Разработка многокомпонентных гибридизационных зондов для распознавания нуклеиновых кислот и генодиагностики тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Рубель Мария Сергеевна

• Рубель Мария Сергеевна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Рубель Мария Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 Обзор литературы

1.1. Значение определения нуклеиновых кислот и изменений в них

1.2. Методы детекции бактериальных и вирусных патогенов

1.3 Детекция нуклеиновых кислот (НК) в лабораторной практике

1.3.1 Амплификация ДНК методом ПЦР

1.3.2 Петлевая изотермическая амплификация LAMP

1.3.3 Изотермическая амплификация SMAP2

1.3.4 Изотермическая амплификация SLPA

1.3.5 Метод изотермической амплификации нуклеиновых кислот (NASBA)

1.3.6 Геликаза-зависимая амплификация (HDA)

1.3.7 Амплификация по типу катящегося колеса (RCA)

1.3.8 Амплификация с вытеснением цепи (SDA)

1.3.9 Изотермическая амплификация с использованием лигазы (LMA)

1.3.10 Технология экспоненциальной амплификации РНК (SMART)

1.3.11 Амплификация на основе рекомбиназы и полимеразы (RPA)

1.3.12 Изотермическая амплификация с одним праймером (SPIA)

1.4 Детекция аллель-специфичных мутаций

1.4.1 Химическое расщепление несоответствий связывания (СМС)

1.4.2 Конкурентная аллель-специфическая ПЦР (KASP)

1.5 Гибридизация in situ и молекулярные маячки

1.6 Каталитические биосенсоры на основе нуклеиновых кислот

1.6.1 Роль G-квадруплексов как особых структур генома и использование пероксидазной активности G-квадруплексов в диагностике

1.6.2 РНК-расщепляющие дезоксирибозимы

1.6.2.1 Механизм действия РНК-расщепляющих рибозимов

1.6.2.2 Применение РНК-расщепляющих ДНКзимов в практике: возможности и перспективы

1.6.2.3 Использование РНК-расщепляющих дезоксирибозимов в диагностике.

ДНК-наномашины

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Подбор последовательности олигонуклеотидов для создания гибридизационных зондов

2.2 Первичный анализ эффективности сенсоров

2.3 Оценка эффективности колориметрических сенсоров

2.4 Оценка эффективности РНК-расщепляющих ДНК-наносенсоров

2.5 Огранизмы и условия их выращиваний

2.6 Выделение ДНК и РНК

2.7 Амплификация нуклеиновых кислот

2.7.1 Амплификация ДНК методом ПЦР

2.7.2 Петлевая амплификация (LAMP)

2.7.3 Амплификация типа SPA

2.8. Статистические методы обработки

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Разработка и апробация колориметрических ДНК-наносенсоров для детекции двухцепочечных фрагментов ДНК

3.2 Разработка флуоресцентных ДНК-наносенсоров для детекции длинных фрагментов ДНК и выявления однонуклеотидных замен в них

3.3 Использование системы флуоресцентных ДНК-наносенсоров для детекции

аллель-зависимых мутаций в длинных и коротких ампликонах

3.4. Разработка ДНК-наносенсорной системы на основе РНК-расщепляющего ДНКзима для детекции фрагментов РНК и обнаружения в них

однонуклеотидных замен

Глава 4 ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Детекция нуклеиновых кислот со стабильной вторичной структурой и двуцепочечной ДНК

4.2. Селективность обнаружения однонуклеотидных замен, в том числе при аллель-специфичном анализе

4.3. Мультиплексирование

4.4. Теоретическое продвижение в дизайне многокомпонентных ДНК-

гибридизационных зондов

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ТЕРМИНОВ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка многокомпонентных гибридизационных зондов для распознавания нуклеиновых кислот и генодиагностики»

ВВЕДЕНИЕ

Работа обусловлена недостаточным развитием подходов диагностики инфекционных заболеваний в условиях, когда требуется провести анализ непосредственно на месте оказания медицинской помощи (POCT — Point-of-Care Testing). Важным направлением развития в этой области является технология многокомпонентных гибридизационных зондов на основе ДНК-наносенсоров -фрагментов нуклеиновых кислот (НК), способных распознавать выбранные фрагменты НК и содержащих участки для создания сигнала в случае распознавания. На сегодняшний день рынок диагностики оценивается в 100-200 млрд. долларов в год [1]. Большую часть этого рынка занимают тест-системы на основе иммунохроматографии. Хотя эти системы удобны в использовании, они обладают низкой чувствительностью и неспособны выявить важные мутации в геноме патогенов, что ограничивает их значение в диагностике инфекций человека. Альтернативой иммунохроматографии является диагностика, нацеленная на нуклеиновые кислоты, например, полимеразная цепная реакция (ПЦР) или изотермическая амплификация. Однако эти методы не всегда могут быть легко интегрированы в форматы POCT из-за необходимости использования сложного оборудования и усложнения технологического процесса.

Диссертационная работа вносит вклад в решение проблемы недостаточной доступности и дороговизны диагностических тестов, в том числе заболеваний человека. В представленной работе были разработаны и апробированы варианты безбелковых каталитических ДНК-структур - ДНК-наносенсоров, которые гибридизуются со специфическими ДНК или РНК-аналитами. В работе представлены: 1) РНК-расщепляющие ДНКзимные ДНК-наносенсоры, содержащие дезоксирибозимное ядро, способное к расщеплению флуоресцентного РНК-ДНК репортерного субстрата; и 2) G-квадруплекс-формирующие ДНК-наносенсоры, которые формируют каталитическое ядро в виде гуанин-богатых тетрамерных структур, которые в свою очередь способны объединяться с химическими соединениями для формирования пероксидазной активности и генерации колориметрического сигнала.

Целью данной работы являлось создание многофункциональных ДНК-наносенсоров для детекции РНК со стабильной вторичной структурой и двуцепочечных ДНК (дцДНК).

Для достижения поставленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать наносенсор на основе G-квадруплекса с пероксидазной активностью для детекции ампликонов дцДНК при комнатной температуре.

2. Разработать флуоресцентный РНК-расщепляющий ДНК-наносенсор на основе ДНКзима для детекции длинных (~1400 п.н.) ампликонов дцДНК.

3. Разработать РНК-расщепляющие ДНК-наносенсоры для обнаружения однонуклеотидных замен в коротких (до 150 п.н.) и длинных (~1400 п.н.) фрагментах дцДНК в гомо-и гетерозиготных образцах в формате биплексной детекции без предварительной ко-денатурации.

4. Разработать наносенсорную систему на основе РНК-расщепляющего ДНКзима для обнаружения однонуклеотидных замен в целевой РНК без необходимости предварительной амплификации.

Научная новизна работы заключается в применении многокомпонентных ДНК-сенсоров для детекции дцДНК и РНК со сложной вторичной структурой, что позволяет сократить время и стоимость детекции и сделать диагностику доступной и недорогой. Впервые показана возможность использования ДНК-наномашин с дцДНК при комнатной температуре и с дцДНК длиной более 200 п.н. без этапа предварительного отжига.

В работе используется генетический материал вируса Эпштейна-Барр, бактерий Escherichia coli, и группы Bacillus cereus: непосредственно B. cereus, а также B. mycoides, B. thurigienensis и ячменя Hordeum vulgare как модельных практически значимых организмов. Разработанные подходы могут быть в дальнейшем применены к другим практически значимым объектам, включая бактерии, грибы и вирусные патогены.

Теоретическая значимость работы заключается в разработке нового класса гибридизационных сенсоров, позволяющих решать задачи детекции нуклеиновых кислот (дцДНК и свернутых РНК) с помощью (с использованием) модульной конструкции функциональных узлов, обладающей высокой селективностью и чувствительностью. Практическая значимость работы заключается в возможности применения разработанной технологии в POCT различных инфекционных заболеваний человека, растений и животных.

Апробация работы и внедрение результатов. Апробацию результатов проводили в ходе детекции патогенов ЦНС при разработке прибора закрытого типа по заказу Центра стратегического планирования Федерального Медико-Биологического Агенства. Результаты работы были представлены на ряде всероссийских и международных конференций: «Современные достижения химико-биологических наук в профилактической и клинической медицине» (2020, 2021), Конференции молодых ученых ИТМО (2021, 2022, 2023). По результатам работы опубликовано 6 статей и получен патент РФ №2798567.

Статьи

1. Nedorezova D.D., Rubel M.S., Rubel A.A. Multicomponent DNAzyme Nanomachines: Structure, Applications, and Prospects // Biochemistry (Moscow). - 2024. - Т. 89. - № S1. - С. S249-S261.

2. Akhmetova M.A, Rubel M.S., Afanasenko O.S., Kolpashchikov D.M. Barley haplotyping using biplex deoxyribozyme nanomachine // Sensors and Actuators reports - 2022. - Т. 4. - С. 100132

3. Maltzeva Y. I., Gorbenko D. A., Nikitina E. V., Rubel M. S., Kolpashchikov D. M. Visual Detection of Stem-Loop Primer Amplification (SPA) Products without Denaturation Using Peroxidase-like DNA Machines (PxDM). // International Journal of Molecular Sciences. - 2023. -Т. 24. - №. 9. - С. 7812.

4. Ateiah, M., Gandalipov E.R., Rubel A.A, Rubel M.S., Kolpashchikov DM. DNA Nanomachine (DNM) Biplex Assay for Differentiating Bacillus Cereus Species // International Journal of Molecular Sciences. - 2023. - Т. 24. - № 5. - С. 4473 Другие публикации по теме исследования:

1. Rubel, M. S., Shkodenko, L. A., Gorbenko, D. A., Solyanikova, V. V., Maltzeva, Y. I., Rubel, A. A., Koshel E.I., Kolpashchikov, D. M. Detection of multiplex NASBA RNA products using colorimetric split G quadruplex probes // RNA Nanostructures: Design, Characterization, and Applications / ed. Afonin K.A. - New York, Springer US. - 2023. - С. 287-298.

2. Рубель М.С., Дубровина И.А., Мясников В.А., Липаева П.В., Синегубова Ю.О. Сравнительная характеристика современных экспресс-методов диагностики инфекционных заболеваний, основанных на методе изотермической полимеразной цепной реакции // Вестник РВМА. - 2018. - №S1. - С. 160-163

3. Rubel M., Zablotskaya S., Pokatova O., El-Deeb A., Ateiah M., Gorbenko D., Shkodenko L., Kolpashchikov D.M. DNA-nanomachines for nucleic acid detection // International conference "Bioinformatics of genome regulation and structure/ System biology" Книга тезисов. Новосибирск. - 4-8 Июля 2022. - С. 355-356.

