Многофункциональные терапевтические олигонуклеотиды для улучшения эффективности и селективности расщепления РНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Дубовиченко Михаил Вадимович

• Дубовиченко Михаил Вадимович
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Дубовиченко Михаил Вадимович

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Степень разработанности темы исследования

Цель и задачи исследования

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Теоретическая и практическая значимость работы

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫ1НОСИМЫ1Е НА ЗАЩИТУ

ЛИЧНЫМ ВКЛАД АВТОРА

Достоверность результатов

Апробация работы и внедрение результатов

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Терапевтические олигонуклеотиды в современный: исследованиях

1.1.1. Интерферирующие РНК: короткие интерферирующие РНК и микроРНК

1.1.2. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО)

1.1.3. Системы CRISPR/Cas

1.1.4. Каталитические олигонуклеотиды

1.2. МАЛАЯ эффективность коротких олигонуклеотидов

1.3. Дилемма аффинности/специфичности

1.4. Мультивалентность

1.5. Мультивалентные биохимические системы

1.5.1. Нуклеазы на основе цинковых пальцев и ТАЬ-эффекторных нуклеаз

1.5.2. Двухвалентные глициновые рибопереключатели

1.5.3. Антитела и мультивалентность

1.5.4. Мультивалентные олигонуклеотиды

1.6. Маркер-зависимые конструкции на основе коротких ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

1.6.1. Активируемые рибозимы

1.6.3. Бинарные ДНКзимы с дополнительными РНК-связывающими доменами

1.6.4. Маркер-зависимые бинарные АСО Ошибка! Закладка не определена.

1.6.5. Триггерные каскады киРНК

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.2. РЕАКТИВЫ, расходные материалы и оборудование

2.4. ДИЗАЙН ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

2.5. ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИЙ ОЛИГОНУКЛЕОТИДОВ

2.6. Сборка конструкций на основе ДНК

2.7. Каталитический цикл расщепления РНК

2.8. Расщепление РНК в условиях многократного оборота

2.9. Расщепление РНК В условиях однократного оборота

2.10. Престационарная кинетика

2.11. ОЦЕНКА СПЕЦИФИЧНОСТИ ДЕЙСТВИЯ РАСЩЕПЛЯЮЩИХ АГЕНТОВ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 МУЛЬТИВАЛЕНТНЫЕ ДНКЗИМЫ

3.1.1 Оценка вторичной структуры РНК-мишеней

3.1.2 Дизайн мультивалентных расщепляющих агентов

3.1.3 Оценка эффективности Мультивалентных конструкций с ДНКзимами традиционного дизайна на мишень РНК-58

3.1.4 Оптимизация дизайна БивДз-конструкций

3.1.5 Оценка РНК-расщепляющего действия в зависимости от концентраций БивДз

3.1.6 Оценка селективности действия БивДз

3.1.7 Оценка влияния количества каталитических ядер на общее число оборотов БивДз1

3.1.8 Влияние повышения числа ДНКзимов в составе мультивалента на РНК-расщепляющую активность

3.1.9 Активность БивДз со слабо-стабильной мишенью РНК-60

3.1.10 Активность БивДз в присутствие РНКазы H

3.2 Бивалентные АСО

3.2.1 Дизайн бивалентных АСО

3.2.2 Оценка РНК-расщепляющего действия БивАСО

3.2.3 Оценка селективности БивАСО

3.3 Аллостерические ДНКзимы (БинДз) и ДНК-конструкции (БинДМ) на ИХ ОСНОВЕ

3.3.1 Подбор РНК-мишеней для БинДз и БинДМ

3.3.2 Оптимизация бинарных Дз-конструкций БинДз и БинДМ

3.3.3 Анализ скоростей расщепления у оптимизированных БинДз и БинДМ

3.3.4 Селективность действия БинДз и БинДМ

ГЛАВА 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

БЛАГОДАРНОСТИ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Многофункциональные терапевтические олигонуклеотиды для улучшения эффективности и селективности расщепления РНК»

ВВЕДЕНИЕ

Настоящая диссертация посвящена разработке и исследованию мультивалентных и аллостерических (маркер-зависимых или маркер-активируемых) конструкций на основе терапевтических олигонуклеотидов (ДНКзимов и антисмысловых олигонуклеотидов). Оба вида ДНК-конструкций способны специфически связываться с целевой РНК в её участках, сложенных во вторичную структуру, и катализировать расщепление её фосфодиэфирной связи. Была проделана оптимизация дизайна ДНК-конструкций, установлены факторы, влияющие на их РНК-расщепляющую активность. Для оптимальных конструкций были определены их параметры каталитической активности (числа каталитических оборотов, обозреваемые константы) и была оценена специфичность.

Актуальность работы Под терапевтическими олигонуклеотидами подразумевается класс молекулярных инструментов на основе коротких олигонуклеотидов, предназначенных для искусственного регулирования экспрессии целевых генов на уровне пре-мРНК и мРНК с последующим ингибированием трансляции целевого белка, в результате чего происходит нокдаун (или сайленсинг) генов. К таким молекулярным агентам относят антисмысловые олигонуклеотиды (АСО), короткие интерферирующие РНК (киРНК), комплексы гРНК-CRISPR/Cas и РНК-расщепляющие ДНКзимы (Дз). Все названные подходы объединяет схожий механизм действия, при котором происходит комплементарное распознавание целевой мРНК и последующая её деградация через расщепление фосфодиэфирных связей внутри неё. Чаще всего такие молекулярные инструменты используются в исследованиях по выключению генов, белки которых участвуют в развитии заболеваний. Терапевтические олигонуклеотиды часто также называют терапевтическими нуклеиновыми кислотами (ТНК) или агентами олигонуклеотидной генной терапии (от англ. oligonucleotide gene therapy (OGT) agents).

Несмотря на то, что начало своего развития технология ТНК берет с конца 1970-х годов, к настоящему времени одобрено лишь небольшое число таких лекарств в виду их малой эффективности. Их малая эффективность обусловлена рядом факторов, тремя наиболее значимыми из которых являются сложность внутриклеточной доставки, низкое сродство к участкам РНК, сложенным во вторичную структуру, и низкая специфичность комплементарного связывания с ней. Эта работа направлена на фундаментальное решение последних двух проблем.

Степень разработанности темы исследования

Для решения проблемы аффинности и специфичности ТНК используются специально разработанные электронные ресурсы по типу GeneScript, OptiRNAi, BLOCK-iT, siRNA-Finder, PFRED и т.д. Данные программы используются для расчета пространственной организации и термодинамических параметров как у разрабатываемых ТНК, так и у целевой РНК. Однако, в настоящее время программы не способны предсказать вторичные структуры длинных мРНК, и часто возникают ситуации, когда необходимо нацеливать короткие ТНК на участки РНК, где присутствуют сложенные структуры, к которым ТНК имеют малую аффинность. Для её повышения олигонуклеотиды модифицируют путем их удлинения и/или внедрения в их последовательности модификаций по типу 2'-OMe (2'-оксиметил) и/или LNA (от англ. Locked Nucleic Acid - замкнутые нуклеиновые кислоты). За счёт таких модификаций аффинность действительно увеличивается. Однако, с таким образом будет также увеличиваться толерантность к неспецифическим регионам РНК при связывании с ней, из-за чего уменьшается специфичность действия, что приводит к соответствующим побочным эффектам.

Таким образом, при дизайне терапевтических олигонуклеотидов возникает т.н. дилемма аффинности и специфичности, при которой высоко специфические ТНК-агенты имеют пониженную аффинность к РНК и, наоборот, при высокой аффинности они будут иметь пониженную специфичность. Способом решения этой дилеммы является использование нанотехнологических многофункциональных конструкций на основе коротких олигонуклеотидов.

В данной работе рассмотрены ранее неизвестные мультивалентные (в данном случае, бивалентные) ДНК-конструкции на основе Дз и АСО, и проведено систематическое исследование аллостерических ДНК-конструкций. Оба вида конструкций способны эффективно связываться с РНК в участках её вторичной структуры и проводить её каталитическое расщепление. Мультивалентные конструкции способны выполнять данные функции с повышенной эффективностью за счет большего числа РНК-расщепляющих доменов в составе самой конструкции. Аллостерические конструкции в свою очередь выполняют свои функции лишь в присутствии эффектора, роль которого играет генетический маркер, что существенно повышает специфичность действия.

Цель и задачи исследования

Цель данной работы - добиться повышения эффективности и специфичности расщепления РНК Дз и АСО агентами путем разработки на их основе многофункциональных бивалентных и маркер-активируемых ДНК-конструкций.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать бивалентные конструкции на основе Дз (БивДз), нацеленные на расщепление РНК-фрагмента со стабильной вторичной структурой (РНК-58). Oтобрать варианты БивДз с длинами Дз-связывающих и РНК-связывающих доменов, обеспечивающих наиболее высокую расщепляющую активность.

