Методы ДНК-доставки и мониторинга фактора некроза опухолей человека на животных моделях тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Суровцева, Елена Владимировна

• Суровцева, Елена Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Суровцева, Елена Владимировна

9

2.1. Функции TNF в клетке

2.1.1. Лиганды и рецепторы семейства TNF. Растворимая и IО трансмембранная форма TNF

2.1.2. Схема внутриклеточной передачи сигналов, осуществляемая с 12 помощью TNF-R. Внутриклеточные каскадные реакции, запускаемые TNF

2.1.2.1. Передача сигналов с помощью TNF-R

2.1.2.1.1. Передача цитотоксического сигнала с участием NF-kB

2.1.2.1.2. Передача цитотоксического сигнала с участием АР

2.1.2.1.3. Эффекторный механизм апоптоза

2.1.2.2. Альтернативные пути передачи цитотоксического сигнала, 16 опосредованные RIP

2.1.2.3. Передача сигналов с помощью TNF-R

2.1.2.3.1. TNF-R2 опосредованная активация NF-кВ и JNK

2.1.2.3.2. Активация апоптоза с помощью TNF-R

2.1.3. Пространственная структура TNF-a и TNF-p. Остатки, 19 ответственные за связывание с рецептором

2.1.3.1. Пространственная структура мономерной формы TNF

2.1.3.2. Пространственная структура тримерной формы молекулы 20 TNF. Аминокислотные остатки, принимающие участие в поддержании пространственной структуры молекулы TNF

2.1.3.3. Структура комплекса TNF-TNF-R. Аминокислотные остатки 23 в молекуле TNF, участвующие в образовании связей с рецептором

2.2. Роль TNF-a в быстрых межклеточных взаимодействиях, 24 запускаемых инвазией

2.2.1. Участие периферических макрофагов и NK-клеток в 24 воспалительных реакциях быстрого типа. Thl и Th2 лимфокины

2.2.2. Участие клеток макрофагального ряда (дендритные клетки) в 31 неклональных воспалительных реакциях быстрого типа. Переход иммунного ответа в генерализованную форму. TNF-a и антиген-презентирующие клетки

2.2.3. Деструктивное действие TNF-a при генерализованном ответе. 35 Роль TNF в заболеваниях, вызывающих гранулематоз

2.3. ДНК-иммунизация, как новый исследовательский инструмент

2.3.1. Принцип ДНК-иммунизации и реакция организма на нее

2.3.1.1. В-клеточный иммунный ответ

2.3.1.2. Клеточный ответ

2.3.1.2.1. Образование CTL

2.3.1.2.2. Т-хелперный ответ

2.3.2. Структура ДНК-конструкций, используемых для иммунизации 44 2.3.2.1. Гистоспецифичный промотор MSA и его регуляция

2.3.3. Особенности ДНК-иммунизации при использовании животных 48 различных видов

2.3.3.1. ДНК-иммунизация мышей и крыс

2.3.3.2. ДНК-иммунизация кроликов

2.3.3.3. Использование обезьян в качестве модельных животных

2.3.4. Методы введения ДНК в организм

2.3.4.1. Внутримышечное введение

2.3.4.2. Введение ДНК с помощью безъыгольного инъектора

2.3.4.3. Бомбардировка коллоидными частицами

2.3.4.4. Введение иммунизирующей ДНК с помощью катионных 55 липосом

2.3.5. Выбор ткани для введения ДНК

2.3.6. Перспективные направления развития ДНК-иммунизации и 58 генотерапии

3. Материалы и методы

3.1. Методы работы с культурами клеток эукариот

3.2. Генноинженерное конструирование 62 3.2.3. Сборка генно-инженерных конструкций

3.3. Культивирование штаммов-продуцентов на основе E.coli и 67 очистка рекомбинантных белков

3.4. Иммунизация животных

3.5. Методы иммунологической детекции

4. Результаты и обсуждение

4.1. Получение TNF-a и тестирование его активности in vitro

4.1.2. Экспрессия TNF-R1 в клетках Drosophila melanogaster

4.2 Получение поликлональной антисыворотки против TNF-a 92 человека. Использование аффинноочищенных антител для тестирования продукции TNF-a в сыворотках больных склерозом

4.3. ДНК-доставка TNF-a на животной модели in vivo с детекцией 97 результата по выработке антител