4. Мальцева Ю.И., Горбенко Д.А., Шкоденко Л.А.., Рубель М.С., Зарубаев В.В., Слита А.В., Колпащиков Д.М. Обнаружение нуклеиновых кислот на основе комбинации методов изотермической амплификации и ДНК-наномашин // «Современные достижения химико-биологических наук в профилактической и клинической медицине» Книга тезисов. Санкт-Петербург. - 2-3 декабря 2021. - С. 247-225

5. Gorbenko D.A., Shkodenko L.A., Nedorezova D.D., Rubel M.S. Visual detection of bacterial and viral pathogens with peroxidase-like deoxyribozymes. // «SPIE Organic Photonic+ Electonic». - Книга тезисов Т. 11477: «Molecular and Nano Machines III». - Онлайн событие. -21 августа 2020. - 1147709.

Достоверность результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных, использованием методов, адекватных поставленным задачам, а также тем, что для интерпретация полученных результатов были применены современные методы статистического анализа данных.

Финансовая поддержка диссертации. Работа была выполнена с помощью финансовой поддержки государственного задания Министерства образования РФ FSER-2022-0009, проекта М-платформы Университета ИТМО в рамках «Приоритет 2030» Министерства образования РФ и контрактами при реализации проекта создания прибора закрытого типа для диагностики инфекций ЦНС от ЦСП ФМБА (договоры №№ 0373100122119000012, 0373100122120000003, 0373100122121000027), а также за счёт средств проекта СПбГУ (ID 95444727).

Объем и структура диссертации. Научно-квалификационная работа выполнена на 114 листах и содержит семь таблиц и 50 рисунков. Структурно работа состоит из введения, аналитического обзора литературы, затрагивающего темы вариантов изотермической амплификации и ДНК-наносенсоров, экспериментальной части, представленной разделами материалы и методы, результаты и обсуждение результатов, а также разделом заключение, содержащим выводы.

Основные научные результаты:

1. Был проведен анализ и систематизация литературных данных о ДНК-наносенсорах различных типов, используемых в диагностике [2]. На основе полученных сведений была сформулирована проблема диссертационной работы.

2. Были проведены исследования, показывающие эффективность использования ДНК-наносенсоры с ДНКзимным ядром на основе G- квадруплекса для высокоточного определения одноцепочечных продуктов реакции в смеси, являющейся результатом мультиплексной изотермической амплификации [3]. В ходе работы были определены основные элементы ДНК-наносенсоров с ДНКзимным ядром, позволившие затем детектировать ампликоны дцДНК, созданные изотермической амплификацией с использованием праймеров с петлей и шпилькой при комнатной без предварительного отжига. Такие ДНК-наносенсоры были способны определять наличие продукта в смеси и точно определять истинно-положительные результаты [4]. Автор диссертации подбирала условия амплификации, создавала дизайны ДНК-наносенсоров и выполняла эксперименты амплификации.

3. Кроме того, была показана возможность определения наличия длинных фрагментов дцДНК, полученных путем амплификации, и однонуклеотидных замен в них [5], используя ДНК-наносенсоры с РНК-расщепляющими ДНКзимными ядром. Также на основе тех же продуктов амплификации была определена возможность определения гомо- и гетерозиготных аллелей в исходном организме. Автор диссертации создавала биплексную систему детекции однонуклеотидных замен и получала фрагменты.

4. Была создана биплексная система ДНК-наносенсоров, использующая РНК-расщепляющее ДНКзимное ядро, для дискриминации близкородственных видов бактерий по однонуклеотидным заменам в 16S рРНК в безамплификационном формате [6]. Автор диссертации проводила биоинформатический анализ, создала дизайны биплексной системы и проводила эксперименты по ее характеризации.

Положения, выносимые на защиту:

1. ДНК-наносенсоры с несколькими аналит-связывающими фрагментами и различными ДНКзимными ядрами могут быть использованы для детекции ампликонов дцДНК как при комнатной, так и при повышенной температуре без предварительного отжига.

2. Биплексная система ДНК-наносенсоров с несколькими аналит-связывающими фрагментами и РНК-расщепляющим ДНКзимным ядром может быть использована для дискриминации практически значимых однонуклеотидных замен в длинных фрагментах рРНК в безамплификационном формате.

3. Биплексная система ДНК-наносенсоров с несколькими аналит-связывающими фрагментами и РНК-расщепляющим ДНКзимным ядром может осуществлять аллель-специфическую дискриминацию однонуклеотидных замен как в длинных, так и в коротких ампликонах дцДНК.

Глава 1 Обзор литературы 1.1. Значение определения нуклеиновых кислот и изменений в них

Определение нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) и изучение изменений в них играют ключевую роль в диагностике, лечении заболеваний, экомониторинге и многих других областях науки и технологии. Эти знания способствуют улучшению здоровья населения и развитию новых идей, направленных на решение медицинских и биологических проблем.

К примеру, определение наличия патогенных НК (например, вирусов, бактерий) позволяет быстро и точно диагностировать инфекционные заболевания, такие как СОУГО-19, ВИЧ, гепатиты и др. Кроме определения наличия, анализ НК может выявить определенные биологические свойства этих патогенов, например, отследить источник заражения или указать на устойчивость к антибиотикам. В целом, изучение изменений в НК патогенов позволяет отслеживать вспышки заболеваний, их распространение и мутации, ассоциированные с тяжестью заболеваний, что критически важно для общественного здравоохранения.

Исследование особенностей генома пацента также может дать значительный объем информации, особенно в условиях заболеваний, вызванных мутациями самого пациента. Например, анализ изменений в НК (мутаций, хромосомных аномалий) помогает выявлять рак на ранних стадиях, а также определять тип опухоли и её прогноз. Определение последовательностей НК помогает исследовать наследственные заболевания, изучать механизмы наследования и эволюцию видов. Это важно для понимания биологических процессов и механизмов, лежащих в основе различных заболеваний. Накопление массива информации о фармакогеномике и мутациях, ассоциированных с метаболизмом химических соединений позволяет разрабатывать индивидуализированные схемы лечения, основанные на генетическом профиле пациента. Это особенно актуально для ранее упоминаемых онкологических заболеваний и наследственных болезней.

Кроме медицинской области применения, НК помогают обеспечить безопасность и сохранность продуктов и окружающей среды. Например, определение НК помогает в контроле за осемененностью пищевых продуктов или других материалов (биодеградация органических соединений, например нефти) и в мониторинге экосистем (например, идентификация инвазивных видов). Кроме того, определение НК человека может быть полезно в судебной практике для идентификации личностей, установления родства и решения уголовных дел.

В биотехнологии определение и манипуляция с НК используются в производстве рекомбинантных белков, вакцин, антибиотиков и других биопродуктов. В таком случае источником НК могут выступать различные организмы, используемые в практике: бактерии, вирусы, животные, растения.

В целом НК - одни из наиболее универсальных и надёжных маркеров для различных задач, поскольку они видоспецифичны и менее разнообразны по структуре, чем белки, а также могут быть надёжно идентифицированы с помощью методов прямого высокоспецифичного анализа.

1.2. Методы детекции бактериальных и вирусных патогенов

Существуют два основных подхода к диагностике инфекционных заболеваний - детекция самого патогена и детекция проявлений, вызываемых патогеном в организме.

Долгое время золотым стандартом для диагностики бактериальных патогенов являлся их посев на питательную среду и дальнейший анализ морфологии клеток. Несмотря на то, что данный подход является достаточно точным и до сих пор активно используется в клинической практике, его существенным недостатком является длительность. Анализ занимает не менее 5-7 дней от посева биоматериала до определения патогена. В отдельных случаях, например, для выявления возбудителя туберкулёза - Mycobacterium tuberculosis (Mtb) требуется около 6 недель [7].

В течение длительного времени классическим методом для детекции вирусов было заражение культур клеток. Такой подход требовал много времени и являлся крайне трудоёмким. Кроме того, из-за сложности определения большинства вирусов по фенотипу и высокой степени изменчивости вирусного генома, подход часто являлся не информативным [8].

В настоящее время для определения возбудителя заболевания в подавляющем большинстве случаев используют молекулярно-генетические методы. Современные методы диагностики в лабораторных условиях позволяют с высокой точностью и скоростью определить инфекционный агент. Методы постоянно развиваются и совершенствуются: появляются новые методы диагностики, уменьшается, время необходимое на определение патогена, снижается стоимость диагностики. При этом, несмотря на наличе преимуществ в сравнении с классическими методами микробиологии и вирусологии, молекулярно-генетические методы также не лишены недостатков: необходимость создания инфраструктуры для перемещения и хранения образцов, необходимость зональности работы с особо опасными возбудителями, создание сложной приборной базы, длительное обучение лаборантов и врачей, а также необходимость накопления биологических образцов для достижения экономической эффективности тестирования. Все эти проблемы могут быть решены благодаря использованию продуктов и технологий диагностики в месте оказания помощи.

Современная медицина вводит понятие диагностики на месте оказания помощи (POCT, от point-of-care testing). РОСТ включает в себя комплекс тестов, которые можно провести рядом с кроватью больного (отсюда второе название - bedtime testing) или на месте взятия образца, используя простые инструменты и доступные реагенты. Концепция РОСТ позволяет расширить сферу применения клинической диагностики до удаленных регионов, быстро проверить на скоротечные заболевания, использовать крайне нестабильные образцы, а также создать основу для массового скрининга и повторяющихся тестирований отдельных индивидуумов.

Диагностика на месте может быть востребована, например, для тестирования пациента на клещевой энцефалит, позволив быстро принять решение о необходимости введения противоэнцефалитной сыворотки и сократить количество случаев ненужной вакцинации. Массовый скрининг позволяет вывить профили заболевания эпизоотий и ограничить очаговые инфекции. Регулярное индивидуальное тестирование позволит проводить, например, анализ динамики численности вируса в крови.

Последняя коронавирусная пандемия на практике в полной мере показала положительный эффект от РОСТ. Например, использование полосок для экспресс-тестирования на коронавирус помогали принимать решения о изоляции больных уже на этапе первичного обращения или даже самостоятельно до приезда врача.

При оценке эффективности методов РОСТ главными критериями являются точность результата, а также скорость и простота проведения реакции тестирования. В случае массового тестирования населения значение имеют также стоимость компонентов, используемых для проведения реакции тестирования, их стабильность в процессе транспортировки и длительность хранения. Для того, чтобы тест-система была признана как отвечающая требованиям РОСТ, результаты анализа должны быть получены не позднее чем через 2 часа после начала тестирования. Себестоимость материалов по оценкам экспертов не должна превышать 10 долларов США. Все манипуляции должны быть осуществимы даже необученными лицами [9,10].

На данный момент существует достаточно широкий спектр тестов, соответствующих требованиям РОСТ, включая наиболее часто используемый - тест на беременность. В основе большинства диагностических тестов, используемых в настоящее время, лежит метод иммунохроматографического анализа в виде тест-полосок (англ. lateral flow devices - LFD). В тестах LFD образец детектируется и визуализируется путём его связывания со специфичными антителами [11]. Метод иммунохроматографического анализа достаточно надежен и позволяет определить наличие исследуемого вещества или патогена, однако имеет низкую чувствительность [12]. По чувствительности иммунохроматографические методы исследования не сопоставимы, например, с методами полимеразной цепной реакции (ПЦР) - пикомолярные концентрации против единичных молекул, соответственно.