2. Изучить влияние степени ассоциации двух Дз субъединиц в составе БиДз на эффективность и специфичность расщепления РНК.

3. Разработать бивалентные АСО (БивАСО) и оценить их эффективность в расщеплении РНК-фрагмента со стабильной вторичной структурой. Оценить зависимость эффективности и селективности РНК-расщепляющего действия от размеров и расположения одиночных АСО в составе БивАСО.

4. Разработать маркер-активируемые конструкции на основе Дз с двумя и с четырьмя РНК-связывающими доменами (БинДз и БинДМ). Оценить влияние количества РНК-связывающих доменов в конструкциях БинДз и БинДМ на эффективность расщепления различных РНК-фрагментов, отличающихся между собой стабильностью вторичной структуры.

5. Оценить специфичность РНК-расщепляющего действия выявленных оптимальных конструкций БинДз и БинДМ.

Научная новизна работы

Эта работа является первым систематическим исследованием бивалентных Дз, АСО и аллостерических конструкций на основе Дз.

Впервые предложено использование бивалентных ДНК-конструкций на основе Дз и АСО агентов с целью увеличения эффективности расщепления РНК со сложной вторичной структурой. Впервые были изучены факторы, влияющие на эффективность РНК-расщепляющей активности у бивалентных ДНК-конструкций: сродство и число каталитических ядер.

Впервые предложен контроль селективности БивДз за счет изменения степени ассоциации двух субъединиц.

В работе впервые были систематически использованы РНК мишени, сложенные в стабильные вторичные структуры для характеристики АСО агентов.

Теоретическая и практическая значимость работы

В диссертационной работе впервые предложено решение дилеммы аффинности/специфичности путем использования многофункциональных РНК-расщепляющих агентов. Были заложены основы изучения кинетики расщепления структурированных РНК с помощью многофункциональных конструкций. Проделанная работа является начальным этапом подготовки технологий БивДз, БивАСО, БинДз и БинДМ к использованию их в условиях in vivo для подавления специфических РНК мишеней, что может быть использовано как в лабораторной исследовательской практике, так и в

разработке подходов терапии генетических, вирусных и онкологических заболеваний.

Положения, выносимые на защиту

1. Конструкции БивДз каталитически расщепляют специфическую РНК со стабильной структурой со значительно большей эффективностью по сравнению с простыми Дз традиционного дизайна, демонстрируя многократно большую скорость расщепления и число оборотов как из-за более высокой аффинности, обеспечиваемое множеством РНК-связывающих доменов, так и за счет наличия большего числа каталитических ядер.

2. У конструкций БивДз с высокой РНК-расщепляющей активностью можно повысить специфичность распознавания однонуклеотидных замен путем уменьшения стабильности связывания двух Дз доменов друг с другом в составе бивалентной конструкции.

3. Конструкции БивАСО могут эффективно и селективно стимулировать РНКаза-Н-опосредованное расщепление целевой РНК, если оба домена АСО короткие и комплементарно связываются с участкам РНК, фланкирующими вторичную структуру.

4. Аллостерические конструкции БинДз демонстрируют расщепление РНК лишь в присутствие специфической последовательности - активатора (генетического маркера), а добавление двух дополнительных РНК-связывающих рук (БинДМ) может давать прирост расщепления РНК со стабильной вторичной структурой.

5. Оптимизированный БинДМ, имеющий четыре РНК-связывающих домена, может обладать одновременно большей эффективностью и селективностью расщепления РНК по сравнению с конструкциями БинДз, имеющих два РНК-связывающих домена.

Личный вклад автора

Глава с результатами исследований поделены на три подраздела: мультивалентные ДНКзимы, бивалентные АСО и аллостерические ДНК-конструкции. В этих трех частях, во всех этапах исследований, планирование и выполнение экспериментальных работ, обработка результатов и их визуализация с помощью диаграмм и графиков проводились непосредственно автором. Написание текста диссертации, куда входило написание глав и создание картинок, автор также выполнял лично.

Достоверность результатов Эксперименты выполнялись как минимум в трехкратном воспроизведении с использованием современного оборудования для исследовательских работ с нуклеиновыми кислотами. Используемые методы исследования и расчетов статистически верные.

Апробация работы и внедрение результатов Работа выполнялась в рамках проекта № 922017 "Передовые технологии на основе нуклеиновых кислот в генной терапии рака", поддержанного программой стратегии развития Университета ИТМО "Приоритет 2030". Проект также был поддержан Комитетом по науке и высшей школе Правительства Санкт-Петербурга в рамках Конкурса грантов для аспирантов вузов, расположенных на территории Санкт-Петербурга в 2022 году. Результаты работы были представлены на следующих конференциях:

• Международная Научная Конференция Молодых ученых «Фундаментальные и прикладные исследования в области молекулярной биологии, биохимии, биотехнологии» (Алма-Ата, Казахстан, 2023);

• 65-я Всероссийская научная конференция МФТИ (раздел ФБМФ - Секция клеточной и молекулярной биологии) (Москва, РФ, 2023);

• Международная конференция 2nd International Electronic Conference on Biomolecules: Biomacromolecules and the Modern World Challenges (2022);

• IX Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков OpenBio 2022 (Кольцово, РФ, 2022);

• XI Конгресс молодых ученых (КМУ) ИТМО 2022 (Санкт-Петербург, РФ, 2022);

• Пятьдесят первая (LI) научная и учебно-методическая конференция Университета ИТМО (Санкт-Петербург, РФ, 2022) ;

• Биохимические научные чтения памяти академика РАН Е.А. Строева (Рязань, РФ, 2022);

• X Конгресс Молодых Ученых (КМУ) ИТМО 2021 (Санкт-Петербург, РФ, 2021);

• VIII Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков OpenBio 2021 (Кольцово, РФ, 2021);

• VII Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, биофизиков, молекулярных биологов и биоинформатиков OpenBio 2020 (Кольцово, РФ, 2021);

• Международный конгресс «VII съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУ, и ассоциированные симпозиумы» (Санкт-Петербург, РФ, 2019).

На основании данных, полученных в работе, было сделано 17 публикаций, 6 из которых являются статьями в журналах Nucleic Acid Research, ChemBioChem, Chemistry the European journal, Russian Journal of Bioorganic Chemistry и Theranostics, индексируемые в МБЦ Scopus и Web of Science.

Диссертационная работа выполнена на 129 страницах, содержит 7 таблиц и 47 рисунков. Структура работы включает в себя введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, заключение, выводы, списки сокращений и терминов, список литературы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Терапевтические олигонуклеотиды в современных исследованиях

Терапевтические олигонуклеотиды - класс молекулярных инструментов в виде коротких последовательностей нуклеиновых кислот, способные регулировать экспрессию специфических генов в клетках живых организмов. Они комплементарно распознают мРНК целевых генов и гибридизуются с ней, после чего происходит расщепление её фосфодиэфирных связей или стерическая блокировка трансляции. Оба таких пути приводят к ингибированию экспрессии целевых генов, процесс которого по-другому называется нокдаун или сайленсинг. Такой метод широко используется в изучении влияния различных генов на жизнедеятельность клеток, а также на его основе разрабатывают терапевтические агенты, подавляющие экспрессию генов, участвующих в патогенных процессах, устраняя симптомы генетических, вирусных и онкологических заболеваний[1,2].

В современных исследованиях выделяют следующие классы терапевтических олигонуклеотидов: интерферирующие РНК (короткие интерферирующие РНК и микроРНК), антисмысловые олигонуклеотиды (АСО), гРНК в комплексе с нуклеазами систем CRISPR/Cas, и каталитические олигонуклеотиды (рибозимы и ДНКзимы)[3,4].

1.1.1. Интерферирующие РНК: короткие интерферирующие РНК и

микроРНК

Интерферирующие РНК - класс малых РНК, которые как при искусственном, так и при природном появлении в клетке запускают каскад взаимодействий с рядом нуклеаз, приводящий к деградации специфической мРНК. Короткие интерферирующие РНК (киРНК с перевода siRNA - small/short interference RNA) и микроРНК (или миРНК с перевода miRNA - microRNA) имеют очень схожий механизм действия, при этом они имеют разные происхождение и биологические роли. Находясь в цитоплазме, интерферирующие РНК, находясь в виде двойной цепи (для киРНК) или одной

цепи, комплементарно связанной самой на себя (для миРНК), связываются с нуклеазным комплексом Dicer. Этот комплекс уменьшает длину интерферирующих РНК до дуплекса из антисмысловой и пассажирской цепей, размером 19-23 п.о., оставляя на каждой цепи липкие 3'-концы, выступающие на 2 нуклеотида (далее, нт) [5]. После, белок AGO2 (Argonaute) в составе РНК-индуцируемого комплекса выключения гена (RISC) захватывает полученный дуплекс. AGO2 расщепляет или высвобождает в цитозоль пассажирскую цепь интерферирующей РНК, образуя рибоуклеопротеид с оставшейся антисмысловой цепью. Полученный комплекс интерферирует уже целевую РНК. При интерференции РНК происходит её комплементарное распознавание и нуклеазное расщепление, таким образом прерывая экспрессию гена на уровне мРНК. В отличие от киРНК, которая чаще изначально находится в цитоплазме, миРНК транскрибируется из соответствующего ей гена в относительно длинный РНК-дуплекс, который расщепляется белком Drosha и перемещается из ядра в цитоплазму белком Exportin 5 [6].