4.3.1. ДНК-иммунизация крыс

4.3.2. ДНК-иммунизация кролика

5.Выводы

Список сокращений а.о. - аминокислотный остаток

ДАБ - 3,3 'диаминобензидин

ИПТГ - изопропил р-тиогалактозид

ЬСЖ — культур альная жидкость мин - минута

ОФД - ортофенилендиамин т.п.н. — тысяча пар нуклеотидов

ТХУ — трихлоруксусная кислота ч — час

Ag - антиген

А — оптическая плотность

BAS - боковой амиотрофический склероз

BrCN - цианбромид

BSA - бычий сывороточный альбумин

CD - поверхностный клеточный маркер

CMV — цитомегаловирус

CTL - цитотоксические Т-лимфоциты (cytotoxic T-lymphocyte)

DOPE - диолеил L-a-фосфатидилэтаноламин

DOSPA - диолеилспермидинфосфатидиламин

DOT АР - 1,2-диолеил-З-триметил-аммоний-пропан DOTMA -N-[ 1 -(2,3-диолеилокси)пропил]-М,Ы,Ытриметиламмонийхлорид

Ed-TNFRl - экстраклеточный домен рецептора TNF типа I ELISA - тведофазный иммунный анализ (enzyme linked immune sorbent analisys)

GFP - green fluorescence protein

HBs-Ag - малый поверхностный антиген гепатита В

HSA - человеческий сывороточный альбумин

IFN - интерферон

Ig - иммуноглобулин

IL — интерлейкин

LPS - липополисахарид

LT — лимфотоксин mAb — моноклонапьные антитела

МНС - главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex) MSA — мышиный сывороточный альбумин MS — рассеянный склероз NF-kB - ядерный фактор кВ NFAT - ядерный фактор AT Ni-NTA - Ni-нитрилтетраацетат лиганд-группа PBL - лимфоциты периферической крови (peripheral blood lymphocyte) РВМС - моноциты периферической крови (peripheral blood mononuclear cell) PBS - забуференный физиологический раствор

RT-PCR - полимеразная цепная реакция в.реальном времени (real time PCR)

SDS-ПААГ- денатурирующий электрофорез в присутствии SDS Term - терминатор транскрипции

TNF-R - рецептор фактора некроза опухолей (tumor necrosis factor receptor)

TNF-a - фактор некроза опухолей (tumor necrosis factor)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Методы ДНК-доставки и мониторинга фактора некроза опухолей человека на животных моделях»

Экстраклеточные белковые медиаторы большинства важнейших процессов в организме человека и млекопитающих функционируют в низких физиологических концентрациях. При этом высокая биологическая активность ростовых факторов и лимфокинов в отношении клеток организма, как правило, компенсируется их стремительной деградацией. Высокая скорость распада и синтеза ростовых факторов приводит к формированию квазистационарных концентрационных градиентов вблизи клеток-продуцентов, которые, по-видимому, являются наиболее естественным типом распределения ростовых и сигнальных факторов в организме. Создание именно таких устойчивых во времени градиентов является желательным условием тестирования действия лимфокинов и ростовых факторов, однако эта задача технически не реализуема при введении испытуемых белков в систему в форме готовой субстанции.

В этой связи более физиологичным методом доставки ростовых факторов представляется экспрессия клеточных медиаторов собственными клетками организма in vivo, которая может быть достигнута при введении в отдельные клетки животного генной конструкции, несущей соответствующий структурный ген. В настоящее время стратегия борьбы со многими вирусными и онкологическими заболеваниями заключается во введении в организм человека ДНК, несущей ген соответствующего лимфокина [1]. В этом случае уровень внутриклеточной экспрессии определяется, прежде всего, силой промотора, а также возможностью доставки ДНК к тканям-мишеням.

Экспрессирующийся in vivo чужеродный белок может восприниматься организмом в качестве антигена. При этом на него могут вырабатываться антитела. Выявление таких антител, легко доступное в техническом отношении, может служить доказательством факта доставки ДНК в заданный участок ткани-мишени.

TNF-a известен как цитокин макрофагапьного происхождения [1]. Он опосредует ряд местных и системных эффектов и может рассматриваться в качестве противоракового терапевтического агента [2].

Повышенный по сравнению с нормой уровень TNF-a встречается при ряде заболеваний как инфекционной (туберкулез), так и аутоиммунной (склероз, саркоидоз, идиопатическая нейтропения) этиологии. Его использование в качестве маркера для тестирования сывороток больных ставит важную задачу получения антител против этого клеточного медиатора.