1.3 Детекция нуклеиновых кислот (НК) в лабораторной практике

Самыми точными методами анализа НК являются методы секвенирования, которые позволяют определить линейную последовательность исследуемого участка ДНК или всего генома организма. В клинической практике для диагностики патогенов методы секвенирования не используют, так как они достаточно трудоемки и требуют дорогостоящего оборудования и реактивов. Несмотря на произошедшее в последние годы значительное удешевление и упрощение методов секвенирования, например, за счёт появление на рынке таких проборов как Пиромарк [13], методы секвенирования пока не могут быть использованы для массовой идентификации патогенов.

Как правило, в клинической и научной практике применяют методы амплификации участков ДНК или РНК, с последующим определением количества нуклеиновых кислот в динамике или в конце реакции. Методы амплификации участка нуклеиновых кислот основаны на использовании ферментов - ДНК- или РНК-зависимых ДНК-полимераз, способных синтезировать комплиментарную нить ДНК на матрице детектируемой нуклеиновой кислоты. Участок амплификации ограничивают при помощи праймеров - небольших фрагментов нуклеиновой кислоты

(олигонуклеотидов), комплементарных ДНК- или РНК-мишени; служащих затравкой для синтеза комплементарной цепи.

Одним из наиболее разработанных методов амплификации нуклеиновых кислот является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), а также его модифицированный вариант РВ-ПЦР (ПЦР в реальном времени). ПЦР чрезвычайно надежна и широко распространена в биологии и медицине, но требует циклирования температуры. Поэтому за последние 10-15 лет получили развитие методы определения качественного и количественного состава ДНК, которые получили общее название изотермической ПЦР (изоПЦР, от isothermalPCR), поскольку при таких способах амплификации все реакции проходят при одной относительно низкой температуре [14]. Наиболее хорошо изученные и часто используемые варианты изоПЦР, такие как LAMP (от англ. Loop mediated isothermal AMPlification), NASBA (от англ. Nuceic Acid Sequence Based Amplification), RCA (от англ. Rolling Cycle Amplification) и другие подробно описаны ниже. Стоит отметить, что количество разработанных методов изотермической ПЦР, намного большое описанных в данной работе, однако значительная часть из них, по всей видимости, так и останутся экзотичными вариантами, адаптированными под конкретные последовательности или задачи исследователя [15].

1.3.1 Амплификация ДНК методом ПЦР

Классический вариант ПЦР, позволяющий осуществлять детекцию результата в конечной точке, был описан в 1983 году [16]. В его основе лежит принцип воспроизведения (репликации) ДНК в клетке. При постановке реакции в ячейку помещают матрицу (исходную ДНК), которая будет являться основой для амплификации фрагмента ДНК; синтезированный химическим способом ДНК-праймер; смесь дезоксинуклеотидов (dNTP), представляющих собой эквимолярный раствор высокоочищенных 2'-дезоксинуклеозид 5'-трифосфатов (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) и фермент ДНК-зависимую ДНК-полимеразу, например, наиболее распространенную ДНК-полимеразу Thermus aquaticus (Taq полимеразу).

Реакция происходит в три этапа:

1. Денатурация - термическое расплетание цепей ДНК при 95°С;

2. Отжиг праймера - присоединение праймеров к специфичным комплементарным участкам ДНК (обычно проходит при температуре 48-62°С);

3. Элонгация - синтез дочерних цепей ДНК на матрице родительской молекулы ДНК, осуществляется путём присоединения dNTP к 3'-концу праймера по принципу комплементарности. Реакция катализируется термоустойчивой ДНК-полимеразой. Температура элонгации определяется оптимумом температуры для работы фермента (составляет 60-72°С, для полимеразы Taq) (Рис. 1).

Рисунок 1 - Схема полимеразной цепной реакции Стрелками обозначено направление синтеза от 5' к

3' концу [17].

За каждый цикл ПЦР происходит удвоение количества молекул ДНК. Количество ДНК, достаточное для анализа, обычно достигается за 25-40 циклов. Метод легко может быть стать мультиплексным и одновременно быть нацеленным на несколько мишеней.

Во время реакции РВ-ПЦР происходит инкорпорирование интеркалирующего флуоресцентного красителя (например, SYBR Green), или высокоспецифичных к детектируемому участку флуоресцентных проб (флуоресцентно-меченых ДНК-зондов, содержащих гаситель флуоресценции). За счёт этого ход протекания реакции ПЦР можно визуализировать в режиме реального времени по накоплению окрашенного продукта амплификации, что экономит время при визуализции результатов, а также позволяет использовать для анализа меньшие количества образцов ДНК по сравнению с классической ПЦР с детекцией результата в конечной точке.

В целом метод РВ-ПЦР очень простой и чувствительный, используемые компоненты очень стабильны и могут быть подвергнуты лиофилизации, имеется возможность работать даже на неочищенных биологических образцах. Несмотря на свою относительную простоту, метод является

времязатратным и зависимым от наличия термоциклера и оборудования для визуализации. Чувствительность метода позволяет детектировать наличие всего одной копии гена в образце. В результате реакции происходит увеличение количества копий в 107 раз [18].

Значительная часть микробиологических и вирусологических лабораторий в России оснащены амплификаторами способными проводить ПЦР в режиме реального времени. Существует множество компаний, производящих наборы для тестирования, и большое количество сертифицированных лабораторных протоколов. ПЦР надежный, зарекомендовавший себя метод, но тем не менее его использование требует специализированных приборов. Современные высококачественные приборы такие как RapidCycler позволяют осуществлять реакцию ампплификации образца за 10-30 минут [18]. При этом в интернете можно найти чертежи по самостоятельной сборке прибора с примерной стоимостью комплектующих меньше 85 долларов США [19]. Но даже при уменьшении стоимости, приборы все равно будут играть роль «бутылочного горлышка» при проведении широкомасштабных экспериментов. Для увеличения пропускной способности и доступности тестирований, а также для уменьшения стоимости экспериментов были созданы методы изоПЦР.

1.3.2 Петлевая изотермическая амплификация LAMP

Метод LAMP (от англ. Loop mediated isothermal AMPlification) - петлевая изотермическая амплификация ДНК и РНК появился в конце 90х годов 20 века. Метод был разработан и запатентован компанией «Aiken» (Япония) [20]. Метод LAMP основан на выпетливании необходимого участка ДНК с помощью праймеров. Использование таких петель способствует многократному созданию участков для распознавания праймеров, что увеличивает вероятность встречи праймеров и накопленных последовательностей при последующих циклах синтеза. Для амплификации ДНК в изначальном варианте метода использовали четыре олигонуклеотидных праймера и большой фрагмент ДНК-полимеразы Bst, обладающий сильной вытесняющей активностью. Прямой внутренний праймер связывается с целевой последовательностью и синтезирует комплементарную цепь, затем прямой-3' праймер связывается с той же последовательностью кнаружи от места прикрепления прямого внутреннего праймера. Полимераза распознает 3'- конец прямого-3' праймера начинает синтезировать одноцепочечную нить на основе исходной последовательности, вытесняя последовательность, содержащую прямой внутренний праймер. На этом этапе прямой внутренний праймер интегрируется в последовательность и сворачивается в кольцо за счет наличия в нем участков самокомплементарности. На одноцепочечную нить садится обратный внутренний праймер, а затем обратный-3' праймер и синтезирует одноцепочеченую цепь с двумя кольцами с обеих сторон. Далее происходит синтез последовательности, каждый раз производя дополнительную копию гена с кольцом и удлиняя структуру на одну или более копий гена. В результате образуется набор конкатомерных ДНК, состоящих из нескольких копий целевой последовательности. Для того чтобы подтвердить размер синтезируемого фрагмента, можно инкорпорировать сайты узнавания в прямой и

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Рубель Мария Сергеевна, 2025 год

использовали

формулу:

SF =

где Fo, -интенсивность флуоресценции фонового сигнала, Fs - интенсивность флуоресценции сигнала специфичной пробы без однонуклеотидной замены и Fns - интенсивность флуоресценции сигнала неспецифичной пробы с однонуклеотидной заменой.

Escherichia coli ATCC 35218 культивировали в жидкой среде LB (Lysogeny broth), состоящей из 1% триптона, 0,5% дрожжевого экстракта, 0,5% хлорида натрия. Культивирование проводили на орбитальном шейкере при скорости вращения 250 об/мин в сосудах, заполненных до 1/10 объема, при температуре 37 °С.

Изоляты Streptococcus agalactiae и Lysteria monocytogenes из клинических образцов культивировали на питательной среде - колумбийский агар, содержащей 5% овечью кровь (Columbia Blood Agar). Культивирование проводили в течение ночи при 37°С в атмосфере с 8-10% СО2. Образцы патогенов были предоставлены НИИ Детских Инфекций ФМБА РФ, г. Санкт-Петербург, Россия. Размножение патогенов проводилось в соответствии с требованиями по биобезопасности Российский Федерации лицами, имеющими разрешение на работу с соответствующими категориями микроорганизмов.

Бактериальные культуры Bacillus cereus ATCC 14579 и Bacillus thuringiensis ATCC 10792 выращивали в 3 мл среды LB при температуре 37 °C в течение 16 часов. Бактери Bacillus mycoides ATCC 6462 - выращивали при температуре 30 °C, в течение 16 часов. Для определения колониеобразующих единиц (КОЕ) B. thuringiensis, B. mycoides и B. cereus инокулировали в 200 мл жидкой среды LB и культивировали в течение ночи при температуре 37 °C. Затем культуры разбавляли до достижения оптической плотности OD600 ~ 1,1. Для калибровки центрифугировали 1 мл культуры, удаляли надосадочную жидкость и добавляли еще 1 мл культуры. После повторного центрифугирования удаляли супернатант, добавляли 1 мл физиологического раствора, ресуспендировали клетки и выращивали до достижения OD600 ~ 2,2. Из маточного раствора готовили серийные разведения, которыедополнительно разбавляли в 80000 раз. Затем высевали по 50 мкл разведенных клеточных культур на чашки Петри и инкубировали в течение ночи при 37 °C, после чего подсчитывали КОЕ. Для оценки количества клеток учитывали только чашки собержащие от 30 до 300 КОЕ. Количество клеток в виде КОЕ/мл рассчитывали путем умножения подсчитанных КОЕ в чашке на коэффициент разбавления 80000 и умножением на 20 для корректировки количества КОЕ на мл.