КиРНК является дву- или одноцепочечной РНК (т.н. короткая шпилечная РНК с перевода shRNA - small/short hairpin RNA), у которой имеется дуплекс с двумя полностью комплементарными друг другу антисмысловыми и пассажирскими цепями (рис. 1А). МикроРНК является одноцепочечной РНК, антисмысловая и пассажирская участки которой образует дуплекс с частично комплементарным участком, называемый "балджем" (от англ. bulge), разделяющий т.н. "seed région" на 5'-конце, отвечающий за распознавание целевой мРНК, от остальной комплементарной цепи на 3'-конце [7] (рис. 1Б). Отмечая биологические роли, у киРНК она заключается в распознавании и деградации чужеродной цепи мРНК одного конкретного гена (например, у вирусов), а миРНК, которая ввиду своей неполной комплементарности способна таргетировать мРНК более одного гена, является регулятором экспрессии генов самой клетки-хозяина [4,5]. МиРНК имеет низкую специфичность действия, что существенно ограничивает её использование в качестве селективной ТНК и чаще выступают самих мишеней для нокдауна, например, если миРНК является

онкогенной и нацелена на на подавление трансляции онкосупрессорных белков (ш1Я-17, ш1Я-522) [8-10]. КиРНК более специфична и, в связи с этим, более популярна в качестве молекулярного инструмента для нокдауна генов [2, 5]. К настоящему моменту на основе киРНК существует по меньшей мере четыре одобренных препарата для лечения наследственных заболеваний (РаЙБ^ап, 01уоБ1гап, ЬишаБ^ап, 1псНв1гап), и по меньшей мере семь других препаратов проходят третью фазу клинических испытаний [2,11].

Рис. 1. Интерферирующие РНК. А) - киРНК, Б) - миРНК, В) -Обобщенный механизм интерференции мРНК с помощью киРНК и миРНК.

1.1.2. Антисмысловые олигонуклеотиды (АСО)

Антисмысловые олигонуклеотиды (далее, АСО) - короткие, одноцепочечные олигомеры, длиной 14-30 нт. Они являются самым первым открытым классом молекулярных инструментов для нокдауна генов, и исследовательские работы, посвященные им, берут начало с 1978 года группой ученого Замечника [4]. В качестве мономеров изначально используются дезоксирибонуклеотиды, но могут также использоваться рибонуклеотиды и морфолиновые олигонуклеотиды. АСО могут использоваться для

комплементарного связывания и нуклеазной деградации мРНК целевого гена, подобно интерферирующим РНК [12]. Но также АСО могут связываться с мРНК с последующей стерической блокировки трансляции, и они, также, могут проводить модуляцию (управление) сплайсинга пре-мРНК [12,13]. При нуклеазной деградации АСО формирует дуплекс с целевой мРНК, который распознается ферментом РНКаза Н и происходит расщепление последней [14]. В этом случае используются АСО, состоящие из дезоксирибонуклеотидов, часто с добавлением тиофосфатных связей и/или нуклеотидов с модифицированной пентозой (2'-OMe, 2-МОЕ, LNA), обеспечивающими внутриклеточную стабильность и аффинность к РНК [14] (рис. 2А). При стерической блокировке АСО комплементарно связывается с РНК, делая её недоступной для связывания с другими молекулами (рис. 2Б). Например, если происходит связь со старт-кодоном мРНК, транскрипционные факторы и рибосома не смогут закрепиться на последней и начать трансляцию белка [4,15]. Если мишенью для стерической блокировки была онкогенная миРНК, то она не сможет связываться с мРНК онкосупрессоров [4,15]. При модуляции сплайсинга АСО гибридизуется с пре-мРНК в области интрона или экзона, тем самым инициируя альтернативный сплайсинг с пропуском участка с образованным дуплексом [16,17]. Для стерической блокировки РНК и модуляции сплайсинга пре-мРНК используются АСО на основе морфолиновых олигонуклеотидов (РМО), мономеры которых содержат рибофуранозу вместо пентозы, соединенные между собой фосфодиамидатными связями, вместо фосфодиэфирных [17]. Благодаря такому строению мономеров, РМО обладает низкой аффинностью к внутриклеточным белкам, защищенностью от внутриклеточных нуклеаз и остаются высоко аффинными к целевой РНК [4, 17] (рис. 2В).

Рис. 2. Антисмысловые олигонуклеотиды с различными механизмами действия. А) - АСО, расщепляющие РНК посредством РНКазы Н, Б) -Морфолиновый АСО (PMO), использующийся для стерической блокировки трансляции и модуляции сплайсинга мРНК, В) - молекулярная структура олигомера PMO.

Особенности АСО делают их полноценными конкурентами для киРНК. В настоящий момент около 10 препаратов на основе АСО используются в качестве зарегистрированных средств лечения таких заболеваний, как миодистрофия Дюшенна, спинальная мышечная атрофия, наследственный амилоидоз и семейная гиперхолестеринемия (СГХС) [13].

1.1.3. Системы CRISPR/Cas

Белки, ассоциированные с повторностями CRISPR (от англ. clustered regularly interspaced short palindromic repeats - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами), в связи с гидовыми РНК (гРНК, от англ. guide RNA, gRNA) представляют собой комплекс CRISPR/Cas, который способен не только выключать гены, но и редактировать их, благодаря чему такая система является привлекательным инструментом в генной терапии [4,18,19]. Наиболее известными представителями таких систем являются CRISPR/Cas9, CRISPR/Cas12 и CRISPR/Cas13, которые главным образом отличаются по подтипу нуклеазы Cas, структуре гидовой РНК, НК в качестве мишени (ДНК или РНК), а так же по мотивам в ней, распознаваемыми нуклеазами для расщепления, и по самому способу её расщепления [4,20-22] (рис. 3).

Рис. 3. Примеры систем CRISPR/Cas с соответствующими гРНК: Cas9, Cas12 и Cas13. Комплексы Cas9 и Cas12 нацелены на дцДНК. Cas13, в свою очередь, на оцРНК.

Система CRISPR/Cas9 (CRISPR/Cas II типа) - наиболее широко изученная система редактирования генов, состоящая из эндонуклеазы Cas9 и гРНК, которая в свою очередь состоит из двух цепей РНК: РНК локуса CRISPR (от англ. crRNA) и трансактивирующая РНК (от англ. tracrRNA) [23]. Полученный дуплекс в виде гРНК связывается с Cas9, образуя рибонуклеопротеидный комплекс, который интерферирует специфическую двуцепочечную ДНК (дцДНК) и при распознавании в ней мотива PAM (от англ. Protospacer Adjacent Motif), который чаще всего длиной 3 нт, происходит разрезание цепи с образованием «тупых» концов [24]. Разрыв в ДНК восстанавливается двумя путями: негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологическая рекомбинация (HDR) [19,25,26]. При первом сценарии происходят инсерции и делеции (т.н. indel^i) со сдвигами рамок считывания, после которых ген становится дисфункциональным (нокаутирован). Во втором случае происходит вставка новой последовательности, что используется для редактирования генома.

Система CRISPR/Cas12 (V тип), использует нуклеазу Cas12 и гРНК в ней изначально одноцепочечная. Комплекс Cas^^RR распознает PAM, состоящий

из 4-х нуклеотидов и при разрезании дцДНК образует «липкие» концы, что позволяет выполнять редактирование генома с большей точностью [20].

CRISPR/Cas13 (VI тип) существенно отличается от двух предыдущих систем, т.к. в ней целевой молекулой является одноцепочечная РНК, что делает её по механизму интерференции ближе к киРНК [27]. Одна из разновидностей нуклеаз Cas12 (Cas12a2), подобно Cas13, тоже способна в связке с гРНК связывать целевую мРНК [28,29].