TNF играет важную роль в реакциях местного иммунитета, причем его действие носит локальный характер. В этой связи физиологичным методом доставки этого ростового фактора представляется его индуцированная экспрессия собственными клетками организма in vivo, которая может быть достигнута при введении животным генной конструкции, несущей соответствующий структурный ген. Тестирование эффективности доставки по продукции специфических поликлональных антител в случае ДНК-доставки является наиболее доступным.

В связи с изложенным выше в качестве цели настоящей работы рассматривалась разработка дизайна генноинженерных конструкций для доставки растворимого TNF-a человека в секреторной и внутриклеточной форме в клетки животных.

Тестирование эффективности доставки TNF-a по продукции специфических поликлональных антител против антигена, выработанного в организме животного, требовало разработки антительной тест-системы с высоким уровнем чувстивительности. В связи с этим, в работе были поставлены следующие научные и практические задачи:

1) Создание оптимизированного полусинтетического гена TNF-a человека и конструирование на его основе штамма на основе Е. coli> обеспечивающего высокий уровень продукции целевого белка;

2) Разработка метода очистки и ренатурации TNF-a из телец включения, с целью дальнейшего использования рекомбинантного белка в качестве антигена для иммунизации и стандарта для калибровки иммунохимических тест-систем;

3) Получение аффинно очищенных кроличьих поликлональных антител против TNF-a человека и создание на их основе иммунохимических тест-систем в вариантах «непрямой иммуноферментный анализ» и «иммуноблоттинг»;

4) Создание конструкций для доставки TNF-a человека в клетки млекопитающих в секреторной и внутриклеточной форме;

5) Изучение функциональности полученных конструкций при введении животным;

6) Изучение свойств аффинноочищенных антител против TNF-a человека при иммунохимическом исследовании сывороток больных рассеянным и боковым амиотрофическим склерозом.

2. Литературный обзор

2.1. Функции TNF в клетке

Изучая развитие раковых опухолей у животных, Old [4] обнаружил белок, в присутствии которого происходил геморрагический некроз трансформированных клеток. Этот фактор был назван фактором некроза опухолей - TNF. Beutler и соавт. [5] показали идентичность нового фактора и открытого ранее белка-кахетина.

В последующие годы было обнаружено целое семейство структурно различающихся, но функционально схожих белков - так называемых TNFлигандов. В норме белки этого семейства участвуют в дифференцировке различных тканей, в частности клеток лимфоидной, костной и нервной тканей, регуляции и реализации иммунных и воспалительных реакций, а также пролиферации и апоптозе клеток. Запуск клеточной гибели является одной из основных функций многих членов этого семейства, а для некоторых, по-видимому, и единственной. Среди TNF-лигандов именно TNF-a участвует в наибольшем количестве межклеточных реакций, выполняя роль важнейшего медиатора в передаче сигналов между клетками. Передача цитотоксического сигнала от TNF-a внутрь клетки опосредована TNF-рецепторами.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Суровцева, Елена Владимировна

5.Выводы

1. Созданы генно-инженерные конструкции для доставки растворимого TNF-a человека в клетки млекопитающих в секреторной и внутриклеточной форме, пригодные для проведения ДНК-иммунизации. Впервые показана возможность доставки TNF-a в организм млекопитающих с помощью плазмидных конструкций.

2. Получен гуморальный ответ против синтезированного in vivo TNF-a человека, доставленного с помощью плазмидных ДНК. Подтверждено ранее сделанное наблюдение о двухфазной динамике сероконверсии специфических антител в ответ на ДНК-иммунизацию у кролика.

3. На основе Е. coli получен новый штамм-продуцент TNF-a человека и предложена методика ренатурации TNF-a из телец включения.

4. В результате экспрессии в клетках Drosophila melanogaster получен экстраклеточный домен высокоаффинного рецептора TNF-a типа 1. Показано связывание рецептора и лиганда in vitro, что подтверждает нативность структуры TNF-a, приобретенной в результате ренатурации.

5. Показана перспективность использования поликлональных аффинноочищенных антител против TNF-a для исследования клинических материалов, в том числе, уточнения диагноза у больных рассеянным склерозом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Суровцева, Елена Владимировна, 2005 год

1. Bartlett E.J., Cull V.S., Mowe E.N., Mansfield J.P., James C.M. // Optimization of Naked DNA Delivery for Interferon Subtype Immunotherapy in Cytomegalovirus Infection // Biol Proced Online. 2003. V. 5. P.43-52

2. Pennica D., Nedwin G.,Hayflick J., Seeburg P., Derynck R., Palladino M., Kohr W., Aggarwal B.B., Goeddel D.E. // Human tumour necrosis factor: precursor structure, expression and homology to lymphotoxin // Nature. 1984. V. 312. P. 724-729.