Вирус Эпштейна Барра и цитомегаловирус были культивированы в НИИ Эпидемиологии им. Пастера, г. Санкт-Петербург, Россия, на клеточной линии Vero (ECACC 84113001). Клетки были выращены на среде альфа-МЕМ «Gibco» (США) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки «HyClone», (США), пенициллина и стрептомицина «Gibco» (США), при температуре 37°С, в

2.5 Огранизмы и условия их выращиваний

атмосфере 5% СО2. После достижения 80% покрытия монослоя клеток, они были отмыты и заражены вирусными частицами. Для извлечения РНК использовали инфицированные клеточные культуры через 18-21 час после заражения до формирования вирусных частиц. Для извлечения ДНК вирусных частиц использовали фракцию вирусных частиц, полученную путем центрифугирования.

Растения ячменя выращивали в виде дигаплоидных линий в горшках на обогащенной почве, одно семя на горшок. Образцы выращивали в теплице в случайном порядке размещения при температуре 16-20 °С и 12 часовом фотопериоде. Полив ячменя осуществляли в ручном режиме. Образцы получены во Всероссийском институте защиты растений, г. Санкт-Петербург, г. Пушкин, Россия.

2.6 Выделение ДНК и РНК

Для выделения ДНК из клеток бактерий использовали метод фенол-хлороформной очистки [169], либо набор для экстракции «АмплиСенс», разработанный компанией «БиоЛабМикс» (Россия). Выделение ДНК с помощью набора «АмплиСенс» осуществляли согласно протоколу производителя. Для выделения РНК использовали набор «PureLink RNA», «Invirtogen» (США) либо набор «ExtractRNA» произведённый компанией ООО «Евроген» (Россия). Выделение РНК осуществляли в соответствии с рекомендациями производителей. Клетки бактерий группы Bacillus перед выделением дополнительно разрушали стеклянными шариками (шарики 425-600 ангстрем) на шейкере (пятью циклами по 2-3 минуты с охлаждением во льду в промежутках).

Для анализа использования ДНК-наноконструкций для детекции НК на продуктах грубого лизиса клеток группы Bacillus, готовили серийные разведения по 1 мл на образец. Клетки бактерий собирали центрифугированием при 900g в течение 5 мин. Далее супернатант удаляли, а осадок ресуспендировали в 150 мкл реакционного буфера, содержащего фрагменты ДНК-наномашины специфичные для B. thuringiensis или B. mycoides. Для лизиса клеток и высвобождения РНК, а также для её отжига с цепями дезоксирибозима, смесь нагревали при 95 °С в течение 5 мин. Далее смесь охлаждали при комнатной температуре в течение 5 мин, а затем центрифугировали при 900g в течение 3 мин. Супернатант (~140 мкл) переносили в чистую микропробирку, после чего добавляли 1 мкл ингибитора РНКазы и F-sub.

Качество и количество выделенных нуклеиновых кислот оценивали на спектрофотометре N50, «Implen» (Германия), а также с помощью агарозного гель-электрофореза. Выделенную ДНК хранили при температуре -20 °С. РНК и смесь НК хранили при температуре -80 °С, с приведением к рабочему раствору в концентрации 1 нг/мкл или в стоковом состоянии.

2.7 Амплификация нуклеиновых кислот 2.7.1 Амплификация ДНК методом ПЦР

Амплификацию ДНК методом ПЦР проводили на приборе T100, «BioRad» (США). В качестве праймеров для амплификации использовали последовательности, представленные в таблице 3. В реакцию добавляли по 0,25 мкМ каждого праймера, по 0,25 мМ каждого из

дезоксинуклеозидтрифосфатов ^АТР, dCTP, dGTP и dTTP), ООО «Евроген» (Россия), 5 и ДНК-полимеразы Taq и соответствующий 1Х буфер для полимеразы Taq ООО «Евроген» (Россия). В отдельных случаях в реакционную смесь добавляли ДМСО и/или БСА. Результаты проведения амплификации анализировали с помощью электрофореза продуктов ПЦР в 2% агарозном геле, при напряжености электрического поля 5 В/см, в течение 30 минут. Для амплификации ДНК методом ПЦР использовали протоколы представленные в таблице 4.

Таблица 3 - Праймеры, использованные в работе при проведении ПЦР.

Название праймера Последовательность олигонуклеотидов 5' - 3'

Ecoli F3 GCCATCTCCTGATGACGC

Ecoli_B3 ATTTACCGCAGCCAGACG

356_forward GAAACGCCATCAGTGAATAAATTAG

356_rewerse CGTCCTCATAAGCCTATAATAATTC

356 forward inner CAACTGCAAATTCATGCACC

356 rewerse inner GCAATGGGGCTATTTCATG

Таблица 4 - Протоколы, использованные для амплификации ДНК методом ПЦР

Стадия ПЦР Получение Получение Получение

фрагментов E. длинных коротких

coli ампликонов ампликонов

ячменя ячменя

Предденатурация 95 °С 5 мин 95 °С 5 мин 95 °С 3 мин

Денатурация 95 °С 30 сек 95 °С 30 сек 95 °С 30 сек

Отжиг праймеров 50 °С 30 сек 59,5 °С 30 сек 60 °С 30 сек

Элонгация 72 °С 30 сек 72°С 90 сек 72°С 30 сек

Количество циклов 30 30 30

Финальное удлинение цепи 72°С 10 мин 72°С 10 мин 72°С 5 мин

ДНК

2.7.2 Петлевая амплификация (LAMP)

Метод LAMP использовали в качестве референсного для амплификации типа SLPA.

Для подбора праймеров использовали web-программу компании «PrimerBiosofit» (США). Последовательность использованных праймеров представлена в таблице 5. Реакционная смесь для проведения амплификации содержала: по 40 пМ праймеров FIP и BIP; по 10 пМ праймеров F3 и B3; 1,25 мкМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), ООО «Евроген» (Россия); 0,8 М бетаина, «Sigma-Aldrich» (Германия); 1х буфер для изотермической амплификации (Isothermal amplification buffer), «NEB» (США); 8 мкМ MgSO4, «NEB» (США); 10 U полимеразы Bst, «NEB» (США). Реакцию амплификации проводили в течение 60-90 минут при температуре 65°С. Результат амплификации анализировали с помощью электрофореза продуктов реакции в 2% агарозном геле, при 80 В, в течение 30 минут.

Таблица 5 - Праймеры, использованные в работе при проведении амплификации LAMP.

Название праймера Последовательность олигонуклеотидов 5' - 3'

Ecoli_FIP CTGGGGCGAGGTCGTCCTATTCCGACAAA CACCACGAATT

Ecoli_BIP CATTTTGCAGCTGTACGCTCGCAGCCCAT CATGAATGTTGCT

Ecoli F3 GCCATCTCCTGATGACGC

Ecoli_B3 ATTTACCGCAGCCAGACG

2.7.3 Амплификация типа SPA

Праймеры для проведения реакции амплификации типа SPA подбирали с помощью веб-

программы «Primer3 tool» [170]. Концевые участки петель праймеров подбирали согласно рекомендациям авторов методики. Праймеры, использованные в работе при проведении амплификации SPA, представлены в таблице 6.

Реакционная смесь для проведения амплификации состояла из: 20-40 пМ праймеров (FrSL и BvSL); 5-10 пМ праймеров (Fr и Bv); 1,25 мкМ каждого из дезоксинуклеозидтрифосфатов (dATP, dCTP, dGTP и dTTP), ООО «Евроген» (Россия); 0,8 М бетаина, «Sigma-Aldrich» (Германия); 1х буфера для изотермической амплификации (Isothermal amplification buffer), «NEB» (США); 8 мкМ MgSO4, «NEB» (США); 10 U полимеразы Bst, «NEB» (США) или такого же количества полимеразы полимеразы Bst собственного производства. Реакцию амплификации проводили в течение 60-90 минут при температуре 65°С. Результаты амплификации анализировали с помощью электрофореза продуктов реакции в 2% агарозном геле, при напряжености электрического поля 5 В/см, в течение 30 минут или при добавлении в реакцию 1х флюоресцирующего красителя «EvaGreen» в амплификаторе CFX, «BioRad» (США) в режиме реального времени.

Таблица 6 - Праймеры, использованные в работе при проведении амплификации SPA.

Название праймера Последовательность олигонуклеотидов 5' - 3'

Ecoli FrSL TTTATATAATATATAAAAGGTTGTTACAAAGG

Ecoli BvSL TTTATATAATATATAAACGACCTCGCCC

Ecoli Fr AGGTTGTTACAAAGG

Ecoli Bv CGACCTCGCCC

EBV_Fr GTCTCGCCGGACTATGGCCT

EBV_Bv TGTTCCAGCCACCCGCCATC

EBV_FrSL_AA TTTATATAATATATAAAGTCTCGCCGGACTATGGCCT

EBV_BvSL_AA TTTATATAATATATAAATGTTCCAGCCACCCGCCATC

EBV_FrSL_CC GGTATATAATATATACCGTCTCGCCGGACTATGGCCT

EBV_BvSL_CC GGTATATAATATATACCTGTTCCAGCCACCCGCCATC

Примечание - жирным шрифтом отмечены участки петель

2.8. Статистические методы обработки

Все экспермиенты проводили как минимум в трехкратном повторении повторении. Для

сравнения различий между экспериментом и негативным контролем использовался ^тест. Для сравнения различий между различными группами использовался дисперсионный анализ ANOVA с

последующими апостериорными тестами (Во^еггош). Все значения представлены как среднее значение ± SD. Значение р < 0,05 считалось статистически значимым.

Определение порога чувствительности проводили с применением методов аналитической химии: порог определяли посредством прибавления трехккратного значения стандартного отклонения к значению сигнала негативного контроля [168].

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Разработка и апробация колориметрических ДНК-наносенсоров для детекции

двухцепочечных фрагментов ДНК

Для определения патогенов, содержащих двухцепочечную ДНК, на месте оказания медицинской помощи, очень удобно применять методы изотермической амплификации такие, как LAMP и его производные. Эти методы позволяют, быстро и легко осуществлять диагностику, дают возможность работать даже с неочищенным образцами и обходиться без сложного оборудования для визуализации результатов анализа. Однако, несмотря на значительные преимущества, LAMP и его производные до сих пор не получили широкого распространения в медицинской практике в первую очередь из-за высокого уровня ложноположительных результатов, что связано с необходимостью использовать высокую концентрацию праймеров и особенностями полимераз, применяемых для изотермических тест-систем. Поэтому для обеспечения точности результатов амплификации требуется дополнительная тщательная проверка истинности результата. Важно, чтобы эта проверка также не требовала использования дополнительного оборудования, чтобы облегчить и ускорить процесс диагностики на месте оказания медицинской помощи.