Системы CRISPR/Cas на сегодняшний день широко используются для редактирования генома, однако, несмотря на свой потенциал, одобренной терапии на основе CRISPR/Cas до сих пор не существует. Использование систем Cas9 in vivo вызывает опасные инсерции/делеции хромосом, а также имеют место сложности внутриклеточной доставки и нецелевые эффекты, связанные с неспецифичной гибридизацией гРНК с дцДНК [30]. В качестве более эффективной альтернативы в настоящее время рассматриваются системы Cas12 в виду их относительно меньших размеров и большей специфичности гибридизации гРНК/ДНК [31]. Для комплексов Cas9/гРНК чаще всего требуются PAM-мотивы -NGG-, -NNGRRT-, -NNNNGATT-, где N - любое основание, R -пуриновое основание [32]. Такие мотивы обладают большой вариативностью нуклеотидов в сиквенсе [32]. Комплекс Cas^A^R^ распознает PAM, который чаще всего состоит из нескольких тиминов подряд (-TTTN-), что способствует большей чувствительности гибридизации и, как следствие, более высокой специфичности [4,31]. Cas13 вместо дцДНК интерферирует одноцепочечную РНК (оцРНК), выполняя нокдаун гена вместо нокаута. Таким образом, у системы CRISPR/Cas13 отсутствует риск повреждения хромосом [4,33,34]. В настоящее время отмечаются успешные попытки использования Cas^-^KR комплексов для нокдауна генов, ответственных за репликацию вирусов Денге и энтеровирусов [33,34].

1.1.4. Каталитические олигонуклеотиды Каталитические олигонуклеотиды - особый класс нуклеиновых кислот, способных самостоятельно каталитически деградировать целевые мРНК без

рекрутирования белковых нуклеаз, как это делают АСО, киРНК и система CRISPR/Cas13. К таковым олигонуклеотидам относят рибозимы и ДНКзимы (они же дезоксирибозимы) [35-37]. Общими чертами строения этих олигонуклеотидов являются наличие РНК-распознающих доменов (их также называют «руками») и нахождения между ними особой последовательности (РНК у рибозимов и ДНК у ДНКзимов), которая в присутствие ионов металлов принимает определенную конформацию, которая называется каталитическим ядром. При помощи этого ядра в присутствии ионов металлов (чаще всего, магния) в качестве ко-факторов, осуществляется каталитическое расщепление фосфодиэфирной связи субстратной РНК [38-42]. К настоящему времени предполагается, что расщепления происходит следующим образом: на сайте расщепления между двумя рибонуклеотидами 2' кислородный нуклеофил атакует соседний фосфат, в результате чего образуются продукты расщепления с циклическим фосфатом на 2'- и 3'- концах и гидроксильной группой на 5'-конце другого нуклеотида [36] (рис. 4). Рибозимы и ДНКзимы, проводящие такое расщепление фосфодиэфирной связи, являются лиазами [43].

Рис. 4. Механизм расщепления фосфодиэфирной связи РНК, проводимый рибозимами и ДНКзимами.

1.1.4.1. Рибозимы

Рибозимы - обширный класс рибонуклеотидных мотивов, которых объединяет способность каталитически воздействовать на РНК. Наибольшую известность получили именно рибозимы, расщепляющие РНК. Рибозимы часто представляются одним из доказательств существования т.н. «РНК-мира» [44,45]. Рибозимы встречаются в природе, многие из них входят в состав генома вирусов, а также являются частью регуляторной системы у бактерий [46,47]. Известными представителями каталитически активных рибонуклеотидов являются рибозимы типа «hammerhead» (молотоглав), рибозимы вируса гепатита Д (HDV), сателлитные рибозимы Варкуда (VS), РНКазы P и интроны I и II групп [48,49]. Наибольшую известность получил первый вариант [50]. На основе молотоглавого рибозима разрабатывались как биосенсоры ионов металлов, так и терапевтические олигонуклеотиды [48,50,51].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дубовиченко Михаил Вадимович, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Palomino-vizcaino G., Alvarez-salas L.M. Therapeutic Oligonucleotides Against Cancer: Recent Approaches and New Perspectives // Nucleic Acid Nanotheranostics. - 2019. - P. 1-26.

2. Kulkarni J.A. The current landscape of nucleic acid therapeutics / Witzigmann D, Thomson S.B, Chen S, et al. // Nat. Nanotechnol. - 2021. - Vol. 16(6).

- P. 630-643.

3. Zhou W. Theranostic DNAzymes. / Ding J., Liu J. // Theranostics. - 2017. -Vol. 7(4). - P. 1010-1025.

4. Nedorezova D.D. Specificity of oligonucleotide gene therapy (OGT) agents / Dubovichenko, M.V., Belyaeva, E.P., Grigorieva, E.D., et al. // Theranostics. - 2022. -Vol. 12(16). - P. 7132-7157.

5. Lam J.K. W. siRNA versus miRNA as therapeutics for gene silencing / Chow M.Y, Zhang Y, Leung S.W. // Mol. Ther. - Nucleic Acids. Official journal of the American Society of Gene & Cell Therapy. - 2015. - Vol. 4(9). - Article ID 252.

6. Carthew R.W., Sontheimer E.J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs // Cell. - 2009. - Vol. 136(4). - P. 642-655.

7. Lim L.P. Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of-target mRNAs / Lau N.C, Garrett-Engele P, Grimson A, et al. // Nature.

- 2005. - Vol. 433(7027) - P. 769-773.

8. Zhang S. The risks of mirna therapeutics: In a drug target perspective / Cheng Z, Wang Y, Han T. // Drug Des. Devel. Ther. - 2021. - Vol. 15. - P. 721-733.

9. Ito M. Current clinical trials with non-coding RNA-based therapeutics in malignant diseases: A systematic review / Miyata Y., Okada M. // Transl. Oncol. - 2023.

- Vol. 31 - Article ID 101634.

10. Hashemi A., Gorji-bahri G. MicroRNA: Promising Roles in Cancer Therapy // Curr. Pharm. Biotechnol. - 2020. - Vol. 21(12). - P. 1186-1203.

11. Zhang M.M. The growth of siRNA-based therapeutics: Updated clinical studies / Bahal R, Rasmussen T.P, Manautou J.E, et al. // Biochem. Pharmacol. - 2021. -Vol. 189. - Article ID 114432.

12. Bennett C.F. Therapeutic antisense oligonucleotides are coming of age // Annu. Rev. Med. - 2019. - Vol. 70. - P. 307-321.

13. Crooke S.T. Antisense technology: an overview and prospectus / Baker B.F, Crooke R.M, Liang X.H. // Nat. Rev. Drug Discov. - 2021. - Vol. 20(6). - P. 427-453.

14. Kandimalla E.R. Design, biochemical, biophysical and biological properties of cooperative antisense oligonucleotides / Manning A, Lathan C, Byrn R.A, and Agrawal S // Nucleic Acids Res. - 1995. - Vol. 23(17) - P. 3578-3584.

15. Nan Y., Zhang Y.J. Antisense phosphorodiamidate morpholino oligomers as novel antiviral compounds // Front. Microbiol. - 2018. - Vol. 9. - P. 1-15.

16. Singh N.N. Pre-mRNA Splicing Modulation by Antisense Oligonucleotides. / Luo D, Singh R.N. // Methods Mol Biol. - 2018. Vol. 1828. - P. 415-437.

17. Crooke S.T. RNA-Targeted Therapeutics / Witztum J.L, Bennett C.F, Baker B.F. // Cell Metab. - 2018. - Vol. 27(4). - P. 714-739.

18. JinekM. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. / Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, et al. // Science. - 2012. - Vol. 337(6096). - P. 816-821.

19. Uddin F. CRISPR Gene Therapy: Applications, Limitations, and Implications for the Future / Rudin C.M., Sen T. // Front. Oncol. - 2020. - Vol. 10. -Article ID 1387.

20. Swarts D.C., Jinek M. Cas9 versus Cas12a/Cpf1: Structure-function comparisons and implications for genome editing // Wiley Interdiscip. Rev. RNA. - 2018. - Vol. 9(5). - P. 1-19.

21. Yao R. CRISPR-Cas9/Cas12a biotechnology and application in bacteria / Liu D, Jia X, Zheng Y, et al. // Synth. Syst. Biotechnol. - 2018. - Vol. 3(3). - P. 135149.

22. Abudayyeh O.O. RNA targeting with CRISPR-Cas13 / Gootenberg J.S, Essletzbichler P, Han S, et al. // Nature. - 2017. - Vol. 550(7675. - P. 280-284.

23. Liao C, Beisel C.L. The tracrRNA in CRISPR Biology and Technologies. // Annu Rev Genet. - 2021. - Vol. 23(55). - P. 161-181.

24. Nishimasu H. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA / Ran F.A, Hsu P.D, Konermann S, et al. // Cell. - 2014. - Vol.156(5). - P. 935-949.

25. Bibikova M. Stimulation of Homologous Recombination through Targeted Cleavage by Chimeric Nucleases / Carroll D, Segal DJ, Trautman JK, et al. // Mol Cell Biol. - 2001. - Vol. 21(1). - P. 289-297.

26. Ghezraoui H. Chromosomal Translocations in Human Cells Are Generated by Canonical Nonhomologous End-Joining / Piganeau M, Renouf B, Renaud J.B., et al. // Mol. Cell. - 2014. - Vol. 55(6). - P. 829-842.