3. Darzynkiewicz Z., Williamson В., Carswell E.A., Old L.J.// Cell cycle-specific effects of tumor necrosis factor // Cancer Res. 1984; 44(1): 83-90.

4. Beutler B.A., Milsark I.W., Cerami A.J. // Cachectin/tumor necrosis factor: production, distribution, and metabolic fate in vivo-II J. Immunol. 1985; 135(6): 3972-3977.

5. Schulze-Osthoff K., Ferrari D., Los M., Wesselborg S., Peter M.E. // Apoptosis signaling by death receptors // Eur. J. Biochem. 1998; 254(3): 439-459.

6. Ashkenazi A., Dixit V.M. // Death receptors: signaling and modulation // Science. 1998; 281(5381): 1305-1308.

7. Brojatsch J., Naughton J., Rolls M.M., Zingler K., Young J.A. // CAR1, a TNFR-related protein, is a cellular receptor for cytopathic avian leukosis-sarcoma viruses and mediates apoptosis // Cell. 1996; 87(5):845-855.

8. Smith C.A., Farrah Т., Goodwin R.G. //The TNF receptor superfamily of cellular and viral proteins: activation, costimulation, and death // Cell. 1994;76(6):959-962.

9. Tartaglia L.A., Ayres T.M., Wong G.H., Goeddel D.V. // A novel domain within the 55 kd TNF receptor signals cell death // Cell. 1993;74(5):845-853.

10. Setareh M., Schwarz H., Lotz M. // A mRNA variant encoding a soluble form of 4-IBB, a member of the murine NGF/TNF receptor family // Gene. 1995; 164(2):311-315.

11. Gearing A.J., Beckett P., Christodoulou M., Churchill M., Clements J., Davidson A.H., Drummond A.H., Galloway W.A., Gilbert R., Gordon J.L., //

12. Processing of tumour necrosis factor-alpha precursor by metalloproteinases // Nature. 1994;370(6490):555-557.

13. Liu Z.G., Hsu H., Goeddel D.V., Karin M. // Dissection of TNF receptor 1 effector functions: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kappaB activation prevents cell death // Cell. 1996;87(3):565-576.

14. Jiang Y., Woronicz J.D., Liu W., Goeddel D.V. // Prevention of constitutive TNF receptor 1 signaling by silencer of death domains // Science. 1999;283(5401):543-546.

15. Park A., Baichwal V.R. // Systematic mutational analysis of the death domain of the tumor necrosis factor receptor 1-associated protein TRADD // J Biol Chem. 1996;271(16):9858-9862.

16. Malinin N.L., Boldin M.P., Kovalenko A.V., Wallach D. // MAP3K-related kinase involved in NF-kappaB induction by TNF, CD95 and IL-1 // Nature. 1997;385(6616):540-544.

17. Woronicz J.D., Gao X., Cao Z., Rothe M., Goeddel D.V. //.I-kappaB kinase-beta: NF-kappaB activation and complex formation with I- kappaB kinase-alpha and NIK // Science. 1997;278(5339):866-869.

18. Yeh T.S., Li S.N., Wu C.J., Liu S.T., Meng C.L., Chang Y.S. // Sequence variations between two Epstein-Barr virus LMP 1 variants have no effect on the activation of NF-kappaB activity // DNA Cell Biol. 1997; 16( 11): 13111319.

19. Nishitoh H., Saitoh M., Mochida Y., Takeda K., Nakano H., Rothe M., Miyazono K., Ichijo H. // ASK1 is essential for JNK/SAPK activation by TRAF2.// Mol Cell. 1998;2(3):389-395.

20. Hoeflich K.P., Yeh W.C., Yao Z., Мак T.W., Woodgett J.R. // Mediation of TNF receptor-associated factor effector functions by apoptosis signal-regulating kinase-1 (ASK1)//Oncogene. 1999;18(42):5814-5820.

21. Boldin M.P., Goncharov T.M., Goltsev Y.V., Wallach D. // Involvement of MACH, a novel MORTl/FADD-interacting protease, in Fas/APO-1- and TNF receptor-induced cell death // Cell. 1996;85(6):803-815.