Для дискриминации истинноположительных результатов была поставлена задача разработать колориметрические ДНК-наносенсоры, позволяющие детектировать целевой фрагмент дцДНК при низкой температуре [4]. Полученные сенсоры должны быть пригодны к использованию с видами изотермической амплификации, которые используют дцДНК в качестве источника нуклеиновых кислот, например, LAMP или SPA и имеют линейную зависимость накопления фрагмента. Ранее было проведено исследование, показывающее возможность дискриминации продукта мультиплексной реакции амплификации в смеси с помощью ДНК-наносенсоров [3,171].

В качестве модельного объекта для разработки диагностического подхода была выбрана кишечная палочка (E. coli). Для детекции был выбран консервативный и селективный для кишечной палочки участок гена malB 4246707-4246910.

На предварительном этапе работы, используя биоинформатическией алгоритмы «DinaMelt» и «mFold» (см. раздел 2.1), был разработан дизайн колометрического ДНК-наносенсора.

В качестве ДНК-переключателя наносенсор содержит колометрический G-квадруплексный кор, к которому добавлены четыре аналит связывающих фрагмента («руки»). Выбор четырёх рук был обусловлен, данными, полученными нами ранее в ходе разработки ДНК-наносенсоров для сложных РНК матриц. Было показано, что двух рук бывает недостаточно для высокой селективности. Поскольку дцДНК более сложный аналит для детекции чем РНК, то мы изначально разработали наносенсор содержащий четыре аналит-связывающих фрагмента. Для удержания вместе элементов наносенсоров и расплетения дцДНК, наносенсор помещён на ДНК-платформу (см. Рис 22).

Для сборки наносенсора были использованы олигонуклеотиды: Ecoli_T1, Ecoli_T2, Ecoli_F7, представленные в таблице 1.

А)

Б)

Рисунок 22 - Схема ДНК-наномашины А) по отношении к двуцепочечному продукту реакций E. coli: Т1 и f7 обозначают участок бинарного сенсора рядом с G-квадруплексом, дополнительные аналит-

связывающие элементы T2 находятся по краям конструкции; Б) места прикрепления аналит-связывающих элементов ДНК-наномашины к одноцепочечному продукту амплификации мишени: цветными линиями отмечены аналит-связывающие последовательности (цвет линий соответствует

цвету элементов нано-сенсора на Рис 22 А).

Далее была проанализирована возможность использования ДНК-наносенсора для детекции дцДНК полученной различными методами амплификации - ПЦР, LAMP, SPA. Для амплфикации использовали праймеры, к целевому фрагменту генома E. coli, представленные в таблицах 3, 5 и 6. Для LAMP использовали праймеры Ecoli_F3, Ecoli_B3, Ecoli_FIP и Ecoli_BIP (Таблица 5). Для амплификации фрагмента методом ПЦР использовали праймеры Ecoli_F3, Ecoli_B3 (Таблица 3). Для SPA использовали пару специфичных праймеров Ecoli_Fr, Ecoli_Bv, и пару праймеров Ecoli_FrSL и

Ecoli_BvSL с той же специфической последовательностью, но дополнительно содержащих петлевую последовательность TTTATATAATATATAAA (Таблица 6). Условия проведения реакций амплификации представлены в разделах 2.8.1, 2.8.3 и 2.8.4.

На рисунке 23 представлены результаты амплификации дцДНК, полученные с использованием различных методов. Размер амплифицированных фрагментов различался в зависимости от метода и используемых праймеров. Размер фрагмента, амплифицированного методом ПЦР, составлял примерно 200 п.н. Продукты амплификации, полученные методами SPA и LAMP, выявлялись в виде характерной для данных типов амплификации лесенки. Все полученные фрагменты содержали участок для узнавания полученной нами ДНК-наномашиной.

Затем продукты амплификации, полученные различными методами, были протестированы на способность взаимодействия с ДНК-наносенсором. Анализ проводили при комнатной температуре (см. Рис. 24А), а также после предварительного нагрева ДНК-наносенсора и продукта амплификации в одной пробирке до 95 °С, с последующим охлаждением до комнатной температуры - ко-денатурации (см. Рис. 24Б). Такой подход позволяет разрушить вторичные структуры, денатурировать ДНК и создать прочные комплексы между аналитом и ДНК-наносенсором. Применение этого подхода позволяет выявить продукт с использованием сенсоров даже в случаях, когда ДНК-наносенсор не работает при заданных для него температурных условиях, в данном случае при комнатной температуре.

Об эффективности наносенсора судили по изменению окраски реакционной смеси в контрольном и опытных образцах, которую оценивали с помощью спектрофотометрии при длине волны 500 нм. Была измерена оптическая плотность опытных и контрольлных образцов, после чего проведён рассчёт отношений оптической плотности у опытных образцов (S) к оптической плотности контрольного образца - фоновый сигнал (B).

ГЦ с S 1500

■ Е — 300

200 100

spa+ spa- lamp+ lamp- пцр+ пцр-

1 2 3 4 5 6 M

Рисунок 23 - Анализ продуктов ДНК-амплификации E. coli различными методами. 1 -продукт полученный при помощи амплификации методом SPA, 2 -отрицательный контроль для метода SPA, 3 - продукт полученный при помощи амплификации методом LAMP, 4 -отрицательный контроль для метода LAMP, 5 - продукт полученный при помощи ПЦР, 6 -отрицательный контроль для ПЦР, M - Маркер веса 100 bp +, ООО «Евроген». 2% Агарозный гель.

Б)

0,9 0,8 -?0,7

я

QJ

То ,6

(J

о

и „

н о 5

О '

с и

¡03

и

О 0,2

0,1 О

А)

1,4 12

*

I-1

*

I-1

*** I-1

пцр LAMP

положительный отрицательный И контроль • контроль

SPA

| 1

■в н и

¡0,8

о

5

с

3 0,6

и о о г

Р 0 4

н vr*

с

О

0,2 -I

*** I-1

* * * I-1

*** I-1

ПЦР LAMP

положительный отрицательный контроль И контроль

SPA

Рисунок 24 - Анализ эффективности определения продуктов амплификации методами ПЦР, LAMP и SPA при помощи ДНК-наномашин. В экспериментальные пробирки добавлено по 300 нг

ДНК, в негативных контролях вместо ДНК использован соответствующий объем воды. Спектрофотометрический анализ происходил при длине волны 500 нм после 5 минут инкубации. Результаты, полученны в ходе не менее чем трех независимых измерений. На графиках показаны

планки, отражающие среднеквадратическоее отклонение среднего значения. А) Приведены результаты спектрометриического анализа, ДНК-продуктов, полученных различными методами

амплификации и детектированных с использованием ДНК-наномашин при комнатной температуре.

Б) Результаты спектрометриического анализа полученные после предварительной ко-денатурации аналита с фрагментами ДНК-наномашины. Представлены средние значения трех независимых измерений с одним стандартным отклонением. *: значение р > 0,05, ***: значение p < 0,001.

Как видно из данных, представленных на рисунке 24Б ко-денатурация позволяет расплести вторичные структуры ДНК. Таким образом, все использованные нами методы амплификации позволяют получить продукт, который может быть детектирован с помощью, разработанной нами наномашины. Отношение сигнала к фону для ДНК-наномашины был: S/Bpcr = 2,9, S/Blamp = 2,7, S/Bspa = 2,4, - что означает возможность идентификации всех продуктов амплификации. В то же время, только метод SPA продемонстрировал способность к детекции продуктов амплификации без предварительной денатурации, что подтверждается соотношением сигнал/фон SPA (S/Bspa) = 2,7 (см. Рис. 24А).

Для всех вариантов, где была показана детекция с использованием спектрофотометрии, также был обнаружен сигнал при визуальном анализе образцов, даже при использовании менее 100 геномных эквивалентов (ГЭ) E. coli [4].

Таким образом, разработанные нами ДНК-наносенсоры позволяют, эффективнно детектировать дцДНК, амплифицированную методом SPA. При этом ампликоны, полученные методом SPA можно детектировать при комнатной температуре, как методом спектрофотометрии, так и визуально. SPA может быть рекомендован для использования в качестве метода накопления образца для детекции с помощью ДНК-наносенсоров.

На следующем этапе работы была оценена возможность использования ДНК-наносенсоров для детекции одновременно нескольких продуктов амплификации в одной пробирке (биплексная амплификация), получнных методом SPA.

В качестве объекта исследования использовали вирус Эпштейна-Барр (EBV), для детекции которого была разработана колометрическая ДНК-наномашина. Полученная наномашина сходна по схеме с ДНК-наномашиной, разработанной для детекции E. coli. В качестве каталитического центра она также содержит G-квадруплекс, к которому добавлены четыре «руки», конструкция помещена на двухцепочечную ДНК-платформу (см. Рис 22A).

Для сборки наносенсора были использованы олигонуклеотиды: EBV_T1, EBV_T2, EBV_f7, представленные в таблице 2. Для апмплификации участка вируса EBV методом SPA были разработаны 2 комплекта праймеров представленные в таблице 7. Праймеры были разработаны в соответствии с предложениями авторов метода SPA [35], которые рекомендовали добавлять бинуклеотиды АА и СС на концевые участки праймеров, формирующих петли.

Первый комплект содержал праймеры специфичные для детекции EBV (EBV_Fr и EBV_Bv) и петлевые праймеры (EBV_FrSL_AA и EBV_BvSL_AA), содержащие помимо специфичного участка последовательность TTTATATAATATATAAA с бинуклеотидами ТТ и АА на концах. Аналогичную петлевую последовательность с бинуклеотидами ТТ и АА на концах содержали и праймеры для амплификации E. coli методом SPA (см. таблицу 6). Второй комплект праймеров был аналогичен

первому, но петлевые праймеры содержали на концевых участках петель вместо ТТ и АА -бинуклеотиды GG и СС (GGTATATAATATATACC).

Продукты амплификации, полученные методом SPA с использованием обоих комплектов праймеров содержали фрагмент для узнавания ДНК-наномашиной и имели одинаковый размер, что видно по результатам гельэлектрофореза (см. Рис. 25А). В отрицательных контролях вместо ДНК вируса EBV использовали соответствующий объём стерильной воды, не содержащей нуклеаз. Эффективность ДНК-наномашин к ампликонам EBV была продемонстрирована колориметрически и с помощью спектрофотометрии (см. Рис. 25Б).

Для исследования возможности проведения биплексной амплификации с использованием метода SPA (одновременной амплификации фрагментов E. coli и EBV) был использован комплект праймеров для амплификации E. coli, содержащий петлевые праймеры с бинуклеотидами АА на концах петель. Также был использован один из комплектов праймеров для амплификации EBV, содержащий петлевые праймеры с бинуклеотидами АА или СС на концах петель. Результаты проведения биплексной реакции представлены на рисунке 26. Как видно из рисунка, применение петлевых праймеров с одинаковыми бинуклеотидами на концах (АА на праймерах для амплификации E. coli и EBV) или разными (АА на праймере для E. coli и СС на праймере для EBV) приводит к различным результатам. При совпадении бинуклеотидов на концах петель (АА для EBV и E. coli) на агарозном геле наблюдается размытое пятно - и отсутствет характерный паттерн продуктов реакции. В случае несовпадения бинуклеотидов (СС для EBV и АА для E. coli) продукт образует четкий лестничный паттерн при визуализации в 2 % агарозном геле.