27. Kulkarni A. Programmable CRISPR interference for gene silencing using Cas13a in mosquitoes / Yu W, Moon A.S, Pandey A., et al. // J. Genomics. - 2020. - Vol. 8. - P. 30-36.

28. Bravo J.P.K. RNA targeting unleashes indiscriminate nuclease activity of CRISPR-Cas12a2 / Hallmark T, Naegle B, Beisel C.L., et al. // Nature. - 2023. - Vol. 613(7944). - P. 582-587.

29. Dmytrenko O. Cas12a2 elicits abortive infection through RNA-triggered destruction of dsDNA / Neumann G.C, Hallmark T, Keiser D.J., et al. // Nature. - 2023. - Vol. 613(7944). - P. 588-594.

30. Zuccaro M. V. Allele-Specific Chromosome Removal after Cas9 Cleavage in Human Embryos / Xu J, Mitchell C, Marin D, et al. // Cell. - 2020. - Vol. 183(6). - P. 1650-1664

31. Badon I.W. Recent application of CRISPR-Cas12 and OMEGA system for genome editing / Oh Y, Kim H.J, Lee S.H, et al. // Mol. Ther. - 2024. - Vol. 32(1). - P. 32-43.

32. Porter S.N. A practical guide to genome editing using targeted nuclease technologies / Levine R.M., Pruett-Miller S.M. // Compr. Physiol. - 2019. - Vol. 9(2). -P. 665-714.

33. Li H. CRISPR-Cas13a Cleavage of Dengue Virus NS3 Gene Efficiently Inhibits Viral Replication / Wang S, Dong X, Li Q. // Mol. Ther. Nucleic Acids. - 2020.

- Vol. 19 - P. 1460-1469.

34. Keng C.T. AAV-CRISPR-Cas 13 eliminates human enterovirus and prevents death of infected mice / Yogarajah T, Lee R.C.H, Muhammad I.B.H, et al. // EBioMedicine. - 2023. - Vol. 93. - Article ID 104682.

35. Fokina A.A. Delivery of therapeutic RNA-cleaving oligodeoxyribonucleotides (deoxyribozymes): from cell culture studies to clinical trials / Chelobanov B.P, Fujii M, Stetsenko D.A. // Expert Opin. Drug Deliv. - 2017. - Vol. 14(9). - P. 1077-1089.

36. Breaker R.R. A common speed limit for RNA-cleaving ribozymes and deoxyribozymes / Emilsson G.M, Lazarev D, Nakamura S. // RNA. - 2003. - Vol. 9(8).

- P. 949-957.

37. Schubert S., Kurreck J. Ribozyme- and Deoxyribozyme-Strategies for Medical Applications. // Curr Drug Targets. - 2004. - Vol. 5(8). - P. 667-681.

38. Khan A.U. Ribozyme : A clinical tool. // Clin Chim Acta. - 2006. - Vol. 367(1-2). - P. 20-27.

39. Liu H. Crystal structure of an RNA-cleaving DNAzyme / Yu X, Chen Y, Zhang J, et al. // Nat. Commun. - 2017. - Vol. 8(1). - P. 1-10.

40. Breaker R.R., Joyce G.F. A DNA enzyme with Mg2+-dependent RNA phosphoesterase activity // Chem. Biol. - 1995. - Vol. 2(10). - P. 655-660.

41. Brännvall M. Cross talk between the +73/294 interaction and the cleavage site in RNase P RNA mediated cleavage . Kikovska E., Kirsebom L.A. // Nucleic Acids Res. - 2004. - Vol. 32(18). - P. 5418-5429.

42. Schelar E., Liu J. Role of Mg2+ in Hammerhead Ribozyme Catalysis from Molecular Simulation // J Am Chem Soc. - 2008. - Vol. 23(1). - P. 1-7.

43. Nedorezova D.D. Cleaving Folded RNA with DNAzyme Agents. / Dubovichenko M.V, Kalnin A.J, Nour M.A.Y, et al. // Chembiochem. - 2024. - Vol. 25(1). - Article ID 202300637.

44. Kuo M. Y. Characterization of self-cleaving RNA sequences on the genome and antigenome of human hepatitis delta virus / Sharmeen L, Dinter-Gottlieb G, Taylor J. // J. Virol. - 1988. - Vol. 62(12). - P. 4439-4444.

45. Cech T.R. The RNA worlds in context // Cold Spring Harb. Perspect. Biol.

- 2012. - Vol. 4(7). - P. 1-5.

46. Scott W.G. Ribozymes // Curr. Opin. Struct. Biol. - 2007. - Vol. 17(3). - P. 280-286.

47. Lotz T.S., Suess B. Small-Molecule-Binding Riboswitches // Microbiol. Spectr. - 2018. - Vol. 6(4). - P. 1-12.

48. Khan A.U, Lal S.K. Ribozymes: A Modern Tool in Medicine // J Biomed Sci. - 2003. - Vol. 10. - P. 457-467.

49. Collins R.A. The Neurospora Varkud satellite ribozyme // Biochem. Soc. Trans. - 2002. - Vol. 30(6). - P. 1122-1126.

50. Fedoruk-Wyszomirska A. Inhibition of HIV-1 gp41 expression with hammerhead ribozymes / Szymanski M, Glodowicz P, Gabryelska M, et al. // Biochem. J. - 2015. - Vol. 471(1). - P. 53-66.

51. Sun L.Q. Catalytic nucleic acids: From lab to applications / Cairns MJ, Saravolac EG, Baker A. // Pharmacol. Rev. - 2000. - Vol. 52(3). - P. 325-347.

52. Alifano P. Ribonuclease E provides substrates for ribonuclease P-dependent processing of a polycistronic mRNA / Rivellini F, Piscitelli C, Arraiano C.M., et al. // Genes Dev. - 1994. - Vol. 8(24). - P. 3021-3031.

53. Peebles C.L. A self-splicing RNA excises an intron lariat / Perlman PS, Mecklenburg KL, Petrillo ML, et al. // Cell. - 1986. - Vol. 44(2). - P. 213-223.

54. Frank D.N., Pace N.R. Ribonuclease P: unity and diversity in a tRNA processing ribozyme // Annu. Rev. Biochem. - 1998. - Vol. 67(1). - P. 153-180.

55. Cech T.R. The RNA worlds in context // Cold Spring Harb. Perspect. Biol.

- 2012. - Vol. 4(7). - P. 1-5.

56. Sinapah S. Cleavage of model substrates by archaeal RNase P: Role of protein cofactors in cleavage-site selection / Wu S, Chen Y, Pettersson B.M, et al. // Nucleic Acids Res. - 2011. - Vol. 39(3). - P. 1105-1116.

57. Guerrier-Takada C. Artificial regulation of gene expression in Escherichia coli by RNase P / Li Y, Altman S. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1995. - Vol. 92(24). - P. 11115-11119.

58. Trang P. Microreview Developing RNase P ribozymes for gene-targeting and antiviral therapy. / Kim K., Liu F. // Cell Microbiol. - 2004. - Vol. 6(6). - P. 499508.

59. Porster A.C., Symons R.H. Self-cleavage of plus and minus RNAs of a virusoid and a structural model for the active sites. // Cell. - 1997. - Vol. 49. - P. 211220.

60. Sarver N. Ribozymes as Potential Anti-HIV-1 Therapeutic Agents. / Cantin E.M, Chang P.S, Zaia J.A, et al. // Science. - 1990. - Vol. 247(4947). - P. 2-5.

61. Liu G. Re-characterization of hammerhead ribozymes as molecular tools for intermolecular RNA cleavage / Huang X, Pu Q, Zhao Y, et al. // Org. Biomol. Chem. -2017. - Vol. 15(21). - P. 4681-4685.

62. Amison J. Inhibition of hepatitis C virus (HCV)-RNA-dependent translation and replication of a chimeric HCV poliovirus using synthetic stabilized ribozymes / Jensen KL, Jamison SF, Domenico K, et al. // Hepatology. - 2000. - Vol. 31(3). - P. 769776.

63. Morrow P.K. An open-label, phase 2 trial of RPI.4610 (angiozyme) in the treatment of metastatic breast cancer / Murthy R.K, Ensor J.D, Gordon G.S, et al. // Cancer. - 2012. - Vol. 118(17). - P. 4098-4104.

64. Xiong H. Recent advances in oligonucleotide therapeutics in oncology / Veedu R.N., Diermeier S.D. // Int. J. Mol. Sci. - 2021. Vol. 22(7). - Article ID 3295.

65. Cobaleda C., Sánchez-García I. In vivo inhibition by a site-specific catalytic RNA subunit of RNase P designed against the BCR-ABL oncogenic products : a novel approach for cancer treatment. // Blood. - 2000. - Vol. 95(3). - P. 731-738.

