacctgggcaaagagacg gtgcagaacatcctggcgctgcggttcgccaaccagctgttcgacccgatctggaatgcgcactacgt cgaccacgtacagatcaccatggccgaagacatcggcctgggcgggcgcgcgggctattacgacggca tcggcgcggcccgcgatgtcatccagaaccatctcatgcagctgctggcgctgaccgcgatggaggag ccggtcagcttccacccggcagcgttgcaggccgagaagatcaaggtgctctcggccacccgccttgc cgagccactcgaccagaccaccagccgcggccagtacgccgccggctggcaaggcggggagaaggtgg ttgggctgctcgacgaggaggggttcgccgaggactccaccaccgaaaccttcgccgctatcaccctg gaagtcgatacgcgccggtgggccggcgtgccgttctatctgcgaacgggaaaacgattgggccgccg ggtgaccgagatcgctctggtcttcaggcgggcgccgcatctgccgttcgacgccaccatgaccgacg agctgggcaccaacgcgatggtcatccgcgtgcagcccgacgaaggtgtcacattgcggttcggctcc aaggtgccgggcaccgccatggaagtccgcgacgtcaacatggacttctcctacggctcggcattcgc cgaagattcaccggaggcctacgagcggctcatcctcgacgtcctgctcggcgagccctcgctgtttc cggtcaacgcggaggtcgaactggcgtgggagatcctcgatccagcgttggaacattgggcggcacac gggacgcccgacgcctacgaggcaggtacctggggtccggaatcatccttggagatgctgcgccgcac cggccgggaatggcggcggccatagaagctt

Последовательность №8, G6PD1_6PGD, 2454 т.п.н.

Кодируемые ферменты: Г6ФД 1 типа из Mycobacterium tuberculosis H37Rv (Г6ФД1М1;), 6ФГД из Mycobacterium tuberculosis H37Rv (6ФГДМ1;).

catatggttgacggcggaggtggcgcgtcagatctgttggtgatcttcggaattaccggtgacctggc ccgcaagatgaccttccgcgcgttgtatcggctcgagcgccaccagttgctggactgccccatcctgg gtgtggccagtgacgacatgtccgtcgggcagttggtcaagtgggctcgcgagtccatcggtcgtacc gaaaagatcgacgatgcggtgttcgaccggttggcgggccggttgtcctacctgcacggtgacgtcac cgacagccagctctacgattcgctggccgaactgattggctcggcctgtcggccgctgtattacctgg aaatgccgccggcgctgttcgcgccgattgtcgaaaatctcgcgaacgtgcggctgttggagcgcgca

cgcgttgccgtggaaaagccgttcggccacgacctggcctccgcgctcgaactcaacgcccggctgcg agcggtgttgggcgaagaccaaatcctgcgtgtggaccactttctgggcaagcagcccgtcgtcgagc tggagtacctgaggttcgccaatcaggcgttagccgagctctgggatcgcaacagcatctccgagatc cacatcaccatggccgaggacttcggggtggaggaccgcggcaagttttacgacgccgtcggtgccct gcgtgacgtcgtgcaaaaccatctgctgcaggtgctggcgctggtgacgatggaaccgccggtcggtt ccagcgccgatgacctcaacgacaagaaggccgaggtcttccgggcgatggcgccgctggatcccgat cggtgcgtgcgtgggcagtacctcggctacaccgaagttgcgggcgtagcaagcgattcggcgaccga aacgtatgtcgcgctgcgaaccgagatcgacaactggcgctgggccggggtgccgatcttcgtgcggg ccggaaaagagctgcccgcgaaggtcaccgaagtacggctatttctacgccgagttccggcattggcc tttctgcccaaccgccgaccggccgagcccaaccagattgtgctgcgtatcgaccccgatccgggtat gcgactgcagatttcggcccacaccgacgactcgtggcgagatatccacctggactcctcgttcgcgg tggacctcggtgaaccgatacgaccctatgagcggctgctgtatgccggattggtcggcgatcaccag ttgttcgcccgcgaggacagcatcgagcagacgtggcggatcgtgcagccgctgctcgacaacccggg tgaaatccatcggtacgatcgcggttcctggggtccggaagccgcgcagtcgttgctgcgcggtcacc gcggttggcagtcgccgtggctgccccgcggcacggacgcatgagttcaaggagacgaaaaggcgatg caactaggaatgatcggtctgggccggatgggtgcgaatatcgtccgccgcttggccaaaggtggaca cgactgcgtggtctacgaccacgaccccgacgcggtcaaggcgatggccggggaggaccggaccaccg gggtggcctcgttgcgtgagttgtctcagcggctctccgccccgcgagttgtctgggtgatggtgccc gcggggaacatcaccaccgcggtgatcgaagagctggccaacacgctcgaggccggcgacattgtgat cgacggtggcaacacctattatcgcgacgatctgcggcacgaaaagctgttgttcaagaagggaattc acctactcgactgtggcaccagcggcggtgtgtggggtcgggaacgtggctactgcctgatgatcggc ggggatggcgacgcgttcgcgcgcgcggagccgatcttcgccaccgtcgcgccgggggtggcggccgc cccgcgcaccccgggccgagacggtgaggtcgcgccatcggaacaaggctatttgcattgtgggcctt gcggttcgggtcacttcgtgaagatggtccacaacggcatcgaatacgggatgatggcctccttggcg gagggattgaacatcctgcgcaatgccgacgtcggcacccgcgtgcaacacggtgacgccgaaaccgc gccgctgccgaatcccgagtgctaccagtacgacttcgacatcccggaggtcgccgaggtatggcggc ggggcagcgtgatcggctcctggctgctggatttgaccgcgatcgcgctgcgcgaatcacctgaccta gcggaattctccggacgggtctccgactctggcgagggccggtggaccgccatcgcggcgatcgacga gggcgtgcccgcgccggtgctgaccaccgcgctgcagtcccgcttcgcctcgcgtgacctcgacgact tcgccaacaaggcgctgtcggcgatgcgcaagcagttcggcggacacgccgagaaaccggctaactaa aagctt

ПРИЛОЖЕНИЕ 2