Далее для детекции продуктов амплификации мы использовали разработанные нами колориметрические ДНК-наномашины. Для анализа использовали по 1 мкл каждого из продуктов амплификации, представленных на рисунке 27. При детекции целевой ДНК с помощью ДНК-наномашин, продукт амплификации добавляли последовательно: сначала в пробирку к одной ДНК-наномашине, затем к другой. Анализ в синглплексном формате был обусловлен тем, что обе наномашины (для EBV, и E. coli) производят одинаковые цветовые реакции неотличимые в одной пробирке. Использование ДНК-наномашин к двум мишеням в одной пробирке не позволило бы определить какая из ДНК-наномашин

А)

м

АА Отр. контроль С С Отр. контроль амплнк к реакции с амилик к реакции с

он

АА праймерами

он

СС

праймерами

Продукт положительной реакции

В

Продукт отрицательной реакции

амллнкон

Рисунок 25 - Демонстрация возможности совместного применения метода SPA и ДНК-наномашины для детекции вируса Эпштейна-Барр с использованием двух вариантов петлевых праймеров. А) Результат амплификации продуктов EBV при помощи метода SPA, с использованием

петлевых праймеров содержащих бинуклеотиды АА или СС на концах петель. М - маркер молекулярных весов 50 Ьр+, ООО «Евроген». 2% агарозный гель. Б) Результаты анализа ампликонов вируса EBV, полученных с использованием метода SPA, при помощи колометрической ДНК-наномашины. Графики демонстрируют результаты спектрометриического анализа опытных и контрольных образцов. Результаты, получены в ходе не менее чем трех независимых измерений. Планки, на графиках отражают среднеквадратическое отклонение от среднего значения. В микропробирках представлены результаты визуального анализа опытных и контрольных образцов.

АА-ампликоны - ампликоны полученные с использованием петлевых праймеров, содержащих на концах петель бинуклеотид АА. СС-ампликоны - ампликоны полученные с использованием петлевых

праймеров, содержащих на концах петель бинуклеотид СС. В опыте в каждую пробирку с ДНК-наномашиной добавляли по 1 мкл продукта положительной реакции амплификации. Для негативного контроля использовали продукт отрицательной амплификации. Представлены средние значения трех независимых измерений с одним стандартным отклонением. ***: значение р < 0,001.

На рисунке 27А можно заметить, что обе ДНК-наномашины (для EBV, и E. coli) продуцируют детектируемый сигнал только при использовании амплификатов, содержащих на концах петлевых праймеров несовпадающие бинуклеотиды (СС для EBV и АА для E. coli). В этом же случае амплификаты образуют четкий лестничный паттерн в агарозном геле. В случае использования амплификатов, содержащих на концах петлевых праймеров совпадающие бинуклеотиды АА (для EBV и E. coli), (см. Рис. 27Б) сигнал не отличался от негативного контроля.

М 1 - 2 - Отр.

АА/АА контроль

амплик для АА/АА

оны ампликонов

3 - 4 - Отр. АА/СС контроль амплик для АА/СС оны ампликоно в

Рисунок 26 - Результат биплексной амплификации методом SPA фрагментов ДНК вируса Эпштейна-Барра и бактерии E. coli, с использованием петлевых праймеров содержащих бинуклеотиды АА или СС на концах петель. М - маркер молекулярных весов 50 bp+, ООО «Евроген». Дорожки 1 и 2 результат амплификации EBV и E. coli и отрицательный контроль проведённые с использованием петлевых прайдгсров. содержащих на концах одинаковые бинуклеотид^^ АА (для EBV и Е. coli). Дорожки 3 и 4 результаты амплификации EBV и Е. coli и отрицательный контроль проведённые с использованием петлевых праймеров, содержащих на концах различные бинуклеотиды СС (для EBV) и АА (для E.

coli). 2% Агарозный гель.

А)

Б)

Рисунок 27 - Анализ эффективности применения колориметрических ДНК-наномашин для детекции продуктов амплификации вируса Эпштейна-Барра и E. coli полученных с использованием

метода SPA в одной пробирке. (А) Анализ результатов биплексной амплификации полученных с использованием петлевых праймеров, содержащих на концах несовпадающие бинуклеотиды (АА для

и E. coli и СС для EBV). (Б) Анализ результатов биплексной амплификации полученных с использованием петлевых праймеров содержащих на концах петлевых совпадающие бинуклеотиды АА (для E. coli и EBV). Графики демонстрируют результаты спектрометриического анализа опытных и контрольных образцов (через 5 минут после начала инкубации). Результаты, получены в ходе не менее чем трех независимых измерений. Планки, на графиках отражают среднеквадратическое отклонение от среднего значения. В микропробирках представлены результаты визуального анализа опытных и контрольных образцов. В опыте в каждую пробирку с ДНК-наномашиной добавляли по 1 мкл амплификата. Для контроля использовали такое же количество продукта негативного контроля амплификации. Представлены средние значения трех независимых измерений с одним стандартным отклонением. *: значение р > 0,05, ***: значение p < 0,001.

Таким образом, изменение бинуклеотидов на концевых участках петлевых праймеров оказывает влияние на формирование цепей с фрагментами аналита в процессе амплификации методом SPA. Разнообразие вариантов концевых участков праймеров позволяет создавать биплексные реакции амплификации, продукты которых могут быть точно определены с помощью колориметрических ДНК-наномашин к каждому из исследуемых фрагментов, амплифицированных при помощи SPA.

Один из существенных недостатков изотермических петлевых методов амплификации, таких как LAMP, SPA и другие, заключается в высокой вероятности ложноположительных результатов. Они могут возникать, вследствие неспецифического связывания праймеров, используемых в процессе анализа. Как правило это связано с тем, что при хранении при комнатной температуре вероятность образования димеров праймеров увеличивается, из-за остаточной активности полимеразы, если она не модифицирована для использования по типу «горячего старта». Мы

предположили, что ДНК-наномашины могут помочь выявить ложноположительны результаты, возникающие при использовании метода SPA. Для того чтобы проверить наше предположение мы амплифицировали фрагмент ДНК E. coli при помощи метода SPA, а также поставлили контрольную реакцию, в которую добавили все комоненты и реагенты за исключением ДНК (негативный контроль). Опытную и контрольную реакции инкубировали при комнатной температуре в течение ночи и 15 минут. После этого мы проанализировали пробы при помощи электрофореза в 2% агарозном геле, а также при помощи, полученной нами ДНК-наномашины. Вариант проверки результатов амплификации, полученных при помощи методов типа LAMP, методом длительной инкубации при низкой температуре перед нагреванием до температуры реакции является стандартным способом проверки стабильности реакций при хранении во время разработки тест-систем для диагностики.

Как видно из данных представленных на рисунке 28 после инкубации контрольного образца (не содержащего ДНК E. coli) в течение ночи при комнатной температуре, на 2% агарозном геле действительно видны продукты реакции амплификации, в виде лесенки образованные из праймеров-димеров, которые визуально сложно отличить от истинноположительных результатов при анализе продуктов реакции гель-электрофорезом (Рисунок 28А). В тоже время при использовании ДНК-наномашины, сигнал, детектированный методом спектрофотометрии, а также визуально позволил различить истиные и ложноположительные результаты. Это свидетельствует о том, что ДНК-наномашина за счёт «чувствительных рук», распознаёт аналит и не распознаёт димеры праймеров. Таким образом полученные нами данные продемонстрировали, что ДНК-наномашины высокоселективны по отношению к продуктам реакции и могут быть использованы для подтверждения истинноположительных результатов (Рис. 28Б). Результаты могут быть оценены как с помощью спектрофотометрии, так и визуально.

А)

150 100

50

М

1 2

Образцы, которые инкубировали в течение ночи

Образцы, которые были собраны перед реакцией

Истин неположительный и истиннонегативный образцы

Истинноположительнмй и ложе 1 о положите л ы 1ып образць i

Рисунок 28 - Оценка эффективности ДНК-наномашин в выявлении ложноположительных результатов полученных SPA. А) Электрофореграмма демонстрирующая результы амплификации фрагмента Е. coli методом SPA. Компоненты реакций амплификации 1 и 2 инкубировали при комнатной температуре в течение ночи. Компоненты реакций амплификации 3 и 4 инкубировали при комнатной температуре в течение 15 минут. На дорожках 1 и 3 представлены истиноположительные продукты амплификации. На дорожках 2 и 4 представлены ложноположительные результате (образцы содержали все необходимые компоненты за исключением ДНК Е. coli). М - маркер молекулярных весов 50 Ьр+, ООО «Евроген». 2% агарозный гель. Б) Анализ истиных и ложноположительных продуктов амплификации при помощи ДНК-наномашин. Графики демонстрируют результаты спектрометриического анализа опытных и контрольных образцов (через 5

минут после начала инкубации). Результаты, получены в ходе не менее чем трех независимых измерений. Планки, на графиках отражают среднеквадратическое отклонение от среднего значения.

В микропробирках представлены результаты визуального анализа опытных и контрольных образцов. В опыте в каждую пробирку с ДНК-наномашиной добавляли по 1 мкл амплификата. Для контроля использовали такое же количество продукта негативного контроля амплификации. Представлены средние значения трех независимых измерений с одним стандартным отклонением. ***: значение p <

0,001.

Таким образом, мы впервые продемонстрировали эффективность использования ДНК-наномашин для детекции двуцепочечных продуков амплификации, полеченных методом SPA, с высокой чувстительностью и селективностью, при комнатной температуре. Данная технология позволила надёжно различать истинные и ложноположительные результаты амплификации. Была также успешно создана биплексная система детекции, объединяющая метод SPA и синглплексное распознавание ДНК с применением колориметрических пероксидазных ДНК-наносенсоров. Для работы данной системы необходимо использование различных комбинаций нуклеотидов на концевых участках петлевых праймеров. В перспективе можно рассмотреть применение комбинации метода SPA и ДНК-наномашин для высокоточного определения наличия патогенов, включая возможность визуального определения по изменению окраски образцов.

3.2 Разработка флуоресцентных ДНК-наносенсоров для детекции длинных фрагментов ДНК и

выявления однонуклеотидных замен в них

Вторая задача данной работы [5] состояла в разработке РНК-расщепляющего ДНКзимного ДНК-наносенсора с дезоксирибозимным ядром, способного детектировать длинные фрагменты дцДНК (~1400 п.н.), а также при необходимости выявлять в них однонуклеотидные замены.