66. Weng D.E., Usman N. Angiozyme: A novel angiogenesis inhibitor // Curr. Oncol. Rep. - 2001. - Vol. 3(2). - P. 141-146.

67. Jiao Y. DNA-based enzymatic systems and their applications / Shang Y, Li N, Ding B. // iScience. - 2022. - Vol. 25(4). - P. 1-17.

68. Santoro S.W., Joyce G.F. Mechanism and utility of an RNA-cleaving DNA enzyme // Biochemistry. - 1998. - Vol. 37(38). - P. 13330-13342.

69. Breaker R.R., Joyce G.F. A DNA enzyme that cleaves RNA // Chem. Biol. - 1994. - Vol. 1(4). - P. 223-229.

70. Ponce-Salvatierra A. DNAmoreDB, a database of DNAzymes / Boccaletto P., Bujnicki J.M. // Nucleic Acids Res. - 2021. - Vol. 49(D1). - P. D76-D81.

71. Hollenstein M. DNA catalysis: The chemical repertoire of DNAzymes // Molecules. - 2015. - Vol. 20(11). - P. 20777-20804.

72. Santoro S.W., Joyce G.F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. - 1997. - Vol. 94(9). - P. 4262-4266.

73. Kumar B. Potent Intracellular Knock-Down of Influenza A Virus M2 Gene Transcript by DNAzymes Considerably Reduces Viral Replication in Host Cells. / Rajput R, Pati DR, Khanna M. // Mol Biotechnol. - 2015. - Vol.57(9). - P. 836-45.

74. Rosenbach H. Molecular Features and Metal Ions That Influence 10-23 DNAzyme Activity / Victor J, Etzkorn M, Steger G, et al. // Molecules. - 2020. - Vol. 25(13). - P. 11-21.

75. Grimpe B. Deoxyribozymes: New Therapeutics to Treat Central Nervous System Disorders // Front. Mol. Neurosci. - 2011. - Vol. 4(25). - P. 1-5.

76. Su J. RNA-Cleaving DNAzyme-Based Amplification Strategies for Biosensing and Therapy / Sun C, Du J, Xing X, et al. // Adv. Healthc. Mater. - 2023. -Vol.12(23). - Article ID 2300367.

77. McConnell E.M. Biosensing with DNAzymes / Cozma I, Mou Q, Brennan J.D, et al. // Chem. Soc. Rev. - 2021. - Vol. 50(16). - P. 8954-8994.

78. Zhao Y. Nucleic Acids Analysis / Zuo X, Li Q, Chen F, et al. // Science China Chemistry. - 2021. - Vol. 64(2). - P. 171-203.

79. Wu Y. Inhibition of bcr-abl oncogene expression by novel deoxyribozymes (DNAzymes) / Yu L, McMahon R, Rossi J.J, et al. // Hum. Gene Ther. - 1999. - Vol. 10(17). - P. 2847-2857.

80. Yan J. Therapeutic DNAzymes : From Structure Design to Clinical Applications / Ran M, Shen X, Zhang H. // Adv Mater. - 2023. - Vol.35(30). - Article ID 2300374.

81. Fokina A.A. Expert Opinion on Biological Therapy DNA enzymes as potential therapeutics : towards clinical application of 10-23 DNAzymes / Stetsenko D.A, François J.C. // Expert Opin Biol Ther. - 2015. - Vol.15(5). - P. 689-711.

82. Cao Y. Therapeutic evaluation of epstein-barr virus-encoded latent membrane protein-1 targeted DNAzyme for treating of nasopharyngeal carcinomas / Yang L, Jiang W, Wang X, et al. // Mol. Ther. - 2014. - Vol. 22(2). -P. 371-377.

83. Ma X. Down-regulation of EBV-LMP1 radio-sensitizes nasal pharyngeal carcinoma cells via nf-Kb regulated ATM expression / Yang L, Xiao L, Tang M., et al. // PLoS One. - 2011. - Vol. 6(11). - Article ID 24647.

84. Pereira S. Lipoplexes to deliver oligonucleotides in gram-positive and gramnegative bacteria: Towards treatment of blood infections / Santos R.S, Moreira L, Guimarâes N, et al. // Pharmaceutics. - 2021. - Vol. 13(7). - Article ID 989.

85. Dass C.R., Choong P.F.M. Sequence-related off-target effect of Dz13 against human tumor cells and safety in adult and fetal mice following systemic administration // Oligonucleotides. - 2010. - Vol. 20(2). - P. 51-60.

86. Cho E.A. Safety and tolerability of an intratumorally injected DNAzyme, Dz13, in patients with nodular basal-cell carcinoma: A phase 1 first-in-human trial (DISCOVER) / Moloney FJ, Cai H, Au-Yeung A, et al. // Lancet. - 2013. - Vol. 381(9880). - P. 1835-1843.

87. Pine A.C. A computational approach to identify efficient RNA cleaving 1023 DNAzymes / Brooke G.N., Marco A. // NAR Genomics Bioinform. - 2023. - Vol. 5(1). - P. 1-9.

88. Scarozza P. Oligonucleotides-A Novel Promising Therapeutic Option for IBD. / Schmitt H, Monteleone G, Neurath MF, et al. // Front Pharmacol. - 2019. -Vol.10(314). - Article ID 31068803.

89. Schmidts T. Protective effect of drug delivery systems against the enzymatic degradation of dermally applied DNAzyme / Dobler D, von den Hoff S, Schlupp P, et al. // Int. J. Pharm. - 2011. - Vol. 410(1-2). - P. 75-82.

90. Popp V. Rectal Delivery of a DNAzyme That Specifically Blocks the Transcription Factor GATA3 and Reduces Colitis in Mice / Gerlach K, Mott S, Turowska A, et al. // Gastroenterology. - 2017. - Vol. 152(1). - P. 176-192.

91. Vickers T.A. Effects of RNA secondary structure on cellular antisense activity / Wyatt J.R, Freier S.M. // Nucleic Acids Res. - 2000. - Vol. 28(6). - P. 13401347.

92. Gredell J.A. Impact of target mRNA structure on siRNA silencing efficiency: A large-scale study / Berger A.K., Walton S.P. // Biotechnol. Bioeng. - 2008.

- Vol. 100(4). - P. 744-755.

93. Liu J., Lilley D.M.J. The role of specific 2'-hydroxyl groups in the stabilization of the folded conformation of kink-turn RNA // RNA. - 2007. - Vol. 13(2).

- P. 200-210.

94. Cox A.J. DNA nanotechnology for nucleic acid analysis: multifunctional molecular DNA machine for RNA detection / Bengtson H.N, Rohde K.H, Kolpashchikov D.M. // Chem. Commun. - 2016. - Vol. 52(99). - P. 14318-14321.

95. Lin Y. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences / Cradick T.J, Brown M.T, Deshmukh H, et al. // Nucleic Acids Res. - 2014. - Vol. 42(11). - P. 7473-7485.

96. Puri N. LNA incorporated siRNAs exhibit lower off-target effects compared to 2'-OMethoxy in cell phenotypic assays and microarray analysis / Wang X, Varma R, Burnett C, et al. // Nucleic Acids Symp. Ser. (Oxf). - 2008. - Vol. 52. - P. 25-26.

97. Yaish O. SWOffinder: Efficient and versatile search of CRISPR off-targets with bulges by Smith-Waterman alignment / Malle A, Cohen E, Orenstein Y. // iScience.

- 2024. - Vol. 27(1). - Article ID 108557.

98. Wang Y. A biologically stable DNAzyme that efficiently silences gene expression in cells / Nguyen K, Spitale R.C, Chaput J.C. // Nat. Chem. - 2021. - Vol. 13(4). - P. 319-326.

99. Nguyen K. Chemical evolution of an autonomous DNAzyme with allele-specific gene silencing activity / Malik T.N., Chaput J.C. // Nat. Commun. - 2023. - Vol. 14(1). - P. 1-11.

100. Brad Wan W., Seth P.P. The Medicinal Chemistry of Therapeutic Oligonucleotides // J. Med. Chem. - 2016. - Vol. 59(21). - P. 9645-9667.

101. Friedrich M. Aigner A. Therapeutic siRNA: State-of-the-Art and Future Perspectives // BioDrugs. - 2022. - Vol. 36(5). - P. 549-571.

102. Lomzov A.A. Diastereomers of a mono-substituted phosphoryl guanidine trideoxyribonucleotide: Isolation and properties / Kupryushkin MS, Shernyukov AV, Nekrasov MD, et al. // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2019. - Vol. 513(4). - P. 807-811.

103. Crooke S.T. Phosphorothioate modified oligonucleotide-protein interactions / Vickers T.A., Liang X.H. // Nucleic Acids Res. - 2021. - Vol. 48(10). - P. 5235-5253.