22. Liu X., Li P., Widlak P., Zou H., Luo X., Garrard W.T., Wang X. // The 40-kDa subunit of DNA fragmentation factor induces DNA fragmentation and chromatin condensation during apoptosis // Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(15):8461-8466.

23. Halenbeck R., MacDonald H., Roulston A., Chen T.T., Conroy L., Williams L.T. // CP AN, a human nuclease regulated by the caspase-sensitive inhibitor DFF45 // Curr Biol. 1998;8(9):537-540.

24. McCarthy J.V., Ni J., Dixit V.M. // RIP2 is a novel NF-kappaB-activating and cell death-inducing kinase // J Biol Chem. 1998;273(27): 16968-16975.

25. Baker S.J., Reddy E.P. // Modulation of life and death by the TNF receptor superfamily// Oncogene. 1998; 17(25):3261-3270.

26. Sanz L., Sanchez P., Lallena M.J., Diaz-Meco M.T., Moscat J. // The interaction of p62 with RIP links the atypical PKCs to NF-kappaB activation //EMBOJ. 1999;18(11):3044-3053.

27. Lin Y., Devin A., Rodriguez Y., Liu Z.G. //. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis // Genes Dev. 1999; 13( 19):2514-2526.

28. Martinon F., Holler N., Richard C., Tschopp J. // Activation of a pro-apoptotic amplification loop through inhibition of NF-kappaB-dependent survival signals by caspase-mediated inactivation of RIP // FEBS Lett. 2000;468(2-3): 134-136.

29. Grell M., Becke F.M., Wajant H., Mannel D.N., Scheurich P.11 TNF receptor type 2 mediates thymocyte proliferation independently of TNF receptor type 1 //Eur J Immunol. 1998;28(l):257-263.

30. Cheng G., Baltimore D. // TANK, а со-inducer with TRAF2 of TNF- and CD 40L-mediated NF-kappaB activation // Genes Dev. 1996;10(8):963-973.

31. Rothe M., Xiong J., Shu H.B., Williamson K., Goddard A., Goeddel D.V. // I-TRAF is a novel TRAF-interacting protein that regulates TRAF-mediated signal transduction // Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93(16):8241-8246.

32. Pomerantz J.L., Baltimore D. // NF-kappaB activation by a signaling complex containing TRAF2, TANK and TBK1, a novel IKK-related kinase //EMBOJ. 1999; 18(23 ):6694-6704.

33. Carpentier I., Beyaert R. // TRAF1 is a TNF inducible regulator of NF-kappaB activation//FEBS Lett. 1999;460(2):246-250.

34. Song H.Y., Rothe M., Goeddel D.V. // The tumor necrosis factorinducible zinc finger protein A20 interacts with TRAF1/TRAF2 and inhibits

35. NF-kappaB activation // Proc Natl Acad Sci USA. 1996;93(13):6721-6725.112

36. Lee S.Y., Lee S.Y., Choi Y. // TRAF-interacting protein (TRIP): a novel component of the tumor necrosis factor receptor (TNFR)- and CD30-TRAF signaling complexes that inhibits TRAF2-mediated NF-kappaB activation // J Exp Med. 1997;185(7): 1275-1285.

37. Tartaglia L.A., Pennica D., Goeddel D.V. // Ligand passing: the 75-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor recruits TNF for signaling by the 55-kDaTNF receptor// J Biol Chem. 1993;268(25):18542-18548.

38. Pinckard J.K., Sheehan K.C., Schreiber R.D. // Ligand-induced formation of p5 5 and p75 tumor necrosis factor receptor heterocomplexes on intact cells // J Biol Chem. 1997;272( 16): 10784-10789.

39. Sidhu R.S., Bollon A.P. // Tumor necrosis factor analogs: identification of functional domains // Anticancer Res. 1989;9(6): 1569-1576.

40. Munder M., Mallo M., Eichmann K., Modolell M. // Murine macrophages secrete interferon gamma upon combined stimulation with interleukin (IL)-12 and IL-18: A novel pathway of autocrine macrophage activation // J Exp Med. 1998; 187( 12):2103-2182.

41. Brevington R., Chatterji M., Zoubin M., Miranda R.N., Norimatsu M., Shnyra A. //IFN-y independent autocrine cytokine regulatory mechanism in reprogramming of macrofage responses to bacterial lipopolysaccharide // J Immunol. 2001;167:392-398.