В качестве объекта для исследования мы выбрали дигаплоидный ячмень Hordeum vulgare. Была поставлена практическая задача, разработать флуоресцентную ДНК-наномашину, для генотипирования устойчивости ячменя к микоинфекции Pyrenophora teres f. teres. Ранее было показано, что устойчивость ячменя к данной микоинфекции связана с однонуклеотидной заменой в биаллельном локусе JHI-Hv50k-2016-166356 [172]. Для анализа использовались отдельные клоны ячменя (№1-15) гомозиготные по локусу. Клоны №1-5 несут тимидин в интересующем локусе. Клоны №№6-15 несут гуанин в интересующем локусе. Стоит также отметить, что участок интереса мультиплецирован в геноме ячменя, указанная последовательность находится на второй, третьей и пятой хромосомах, при этом устойчивость к микоинфекции обеспечивает только локус, находящийся на третьей хромосоме. Участок интереса имеет длину примерно 1400 п.н.

Для детекции данного фрагмента была спроектирована ДНК-наномашина, представленная на рисунке 29А. ДНК-наномашина состоит из четырёх расплетающих аналит-связывающих фрагментов и платформы, находящейся под реакционным кором. Центральная часть ДНК-наномашины используется в качестве бинарного сенсора. В качестве ядра для ДНК-сенсора использован флуоресцентный РНК-расщепляющий ДНКзим. Флуоресцентный зонд - F-sub, используемый для детекции несёт метку FAM и соответствующий ей гаситель флуоресценции BHQ1.

Перед применением проводили предварительную сборку ДНК-наномашины. Для этого нагревали эквимолярный раствор олигонуклеотидов 356_(Arm1-Arm4 (Tilel) и 356_Arm3 (Tile2) см. таблицу 2), содержащих участки, формирующие ДНК-платформу.

Эффективность сборки ДНК-наномашины подтверждали методом электрофореза в полиакриламидном геле (см. Рис. 30Б). Как видно из данных, представленных на рисунке, полоса с предсобранным фрагментом заметно отличается по молекулярному весу от каждого из составляющих ее олигонуклеотидов.

Стоит отметить, что предварительная сборка для РНК-расщепляющих ДНКзимных ДНК-наномашин требуется в связи с тем, что они применяются в более низких концентрациях, чем ДНК-наносенсоры с G-квадруплексами. Для ДНК-наносенсоров на основе ДНКзимов требуется менее 20 нМ каждого из элементов (см. раздел 2.4). Для сравнения для ДНК-наносенсоров с G-квадруплексом требуется конечная концентрация в 1 мкМ (см. раздел 2.3).

Перед анализом интересующий нас участок геномной ДНК ячменя, находящийся на третьей хромосоме, амплифицировали методом ПЦР (Рис. 29). Для амплификации использовали праймеры 356_forward и 356_reverse, представленные в таблице 3. Праймеры подбирали таким образом, чтобы был амплифицирован только интересующий нас фрагмент ДНК, ассоциированный с устойчивостью к микоинфекции. Минимальная длина фрагмента, который может быть, амплифицирован с помощью уникальных праймеров, составила 1348 п.н. Получение более короткого фрагмента с интересующей нас заменой было возможно только с помощью метода вложенной ПЦР.

Результаты амплификации, содержащие интересующий нас фрагмента ДНК ячменя представлены на рисунке 30.

А)

Б)

Рисунок 29 - ДНК-наномашина, содержащая РНК-расщепляющий ДНКзимный сенсор, для детекции фрагмента дигаплоиного ячменя размером 1348 п.н. Фрагмент интереса находится в локусе JHI-Hv50k-2016-166356 на хромосоме III. A) Принципиальная схема. ДНК-наномашина собрана из трёх олигонуклеотидов представленных в таблице 2 (356_Arm1-Arm4 (Tilel), (356_Arm3 (Tile2) и 356_G4 (Dza)). Черным цветом обозначена ДНК-платформа, В центре находится РНК-расщепляющие ДНКзим, рядом с которым находятся аналит-связывающие элементы - «руки» (Дза и Дзб). По краям конструкции находятся дополнительные аналит-связывающие элементы («рука» 3 и «рука» 4). Кроме того, имеется две руки для связывания флуоресцентного зонда (F-sub). Флуоресцентный зонд несёт

метку FAM и гаситель флуоресценции BHQ1. Б) Электрофорез в полиакриламидном геле, подтверждающий сборку ДНК-наномашины. 1 - собранная ДНК-наномашина 2 - олигонуклеотид (356_Arm1-Arm4 (Tilel)), 3 - олигонуклеотид (356_Arm3 (Tile2))

Рисунок 30 - Электрофореграмма, отражающая результаты амплификации фрагмента ДНК ячменя. Lad - маркер молекулярных весов 50+Ьр, ООО «Евроген» (Россия); NC - негативный контроль (содержит воду вместо ДНК-матрицы), 1-10 образцы ДНК, полученные путём ПЦР. В качестве источника для амплификации использована геномная ДНК ячменя из отдельных растений. На электрофореграмме красной стрелкой указана полоса маркерной ДНК, соответствующая 1500 п.н. 1% агарозный гель.

В отличие от колориметрических ДНК-наносенсоров, РНК-расщепляющие ДНКзимные сенсоры требуют дополнительной проверки оптимального соотношения олигонуклеотидов, из которых состоит реакционный центр (Рис. 31). В этой связи, перед анализом амплифицированного фрагмента при помощи ДНК-наномашины была проведена оценка оптимальных соотношений в пределах от 5 до 20 нМ каждого из олигонуклеотидных фрагментов - предсобранной конструкции и олигонуклеотида, содержащего аналит-связывающий фрагмент Агт2 - 356_С4 (см. Таблицу 2). То есть, к предсобранной ДНК-наномашине (состоящей из олигонуклеотидов 356_Агт1-Агт4 (ТПс 1) и 356_АгтЗ (Тйе2)) добавляли, олигонуклеотид 356_С4 (Бга) и флуоресцентный субстрат. Для проверки соотношений в качестве аналита использовании 1 нМ синтетической оцДНК (соответствующей анализируемому ампликону ячменя размером 1348 п.н., содержащему нуклеотид в в исследуемом локусе).

в

о

-е-

ы я

ч «

в —

в

w ш В

в

э

о в

н

о

Оценка оптимального соотношения аналит-связывающих фрагментов формирующих каталитическое ядро

■ 1 hour ■ 3 hours

6.0 5.5 5.0 4.5 А 4.0 -3.5 -3.0 -2.5 -2.0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0

п|

1

1

1

1

I

1

I

ч-

JsP О? ** О? ** О? О? О? ^ ч^ ^ ч^

^ .Л Х .л* Х .л* ^ .л* ^ .Л ^

V

#

V

/

У

Рисунок 31 - Зависимость флуоресценции ДНК-наномашины при различных добавленных соотношениях рук, составляющих реакционный центр Графики демонстрируют интенсивность флуоресцентного сигнала, измеренного при длине волны возбуждения 480 нм и эмиссии при 525 нм

спустя 1 и 3 часа инкубации при 55° С. Концентрация добаленных фрагментов, формирующих каталитическое ядро, указана в наномолях в виде дроби в подписи столбцов. В каждую пробирку с ДНК-наномашиной добавляли по 1 нМ комплементарного синтетического оцДНК аналита (+Ап). Результаты, получены в ходе не менее чем трех независимых измерений. Планки, на графиках отражают среднеквадратическое отклонение от среднего значения.

Детекцию оцДНК-аналита с использованием ДНК-наномашины проводили методом флуорометрии при длинах волн, соответствющих флуорофору БАМ (длина возбуждения 480 нм и длина эмиссии 525 нм) (см. раздел 2.4).

Исходя из полученных результатов (Рис. 31), для дальнейшей работы с продуктами ПЦР было выбрано соотношение олигонуклеотидов 20 нМ : 20 нМ. При даном соотношении удалось детектировать 1 нМ аналита - оцДНК. При этих концентрациях олигонуклеотидов отношение флуоресцентного сигнала в опыте, содержащими компоненты ДНК-наномашины и контроле (фоновое свечение без компонентов ДНК-наномашины) было менее 1,5. Это отношение указывает на низкую вероятность спонтаннного разрушения флуоресцентного зонда в отсутствие компонентов машины (см раздел 2.4). В то же время уровень сигнала в присутствии аналита высок уже в течение часа, а разброс значений невысок.

А)

Предел обнаружения синтетического фрагмента с помощью бинарного ДНК-наносенсора

Концентрация синтетической оцДНК, пМ

Предел обнаружения синтетического фрагмента с помощью ДНК-наномашины

5000

4500

| 4000 х

я 3500 «

о 3000

£

К

«

X

л

ч

н

Ё 1000 о

500

2500 2000 1500

0 100 200 300 400 500 600

Концентрация синтетической оцДНК, пМ

о 1 час А 3 часа

Уровень фонового шума _ . .Уровень фонового шума

для 1 часа инкубации для 3 часов инкубации

Рисунок 32 - Предел обнаружения комплементарного синтетического оцДНК с помощью (А) бинарного ДНК-наносенсора и (Б) ДНК-наномашины по каналу БАМ. Диапазон добавленной

концентрации аналита находится в пределах 2-600 пМ. Графики демонстрируют интенсивность флуоресцентного сигнала, измеренного при длине волны возбуждения 480 нм и эмиссии при 525 нм спустя 1 и 3 часа инкубации при 55° С. Результаты, получены в ходе не менее чем трех независимых измерений. Планки, на графиках отражают среднеквадратическое отклонение от среднего значения.

Предел обнаружения определялся как пересечение линейного участка зависимости накопления сигнала с уровнем трехкратного добавления стандартного отклонения относительно негативного контроля (синтетическая оцДНК не добавлялась в реакцию).

Одним из элементов характеризации ДНК-наномашин с РНК-разрезающим ДНКзимным кором является предел обнаружения при использовании синтетического оцДНК фрагмента (см раздел 2.4). Он был определен для ДНК-наномашины и для ее центральной части без платформы -бинарного ДНК-наносенсора (для этого использовали только олигонуклеотиды 356_Агт1-Агт4 (Тйе1), и 356_G4 (Dza)). Для бинарного ДНК-наносенсора он составил 76 пМ спустя 60 минут инкубации и 57 пМ спустя 180 минут инкубации. Для ДНК-наномашины предел обнаружения составил 127 пМ через 60 минут инкубации и 53 пМ через 180 минут (см. Рис. 32).

Несмотря на то, что бинарный сенсор продемонстрировал схожий предел обнаружения с ДНК-наномашиной при использовании короткого синтетического оцДНК фрагмента, бинарный сенсор оказался не эффективен для детекции дцДНК амплификат ячменя, в отличие от ДНК-наномашины.

