Разработка многокомпонентных ДНК-конструкций для селективного и эффективного расщепления РНК-мишеней тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Недорезова Дарья Дмитриевна

• Недорезова Дарья Дмитриевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Недорезова Дарья Дмитриевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Современные подходы к терапии опухолевых заболеваний

1.2. Специфичность олигонуклеотидных агентов

1.3. Дилемма сродства/ селективности

1.4. РНК-расщепляющие рибозимы и ДНКзимы

1.5. Специфичность и селективность рибозимов и ДНКзимов

1.6. Подходы к увеличению специфичности рибозимов и ДНКзимов

1.6.1. Биоинформатический выбор последовательностей

1.6.2. РНК-технологии для маркер-активируемого расщепления РНК при помощи рибозимов

1.6.3. Бинарная ДНК технология для селективного распознавания РНК-мишеней

1.6.4. Нацеливание на гены домашнего хозяйства

1.7. Низкая эффективность дезоксирибозимов

1.7.1. Химический механизм действия ДНКзимов

1.7.2. Каталитический цикл ДНКзимов

1.7.3. Дилемма связывания/высвобождения

1.7.4. Влияние структуры РНК-мишени на каталитическую эффективность

ДНКзима

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Реактивы, расходные материалы и оборудование

2.2. Экспериментальные процедуры

2.2.1. Использование сервера тБоМ

2.2.2. Измерение концентраций олигонуклеотидов

2.2.3. Сборка ДНК-наномашин

2.2.4. Анализ расщепления РНК

Глава 3. Результаты

3.1. Дизайн бинарной ДНК-наномашины для маркер-зависимого расщепления целевых РНК-мишеней

3.2. РНК-мишень и онкомаркер, их термодинамические свойства

3.3. Разработка бинарной ДНК-наномашины для маркер-зависимого расщепления целевых РНК-мишеней

3.3.1. Сборка бинарной ДНК-наномашины

3.3.2. Селективное расщепление РНК-мишени в присутствии онкомаркера

3.3.3. Определение предела обнаружения онкомаркера с помощью биДНМ-1

3.3.4. Вклад дополнительных РНК-связывающих доменов в расщепление РНК

3.3.5. Зависимость эффективности расщепления РНК от стабильности вторичной структуры РНК-мишени

3.4. Оптимизация активности ДНКзимов и ДНК-наномашин на их основе на РНК-мишенях с высокой стабильностью

3.5. Оптимизация ДНКзимов традиционного дизайна

3.6. Оптимизация ДНК-наномашин на основе традиционного ДНКзима

3.6.1. Оптимизация ДНК-наномашин для расщепления РНК-2

3.6.2. Оптимизация ДНК-наномашин для расщепления РНК-1

3.6.3. Оптимизация ДНК-наномашин для расщепления РНК-3

3.7. Определение каталитических констант оптимальных ДНКзимных конструкций

3.7.1. Определение константы скорости расщепления РНК (к2)

3.7.2. Определение константы Михаэлиса (Кт), константы скорости (к^) и расчет каталитических констант (к1, к-1, к3)

3.7.3. Каталитическая эффективность оптимальных ДНКзимов

3.7.4. Каталитическая эффективность оптимальных ДНК-наномашин в сравнении с оптимальными ДНКзимами

3.8. Исследование селективности оптимальных ДНКзимов и ДНК-наномашин...83 Глава 4. Обсуждение

4.1. Высокоселективное маркер-зависимое расщепление РНК-субстрата

4.2. Стабильность локальной структуры РНК (сайта расщепления) определяет эффективность расщепления

4.3. Стадия присоединения ДНКзима к РНК является лимитирующей при расщеплении структурированных РНК

4.4. ДНКзимы с высокоаффинными доменами могут обеспечить высокую скорость расщепления и высокую селективность, если продукты расщепления РНК образуют стабильные вторичные структуры

4.5. Последовательности РНК-субстрата, фланкирующие сайт расщепления 5'-Ои-З', влияют на константу расщепления (к2)

4.6. Влияние дополнительных РНК-связывающих доменов на эффективность оптимальных ДНКзимов

4.7. Влияние дополнительных РНК-связывающих доменов на эффективность родительских ДНКзимов

4.8. Термодинамические особенности конструирования ДНК-наномашин

4.9. Дополнительные домены ДНК-наномашин не способствуют достижению

максимально возможной скорости расщепления

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Список сокращений

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ Приложение

121

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка многокомпонентных ДНК-конструкций для селективного и эффективного расщепления РНК-мишеней»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Онкологические заболевания занимают второе место среди причин смертности в мире. Несмотря на многолетние усилия по разработке новых методов лечения, универсального и безопасного подхода к терапии опухолевых заболеваний до сих пор не найдено. Генная терапия является многообещающим подходом для борьбы с онкологическими заболеваниями. Расщепление матричной РНК (мРНК) любого гена приводит к утрате его биологической функции, например, может привести к подавлению экспрессии целевого белка. Ранее проводились исследования, направленные на возможность использования олигонуклеотидных генно-терапевтических агентов, таких как малые интерферирующие РНК, антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы и дезоксирибозимы (ДНКзимы) для лечения онкологических заболеваний. Однако, к сожалению, они часто оказывались неэффективными, из-за низкой селективности и специфичности, что приводило к нежелательным побочным эффектам. Большинство генно-терапевтических агентов были направлены на подавление экспрессии РНК-мишеней, ответственных за развитие опухолей (онкомаркеров). Нацеливание на онкомаркеры зачастую лишь замедляет рост опухоли, но не приводит к гибели опухолевых клеток. Более того, традиционные агенты могут неспецифически связываться с нецелевыми частично комплементарными РНК, вызывая побочные эффекты. Для повышения эффективности и селективности существующих генно-терапевтических подходов в данной работе предлагается разработать многокомпонентную ДНК-конструкцию, активируемую РНК-онкомаркером, способную избирательно подавлять экспрессию жизненно важного гена, например гена домашнего хозяйства.

В качестве активной части многокомпонентной ДНК-конструкции предлагается использовать РНК-расщепляющие ДНКзимы - короткие синтетические последовательности ДНК, способные расщеплять РНК-мишени благодаря наличию в их составе каталитического ядра. Для осуществления

функции маркер-активируемого и селективного расщепления целевой РНК предлагается использовать подход на основе бинарного ДНКзима (биДНКзима). В таком случае каталитическое ядро ингибировано путем его разделения на две части. Связывание маркерной последовательности восстанавливает каталитическую активность и приводит к расщеплению целевой РНК-мишени. Ранее на основе биДНКзимов были разработаны биосенсоры для узнавания нуклеиновых кислот. Исследования продемонстрировали высокую селективность такого «бинарного» подхода к связыванию РНК-мишеней при физиологических условиях. Такой подход эффективно решает проблему сродства и селективности при разработке дизайна гибридизационных зондов. В данной работе впервые предлагается применение биДНКзима для терапии опухолевых заболеваний, основанное на маркер-зависимом расщеплении РНК гена домашнего хозяйства в присутствии специфической маркерной последовательности, характерной для онкологического заболевания.

Для увеличения эффективности расщепления РНК, имеющей стабильную вторичную структуру, в данной работе предложено использование многокомпонентных ДНК-конструкций - ДНК-наномашин, с дополнительными РНК-связывающими доменами - «руками». Такие домены способны увеличить эффективность ДНКзима традиционного дизайна путем ускорения стадий присоединения и высвобождения за счет использования четырех укороченных РНК-связывающих доменов, вместо двух длинных. Данный подход может эффективно решить проблему связывания и высвобождения традиционных ДНКзимов. В ходе работы была проведена оптимизация ДНКзимов традиционного дизайна, а также разработка на их основе ДНК-наномашин. Кроме того, были измерены каталитические параметры их эффективности и селективности в расщеплении трёх структурированных РНК-мишеней. Было установлено, что ДНК-наномашины действительно обладают более высокой эффективностью благодаря увеличению скорости связывания РНК-субстрата и ускоренному высвобождению продуктов расщепления, при этом сохраняется

высокая селективность распознавания РНК-мишени за счет использования коротких РНК-связывающих доменов.

Таким образом, целью работы являлась разработка маркер-активируемых многокомпонентных ДНКзимных конструкций для эффективного и селективного расщепления РНК-мишеней, и исследование каталитических особенностей ДНКзимных конструкций в расщеплении структурированных РНК-мишеней.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать многокомпонентную ДНК-конструкцию на основе бинарного ДНКзима для селективного маркер-зависимого расщепления РНК-мишеней.

2. Оптимизировать ДНКзимы традиционного дизайна для расщепления РНК-субстратов со стабильной вторичной структурой и исследовать влияние параметров стабильности РНК на каталитическую активность ДНКзимов.

3. Включить традиционный ДНКзим в многокомпонентную ДНК-конструкцию, содержащую дополнительные РНК-связывающие домены, и исследовать их способность увеличивать сродство к РНК-мишени по сравнению с оптимальным ДНКзимом традиционного дизайна при сохранении высокой селективности.

4. Исследовать способность дополнительных РНК-связывающих доменов многокомпонентных ДНК-конструкций одновременно ускорять как связывание структурированных РНК-мишеней, так и высвобождение продуктов реакции по сравнению с оптимальными ДНКзимами традиционного дизайна.

Научная новизна работы заключается в разработке конструкций, способных распознавать последовательность онкомаркера с последующим расщеплением РНК-мишени, отличающейся от онкомаркера. Такой подход открывает перспективы создания генно-терапевтических агентов нового поколения, обладающих повышенной эффективностью подавления опухолевых клеток и минимальными побочными эффектами. Кроме того, в данной работе впервые оптимизированы как ДНКзимы традиционного дизайна, так и ДНК-наномашины для расщепления РНК-мишеней со стабильной вторичной структурой. Было протестировано 34 ДНКзима традиционного дизайна и 48 ДНК-

наномашин на его основе. Каталитические параметры реакции расщепления были измерены для шести оптимизированных агентов, направленных на три РНК-мишени. На основе результатов впервые было установлено, что включение дополнительных РНК-связывающих доменов в ДНКзимные конструкции значительно увеличивает скорость расщепления РНК. Это достигается как за счет ускоренного связывания с РНК-мишенью, так и за счёт более быстрого высвобождения продуктов расщепления в условиях многократного каталитического оборота.