42. Byrne A., Reen D.J. // Lipopolysaccharide induces rapid production of IL-10 by monocytes in the presence of apoptotic neutrophils // J Immunol. 2002; 168(4): 1968-1977.

43. Gerosa F., Baldani-Guerra В., Nisii C., Marchesini V., Carra G., Trinchieri G. // Reciprocal activating interaction between natural killer cells and dendritic cells // J Exp Med. 2002;195(3):327-333.

44. Bertier R., Rizzitelli A., Martinon-Ego C., Laharie A.M., Collin V., Chesne S., Marche P.N. // Fibroblasts inhibit the production of interleukin — 12p70 by murine dendritic cells // Immunol. 2003;108:391-400.

45. Wesa A.K., Galy A. // Regulation of T cell cytokine production by dendritic cells generated in vitro from hematopoietic progenitor cells // Cell Immunol. 2001;208(2):115-124.

46. Faehalls G., Stevens L., Bezuidenhout J., Amphlett G.E., Duncan K., Bardin P., Lukey Pt. // Distribution of IFN-y, IL-4 and TNF-a protein and

47. CD8 T cells producing IL-12p40 mRNA in human lung tuberculous granulomas // Immunol. 2002;105:325-335.

48. Ormerod L.P. // Tuberculosis and anti-TNF-alpha treatment // Thorax. 2004;59(11):921

49. Lee C.H., Choi Y.H., Yang S-H., Chang W.L., Sang J.H., Sung Y.C. // Hepatitis С Virus Core protein inhibits interleukin 12 and notric oxideproduction from activated macrofages // J. Virol. 2001;279:271-279.

50. Martino G., Consiglio A., Franciotta D.M., Corti A., Fillipi M., Vanderbroeck K., Sciacca F.L., Comi G., Grimaldi L. // Tumor necrosis factor a and its raceptors in replapsing-remitting multiple sclerosis // J Neurol. Sci. 1997;152:51-61.

51. Davis H.L., Michel M.L., Whalen R.G. // DNA-based immunization induces continuous secretion of hepatitis В surface antigen and high levels of circulating antibody // Hum Mol Genet. 1993;2( 11): 1847-1851.

52. Davis H.L., Michel M.L., Mancini M., Schleef M., Whalen R.G. // Direct gene transfer in skeletal muscle: plasmid DNA-based immunization against the hepatitis В virus surface antigen // Vaccine. 1994; 12(16): 1503-1509.

53. Cox M., Maitland N., Scully С. II Human herpes simplex-1 and papillomavirus type 16 homologous DNA sequences in normal, potentially malignant and malignant oral mucosa // Eur J Cancer В Oral Oncol. 1993 ;29B(3) :215-219.

54. Corny R.M., Widera G., LoBuglio A.F., Fuller J.T., Moore S.E., Barlow D.L., Turner J., Yang N.S., Curiel D.T. // Selected strategies to augment polynucleotide immunization// Gene Ther. 1996;3(l):67-74.

55. Xiang Z.Q., Ertl H.C. // A simple method to test the ability of individual viral proteins to induce immune responses // J Virol Methods. 1994;47(1-2):103-116.

56. Fynan E.F., Ewert D.L., Block T.M. // Latency and reactivation of Marek's disease virus in В lymphocytes transformed by avian leukosis virus // J Gen Virol. 1993;74 ( Pt 10):2163-2170.

57. Sedegah M., Hedstrom R., Hobart P., Hoffman S.L. // Protection against malaria by immunization with plasmid DNA encoding circumsporozoite protein // Proc Natl Acad Sci USA. 1994;91(21):9866-9870.

58. Geissler E.K., Wang J., Fechner J.H. Jr., Burlingham W.J., Kiiechtle S.J. // Immunity to MHC class I antigen after direct DNA transfer into skeletal muscle//J Immunol. 1994; 152(2):413-421.

59. Lee A.H., Suh Y.S., Sung J.H., Yang S.H., Sung Y.C. // Comparison of various expression plasmids for the induction of immune response by DNA immunization // Mol Cells. 1997;7(4):495-501.

60. Wu К-J., Wilson D.R., Shin C., Darlington G. // The transcription factor HNF1 acts with C/EBPa to synergistically activate the human albumin promoter through a novel domain // JBC 1994;269:1177-1182.