Мы показали, что при добавлении в пробирку 2,5 мкл реакционной ПЦР-смеси, ДНК-наномашина способна определить наличие полностью комплиментарного фрагмента с отношением сигнала к фону около 1,6. Также наномашина позволяет различить полностью комплиментарные последовательности от последовательностей несущих однонуклеотидную замену (фактор селективности (опеределение фактора селективности описано в 2.4) составлял 75 % после 1 часа инкубации реакционной смеси и 64 % после 3 часов инкубации) (см. Рис. 33). Как видно из данных, представленных на рисунке 33, сигнал ДНК-наномашины коррелирует с информацией о наличии гуанина в исследуемом локусе, ранее полученной путем секвенирования. Таким образом, это первый пример детекции настолько длинного фрагмента дцДНК.

Детекция длинного ампликона ДНК-наномашиной

ч о«

к 13

я

X

а>

я

и о« а.

о

^

-8-

ся ев X Л

п

а> н 13 и о X н

о

6000

5000

4000

3000

2000

1000

1 час

3 часа

Рисунок 33 - Детекция амликонов ячменя размером 1348 п.н. при помощи ДНК-наномашины. Графики демонстрируют интенсивность флуоресцентного сигнала, измеренного при длине волны возбуждения 480 нм и эмиссии при 525 нм спустя 1 и 3 часа инкубации при 55° С. Номерами 1-10 обозначена интенсивность флуоресценции ампликонов, полученых из геномной ДНК различных растений ячменя (несущих и не несущих однонуклеотидные замены в исследуемом локусе). Р-эиЬ обозначает интенсивность флуоресценции реакционной смеси, содержащей только флуоресцентный зонд; оцДНК показывает вариант детекции синтетической оцДНК ДНК-наномашиной. НКтр -негативный контроль без добавленного аналита. Результаты, получены в ходе не менее чем трех

независимых измерений. Планки, на графиках отражают среднеквадратическое отклонение от среднего значения. В каждую пробирку с ДНК-наномашиной добавляли по 2,5 мкл реакционной смеси. Представлены средние значения трех независимых измерений с одним стандартным отклонением. **: р < 0,05, ***: значение р < 0,001.

На основании ранее полученных нами данных, мы предположили, что использование более короткого фрагмента, содержащего искомую однонуклеотидную замену, позволит повысить селективность ДНК-наномашины. Для проверки данного предположения мы провели вложенную ПЦР с помощью дополнительного комплекта праймеров 3 5 6_1о г\\агсМ п п с г и 3 5 6_гс \с п пс г (см. Таблицу 3) и амплифицировали фрагмент геномной ДНК ячменя длинной 148 п.н., содержащий интересующую нас однонуклеотидную замену (см. Рис. 34).

Рисунок 34 - Анализ продуктов ПЦР на матрице геномной ДНК ячменя, методом электрофореза в полиакриламидном геле. NC - негативный контроль, 1, 2, 6 - 10 ампликоны (размером 148 п.н.), полученные на геномной ДНК различных растений, справа маркер молекулярных весов, Ultra Low Range, Thermo Fisher Scientific (Германия). Красными стрелками

указан размер бендов ДНК-маркера в п.н.

Далее для детекции анализируемого фрагмента ДНК, мы использовали разработанную нами ДНК-наномашину. Как видно из данных, представленных на рисунке 35, укорочение исследуемого аналита днйствительно позволило достичь более высокого фактора селективности в 66% уже после 60 минут инкубации. Более продолжительная инкубация (3 часа) позволяет достичь селективности в 80%.

Таким образом, полученные в работе результаты показывают, что длинные амплифицированные фрагменты могут быть использованы в качестве исследуемого образца. В длинных фрагментах могут быть опредеелны однонуклеотидные замены. Продукты амплификации могут быть использованы спустя значительное время. Использование для детекции более короткого фрагмента повышает эффективность ДНК-наносенсора, хотя и не значительно.

Детекция короткого ампликона ДНК-наномашиной

& 5500 g 5000 | 4500 о 4000 "t 3500

И

S зооо

в 2500 и

5 2000

О

1500 1000 500 0

£ ¿> # # ^ ^ ^ X<V

ч ^ ^

■ 1 hour 3 hours

Рисунок 35 - Детекция коротких амликонов ячменя размером 148 п.н. при помощи ДНК-наномашины. Графики демонстрируют интенсивность флуоресцентного сигнала, измеренного при

длине волны возбуждения 480 нм и эмиссии при 525 нм спустя 1 и 3 часа инкубации при 55° С. Номерами 1,2, 11, 12, 13, 15 обозначена интенсивность флуоресценции ампликонов, полученых при помощи метода вложенной ПЦР из геномной ДНК различных растений ячменя (несущих и не несущих однонуклеотидные замены в исследуемом локусе). №1+12 обозначает присутствие в пробирке одновременно двух коротких ампликонов. Fam/Cy обозначает интенсивность флуоресценции реакционной смеси, содержащей только флуоресцентный зонд; AnalyteG и AnalyteT -ДНК-наномашины адаптированные для детекции различные однонуклеотидных замен - G или Т соответственно в последовательности синтетического фрагмента оцДНК, содержащего G в исследуемом локусе. Результаты, получены в ходе не менее чем трех независимых измерений. Планки, на графиках отражают среднеквадратическое отклонение от среднего значения. В каждую пробирку с ДНК-наномашиной добавляли по 2,5 мкл реакционной смеси. Представлены средние значения трех независимых измерений с одним стандартным отклонением. ***: значение р < 0,001.

3.3 Использование системы флуоресцентных ДНК-наносенсоров для детекции аллель-зависимых мутаций в длинных и коротких ампликонах

В разделе 3.2 была продемонстрирована возможность использования ДНК-наносенсоров для определения биаллельных комбинаций в геноме. Однако точность определения сигнала у гетерозигот - «смешанных по сигналу» -только одним сенсором оказалась крайне затруднительной и неточной.

Чтобы избежать неоднозначности при анализе гетерозигот нами, была создана дополнительная ДНК-наномашина, в которой вместо олигонуклеотида 356_G4 (Dza) был использован олигонуклеатид 356_T4 (Dza) [5]. Данные олигонуклеотиды отличаются, однонуклеотидной заменой (вместо G содержат T) в последовательности, формирующей «руку» Dza, кроме того, они содержат разные фрагменты для распознавания флуоресцентных субстатов. Соответственно, наномашины созданные на основе олигонуклеотидов 356_G4 (Dza) и 356_T4 (Dza), отличаются тем, какой субстрат, распознают наномашины и флуорофором, который связан с олигонуклеотидам - исходный 356_G4 (Dza) несет флюорофор FAM и гаситель BHQ1, а олигонуклеотид 356_T4 (Dza) флюорофор Су5 и гаситель BHQ2 (см. Рис 36).

Далее короткий ПЦР фрагмент (размером 148 п.н.), полученный с использованием геномой ДНК гетерозиготных (Т/G) или гомозиготных (Т/Т и G/G) растений ячменя добавляли к двум указанным выше ДНК-наномашинам, и анализировали при помощи флуорометрии при длине волны 480/525 нм (для анализа конструкций содержащий флуоресцентный краситель FAM) и 617/662 нм (для анализа конструкций содержащий флуоресцентный краситель Су5). В зависомости от наличия сигнала от одного или сразу от двух каналов флуоресценции, можно было судить о присутствии в продукте амплификации того или иного аллельного варианта.

Hordeum vulgare третья хромосома

ОНЗ (ТИМиН) JHI-Hv50k-2018-1663« \_

Аналит-связывающиц*^ _ _ Элемент 4 ' 1

A)

А нал и т-с вязывакэщии

, элемент 1

тг

ОНЗ [гуанин) JHI-Hv50k-2 016-166 356

Hordeum vulgare третья хромосома ^

Аналит-связывающим А дДб f дза Аналит-^нязывающии

элемент 4 / \ (днКэиМнОе \ ™ент 1

Б)

/ \ \ ЯДРО У ■

■

L I

i I

* I

\ 4~

тг

Рисунок 36 - Схемы ДНК-наномашин с РНК-расщепляющим дезоксирибозимным ядром и четырьмя аналит-связывающими фрагментами, позволяющих различить различные гомозиготные и гетерозиготные растения ячменя с предварительной амплификацией целевого фрагмента размером 148 п.н. Отмечена локализация однонуклеотидной замены и различие в цвете флуорофора. А) ДНК-наносенсор для детекции фрагмента, несущего тимин. Б) ДНК-наносенсор для детекции фрагмента,

несущего гуанин.

ДНК-наносенор был дополнительно охарактеризован. Мы определили характерный для него предел обнаружения (Рис. 37). ДНК-наносенсор при детекции по каналу Су оказался более чувствителен: после часа инкубации ДНК-наносенсор достигает чувствительность 57 пМ против 121 пМ при использовании FAM канала и 55 пМ против 53 пМ, соответственно, спустя 3 часа.

о Я н О

Предел обнаружения синтетического фрагмента с помощью ДНК-наномашины

2500

ч:

^ Л"«:.-:.-а а я

:

а

! :

£ ч ■е

¡а :п::.::.

л

ч

:

н а

500

Я1 = 0,9978 1-—

хГ __________ ^-------- К' = 0,9937

-^¿^Йг^-________________ _ . ,_ . , _ .

—1—I—1—■—1—1—1—■—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1—1— 1 1 '-'-

100 200 300

Концентрация синтетической оцДНК, пМ

400

500

о 1 час ;

_ _ .Уровень фонового шума _ .

для 1 часа инкубации

3 часа Уровень фонового шума для 3 часов инкубации

Рисунок 37 — Предел обнаружения комплементарного синтетического оцДНК с помощью ДНК-наномашины по каналу Су. Диапазон использованной концентрации аналита находится в пределах 10-500 пМ. Графики демонстрируют интенсивность флуоресцентного сигнала, измеренного при длине волны возбуждения 617 нм и эмиссии при 662 нм спустя 1 и 3 часа инкубации при 55° С.

Результаты получены в ходе не менее чем трех независимых измерений. Планки, на графиках отражают среднеквадратическое отклонение от среднего значения. Предел обнаружения определялся

как пересечение линейного участка зависимости накопления сигнала с уровнем трехкратного добавления стандартного отклонения относительно негативного контроля (синтетическая оцДНК не

добавлялась в реакцию).

Результаты, представленные на рисунке 38, указывают на возможность создания биплексной системы с двумя различными флюорофорами для детекции гомо- и гетерозиготных организмов (Рис. 38). При использовании образцов от гетерозиготных особей можно мы зафиксировали сигнал по двум каналам и полное отсутствие сигнала по одному из каналов указывает на то, что исследуемый материал был получен от гомозиготы. Следует отметить, что выбранные флуорофоры демонстрировали различную интенсивность сигнала в абсолютных значениях. Тем не менее, при определении гетерозиготности по однонуклеотидных заменам, основным критерием является изменение уровня сигнала относительно негативного контроля для каждого флуорофора.

^ Ы1ПП

^ 5Г111и я

ц -кши

Ц пеню

о

¡4 ......

-е

я

«

X л

ч