Теоретическая и практическая значимость работы. Разработка маркер-активируемых ДНКзимных конструкций открывает новые горизонты для создания инструментов, направленных на специфическое подавление целевых клеток, включая раковые. Эти конструкции могут быть созданы не только на основе ДНКзимов, но также на антисмысловых олигонуклеотидах и малых интерферирующих РНК. Данная работа представляет собой как технологическую разработку, так и прикладное исследование РНК-расщепляющих ДНКзимов. Вклад работы в фундаментальную науку состоит в исследовании каталитического цикла ДНКзимных конструкций при расщеплении РНК-субстратов, обладающих устойчивой вторичной структурой. Кроме того, работа сфокусирована на решении проблем, связанных со сродством и селективностью, а также связыванием и высвобождением, которые характерны для гибридизационных зондов на основе ДНКзимов. Полученные результаты закладывают основу для последующего применения ДНКзимных конструкций в терапевтических системах. Важно отметить, что исследования были проведены в бесклеточной системе и полученные результаты необходимо далее верифицировать в клеточных культурах и на животных моделях.

Результаты данного исследования в будущем могут стать основой для разработки инновационного подхода к селективному расщеплению структурированных РНК только в присутствии маркерных последовательностей. Это станет важным шагом в развитии противоопухолевой терапии. Кроме того,

предложенный подход имеет потенциал найти применение в лечении вирусных и генетических заболеваний.

Методология и методы исследования. В данном исследовании в качестве РНК-мишеней были использованы фрагменты мРНК биологически значимых генов, обладающих различной стабильностью вторичных структур полного фрагмента, фрагментов шпилек, окружающих сайты расщепления, и продуктов их расщепления. Среди выбранных мРНК были: мРНК гена домашнего хозяйства 0Л01, потеря белкового продукта данного гена приводит к апоптотической гибели клеток; мРНК суицидального вектора pKNG101, содержащего ген, обеспечивающий устойчивость бактерий к стрептомицину (STR); мРНК гена зеленого флуоресцентного белка (GFP), который служит удобной модельной мишенью для экспериментов на клеточных культурах. В качестве онкомаркера для активации расщепления с использованием бинарного ДНКзима был использован фрагмент мРНК биологически значимого гена Ы-Муе, высокая экспрессия которого является маркером нейробластомы. Были разработаны и протестированы следующие ДНК-конструкции: (1) бинарная ДНК-наномашина на основе бинарного ДНКзима для маркер-зависимого расщепления РНК-мишеней; (2) ДНК-наномашина на основе традиционного ДНКзима, направленная на увеличение эффективности расщепления структурированных РНК-мишеней. Основными методами исследования были электрофорез в агарозном и полиакриламидном геле, а также количественный анализ продуктов расщепления РНК. Эти методы позволили оценить степень сборки ДНК-наномашин и процент расщепления целевой мРНК.

Достоверность научных достижений. Заключения, сделанные в ходе работы основаны на статистически значимых результатах, которые были получены на современном оборудовании с использованием общепринятых подходов к определению активности ДНКзимных конструкций. Каждый эксперимент был проведен по крайне мере в трехразовой повторности для проверки их воспроизводимости и статистической обработки результатов.

Апробация работы. Результаты были апробированы на конференциях:

1. Молодежная конференция по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2018).

2. VII Конгресс молодых ученых Университета ИТМО (Санкт-Петербург, 2018).

3. 11th Annual Nanoscience an Engineering Research Conference NanoFlorida (Мельбурн, Флорида, США 2018).

4. The Eleventh International Conference BGRS\SB-2018, SYSTEMS BIOLOGY AND BIOMEDICINE (SBIOMED-2018) Symposium (Новосибирск, 2018).

5. American Chemical Society meeting, Spring 2019 (Орландо, Флорида, США, 2019).

6. 3rd International Conference "Smart Bio" (Каунас, Латвия, 2019).

7. Международный конгресс «VII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУ, и ассоциированные симпозиумы» (Санкт-Петербург, 2019).

8. VIII Конгресс молодых ученых Университета ИТМО (Санкт-Петербург, 2019).

9. II Ежегодный саммит молодых ученых и инженеров «Большие вызовы для общества, государства и науки».

10. МОЛОДЁЖНАЯ ШКОЛА-КОНФЕРЕНЦИЯ по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2020).

11. 25-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА» (Пущино, 2022).

12. Конференция "Информационные технологии для персонализированной медицины" с блоком летней школы для молодых ученых (2022).

13. Геномика и биотехнология микроорганизмов. Всероссийская научная молодежная конференция (Владивосток, 2022).

Публикации по теме диссертации.

1. Nedorezova D.D., Fakhardo A.F., Nemirich D.V., Bryushkova E.A., Kolpashchikov D.M. Towards DNA Nanomachines for Cancer Treatment: Achieving Selective and Efficient Cleavage of Folded RNA // Angewandte Chemie - International Edition - 2019, № 58 (14), pp. 4654-4658. DOI: 10.1002/anie.201900829.

2. Nedorezova D.D., Fakhardo A.F., Molden T.A., Kolpashchikov D.M. Deoxyribozyme-based DNA Machines for Cancer Therapy // ChemBioChem - 2020, № 21 (5), pp. 607-611. DOI: 10.1002/cbic.201900525.

3. Nedorezova D.D., Dubovichenko M.V., Krasnoshchekova E.P., Grigorieva E.D., Peresadina A.V., Kolpashchikov D.M. Specificity of oligonucleotide gene therapy (OGT) agents // Theranostics - 2022, № 12 (16), pp. 7132-7157. DOI: 10.7150/thno.77830.

4. Nedorezova D. D., Rubel M. S., Rubel A. A. Multicomponent DNAzyme Nanomachines: Structure, Applications, and Prospects //Biochemistry (Moscow). -2024, № 1 (89), pp. S249-S261. DOI: 10.1134/S0006297924140141.

5. Nedorezova D. D. Dubovichenko M.V., Kalnin A.J., Nour M.A., Eldeeb A.A., Ashmarova A.I., Kurbanov G.F., Kolpashchikov D.M. Cleaving Folded RNA with DNAzyme Agents // ChemBioChem. - 2024, № 1 (25), p. e202300637. DOI: 10.1002/cbic.202300637

6. Nedorezova D.D., Dubovichenko M.V., Eldeeb A. A., Nur M.A., Bobkov G.A., Ashmarova A.I., Kalnin A.J., Kolpashchikov, D.M. Cleaving Folded RNA by Multifunctional DNAzyme Nanomachines // Chemistry-A European Journal. - 2024, p. e202401580. DOI: 10.1002/chem.202401580.

Работа была поддержана грантом Российского Фонда Фундаментальных Исследований Аспиранты, проект №20-34-90071, Комитетом по науке и высшей школе Правительства Санкт-Петербурга в рамках Конкурса грантов для студентов вузов, расположенных на территории Санкт-Петербурга, аспирантов вузов, отраслевых и академических институтов, расположенных на территории Санкт-Петербурга в 2018 и 2020 годах, а также Санкт-Петербургским государственным университетом (проект № 95444727).

Личный вклад автора заключался в проведении анализа литературных источников, разработке дизайнов ДНКзимов и ДНК-наномашин, а также проведении экспериментов, описанных в диссертации. Все изложенные в работе результаты, описанные на внеклеточных растворах получены автором самостоятельно или при его непосредственном участии. Результаты исследований и сделанные по ним выводы были подвергнуты статистической обработке, оформлению и описанию автором лично и обсуждены с научными руководителями и со-авторами статей при подготовке публикаций.

Структура и объем диссертации. Диссертация представлена на русском и английском языках. Текст диссертации в обоих вариантах состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, использованных в работе, описания результатов исследования, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов, а также списка использованных источников. Русский текст диссертации изложен на 132 печатных страницах, проиллюстрирован 24 рисунками, 3 таблицами, содержит 1 приложение. Список литературы содержит 152 литературный источник, включая статьи в ведущих научных журналах в этой области. Диссертация изложена в соответствии с общими требованиями к оформлению кандидатских и докторских диссертаций, утверждёнными в ГОСТ Р 7.0.11-2011.

Основные научные результаты:

• Разработана ДНК-наноконструкция, которая способна расщеплять фрагмент целевой матричной РНК гена домашнего хозяйства с высокой селективностью в присутствии маркерной последовательности, см. работы [52,97,120,121,122] (личный вклад автора состоял в дизайне ДНК-наноконструкций, их тестировании, анализе результатов, написании и редактуре публикаций)

• Установлено, что дополнительные РНК-связывающие домены разработанной ДНК-наноконструкции способны одновременно повышать как эффективность расщепления, так и селективность распознавания целевого РНК-субстрата, обладающего стабильной вторичной структурой, по сравнению с

ДНКзимами традиционного дизайна, решая проблему сродства/селективности, см. работы [52, 120, 121, 122, 132, 133] (личный вклад автора состоял в дизайне ДНК-наноконструкций, их тестировании, анализе результатов, написании и редактуре публикаций)

• Установлено, что дополнительные РНК-связывающие домены разработанных ДНК-наноконструкций повышают эффективность расщепления целевого РНК-субстратов за счет раскручивания их стабильной вторичной структуры и, следовательно, ускорения стадии присоединения, см. работы [52, 97, 120, 121, 122, 132, 133] (личный вклад автора состоял в дизайне ДНК-наноконструкций, их тестировании, расчете каталитических констант, анализе результатов, написании и редактуре публикаций)

• Установлено, что дополнительные РНК-связывающие домены разработанных ДНК-наноконструкций повышают эффективность расщепления целевого РНК-субстратов за счет использования четырех укороченных доменов, вместо двух длинных, что приводит к ускорению стадии высвобождения продуктов реакции, решая проблему присоединения/высвобождения, см. работы [132, 133] (личный вклад автора состоял в дизайне ДНК-наноконструкций, их тестировании, расчете каталитических констант, анализе результатов, написании и редактуре публикаций)

• Установлено, что лимитирующей стадией расщепления РНК-субстратов, обладающих устойчивой вторичной структурой, при помощи ДНКзимов классического дизайна является стадия присоединения, см. работу [131] (личный вклад автора состоял в проведении экспериментов, расчете каталитических констант, анализе результатов, написании и редактуре публикации)

• Установлено, что ДНКзимы с длинными высокоаффинными доменами могут обеспечить как высокую скорость, так и высокую селективность расщепления целевой РНК, если продукты расщепления РНК образуют стабильные вторичные структуры, см. работу [131,132] (личный вклад автора