104. Borggrafe J. The architecture of the 10-23 DNAzyme and its implications for DNA-mediated catalysis / Gertzen C.G.W, Viegas A, Gohlke H, et al. // FEBS J. -

2023. - Vol. 290(8) - P. 2011-2021.

105. Nedorezova D.D. Towards DNA Nanomachines for Cancer Treatment: Achieving Selective and Efficient Cleavage of Folded RNA / Fakhardo A.F, Nemirich D.V, Bryushkova E.A, et al. // Angew. Chemie Int Ed Engl. - 2019. - Vol. 58(14) - P. 4654-4658.

106. Molden T.A. Cut and Paste for Cancer Treatment: A DNA Nanodevice that Cuts Out an RNA Marker Sequence to Activate a Therapeutic Function / Niccum C.T, Kolpashchikov D.M. // Angew. Chemie - Int. Ed. - 2020. - Vol. 59(47). P. 21190-21194.

107. Yamaguchi S. Conditional knockdown of Nanog induces apoptotic cell death in mouse migrating primordial germ cells / Kurimoto K, Yabuta Y, Sasaki H, et al. // Development. - 2009. - Vol. 136(23). -. P. 4011-4020.

108. Tan K. Targeting TtVgR via siRNA Knockdown Elicits Ovarian Cell Death in the Tri-spine Horseshoe Crab / Ma X, Su B, Zhan C, et al. // Mar Biotechnol (NY). -

2024. - Vol.26(3). - P. 575-587.

109. Park S. Knockdown of Maged1 inhibits cell cycle progression and causes cell death in mouse embryonic stem cells / Kwon W, Kim H.Y, Ji Y.R, et al. // Differentiation. - 2022. - Vol. 125. - P. 18-26.

110. Kremer D.M. GOT1 inhibition promotes pancreatic cancer cell death by ferroptosis / Nelson B.S, Lin L, Yarosz E.L, et al. // Nat. Commun. - 2021. - Vol. 12(1). - P. 1-13.

111. Cairns M.J. Optimisation of the 10-23 DNAzyme-substrate pairing interactions enhanced RNA cleavage activity at purine-cytosine target sites / King A., Sun L.Q. // Nucleic Acids Res. - 2003. - Vol. 31(11). - P. 2883-2889.

112. Zaborowska Z. Sequence requirements in the catalytic core of the "10-23" DNA enzyme / Fürste J.P, Erdmann V.A, Kurreck J. // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277(43). - P. 40617-40622.

113. Demidov V.V. Frank-Kamenetskii M.D. Two sides of the coin: Affinity and specificity of nucleic acid interactions // Trends Biochem. Sci. - 2004. - Vol. 29(2). - P. 62-71.

114. Kolpashchikov D.M. Evolution of Hybridization Probes to DNA Machines and Robots: research-article // Acc. Chem. Res. - 2019. - Vol. 52(7). - P. 1949-1956.

115. Yan J. An autocatalytic multicomponent DNAzyme nanomachine for tumor-specific photothermal therapy sensitization in pancreatic cancer / Ma X, Liang D, Ran M, et al. // Nat. Commun. - 2023. - Vol. 14(1). - P. 1-21.

116. Nedorezova D.D. Deoxyribozyme-Based DNA Machines for Cancer Therapy / Fakhardo A.F, Molden T.A, Kolpashchikov D.M. // ChemBioChem. - 2020. -Vol. 21(5). - P. 607-611.

117. Böhmer V.I. Multivalent Probes in Molecular Imaging: Reality or Future? / Szymanski W, Feringa B.L, Elsinga P.H. // Trends Mol. Med. - 2021. - Vol. 27(4). - P. 379-393.

118. Mammen M. Polyvalent interactions in biological systems: Implications for design and use of multivalent ligands and inhibitors / Choi S.K., Whitesides G.M. // Angew. Chemie - Int. Ed Engl. - 1998. - Vol. 37(20). - P. 2754-2794.

119. Arsiwala A. Designing multivalent ligands to control biological interactions: From vaccines and cellular effectors to targeted drug delivery / Castro A, Frey S, Stathos M, et al. // Aust. J. Public Adm. - 2019. - Vol. 78(1). - P. 244-255.

120. Kuwabara T. A novel allosterically trans-activated ribozyme, the maxizyme, with exceptional specificity in vitro and in vivo / Warashina M, Tanabe T, Tani K, et al. // Mol Cell. - 1998. - Vol.2(5). - P. 617-627.

121. Dubovichenko M. V. Multivalent DNAzyme agents for cleaving folded RNA / Batsa M., Bobkov G.A., Vlasov G.S, et al. // Nucleic Acids Res. - 2024. - Vol.52(10).

- P. 1-14.

122. Isalan M. Zinc-finger nucleases: How to play two good hands // Nat. Methods. - 2012. Vol. 9(1). - P. 32-34.

123. Waryah C.B. Zinc Fingers, TALEs, and CRISPR Systems: A Comparison of Tools for Epigenome Editing. / Moses, C., Arooj, M., Blancafort, P. // Methods Mol Biol.

- 2018. - Vol.1767. - P. 19-63.

124. Hendel A. Quantifying on- and off-target genome editing / Fine E.J, Bao G, Porteus M.H. // Trends Biotechnol. - 2015. - Vol. 33(2). - P. 132-140.

125. Li T. TAL nucleases (TALNs): Hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain / Huang S, Jiang WZ, Wright D, et al. // Nucleic Acids Res. - 2011. - Vol. 39(1). - P. 359-372.

126. Mandal M. A glycine-dependent riboswitch that uses cooperative binding to control gene expression / Lee M, Barrick J.E, Weinberg Z, et al. // Science. - 2004. - Vol. 306(5694). - P. 275-279.

127. Greenspan N.S., Cavacini L.A. Immunoglobulin Function // Clinical Immunology: Principles and Practice. - 2019. - 5th edition. - P. 223-233.

128. Aiassa L.V. The multivalency game ruling the biology of immunity / Battaglia G., Rizzello L. // Biophys Rev (Melville). - 2023. - Vol. 4(4). - Article ID 041306.

129. Schindler C. A multivalent antibody assembled from different building blocks using tag/catcher systems: A case study / Faust C, Sjuts H, Lange C, et al. // Protein Eng. Des. Sel. - 2022. - Vol. 17(35). - Article ID 014.

130. Miller A. Multimeric antibodies with increased valency surpassing functional affinity and potency thresholds using novel formats / Carr S, Rabbitts T, Ali H. // MAbs. - 2020. - Vol. 12(1). - Article ID 1752529.

r

131. Cuesta A.M. Multivalent antibodies: When design surpasses evolution / Sainz-Pastor N, Bonet J, Oliva B, et al. // Trends Biotechnol. - 2010. - Vol. 28(7). - P. 355-362.

132. Schmidt C. RNA double cleavage by a hairpin-derived twin ribozyme / Welz R, Müller S. // Nucleic Acids Res. - 2000. - Vol. 28(4). - P. 886-894.

133. Iyo M. Maxizyme technology. / Kawasaki H., Taira K. // Methods Mol Biol. - 2004. - Vol. 252- P. 257-265.

134. Thiel K.W., Giangrande P.H. Therapeutic applications of DNA and RNA aptamers // Oligonucleotides. - 2009. - Vol. 19(3). - P. 209-222.

135. Lin M. Rationally Designed Multivalent Aptamers Targeting Cell Surface for Biomedical Applications / Zhang J, Wan H, Yan C, et al. // ACS Appl. Mater. Interfaces. - 2021. - Vol. 13(8). - P. 9369-9389.

136. Wang Z. Multivalent Aptamer Approach: Designs, Strategies, and Applications / Yang X, Lee NZ, Cao X. // Micromachines. - 2022. - Vol. 13(3). - P. 117.

137. Alterman J.F. A divalent siRNA chemical scaffold for potent and sustained modulation of gene expression throughout the central nervous system / Godinho B.M.D.C, Hassler M.R, Ferguson C.M, et al. // Nat. Biotechnol. - 2019. - Vol. 37. - P. 884-894.

138. Hariharan V.N. Divalent siRNAs are bioavailable in the lung and efficiently block SARS-CoV-2 infection / Shin M, Chang CW, O'Reilly D, et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. - 2022. - Vol. 120(11). - Article ID 2219523120.

139. Kolpashchikov D.M. Binary malachite green aptamer for fluorescent detection of nucleic acids // J. Am. Chem. Soc. - 2005. - Vol. 127(36). - P. 12442-12443.

140. Kuwabara T. A novel allosterically trans-activated ribozyme, the maxizyme, with exceptional specificity in vitro and in vivo / Warashina M, Tanabe T, Tani K, et al. // Mol. Cell. - 1998. - Vol. 2(5). - P. 617-627.

141. Burke D.H. Articles Allosteric Hammerhead Ribozyme TRAPs / Ozerova N.D.S., Nilsen-hamilton M. // Oligonucleotides. - 2002. - Vol.41(21). - P. 6588-6594.