61. Ни C., Perlmutter D.H. // Cell-specific involvement of HNF-lbeta in alpha(l)-antitrypsin gene expression in human respiratory epithelial cells // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2002;282(4): 757-65.99.

62. Pastore L., Morral N., Zhou H., Garcia R., Parks R.J., Kochanek S., Graham F.L., Lee В., Beaudet A.L. // Use of a liver-specific promoter reduces immune response to the transgene in adenoviral vectors // Hum Gene Ther. 1999; 10(11):1773-1781.

63. Izban M.G., Papaconstantinou J. // Cell-specific expression of mouse albumin promoter. Evidence for cell-specific DNA elements within the proximal promoter region and cis-acting DNA elements upstream of—160 // J Biol Chem. 1989 5;264(16):9171-9179.

64. Acsadi G., Dickson G., Love D.R., Jani A., Walsh F.S., Gurusinghe A., Wolff. // Human dystrophin expression in mdx mice after intramuscular injection of DNA constructs // Nature. 1991;352(6338):815-818.

65. Yim T.J., Tang S., Andino R. // Poliovirus recombinants expressing hepatitis В virus antigens elicited a humoral immune response in susceptible mice // Virology. 1996;218(l):61-70.

66. Eisenbraun M.D., Fuller D.H., Haynes J.R. // Examination of parameters affecting the elicitation of humoral immune responses by particle bombardment-mediated genetic immunization // DNA Cell Biol. 1993 ;12(9):791-797.

67. Chowdhury P.S., Gallo M., Pastan I. // Generation of high titer antisera in rabbits by DNA immunization // J Immunol Meth. 2001;249:147-154.

68. Gardsvoll H., Solberg H., Dano K., Hoyer-Hansen G. // Generation of high-affinity rabbit polyclonal antibodies to the murine urokinase receptor using DNA immunization //J Immunol Meth. 2000;234:107-116.

69. Wolff L., Koller R. // Regions of the Moloney murine leukemia virus genome specifically related to induction of promonocytic tumors // J Virol. 1990;64(1):155-160.

70. Jiao S., Moberly J.B., Schonfeld G. // Editing of apolipoprotein В messenger RNA in differentiated Caco-2 cells // J Lipid Res. 1990;31 (4):695-700.

71. Davis H.L., Jasmin B.J. // Direct gene transfer into mouse diaphragm // FEBS Lett. 1993;333(1-2): 146-150.

72. Danko I., Wolff J.A. // Direct gene transfer into muscle // Vaccine. 1994;12( 16): 1499-1502.

73. Whalen R.G., Harris J.B., Butler-Browne G.S., Sesodia S. // Expression of myosin isoforms during notexin-induced regeneration of rat soleus muscles // Dev Biol. 1990;141(l):24-40.

74. Nabel E.G., Gordon D., Yang Z.Y., Xu L., San H., Plautz G.E., Wu B.Y.,

75. Gao X., Huang L., Nabel G.J. // Gene transfer in vivo with DNA-liposome120complexes: lack of autoimmunity and gonadal localization // Hum Gene Ther. 1992;3(6):649-656.

76. Furth E.E., Sprecher H., Fisher E.A., Fleishman H.D., Laposata M. // An in vitro model for essential fatty acid deficiency: HepG2 cells permanently maintained in lipid-free medium // J Lipid Res. 1992;33(11): 1719-1726.

77. Pecorino L.T., Lo D.C. // Having a blast with gene transfer // Curr Biol. 1992;2(l):30-32.

78. Tranchant I., Thompson В., Nicolazzi C., Mignet N., Scherman D. // Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids // J Gene Med. 2004 ;6:24-35.

79. Ahearn A., Malone R. // Models of cationic liposome mediated transfection // Gen Ther. Mol. Biol. 1999;4:159-170.

80. Gregoriadis G., Saffie R., de Souza J.B. // Liposome-mediated DNAvaccination // FEBS Lett. 1997;402(2-3): 107-110.121

81. Liu Y., Liggitt D., Zhong W., Tu G., Gaensler K., Debs R. // Cationic liposome-mediated intravenous gene delivery // J Biol Chem. 1995;270(42):24864-24870.

82. Davis H.L., Millan C.L., Watkins S.C. // Immune-mediated destruction of transfected muscle fibers after direct gene transfer with antigen-expressing plasmid DNA//Gene Ther. 1997;4(3):181-188.