состоял в проведении экспериментов, расчете стабильности структур РНК, анализе результатов, написании и редактуре публикаций)

• Установлено, что стабильность локальной структуры РНК определяет эффективность ее расщепления при помощи ДНКзимных конструкций, см. работы [131,133] (личный вклад автора состоял в проведении экспериментов, расчете стабильности структур РНК, анализе результатов, написании и редактуре публикаций)

• Установлено, что последовательность РНК-субстрата, фланкирующая сайт расщепления влияет на константу скорости расщепления данной РНК, см. работу [131] (личный вклад автора состоял в проведении экспериментов, расчете каталитических констант, анализе результатов, написании и редактуре публикации)

• Проведено подробное исследование каталитической активности ДНК-наноконструкций на основе ДНКзимов классического дизайна в расщеплении РНК-субстратов, обладающих устойчивой вторичной структурой, см. работы [129, 131, 132, 133] (личный вклад автора состоял в дизайне ДНК-наноконструкций, их тестировании, анализе результатов, написании и редактуре публикаций)

• Было проведено подробное литературное исследование известных ДНК-наноконструкций на основе ДНКзимов различного дизайна, описаны способы и рекомендации к их применению, см. работы [52, 97] (личный вклад автора состоял в анализе литературных источников, руководстве написания литературного обзора, написании и редактуре обзорных статей)

• Было проведено подробное литературное исследование специфичности известных терапевтических агентов на основе нуклеиновых кислот, а также подходов к увеличению их специфичности, см. работы [35, 52] (личный вклад автора состоял в анализе литературных источников, руководстве написания литературного обзора, написании и редактуре обзорных статей)

• На основе литературных данных было установлено, что ДНКзимы обладают наибольшей специфичностью распознавания целевых РНК мишеней в

биологических системах, см. работу [35] (личный вклад автора состоял в анализе литературных источников, руководстве написания литературного обзора, написании и редактуре обзорной статьи)

Положения, выносимые на защиту:

1. Используя подходы ДНК-технологий возможно включить РНК-расщепляющие ДНКзимы в многокомпонентную конструкцию для терапии заболеваний, которая способна: (1) высоко селективно распознавать маркерную последовательность; (2) высоко селективно распознавать целевую РНК; (3) связывать целевую РНК с повышенным сродством; (4) расщеплять целевую РНК только в присутствии нуклеотидной последовательности активатора.

2. ДНКзимы традиционного дизайна могут эффективно и селективно расщеплять РНК-субстраты со стабильными вторичными структурами в условиях многократного каталитического оборота, при условии, что они обладают высоким сродством к РНК мишени и продукты расщепления РНК формируют стабильную структуру.

3. Многофункциональные ДНК-конструкции на основе ДНКзимов способны решить дилемму сродства/селективности за счет использования дополнительных РНК-связывающих доменов, которые увеличивают сродство ДНКзимного ядра к целевой РНК без потери селективности.

4. Многофункциональные ДНК-конструкции на основе ДНКзимов способны более эффективно расщеплять структурированные РНК-мишени в условиях многократного оборота по сравнению с оптимальным ДНКзимом традиционного дизайна за счет как ускорения связывания целевой РНК, так и ускорения высвобождения продуктов реакции, решая проблему связывания/высвобождения.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные подходы к терапии опухолевых заболеваний

Рак является второй причиной смертности в мире [1]. Традиционные методы лечения онкологических заболеваний включают хирургическое вмешательство, лучевую, гормональную, химиотерапию или их комбинации. Однако эффективность удаления опухоли хирургическим путем часто ограничена инвазией опухоли в соседние ткани и метастазированием в отдаленные органы [25]. Химиотерапия и лучевая терапия часто оказывают негативное влияние на нормальные клетки, что приводит к нежелательным побочным эффектам [2,5,6]. Повышение эффективности лечения и улучшение ранней диагностики онкологических заболеваний могут спасти сотни тысяч человеческих жизней.

Предпринимаются постоянные попытки решить проблему низкой селективности традиционных методов противоопухолевого лечения. Молекулярно-направленная химиотерапия опухолей при помощи малых молекул и моноклональных антител направлена на устранение побочных эффектов традиционной терапии путем избирательного подавления молекул, участвующих в развитии онкологии [7-18]. Однако и этот подход не лишен определенных побочных эффектов, такие как гепатотоксичность, желудочно-кишечные кровотечения, нарушение целостности сосудов [12, 19]. В целом, нецелевое токсичное воздействие и трудности с доступом ко всем опухолевым клеткам значительно снижают эффективность противоопухолевых агентов [17].

В настоящее время, когда у ученых появилась возможность управлять клетками на уровне генома, одним из наиболее перспективных подходов является подавление (нокдаун) генов, ответственных за развитие опухолевых клеток или за устойчивость к химиотерапии на уровне посттранскрипционных процессов. Для этой цели применяют олигонуклеотидные агенты - синтетические молекулы ДНК и РНК или их химические аналоги, способные подавлять экспрессию целевого гена посредством инактивации мРНК. Это приводит к ее последующей

деградации и выключению синтеза целевого белка. К таким олигонуклеотидным генно-терапевтическим агентам относятся антисмысловые олигонуклеотиды (АСО), малые интерферирующие РНК (миРНК), микроРНК, рибозимы и ДНКзимы, а также технология CRISPR/Cas [20-26]. На сегодняшний день существует ряд одобренных генно-терапевтических препаратов для лечения неопухолевых заболеваний, среди которых десять относятся к АСО: Fomiversen, FDA 1998, Mipomersen FDA 2013, Eteplirsen FDA 2016, Nusinersen FDA 2016, Inotersen FDA 2018, Milasen FDA 2018, Golodirsen FDA 2019, Volanesorsen FDA 2020, Viltolarsen FDA 2020, Casimersen FDA 2021; а также четыре миРНК -Patisiran FDA 2108, Givosiran FDA 2019, Lumasiran FDA 2020, Inclisiran FDA 2021 [27-30]. В клинических испытаниях для лечения онкологии протестировано более двадцати генно-терапевтических агентов [31], однако, несмотря на огромные усилия и значительный прогресс в исследованиях, на рынке пока отсутствуют олигонуклеотидные препараты для лечения опухолей [32,33].

Основной проблемой генно-терапевтического подхода остаётся внутриклеточная доставка олигонуклеотидов. В настоящее время многие исследователи работают над решением этой проблемы с помощью наночастиц на основе липидов и полимеров [34]. Кроме того, двумя другими серьезными ограничениями предлагаемых олигонуклеотидных подходов являются: (1) низкая специфичность, приводящая к побочным эффектам, и (2) недостаточная эффективность, не позволяющая уничтожить 100% опухолевых клеток [35]. Проблемы низкой специфичности также характерны для технологии CRISPR/cas9, которая в настоящее время рассматривается, как потенциальный метод лечения опухолевых заболеваний. Растущий объем данных подтверждает низкую специфичность данной технологии in vivo [35-38].

1.2. Специфичность олигонуклеотидных агентов

Специфичностью называют способность агента связывать только целевую последовательность РНК в сложной смеси биологических молекул, например, обнаруженных в организме человека, без взаимодействия с другими

биомолекулами, включая нецелевые РНК [35]. Низкая специфичность олигонуклеотидных агентов обусловлена их взаимодействием с нецелевыми биомолекулами, такими как РНК и белки. Это приводит к множеству нецелевых эффектов, которые можно разделить на две основные категории: независимые от гибридизации и зависимые от гибридизации [39].

Независимые от гибридизации эффекты связаны с неспецифическим взаимодействием олигонуклеотидов с внеклеточными и внутриклеточными белками подобно непреднамеренной токсичности малых молекул. Этот тип нецелевых эффектов не связан с комплементарным связыванием нецелевых РНК, а скорее вызван химическими свойствами агентов. Например, химическая модификация цепей ДНК первого поколения - фосфоротиоатные олигонуклеотиды, проявляют тенденцию к независимым от гибридизации нецелевым эффектам за счет неспецифического связывания с белками, вызывая пространственную цитотоксичность при высоких концентрациях фосфоротиоатных АСО [40].

Другим типом независимых от гибридизации эффектов является неспецифическая активация иммунного ответа. Установлено, что АСО активируют провоспалительные реакции за счет как химических модификаций, так и присутствия в их последовательностях CpG-мотивов, распознаваемых иммунной системой как компоненты бактериальных патогенов через толл-подобный рецептор-9 (TLR-9) [41]. Было обнаружено, что ДНКзимы, которые также, как и АСО являются ДНК молекулами, активируют иммунный ответ через TLR-9 [42].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Недорезова Дарья Дмитриевна, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Cancer // Word Health Organization [Электронный ресурс] - URL: http: //www.who. int/cancer/en/.

2. Enger E. et al. Concepts in Biology' 2007 Ed. - Rex Bookstore, Inc., 2003 - C. 173.

3. Goto O. et al. Hybrid surgery for early gastric cancer //Translational Gastroenterology and Hepatology. - 2016. - Т. 1.

4. Hundahl S. A., Phillips J. L., Menck H. R. The National Cancer Data Base Report on poor survival of US gastric carcinoma patients treated with gastrectomy: American Joint Committee on Cancer staging, proximal disease, and the "different disease" hypothesis //Cancer. - 2000. - Т. 88. - №. 4. - С. 921-932.

5. Kim S. W. et al. Long-term outcome of radiofrequency ablation for intraoral microcystic lymphatic malformation //Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. - 2011. - Т. 137. - №. 12. - С. 1247-1250.

6. Anderson B., Sawyer D. B. Predicting and preventing the cardiotoxicity of cancer therapy //Expert Review of Cardiovascular Therapy. - 2008. - Т. 6. - №. 7. - С. 10231033.

7. Pérez-Herrero E., Fernández-Medarde A. Advanced targeted therapies in cancer: drug nanocarriers, the future of chemotherapy //European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics. - 2015. - Т. 93. - С. 52-79.

8. Drebin J. A. et al. Inhibition of tumor growth by a monoclonal antibody reactive with an oncogene-encoded tumor antigen //Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1986. - Т. 83. - №. 23. - С. 9129-9133.