142. Soda Y. A novel maxizyme vector targeting a bcr-abl fusion gene induced specific cell death in Philadelphia chromosome-positive acute lymphoblastic leukemia / Tani K, Bai Y, Saiki M, et al. // Blood. - 2004. - Vol. 104(2). - P. 356-363.

143. Kolpashchikov D.M. A binary deoxyribozyme for nucleic acid analysis // ChemBioChem. - 2007. - Vol. 110(8). - P. 2039-2042.

144. Vorobjeva M. Binary Hammerhead Ribozymes with Improved Catalytic Activity / Zenkova, M., Venyaminova, A., Vlassov, V. // Oligonucleotides. - 2006. - Vol. 16(3). - P. 239-252.

145. Gomes de Oliveira A.G. RNA-Cleaving DNA Thresholder Controlled by Concentrations of miRNA Cancer Marker / Dubovichenko MV, ElDeeb AA, Wanjohi J, et al. // ChemBioChem. - 2021. - Vol. 22(10). - P. 1750-1754.

146. Patra C., Eldeeb A.A. Thresholding DNA nanomachine as a highly cooperative and efficient enzyme-like system for controlled RNA cleavage. // ChemMedChem. - 2023. - Vol.18(7). - P. 1-8.

147. Lyalina T.A. A DNA minimachine for selective and sensitive detection of DNA . Goncharova EA, Prokofeva NY, Voroshilina ES, et al. // Analyst. - 2019. - Vol. 144(2). - P. 416-420.

148. Ateiah M. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus cereus Species / Gandalipov ER, Rubel AA, Rubel MS, et al. // Int. J. Mol. Sci. - 2023. - Vol. 24(5). - Article ID 4473.

149. Maltzeva Y.I. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) Products without Denaturation Using Peroxidase-like DNA Machines (PxDM) / Gorbenko DA, Nikitina EV, Rubel MS, et al. // Int. J. Mol. Sci. - 2023. - Vol. 24(9). -Article ID 7812.

150. Hussein Z. DNAzyme Nanomachine with Fluorogenic Substrate Delivery Function: Advancing Sensitivity in Nucleic Acid Detection / Nour MAY, Kozlova AV, Kolpashchikov DM, et al. // Anal. Chem. - 2023. - Vol. 95(51). - P. 18667-18672.

151. Drozd V.S. Binary Antisense Oligonucleotide Agent for Cancer Marker-Dependent Degradation of Targeted RNA / Eldeeb A.A, Kolpashchikov D.M, Nedorezova D.D. // Nucleic Acid Therapeutics. - 2022. - Vol.32(5). - P. 412-420.

152. Zakrevsky P. A suite of therapeutically-inspired nucleic acid logic systems for conditional generation of single-stranded and double-stranded oligonucleotides / Bindewald E, Humbertson H, Viard M, et al. // Nanomaterials. - 2019. - Vol. 9(4). -Article ID 615.

153. Batsa M. Bivalent System of Deoxyribozymes for Efficient RNA Cleavage / Dubovichenko M.V., Kolpashchikov D.M. // Biol. Life Sci. Forum. - 2022. - Vol. 20(1).

- P. 1-13.

154. Sundin G.W., Bender C.L. Dissemination of the strA-strB streptomycin-resistance genes among commensal and pathogenic bacteria from humans, animals, and plants // Mol. Ecol. - 1996. - Vol. 5(1). - P. 133-143.

155. Hershey J.W.B. The role of eIF3 and its individual subunits in cancer // Biochim Biophys Acta. - 2015. - Vol. 1849(7). - P. 792-800.

156. Taylor A.I. A modular XNAzyme cleaves long, structured RNAs under physiological conditions and enables allele-specific gene silencing / Wan CJK, Donde MJ, Peak-Chew SY, et al. // Nat Chem. - 2022. - Vol. 14(11). - P. 1295-1305.

157. Xiao L. A promising nucleic acid therapy drug: DNAzymes and its delivery system / Zhao Y, Yang M, Luan G, et al. // Front. Mol. Biosci. - 2023. - Vol. 10. - P. 116.

158. Dubovichenko M. V. Comparison of antisense oligonucleotides, DNAzymes and their bivalent forms in rnase h dependent cleavage of folded RNA / Nnanyereugo V.O, Bobkov G.A, ElDeeb A.A, et al. // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2024.

- Article ID BioChem2460524, Accepted (Принято к публикации).

159. Nedorezova D.D. Cleaving Folded RNA by Multifunctional DNAzyme Nanomachines / Dubovichenko M.V, Eldeeb A. A, Nour M. A. Y, et al. // Chem. Eur. J.

- 2024. - Vol. 30(40). - Article ID 202401580.

160. Dubovichenko M.V. Marker-dependent cleavage of RNA by binary (split) DNAzyme Machines / Nedorezova D.D, Patra C, Drozd V.S, et al. // ChemBioChem. -2024. - cbic.202400665. Submitted.

161. Brewster J.L. Deletion of Dadl in mice induces an apoptosis-associated embryonic death / Martin SL, Toms J, Goss D, et al. // Genesis. - 2000. - Vol. 26(4). -P. 271-278.

162. Gertsen A. V. Development of a strategy to combat antibiotic-resistant strains of bacteria based on the use of DNA-nanomachines / Chalenko K.P, Nedorezova D.D, Kolpashchikov D.M, et al. // Genes & Cells. - 2020. - Vol. 15. - P. 184-184.

163. El-Deeb A.A. Toward a Home Test for COVID-19 Diagnosis: DNA Machine for Amplification-Free SARS-CoV-2 Detection in Clinical Samples / Zablotskaya SS, Rubel MS, Nour MAY, et al. // ChemMedChem. - 2022. - Vol 17(20). - Article ID 202200382.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Dubovichenko M.V. Multivalent DNAzyme agents for cleaving folded RNA / Batsa M, Bobkov G.A, Vlasov G.S, et al. // Nucleic Acids Res. - 2024. - P. - 114. https://doi.org/10.1093/nar/gkae295

2. Dubovichenko M.V. Comparison of antisense oligonucleotides, dnazymes and their bivalent forms in rnase h dependent cleavage of folded RNA / Nnanyereugo V.O, Bobkov G.A, ElDeeb A.A, et al. // Russian Journal of Bioorganic Chemistry. - 2024. https://doi.org/10.1134/S1068162024060219

3. Dubovichenko M.V. Marker-Dependent Cleavage of RNA by Binary (split) DNAzyme (BiDz) and Binary DNA Machines (BiDM) / Nedorezova D.D., Patra C., Drozd V.S., et al. // ChemBioChem. - 2024. https://doi.org/10.1002/cbic.202400665

4. Batsa M. Bivalent System of Deoxyribozymes for Efficient RNA Cleavage / Dubovichenko M.V, and Kolpashchikov D.M. // Biol. Life Sci. Forum. - 2022. - Vol. 20(1). - P. 1-13. https://doi.org/10.3390/IECBM2022-13510

5. Nedorezova D.D. Cleaving Folded RNA by Multifunctional DNAzyme Nanomachines / Dubovichenko M.V, Eldeeb A. A, Nour M. A. Y, et al. // Chem. Eur. J. 2024. - Vol. 30. - Article ID e202401580. https://doi.org/10.1002/chem.202401580

6. Nedorezova D.D. Cleaving Folded RNA with DNAzyme Agents / Dubovichenko M.V, Kalnin A.J, Nour M.A.Y, et al. // Chembiochem. - 2024 - Vol. 25(1). - Article ID e202300637. https://doi.org/10.1002/cbic.202300637

7. Nedorezova D.D. Specificity of oligonucleotide gene therapy (OGT) agents / Dubovichenko M.V, Belyaeva E.P, Grigorieva E.D, et al. // Theranostics. - 2022. -Vol. 12(16). - P. 7132-7157. https://doi.org/10.7150/thno.77830

БЛАГОДАРНОСТИ

Я бы хотел выразить свою искреннюю благодарность:

Моему научному руководителю к.х.н. Д.М. Колпащикову, профессору Университета Центральной Флориды и Университета ИТМО, за научное руководство в магистратуре и аспирантуре, за опыт и наставничество, за неоценимую поддержку и помощь во всех этапах проведений исследований, публикаций полученных результатов и написании диссертации.

Руководителям химико-биологического кластера ИТМО., д.х.н. В.В. Виноградову и П.П. Хапаевой за помощь и поддержку в работе над диссертацией.

Научным коллективам лаборатории «Нанотехнологий нуклеиновых кислот» ИТМО и лаборатории «ДНК-наносенсорной диагностики» за внимание, содействие в выполнении проектов, и проводимые научные дискуссии.

Хочу также выразить особую благодарность своей семье, которая была источником эмоциональной и финансовой поддержки, мотивации и сил.