83. Fynan E.F., Webster R.G., Fuller D.H., Haynes J.R., Santoro J.C., Robinson H.L. // DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene-gun inoculations // Proc Natl Acad Sci USA. 1993;90(24): 11478-11482.

84. Whalen E., Donnelly T.A., Naughton G., Rheins L.A. // The development of three-dimensional in vitro human tissue models // Hum Exp Toxicol. 1994;13(12):853-859.

85. Davis H.L., Michel M.L., Mancini M., Schleef M., Whalen R.G. // Direct gene transfer in skeletal muscle: plasmid DNA-based immunization against the hepatitis В virus surface antigen // Vaccine. 1994; 12(16): 15031509.

86. Tada H., Maron D.J., Choi E.A., Barsoum J., Lei H., Hie Q., Liu W„ Ellis L., Moscioni A.D., Tazelaar J., Fawell S., Qin X., Propert K.J., Davis

87. A., Fraker D.L., Wilson J.M., Spitz F.R. // Sistemic IFN-p gene therapy results in long-term survival in mice established colorectal liver metastases Hi Clin Invest. 2001;108:83-95.

88. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. // Molecular cloning // Eds. Cold Spring Harbor Laboratory press. New York. 1989.

89. Athenaes // Protein refolding manual: http://www.athenaenvironrnental.com/Refolding%20Kit%20Manual.pdf

90. Merli S, Corti A, Cassani G. // Production of soluble tumor necrosis factor receptor type I in Escherichia coli: optimization of the refolding yields by a microtiter dilution assay. // Analyt. Biochem.;1995;230:85-91.

91. Шингарова JI.H., Сагайдак Л.Н., Турецкая P.JI., Беркова Н.П., Коробко В.Г // Мутанты факторв некроза опухолей: получение и некоторые свойства// Биоорган, химия.; 1997;23:428-433.

92. Патрушев Л.И. // Экспрессия генов. М.: Наука, 2000.

93. Шингарова Л.Н., Сагайдак Л.Н., Турецкая Р.Л., Беркова Н.П., Коробко В.Г // Взаимодействие анти-TNF-a моноклональных антителЕ7Н2с мутантными и гибридными белкамиБиоорган. химия.;1997;23:428-433.

94. Кэролл С.Б., Логон А // Получение и очистка поликлональных антител к гетерологичным фрагментам гибридных белков, содержаих р-галактазидазу. В: Новое в клонировании ДНК. Методы. М.: Мир, 1989.

95. Гурвич А.Е. // Получение чистых антител и определение абсолютных количеств антител в сыворотках при помощи антигенов, фиксированных на целлюлозе. // В: Современные методы в биохимии. //М.: Медицина, 1964.

96. Milatovich A., Song К., Heller R. А. // Tumor necrosis factor receptor genes, TNFR1 and TNFR2, on human chromosomes 12 and 1 // Somat. Cell Mol. Genet.; 1991:519-523.

97. Engelmann H., Holtmann H., Brakebusch C. // Antibodies to a solubleform of a tumor necrosis factor (TNF) receptor have TNF-like activity // J.

98. Biol. Chem.; 1990;265:14497-14504.124

99. Cheng J., Liu C., Koopman W. J., Mountz J. D. // J. Immunol.; 1995; 154.- 1239-1245.

100. McTigue M. A., Wickersham J. A., Pinko C. // Crystal structure of the kinase domain of human vascular endothelial growth factor receptor 2: a key enzyme in angiogenesis //Structure Fold Des.;1999;7:319-330.

101. Schneider-Kolsky M. E., Manuelpillai U., Waldron K. // The distribution of activin and activin receptors in gestational tissues across human pregnancy and during labour// Placenta.;2002.;23:294-302.

102. Loetscher H. S., Gentz R. S., Zulauf M. // Recombinant 55-kDa tumor necrosis factor (TNF) receptor. Stoichiometry of binding to TNF alpha and TNF beta and inhibition of TNF activity // J. Biol. Chem.; 1991 ;266:18324-18329.

103. Maroushek Boury N., Bosworth В. Т., Stabel T. J. // Cloning and expression of porcine recombinant soluble tumor necrosis factor receptor 1 // Am. J. Vet. Res.; 1998;59:1317-1322.

104. Sato Y., Nio Y., Omori H., Inoue Y., Hirahara N., Sasaki S., Tamura K. // Human proinsulin gene-transfected Chinese hamster ovary cells secrete immunoreactive insulin // In Vivo. 1999;13(6):535-540.