9. Zhukov N. V., Tjulandin S. A. Targeted therapy in the treatment of solid tumors: practice contradicts theory //Biochemistry (Moscow). - 2008. - Т. 73. - №. 5. - С. 605.

10. Zhang J., Yang P. L., Gray N. S. Targeting cancer with small molecule kinase inhibitors //Nature Rev. Can. - 2009. - Т. 9. - №. 1. - С. 28-39.

11. Deininger M., Buchdunger E., Druker B. J. The development of imatinib as a therapeutic agent for chronic myeloid leukemia //Blood. - 2005. - Т. 105. - №. 7. - С. 2640-2653.

12. Mughal T. I., Schrieber A. Principal long-term adverse effects of imatinib in patients with chronic myeloid leukemia in chronic phase //Biologies: targets & therapy. - 2010. - T. 4. - C. 315.

13. Schellmann N. et al. Targeted enzyme prodrug therapies //Mini reviews in medicinal chemistry. - 2010. - T. 10. - №. 10. - C. 887-904.

14. Clynes R. A. et al. Inhibitory Fc receptors modulate in vivo cytoxicity against tumor targets //Nature medicine. - 2000. - T. 6. - №. 4. - C. 443-446.

15. Manjappa A. S. et al. Antibody derivatization and conjugation strategies: application in preparation of stealth immunoliposome to target chemotherapeutics to tumor //Journal of Controlled Release. - 2011. - T. 150. - №. 1. - C. 2-22.

16. Zhao X., Subramanian S. Intrinsic resistance of solid tumors to immune checkpoint blockade therapy //Cancer research. - 2017. - T. 77. - №. 4. - C. 817-822.

17. Karjoo Z., Chen X., Hatefi A. Progress and problems with the use of suicide genes for targeted cancer therapy //Advanced drug delivery reviews. - 2016. - T. 99. - C. 113-128.

18. " Los M., Roodhart J. M. L., Voest E. E. Target practice: lessons from phase III trials with bevacizumab and vatalanib in the treatment of advanced colorectal cancer //The oncologist. - 2007. - T. 12. - №. 4. - C. 443-450.

19. Brandes A. A. et al. Practical management of bevacizumab-related toxicities in glioblastoma //The oncologist. - 2015. - T. 20. - №. 2. - C. 166.

20. Keles E. et al. Recent progress in nanomaterials for gene delivery applications //Biomaterials science. - 2016. - T. 4. - №. 9. - C. 1291-1309.

21. Adiseshaiah P. P. et al. Nanomedicine strategies to overcome the pathophysiological barriers of pancreatic cancer //Nature reviews Clinical oncology. - 2016. - T. 13. - №. 12. - C. 750.

22. Liposomal doxorubicin (Caelyx, Myocet)". Macmillan Cancer Support. 2009. Retrieved 2009-11-27.

23. Petschauer J. S. et al. The effects of nanoparticle drug loading on the pharmacokinetics of anticancer agents //Nanomedicine. - 2015. - T. 10. - №. 3. - C. 447-463.

24. Gabizon A. A., Patil Y., La-Beck N. M. New insights and evolving role of pegylated liposomal doxorubicin in cancer therapy //Drug Resistance Updates. - 2016. - T. 29. -C. 90-106.

25. Khokha R., Denhardt D. T. On the use of anti-sense RNA: down-regulation of mRNA encoding a metalloproteinase inhibitor //Anticancer research. - 1987. - T. 7. -№. 4A. - C. 653.

26. Moreno P., Pego A. P. Therapeutic antisense oligonucleotides against cancer: hurdling to the clinic //Frontiers in chemistry. - 2014. - T. 2. - C. 87.

27. Stein C. A., Castanotto D. FDA-approved oligonucleotide therapies in 2017 //Molecular Therapy. - 2017. - T. 25. - №. 5. - C. 1069-1075.

28. Hoy S. M. Patisiran: first global approval //Drugs. - 2018. - T. 78. - №. 15. - C. 1625-1631.

29. Dhuri K. et al. Antisense oligonucleotides: an emerging area in drug discovery and development //Journal of clinical medicine. - 2020. - T. 9. - №. 6. - C. 2004.

30. Hu B. et al. Therapeutic siRNA: state of the art //Signal transduction and targeted therapy. - 2020. - T. 5. - №. 1. - C. 1-25.

31. Palomino-Vizcaino G., Alvarez-Salas L. M. Therapeutic Oligonucleotides Against Cancer: Recent Approaches and New Perspectives //Nucleic Acid Nanotheranostics. -2019. - C. 1-26.

32. Ma C. C. et al. The approved gene therapy drugs worldwide: from 1998 to 2019 //Biotechnology Advances. - 2020. - T. 40. - C. 107502.

33. Xiong H., Veedu R. N., Diermeier S. D. Recent advances in oligonucleotide therapeutics in oncology //International journal of molecular sciences. - 2021. - T. 22. -№. 7. - C. 3295.

34. Xiao Y. et al. Engineering nanoparticles for targeted delivery of nucleic acid therapeutics in tumor //Molecular Therapy-Methods & Clinical Development. - 2019. -T. 12. - C. 1-18.

35. Nedorezova D.D., Dubovichenko M.V., Krasnoshchekova E.P., Grigorieva E.D., Peresadina A.V., Kolpashchikov D.M. Specificity of oligonucleotide gene therapy (OGT) agents // Theranostics - 2022. - T. 12. - №. 16. - C. 7132.

36. Zhang X. H. et al. Off-target effects in CRISPR/Cas9-mediated genome engineering //Molecular Therapy-Nucleic Acids. - 2015. - T. 4. - C. e264.

37. Klein M. et al. Hybridization kinetics explains CRISPR-Cas off-targeting rules //Cell reports. - 2018. - T. 22. - №. 6. - C. 1413-1423.

38. Vakulskas C. A., Behlke M. A. Evaluation and reduction of CRISPR off-target cleavage events //Nucleic acid therapeutics. - 2019. - T. 29. - №. 4. - C. 167-174.

39. Lindow M. et al. Assessing unintended hybridization-induced biological effects of oligonucleotides //Nature biotechnology. - 2012. - T. 30. - №. 10. - C. 920-923.

40. Levin A. A. A review of issues in the pharmacokinetics and toxicology of phosphorothioate antisense oligonucleotides // Biochimica et Biophysica Acta-Gene Structure and Expression. - 2000. - T. 1489. - №. 1. - C. 69-84.

41. Marques J. T., Williams B. R. G. Activation of the mammalian immune system by siRNAs //Nature biotechnology. - 2005. - T. 23. - №. 11. - C. 1399-1405.

42. Frazier K. S. Antisense oligonucleotide therapies: the promise and the challenges from a toxicologic pathologist's perspective //Toxicologic pathology. - 2015. - T. 43. -№. 1. - C. 78-89.

43. Krieg A. M. Therapeutic potential of Toll-like receptor 9 activation //Nature reviews Drug discovery. - 2006. - T. 5. - №. 6. - C. 471-484.

44. Meng Z., Lu M. RNA interference-induced innate immunity, off-target effect, or immune adjuvant? //Frontiers in immunology. - 2017. - T. 8. - C. 331.

45. Saitoh S. I., Miyake K. Nucleic Acid Innate Immune Receptors //Advances in Nucleic Acid Therapeutics; Agrawal, SG, Michael, J., Eds. - 2019. - C. 292-305.

46. Burnett J. C., Rossi J. J. RNA-based therapeutics: current progress and future prospects //Chemistry & biology. - 2012. - T. 19. - №. 1. - C. 60-71.

47. Kleinman M. E. et al. Sequence-and target-independent angiogenesis suppression by siRNA via TLR3 //Nature. - 2008. - T. 452. - №. 7187. - C. 591-597.

48. Robbins M. et al. Misinterpreting the therapeutic effects of small interfering RNA caused by immune stimulation //Human gene therapy. - 2008. - T. 19. - №. 10. - C. 991-999.

49. Jang D. et al. Dual effects of a CpG-DNAzyme targeting mutant EGFR transcripts in lung cancer cells: TLR9 activation and EGFR downregulation //BMB reports. -2018. - T. 51. - №. 1. - C. 27.

50. Crooke S. T. et al. Integrated assessment of the clinical performance of GalNAc3-conjugated 2'-O-methoxyethyl chimeric antisense oligonucleotides: I. human volunteer experience //nucleic acid therapeutics. - 2019. - T. 29. - №. 1. - C. 16-32.

51. Zakrevsky P. et al. A suite of therapeutically-inspired nucleic acid logic systems for conditional generation of single-stranded and double-stranded oligonucleotides //Nanomaterials. - 2019. - T. 9. - №. 4. - C. 615.

52. Nedorezova D. D., Fakhardo A.F., Molden T.A., Kolpashchikov D.M. Deoxyribozyme-Based DNA Machines for Cancer Therapy //ChemBioChem. - 2020. -T. 21. - №. 5. - C. 607-611.

53. Kundert K. et al. Controlling CRISPR-Cas9 with ligand-activated and ligand-deactivated sgRNAs //Nature communications. - 2019. - T. 10. - №. 1. - C. 1-11.

54. Demidov V. V., Frank-Kamenetskii M. D. Two sides of the coin: affinity and specificity of nucleic acid interactions //Trends in biochemical sciences. - 2004. - T. 29.

- №. 2. - C. 62-71.

55. Kamola P. J. et al. In silico and in vitro evaluation of exonic and intronic off-target effects form a critical element of therapeutic ASO gapmer optimization //Nucleic acids research. - 2015. - T. 43. - №. 18. - C. 8638-8650.

56. Burel S. A. et al. Hepatotoxicity of high affinity gapmer antisense oligonucleotides is mediated by RNase H1 dependent promiscuous reduction of very long pre-mRNA transcripts //Nucleic acids research. - 2016. - T. 44. - №. 5. - C. 2093-2109.

57. Kasuya T. et al. Ribonuclease H1-dependent hepatotoxicity caused by locked nucleic acid-modified gapmer antisense oligonucleotides //Scientific reports. - 2016. -T. 6. - №. 1. - C. 1-12.

58. Hagedorn P. H. et al. Identifying and avoiding off-target effects of RNase H-dependent antisense oligonucleotides in mice //Nucleic acids research. - 2018. - T. 46.

- №. 11. - C. 5366-5380.

59. Gentsch G. E. et al. Innate immune response and off-target mis-splicing are common morpholino-induced side effects in Xenopus //Developmental cell. - 2018. -T. 44. - №. 5. - C. 597-610. e10.

60. Kruger K. et al. Self-splicing RNA: autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena //Cell. - 1982. - T. 31. - №. 1. -C. 147-157.

61. Breaker R. R., Joyce G. F. A DNA enzyme that cleaves RNA //Chemistry & biology. - 1994. - T. 1. - №. 4. - C. 223-229.

62. Breaker R. R. et al. A common speed limit for RNA-cleaving ribozymes and deoxyribozymes //Rna. - 2003. - T. 9. - №. 8. - C. 949-957.

63. Cairns M. J., King A., Sun L. Q. Optimisation of the 10-23 DNAzyme-substrate pairing interactions enhanced RNA cleavage activity at purine-cytosine target sites //Nucleic acids research. - 2003. - T. 31. - №. 11. - C. 2883-2889.

64. Khachigian L. M. Deoxyribozymes as catalytic nanotherapeutic agents //Cancer research. - 2019. - T. 79. - №. 5. - C. 879-888.

65. Kim S. H., Dass C. R. Induction of caspase-2 activation by a DNA enzyme evokes tumor cell apoptosis //DNA and cell biology. - 2012. - T. 31. - №. 1. - C. 1-7.

66. Dass C. R. et al. Dz13 induces a cytotoxic stress response with upregulation of E2F1 in tumor cells metastasizing to or from bone //Oligonucleotides. - 2010. - T. 20. - №. 2. - C. 79-91.

67. Hertel K. J., Herschlag D., Uhlenbeck O. C. Specificity of hammerhead ribozyme cleavage //The EMBO Journal. - 1996. - T. 15. - №. 14. - C. 3751-3757.

68. Choi W. H. et al. Design and kinetic analysis of hammerhead ribozyme and DNAzyme that specifically cleave TEL-AML1 chimeric mRNA //Biochemical and biophysical research communications. - 2008. - T. 374. - №. 1. - C. 169-174.

69. SANDBERG J. A. et al. Acute Toxicology and Pharmacokinetic Assessment of a Ribozyme (ANGIOZYME™) Targeting Vascular Endothelial Growth Factor Receptor mRNA in the Cynomolgus Monkey //Antisense and Nucleic Acid Drug Development. -2000. - T. 10. - №. 3. - C. 153-162.

70. Usman N. et al. Nuclease-resistant synthetic ribozymes: developing a new class of therapeutics //The Journal of clinical investigation. - 2000. - T. 106. - №. 10. - C. 1197-1202.

71. Sandberg J. A. et al. Pharmacokinetics and tolerability of an antiangiogenic ribozyme (ANGIOZYME™) in healthy volunteers //The Journal of Clinical Pharmacology. - 2000. - T. 40. - №. 12. - C. 1462-1469.

72. Weng D. E. et al. A phase I/II study of repetitive dose Angiozyme (TM), a ribozyme targeting the Flt-1 receptor for VEGF //CLINICAL CANCER RESEARCH. - PO BOX 11806, BIRMINGHAM, AL 35202 USA: AMER ASSOC CANCER RESEARCH, 2000. - T. 6. - C. 4519S-4519S.

73. Suzuki T. et al. Adenovirus-mediated ribozyme targeting of HER-2/neu inhibits in vivo growth of breast cancer cells //Gene Therapy. - 2000. - T. 7. - №. 3. - C. 241-248.

74. Weng D. E. et al. A phase I clinical trial of a ribozyme-based angiogenesis inhibitor targeting vascular endothelial growth factor receptor-1 for patients with refractory solid tumors //Molecular cancer therapeutics. - 2005. - T. 4. - №. 6. - C. 948-955.

75. Abdelgany A. et al. Selective DNAzyme-mediated cleavage of AChR mutant transcripts by targeting the mutation site or through mismatches in the binding arm //Journal of RNAi and gene silencing: an international journal of RNA and gene targeting research. - 2005. - T. 1. - №. 1. - C. 32.

76. Wang T. H. et al. The use of 10-23 DNAzyme to selectively destroy the allele of mRNA with a unique purine-pyrimidine dinucleotide //Oligonucleotides. - 2008. - T. 18. - №. 3. - C. 295-300.

77. Warashina M. et al. Extremely high and specific activity of DNA enzymes in cells with a Philadelphia chromosome //Chemistry & biology. - 1999. - T. 6. - №. 4. - C. 237-250.

78. Fahmy R. G. et al. Transcription factor Egr-1 supports FGF-dependent angiogenesis during neovascularization and tumor growth //Nature medicine. - 2003. - T. 9. - №. 8. - C. 1026-1032.

79. Zhang G. et al. Effect of deoxyribozymes targeting c-Jun on solid tumor growth and angiogenesis in rodents //Journal of the National Cancer Institute. - 2004. - T. 96. - №. 9. - C. 683-696.

80. Cho E. A. et al. Safety and tolerability of an intratumorally injected DNAzyme, Dz13, in patients with nodular basal-cell carcinoma: a phase 1 first-in-human trial (DISCOVER) //The Lancet. - 2013. - T. 381. - №. 9880. - C. 1835-1843.

81. Cao Y. et al. Therapeutic evaluation of Epstein-Barr virus-encoded latent membrane protein-1 targeted DNAzyme for treating of nasopharyngeal carcinomas //Molecular Therapy. - 2014. - T. 22. - №. 2. - C. 371-377.

82. Sullivan S. M. Development of ribozymes for gene therapy //Journal of investigative dermatology. - 1994. - T. 103. - №. 5. - C. 85S.

83. Gabryelska M. M. et al. Prediction of hammerhead ribozyme intracellular activity with the catalytic core fingerprint //Biochemical Journal. - 2013. - T. 451. - №. 3. - C. 439-451.

84. Kharma N. et al. Automated design of hammerhead ribozymes and validation by targeting the PABPN1 gene transcript //Nucleic acids research. - 2016. - T. 44. - №. 4. - C. e39.

85. Santoro S. W., Joyce G. F. Mechanism and utility of an RNA-cleaving DNA enzyme //Biochemistry. - 1998. - T. 37. - №. 38. - C. 13330-13342.

86. Ahmadi N. S., Esmaeili A., Javadi Zarnaghi F. Bioinformatics Designing of 10-23 Deoxyribozyme against Coding Region of Beta-galactosidase Gene //Research in Molecular Medicine. - 2017. - T. 5. - №. 2. - C. 28-33.

87. Mohammadi-Arani R. et al. DNAzymeBuilder, a web application for in situ generation of RNA/DNA-cleaving deoxyribozymes //Nucleic Acids Research. - 2022. -T. 50. - №. W1. - C. W261-5.

88. Burke D. H., Ozerova N. D. S., Nilsen-Hamilton M. Allosteric hammerhead ribozyme TRAPs //Biochemistry. - 2002. - T. 41. - №. 21. - C. 6588-6594.

89. Iyo M, Kawasaki H, Taira K. Maxizyme technology. // Sioud M. (ed.). Ribozymes and siRNA protocols. - Springer Science & Business Media, 2004. - C. 257-265.

90. Tyagi S., Kramer F. R. Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization //Nature biotechnology. - 1996. - Т. 14. - №. 3. - С. 303-308.

91. Kolpashchikov D. M. A binary DNA probe for highly specific nucleic acid recognition //Journal of the American Chemical Society. - 2006. - Т. 128. - №. 32. - С. 10625-10628.

92. Gerasimova Y. V., Kolpashchikov D. M. Detection of bacterial 16S rRNA using a molecular beacon-based X sensor //Biosensors and Bioelectronics. - 2013. - Т. 41. - С. 386-390.

93. Kolpashchikov D. M. A binary deoxyribozyme for nucleic acid analysis //ChemBioChem. - 2007. - Т. 8. - №. 17. - С. 2039-2042.

94. Kolpashchikov D. M. Binary probes for nucleic acid analysis //Chemical reviews. -2010. - Т. 110. - №. 8. - С. 4709-4723.

95. Kolpashchikov D. M. Evolution of hybridization probes to DNA machines and robots //Accounts of Chemical Research. - 2019. - Т. 52. - №. 7. - С. 1949-1956.

96. Недорезова Д.Д., Рубель М.С., Рубель А.А. Многокомпонентные ДНКзимные наномашины: структура, применение и перспективы// Успехи биологической химии. - 2024. - Т. 64. - С. 479-502.

97. Nedorezova D. D., Rubel M. S., Rubel A. A. Multicomponent DNAzyme Nanomachines: Structure, Applications, and Prospects //Biochemistry (Moscow). -2024. - Т. 89. - №. Suppl 1. - С. S249-S261.

98. Cox A. J. et al. DNA nanotechnology for nucleic acid analysis: multifunctional molecular DNA machine for RNA detection //Chemical Communications. - 2016. - Т. 52. - №. 99. - С. 14318-14321.

99. Douglas S. M., Bachelet I., Church G. M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads //Science. - 2012. - Т. 335. - №. 6070. - С. 831-834.

100. Li S. et al. A DNA nanorobot functions as a cancer therapeutic in response to a molecular trigger in vivo //Nature biotechnology. - 2018. - Т. 36. - №. 3. - С. 258-264.

101. Fokina A. A. et al. Delivery of therapeutic RNA-cleaving oligodeoxyribonucleotides (deoxyribozymes): from cell culture studies to clinical trials //Expert opinion on drug delivery. - 2017. - Т. 14. - №. 9. - С. 1077-1089.

102. Romani AMP. Intracellular magnesium homeostasis. In: Vink R, Nechifor M, editors. Magnesium in the Central Nervous System. Adelaide (AU): University of Adelaide Press; 2011. [Электронный ресурс] - URL: https: //www.ncbi .nlm. nih. gov/books/NBK507258/

103. Cairns M. J. et al. The influence of arm length asymmetry and base substitution on the activity of the 10-23 DNA enzyme //Antisense and Nucleic Acid Drug Development. - 2000. - Т. 10. - №. 5. - С. 323-332.

104. Horn S., Schwenzer B. Oligonucleotide facilitators enhance the catalytic activity of RNA-cleaving DNA enzymes //Antisense and Nucleic Acid Drug Development. -1999. - Т. 9. - №. 5. - С. 465-472.

105. Santiago F. S. et al. New DNA enzyme targeting Egr-1 mRNA inhibits vascular smooth muscle proliferation and regrowth after injury //Nature medicine. - 1999. - Т. 5. - №. 11. - С. 1264-1269.

106. Sun L. Q. et al. Suppression of smooth muscle cell proliferation by a c-myc RNA-cleaving deoxyribozyme //Journal of Biological Chemistry. - 1999. - Т. 274. - №. 24. -С. 17236-17241.

107. Khachigian L. M. et al. c-Jun regulates vascular smooth muscle cell growth and neointima formation after arterial injury: inhibition by a novel DNA enzyme targeting c-Jun //Journal of Biological Chemistry. - 2002. - Т. 277. - №. 25. - С. 22985-22991.

108. Xiang G. et al. Down-regulation of plasminogen activator inhibitor 1 expression promotes myocardial neovascularization by bone marrow progenitors //The Journal of experimental medicine. - 2004. - Т. 200. - №. 12. - С. 1657-1666.

109. Hou W. et al. Inhibition of hepatitis B virus X gene expression by 10-23 DNAzymes //Antiviral research. - 2006. - Т. 72. - №. 3. - С. 190-196.

110. Sel S. et al. Effective prevention and therapy of experimental allergic asthma using a GATA-3-specific DNAzyme //Journal of Allergy and Clinical Immunology. - 2008. -Т. 121. - №. 4. - С. 910-916.

111. Lu Z. X. et al. Effect of EBV LMP1 targeted DNAzymes on cell proliferation and apoptosis //Cancer gene therapy. - 2005. - Т. 12. - №. 7. - С. 647-654.

112. Petrocca F., Lieberman J. Promise and challenge of RNA interference-based therapy for cancer //Journal of Clinical Oncology. - 2010. - Т. 29. - №. 6. - С. 747754.

113. Donini S. et al. The advantages of being locked: Assessing the cleavage of short and long RNAs by locked nucleic acid-containing 8-17 deoxyribozymes //Journal of Biological Chemistry. - 2007. - Т. 282. - №. 49. - С. 35510-35518.

114. Vester B. et al. Locked nucleoside analogues expand the potential of DNAzymes to cleave structured RNA targets //BMC molecular biology. - 2006. - Т. 7. - №. 1. - С. 1-9.

115. RNA Folding Form Application. The mfold Web Server // The RNA Institute. College of Art & Science. University at Albany. [Электронный ресурс] - URL: http://www.unafold.org/mfold/applications/rna-folding-form.php.

116. Hybridization of two Different Strands of DNA or RNA. The mfold Web Server // The RNA Institute. College of Art & Science. University at Albany. [Электронный ресурс] - URL: http://www.unafold.org/Dinamelt/applications/hybridization-of-two-different-strands-of-dna-or-rna.php.

117. Смирнов Д.Д., Недорезова Д.Д., Немирич Д.В., Колпащиков Д.М. Альтернативные подходы к терапии и детекции онкологических заболеваний//Сборник тезисов VI Молодежной конференции по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН. - 2018. - С. 99 - 100.

118. Недорезова Д.Д., Немирич Д.В., Фахардо А.Ф., Сапарова В.Б. Разработка и оптимизация ДНК-наномашины на основе дезоксирибозимов для уничтожения раковых клеток // Сборник тезисов докладов конгресса молодых ученых. Электронное издание. - СПб: Университет ИТМО. - 2018.

119. Nedorezova D.D., Kolpashchikov D.M. DNA Nanomachine: New Approach for Cancer Treatment, Abstract book of 11th Annual Nanoscience an Engineering Research Conference NanoFlorida 2018. - 2018.

120. Nedorezova D.D., Kolpashchikov D.M. Development and optimization DNA platform for suppressing cancer cells // SYSTEMS BIOLOGY AND BIOMEDICINE

(SBIOMED-2018) Symposium. Abstracts. The Eleventh International Conference (Novosibirsk, 21-22 августа 2018 г.) - 2018, pp. 102.

121. Kolpashchikov D., Nedorezova D., Spelkov A., Roldan C., Amanda C. Development of deoxyribozyme DNA nanomachines for diagnostics and therapy // Abstracts of Papers of the American Chemical Society - 2019, Vol. 257, pp. 161.

122. Nedorezova D.D., Fakhardo A.F., Nemirich D.V., Bryushkova E.A., Kolpashchikov D.M. Towards DNA Nanomachines for Cancer Treatment: Achieving Selective and Efficient Cleavage of Folded RNA // Angewandte Chemie - International Edition - 2019, Vol. 58, No. 14, pp. 4654-4658.

123. Brewster J. L. et al. Deletion of Dadl in mice induces an apoptosis-associated embryonic death //genesis. - 2000. - V. 26. - №. 4. - P. 271-278.

124. Cheng J. M. et al. Preferential amplification of the paternal allele of the n-myc gene in human neuroblastomas //Nature genetics. - 1993. - Т. 4. - №. 2. - С. 191-194.

125. Whitfield J. R., Beaulieu M. E., Soucek L. Strategies to inhibit Myc and their clinical applicability //Frontiers in cell and developmental biology. - 2017. - Т. 5. - №. 10. - С. 1-13.

126. Wong K. E. et al. Evaluation of Rhodiola crenulata on growth and metabolism of NB-1691, an MYCN-amplified neuroblastoma cell line //Tumor Biology. - 2018. - Т. 40. - №. 6. - С. 1-15.

127. Kaniga K., Delor I., Cornelis G. R. A wide-host-range suicide vector for improving reverse genetics in gram-negative bacteria: inactivation of the blaA gene of Yersinia enterocolitica // Gene. - 1991. - V. 109. - No. 1. - P. 137-141.

128. Zimmer M. Green fluorescent protein (GFP): applications, structure, and related photophysical behavior //Chemical reviews. - 2002. - Т. 102. - №. 3. - С. 759-782.

129. Дубовиченко М.В., Недорезова Д.Д., Колпащиков Д.М. Оптимизация дезоксирибозимов для расщепления гена домашнего хозяйства DAD1 // Международный конгресс «VII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвященный 100-летию кафедры генетики СПбГУ, и ассоциированные симпозиумы». Сборник тезисов. - 2019. - С. 977-978.

130. Кальнин А.Ю., Недорезова Д.Д., Колпащиков Д.М. Оптимизация ДНК машин для расщепления РНК раковых клеток // Сборник тезисов докладов конгресса молодых ученых. Электронное издание. - СПб: Университет ИТМО. -2019.

131. Nedorezova D.D., Dubovichenko M.V., Kalnin A.J., Nour M.A., Eldeeb A.A., Ashmarova A.I., Kurbanov G.F., Kolpashchikov D.M. Cleaving Folded RNA with DNAzyme Agents //ChemBioChem. - 2024. - Т. 25. - №. 1. - С. e202300637.

132. Nedorezova D.D., Dubovichenko M.V., Eldeeb A. A., Nur M.A., Bobkov G.A., Ashmarova A.I., Kalnin A.J., Kolpashchikov, D.M. Cleaving Folded RNA by Multifunctional DNAzyme Nanomachines //Chemistry-A European Journal. - 2024. -С. e202401580.

133. Недорезова Д.Д., Дубовиченко М.В., Андриянова А.И., Бобков Г.А., Курбанов Г.Ф., Андриянов В.С., Колпащиков Д.М. РНК-расщепляющие ДНК-машины для эффективного подавления экспрессии бактериальных генов // Геномика и биотехнология микроорганизмов. Всероссийская научная молодежная конференция. Тезисы докладов - 2022. - С. 35.

134. Drozd V.S., El-Deeb A.A., Kolpashchikov D.M., Nedorezova D.D. Binary Antisense Oligonucleotide Agent for Cancer Marker-Dependent Degradation of Targeted RNA // Nucleic Acid Therapeutics. - 2022. - Т. 32. - №. 5. - С. 412-420.

135. Agarwal S. et al. MYCN acts as a direct co-regulator of p53 in MYCN amplified neuroblastoma //Oncotarget. - 2018. - V. 9. - №. 29. - P. 20323-20328.

136. Wang J. et al. The protective autophagy activated by GANT-61 in MYCN amplified neuroblastoma cells is mediated by PERK //Oncotarget. - 2018. - V. 9. - №. 18. - P. 14413-14427.

137. Wagatsuma A. et al. Determination of the exact copy numbers of particular mRNAs in a single cell by quantitative real-time RT-PCR //Journal of experimental biology. - 2005. - V. 208. - №. 12. - P. 2389-2398.

138. Carpentieri A. et al. Differentiation of human neuroblastoma cells toward the osteogenic lineage by mTOR inhibitor //Cell death & disease. - 2015. - Т. 6. - №. e1974. - С. 1-9.

139. Gomes de Oliveira A. G. et al. RNA-Cleaving DNA Thresholder Controlled by Concentrations of miRNA Cancer Marker //ChemBioChem. - 2021. - Т. 22. - №. 10. -С. 1750-1754.

140. Spelkov A. A. et al. Bifunctional RNA-Targeting Deoxyribozyme Nanodevice as a Potential Theranostic Agent //Chemistry-A European Journal. - 2020. - Т. 26. - №. 16.

- С. 3489-3493.

141. Molden T. A., Niccum C. T., Kolpashchikov D. M. Cut and Paste for Cancer Treatment: A DNA nanodevice that cuts out an RNA marker sequence to activate a therapeutic function //Angewandte Chemie. - 2020. - Т. 132. - №. 47. - С. 2137621380.

142. Patra C., ElDeeb A. A. Thresholding DNA Nanomachine as a Highly Cooperative and Efficient Enzyme-Like System for Controlled RNA Cleavage // ChemMedChem. -2023. - Т. 18. - №. 7. - С. e202300040.

143. He M. et al. mRNA-Activated Multifunctional DNAzyme Nanotweezer for Intracellular mRNA Sensing and Gene Therapy //ACS Applied Materials & Interfaces.

- 2021. - Т. 13. - №. 7. - С. 8015-8025.

144. Chalenko K.P., Nedorezova D.D., Koshel E.I., Kolpashchikov D.M. The First DNA-Machines Against Antibiotic Resistant Bacteria // Abstract book of 3rd International Conference "Smart Bio"- 2019, pp. 86.

145. Герцен А.В., Чаленко К.П., Недорезова Д.Д. Разработка стратегии борьбы с антибиотикорезистентными штаммами бактерий на основе использования днк — наномашин // Гены & Клетки - 2020. - Т. XV. - Вып. VII МОЛОДЁЖНАЯ ШКОЛА-КОНФЕРЕНЦИЯ по молекулярной и клеточной биологии Института цитологии РАН. - № 3. - С. 186.

146. Бобков Г.А., Дубовиченко М.В., Недорезова Д.Д., Колпащиков Д.М. Использование ДНК-машин для подавления генной экспрессии на уровне РНК // Сборник тезисов 25-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых с международным участием «БИОЛОГИЯ - НАУКА XXI ВЕКА». - 2022. - С. 23.

147. How much RNA does a typical mammalian cell contain? // QIAGEN [Электронный ресурс] - URL:

https://www.qiagen.com/us/resources/faq?id=06a192c2-e72d-42e8-9b40-3171e1 eb4cb8&lang=en.

148. Taylor A.I., Wan C.J.K, Donde M.J., Peak-Chew S.Y., Holliger P. A modular XNAzyme cleaves long, structured RNAs under physiological conditions and enables allele-specific gene silencing // Nature Chemistry. - 2022. - T. 14. - №. 11. - C. 12951305.

149. Wang Y., Nguyen K., Spitale R.C. and Chaput J.C. (2021) A biologically stable DNAzyme that efficiently silences gene expression in cells //Nature Chemistry. - 2021. - T. 13. - №. 4. - C. 319-326.

150. Nguyen K., Malik T. N., Chaput J. C. Chemical evolution of an autonomous DNAzyme with allele-specific gene silencing activity //Nature Communications. -2023. - T. 14. - №. 1. - C. 2413.

151. Bonnet G., Tyagi S., Libchaber A., Kramer F.R. Thermodynamic basis of the enhanced specificity of structured DNA probes // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1999. - T. 96. - №. 11. - C. 6171-6176.

152. Santoro S. W., Joyce G. F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme // Proceedings of the national academy of sciences. - 1997. - T. 94. - №. 9. - C. 42624266.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор благодарит научного консультанта к.х.н. Колпащикова Д. М. и научного руководителя к.б.н. Рубеля А. А. за наставничество, поддержку и советы по постановке экспериментов, интерпретации результатов и оформлении их в научные статьи и текст диссертации. Автор благодарит всех со-авторов статей за помощь в проведении работы и обсуждении результатов. В частности, автор благодарен Дубовиченко М. В. и Эльдиб А. А. за помощь в проведении экспериментальных работ по оптимизации ДНКзимных конструкций. Автор благодарит к.б.н. Фахардо А. Ф. и к.х.н. Новопашину Д. С. за их неоценимые советы в подготовке основного текста диссертации. Автор благодарит Рубель М. С. за ее бесценную помощь в организации защиты диссертации. Автор благодарит Бобкова Г. А. за проверку орфографии в тексте диссертации. Автор благодарит к.б.н. Будаеву В. В., Горбенко Д. С., Шкоденко Л. А., Гастева А. А. и Какко Л. А. Х. за их вдохновение и поддержку в ходе подготовки диссертации и поиске диссертационного совета.

Приложение

Таблица П1 - Олигонуклеотиды, использованные в исследовании

Название Последовательность 5' -> 3' Очистка

РНК-1 (STR) FAM" - 5' - UC G CAC CUG CU U CCC GCC GCG GU GAG CUC GCU G GAG AGC GUG ACC GC sd6

РНК-46 (РНК-2) (DAD1) FAM - 5' - GUA CUU GAG CUC C AC UCC GCA GC GU CU GAA GUU GC U GGA CGC GUA C SD

РНК-20 (DAD1) FAM - 5' - C UCC GCA GC GU CU GAA GUU G SD

РНК-3 (GFP) FAM - 5' - GCC ACC UAC GGC AAG C U GAC CCU GAA GU UC AUC UGC ACC ACC GGC AAG CUG CCC GUG CCC SD

N-MYC ДНК 5'- AAG TTC TGT GTT ТЛЛ ТТТ СТТ CAA AAT GTA Т PAGEB

биДНМ1_Т1 5'- GTG GAG CTC ТТТ T /iSp9c /г CAC ACG TGT TCT GTT CGT CTA ATC GGC GAG TCT TTT TGT CCA GCA SD

биДНМ 1_Т1 _бд3 5'- CAC ACG TGT TCT GTT CGT CTA ATC GGC GAG TCT TTT TGT CCA GCA SD

биДНМ 1_Т1 _бд3 5'- GTG GAG CTC TTT T /iSp9c / CAC ACG TGT TCT GTT CGT CTA ATC GGC GAG TC SD

биДНМ1 Т1 бд3,4 5'- CAC ACG TGT TCT GTT CGT CTA ATC GGC GAG TC SD

биДНМ1_Т2 5'- A TAC ATT TTG AAG AAA A CAA CGA GCT GCG G /iSp9/ GAACA GAACA CGTGTG SD

биДНМ1 Т3 5'- GAC TCG CCG ATT AGA C SD

биДНМ1 ДЗб 5'- CTT CAG AGG CTA GCTTTA AAC ACA GAA CTT SD

биДНМ1 ДЗб-мм1 5'- CTC CAG AGG CTA GCT TTA AAC ACA GAA CTT SD

биДНМ1 ДЗб-мм2 5'- CTT CAG AGG CTA GCT TTA AAC ТСА GAA CTT SD

ДНМ T3 5' - C AGT CGA CTC GCC GAT TAG ACG AAC A PAGE

T1 (0/0) 5' - GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG PAGE

РНК-1 ДЗ-9/9 5' - AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG PAGE

РНК-1 ДЗ-10/9 5' - C AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG PAGE

РНК-1 ДЗ-9/10 5' - AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG A PAGE

РНК-1 ДЗ.10/10 5' - C AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG A PAGE

РНК-1 ДЗ-10/11 5' - C AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG AA PAGE

РНК-1 ДЗ-11/10 5' - CC AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG A PAGE

РНК-1 ДЗ-11/11 5' - CC AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG AA PAGE

РНК-1 ДЗ-11/12 5' - CC AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG AAG PAGE

РНК-1 ДЗ-12/11 5' - TCC AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG AA PAGE

РНК-1 ДЗ-12тт/11 5' - TCC AGC T AG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG AA PAGE

РНК-1 ДЗ-12/11тт 5' - TCC AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC G T С GGG AA PAGE

РНК-1 ДЗ-12/12 5' - TCC AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG AAG PAGE

РНК-1_Т1 (6/6) 5' - CA GGT G /HEG/r GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ CAC GCT PAGE

РНК-1_Т1 (7/7) 5' - CA GGT GC /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ CAC GCT C PAGE

РНК-1_Т1 (8/8) 5' - GCA GGT GC /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ CAC GCT CT PAGE

РНК-1_Т1 (9/9) 5' - AGC AGG TGC /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ CAC GCT CTC PAGE

РНК-1_Т1 (10/10) 5' - A AGC AGG TGC /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ T CAC GCT CTC PAGE

РНК-1_Т2 (8/6) 5' - GC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-1_Т2 (9/7) 5' - AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC G /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-1_Т2 (10/8) 5' - C AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GG /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-1_Т2 (11/9) 5' - CC AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-1_Г2 (12/10) 5' - TCC AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG A /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-1_Г2 (11mm/9) 5' - CC AGC T AG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC GGC GGG /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-1_Г2 (11/9mm) 5' - CC AGC GAG CTC A GGC TAG CTA CAA CGA CGC G T C GGG /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНK-2_T1 (9/7) 5' - GAG CTC AAG TTTT /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG TTTTT CGC GTC C PAGE

РНK-2_T1-9/7-ttt 5' - GAG CTC AAG TTT GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG TTT CGC GTC C PAGE

РНK-2_T1-9/7-HEG 5' - GAG CTC AAG /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ CGC GTC C PAGE

РНK-2_T1 (10/8) 5' - GAG CTC AAG T TTTT /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG TTTTT A CGC GTC C PAGE

РНK-2_T1 (10/8)-HEG 5' - GAG CTC AAG T /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ A CGC GTC C PAGE

РНК-2_Г1 (8/7mm) 5' - AG CTC AAG /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ TGC GTC C PAGE

РНK-2_T2 (8/8) 5' - AA CTT CAG A GGC TAG CTA CAA CGA GCT GCG GA tttt GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНK-2_T2 (9/9) 5' - CAA CTT CAG A GGC TAG CTA CAA CGA GCT GCG GAG tttt GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-2_Г2 (10/10) 5' - G CAA CTT CAG A GGC TAG CTA CAA CGA GCT GCG GAG T tttt GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНK-2_T2 (8/б) 5' - AA CTT CAG A GGC TAG CTA CAA CGA GCT GCG tttt GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-2_Г2 (9/7) 5' - CAA CTT CAG A GGC TAG CTA CAA CGA GCT GCG G tttt GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНK-2_T2 (9/7)-HEG 5' - CAA CTT CAG A GGC TAG CTA CAA CGA GCT GCG G /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНK-2_T2 (10/8) 5' - G CAA CTT CAG A GGC TAG CTA CAA CGA GCT GCG GA tttt GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-2_Г2 (10/8)-HEG 5' - G CAA CTT CAG A GGC TAG CTA CAA CGA GCT GCG GA /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНK-2_T2 (10/9) 5' - G CAA CTT CAG A GGC TAG CTA CAA CGA GCT GCG GAG /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-2_Г2 (11/10) 5' - AG CAA CTT CAG A GGC TAG CTA CAA CGA GCT GCG GAG T /HEG/ GA ACA CGT GTGCTGAC PAGE

РНК-3 ДЗ-7/7 5' - CA GAT GA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG G PAGE

РНК-3 ДЗ-8/8 5' - GCA GAT GA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GT PAGE

РНК-3 ДЗ-9/9 5' - T GCA GAT GA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC PAGE

РНК-3 ДЗ-9/10 5' - T GCA GAT GA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC A PAGE

РНК-3 ДЗ-10/10 5' - GT GCA GAT GA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC A PAGE

РНК-3 ДЗ-10/9 5' - GT GCA GAT GA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC PAGE

РНК-3 ДЗ-11/11 5' - GG TGC AGA TGA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC AG PAGE

РНК-3 ДЗ-12/12 5' - TGG TGC AGA TGA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC AGC PAGE

РНК-3 Д3-13/13 5' - G TGG TGC AGA TGA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC AGC T PAGE

РНК-З_ДЗ-14/14 5' - GG TGG TGC AGA TGA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC AGC TT PAGE

РНК-З_ДЗ-15/15 5' - CGG TGG TGC AGA TGA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC AGC TTG PAGE

РНK-3_T1 (7/7) 5' - CTT GCC G /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ TTG CCG G PAGE

РНK-3_T1 (8/8) 5' - CTT GCC GT TTTT /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG TTTTT TT GCC GGT PAGE

РНК-3^1 (8/8)-HEG 5' - CTT GCC GT /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ TT GCC GGT PAGE

РНK-3_T1 (9/9) 5' - CTT GCC GTA TTTT /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG TTTTT CTT GCC GGT PAGE

РНК-3^1 (9/9)-HEG 5' - CTT GCC GTA /HEG/ GTCAG CACACG TGTTC TGTTC GTCTA ATCGG CGAG TC GACTG /HEG/ CTT GCC GGT PAGE

РНК-3_Т2 (8/8) 5' - GCA GAT GA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GT / HEG/ GA ACA CGT GTG CTGAC PAGE

РНК-3_Т2 (9/9) 5' - T GCA GAT GA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GT / HEG/ GA ACA CGT GTG CTGAC PAGE

РНК-3-Т2 (10/9) 5' - GT GCA GAT GA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC / HEG/ GA ACA CGT GTG CTGAC PAGE

РНК-3_Т2 (10/10) 5' - GT GCA GAT GA A GGC TAG CTA CAA CGA TTC AGG GTC A / HEG/ GA ACA CGT GTG CTGAC PAGE

^FAM - флуоресцеина амидит, флуоресцентная метка

6SD - стандартное обессоливание

^PAGE - полиакриламидный гель электрофорез

2iSp9, HEG - триэтиленгликолевый и гексаэтиленгликолевый линкеры, соответсвенно Сайты связывания между ДНК-конструкциями и целевыми РНК выделены подчеркиванием Каталитические ядра дезоксирибозимов выделены жирным курсивом

Рисунок П1 - Полиакриламидный гель (ПААГ) (15 %) электрофорез расщепления РНК-46 различными ДНКзимными конструкциями через 0, 1, 2, 3, 5, 7 и 10 ч инкубации при 37°С в буфере Реакционном буфере (50 мМ HEPES, 150 мМ KCl, 15 мМ NaCl и 2 мМ MgCl2, pH=7,4). А) контроль РНК-46 (1 мкм); Б) РНК-46 (1 мкМ) + биДНКзим + N-Myc (100 нМ); В) РНК-46 (1 мкМ) + биДНМ-1 + N-Myc (100 нМ); Г) РНК-46 (1 мкМ) + ДНКзим-1 (100 нМ). Стрелки показывают исходную РНК-46 и продукт расщепления длиной 24 нт.

Рисунок П2 - ПААГ электрофорез (15%) РНК фрагментов, расщепленных при

помощи ДНКзимов с различной длиной РНК-связывающих доменов 1/2. В условиях многократного оборота использовали 1000 нМ каждой РНК-мишени и

(А) 100 нМ ДЗ против РНК-1, (Б,В) 10 нМ нМ против РНК-2, РНК-3 в Реакционном буфере. Образцы инкубировали в течение 5 ч (А) и 10 ч (Б,В) при 37°С. Исходная РНК показана черной стрелкой. Только 5' продукт расщепления был виден в геле без окрашивания (серая стрелка).

Таблица П2 - Температуры плавления (Тпл) между РНК-связывающими доменами и РНК-мишенями

РНК Домен 1, нт Тпл, °Ca Домен 2, нт Тпл, °C Домен 3/ Домен 4, нт Тпл (домен 3/ домен 4), °C

9 57,3 9 51,0 6/6 9,0/20,4

РНК-1 10 63,2 10 55,0 7/7 26,2/28,8

11 65,0 11 58,8 8/8 35,5/37,5

12 65,8 12 63,4

8 44,2 8 33,1 8/7шшб 29,5/16,6

9 47,0 9 39,0 9/7 19,7/16,2

10 51,2 10 46,2 10/8 42,7/34,0

РНК-2 11 55,6 11 51,2

12 58,9 12 54,7

13 63,3 13 57,9

14 64,2 14 61,7

15 66,6 15 62,8

8 34,7 8 34,1 7/7 27,7/32,4

9 38,7 9 42,8 8/8 38,3/40,3

10 45,7 10 46,3 9/9 43,6/46,2

РНК-3 11 49,0 11 52,3

12 55,2 12 57,1

13 59,5 13 59,1

14 62,9 14 62,7

15 64,3 15 66,0

аТпл были рассчитаны для ДНК/ДНК гибридов с помощью Hybridization of two Different Strands of DNA or RNA [116] при условиях 37 °C, [Na+] = 215 мМ, [Mg2+] = 2 мМ и концентрации цепей: РНК = 1 мкМ, дНКзимы/ДНК-машины = 0,01 - 0,1 мкМ.

б7шш - домен, содержащий одно несовпадение (mismatch) на конце последовательности для понижения Тпл, как показано в Таблице 1.

Рисунок П3 - ПААГ электрофорез РНК фрагментов: А) РНК-1, Б) РНК-2, В) РНК-

3, расщепленных при помощи ДНК-машин с различной длиной РНК-связывающих доменов 1/2/3/4. В условиях многократного оборота использовали 1000 нМ каждой РНК-мишени и (А) 100 нМ ДНКзимов/ДНК-машин против РНК-1 (Б) 50 нМ против РНК-2 (В) 25 нМ против РНК-3 в Реакционном буфере. Образцы инкубировали в течение 5 ч при 37°С с последующим анализом в денатурирующем ПААГ (15%). Исходная РНК показана черной стрелкой. Только 5' продукт расщепления был виден в геле без окрашивания (серая стрелка).

Рисунок П4 - А) Структура ДНК-машины 2_ДНМ-8/10/0/0, нацеленной на РНК-2, с РНК-связывающими доменами 1, 2 равными 8, 10 нт, соответственно и без дополнительных связывающих доменов. Пунктирная линия показывает HEG линкер. Б) Агарозный гель электрофорез ДНК-машин с различными длинами РНК-связывающих доменов, собранных в концентрации 1000 нМ в Реакционном

буфере. ДНК-машины были получены путем отжига цепей T1, T2 и T3 с соответствующей длиной РНК-связывающих плеч (приложение, таблица П1). В геле представлены ДНК-машины, нацеленные на РНК DAD1 (дорожки 1-4) в сравнении с отдельными цепями (дорожки 5-7).

Рисунок П5 - Пример данных, используемых для расчета k2. Фрагменты РНК расщеплялись с использованием оптимальных ДНКзимов (ДЗ) 1_ДЗ-11/12 (А), 2_ДЗ-10/11 (Б,В), 3_ДЗ-9/10 (Г). В условиях однократного оборота использовали 1 мкМ каждой РНК мишени и 20 мкМ ДНКзимов в буфере 2 (15 мМ NaCl, 150 мМ KCl, 50 мМ HEPES/NaOH, pH = 7,4). Образцы предварительно отжигали, охлаждали и инкубировали с добавлением 2 мМ MgCl2 в течение 1 и 5 мин при

37°С. Анализ образца проводили в денатурирующем ПААГ (15%). Расчет k2 производили по данным расщепления РНК субстрата за 5 минут для РНК-1 и 1 минуту для РНК-2 и РНК-3. Исходная РНК показана черной стрелкой. В геле без окрашивания был виден только 5'-продукт расщепления (показан серой стрелкой).

1/[РНК], 1/нМ 1/[РНК], 1/нМ

Рисунок П6 - Графики Лайнуивера-Берка, показывающие зависимость обратной

скорости реакции (1/У) от обратной концентрации РНК (1/[РНК]) со стандартными отклонениями полученными в трех независимых экспериментах для оптимальных ДНКзимных конструкций нацеленных на (А) РНК-1, (Б) РНК-2,

(В) РНК-20, (Г) РНК-3.

5'-продукт З'-продукт Оптимальный

расщепления РНК расщепления РНК ДНКзим

AG = - 3,1 ккал/моль AG = - 6,6 ккал/моль AG = — 5,1 ккал/моль

/ и >Г" =Г"- и ------ "г" т

/и с \ " 1 ч I 0 I С I I« f

с / / '""а --а J I ^- G— С — г- \ —' / Ч \ » — С и ■. А — G— С — G— А — G— С"""" Чс III III

с I I I \ Т—С—G—А—Т— С — G. А в-

PHK-1 / с L ( I Q | А I £0 С I

\ сJ и го G Домен 2 А I

1 а \ Домен 1 I А I I \ - 30 С — G G I I I

G — 1 С / 20 I С I G — С С

и — С — 11 О-в С I G I

FAM I G I 3' с ■и макая»-N-(7* А 3' А

AG = - 1,2 ккал/моль AG = - 0,9 ккал/моль AG = - 2,5 ккал/моль

и "" с . с У G

/ \ с С

\ // I и I А С

G I I / G т 1

А I _ || ( Домен 1 I А | д

PHK-2 G У и — С \ \\ с \ А ■И Домен 2 G А

( и G \ I 10 G

I с \ С I / / 20 г и — G — С \ С 1 20 А-О-С-Т А

А ^ А У I I I G T-C-G-^ А

Хи — G f G — С — G / \ А G б"0

I FAM G I ( — С — G I 20 U I С 4 G

I IIHTIMijiH т. I 3' А А*« А

AG = - 4,5 ккал/моль AG = - 8,1 ккал/моль AG = - 0,1 ккал/моль

FAM 5 G ]

G— c-c с 5' -U I G С

С-А I I 1 G-(3 U XC-A U I I С 1 1 [ A G (

А 0 Ю ? Домен 2 { G Ц fa-%

РНК-3 С с 1 10 A—G—A—T—д' A 1

и С

G G-C-A-C С G

А 20 С I С I I I I C-G-U-G к с I 3-СИ Ч>-» A T { С

с и G . Домен 1 G N 1 А - 20 \ / 30 - A G G

А А I Ъ-чйй« | ® Qe - -аияя^ае-ж»»

Рисунок П7 - Вторичные структуры и энергия Гиббса их образования продуктов реакции расщепления РНК, а также оптимальных ДНКзимов, определенные при помощи RNA и DNA Folding Form Application веб-сервера mFold [115].