Модификация биохимических методов оценки содержания фосфорорганических соединений в пробах сложного состава тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Прокофьева, Дарья Станиславовна

  • Прокофьева, Дарья Станиславовна
  • кандидат биологических науккандидат биологических наук
  • 2010, Санкт-Петербург
  • Специальность ВАК РФ03.01.04
  • Количество страниц 124
Прокофьева, Дарья Станиславовна. Модификация биохимических методов оценки содержания фосфорорганических соединений в пробах сложного состава: дис. кандидат биологических наук: 03.01.04 - Биохимия. Санкт-Петербург. 2010. 124 с.

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Прокофьева, Дарья Станиславовна

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ

АСПЕКТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОС (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. АХЭ: СТРУКТУРА, ЛОКАЛИЗАЦИЯ, ФУНКЦИИ

1.2. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ХОЛИНЭСТЕРАЗ

1.2.1. Биологический метод

1.2.2. Манометрический метод

1.2.3. Титриметрический метод (потенциометрическое титрование)

1.2.4. Электрометрический метод

1.2.5. Спектрофотометрические (колориметрические) методы, основанные на использовании рН индикаторов

1.2.6. Спектрофотометрические (колориметрические) методы, основанные на использовании специфических субстратов

1.2.7. Химический метод

1.2.8. Радиометрический метод

1.2.9. Обзор методов определения активности ХЭ: резюме

1.3. СОЗДАНИЕ ПЛАНШЕТНЫХ ВАРИАНТОВ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АХЭ

1.4. СОЗДАНИЕ ПЛАНШЕТНЫХ ВАРИАНТОВ МЕТОДОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ АХЭ, СОДЕРЖАЩЕЙСЯ

В ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЕ КЛЕТОК

1.5. ВОЗМОЖНОСТЬ ЗАМЕНЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ КЛЕТОЧНЫМИ ЛИНИЯМИ

1.6. ИСТОРИЯ СОЗДАНИЯ ФОС И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

1.7. МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФОС С АХЭ

1.8. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНЫХ

КОЛИЧЕСТВ ФОВ

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Планшетный вариант метода Эллмана

2.2 Планшетный вариант метода Хестрина

2.3 Исследование влияния примесей

2.4 Планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве источника АХЭ клеточной линии человеческой нейробластомы

2.5. Оценка цитотоксичности с помощью определения содержания

АТФ в клетках нейробластомы SH-SY5Y

2.6. Комплексное исследование проб с объекта УХО

2.7 Анализ продуктов гидролиза RVX методом ГХМС-ЭУ

2.7.1. Идентификация продуктов превращения RVX избыточным количеством воды в кислой среде

2.7.2. Идентификация продуктов превращения RVX эквимолярным количеством воды

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Химический анализ продуктов превращения ФОВ

3.2. Планшетные варианты биохимических методов

3.3. Изучение влияния продуктов гидролиза ФОВ на результаты биохимического анализа

3.4. Изучение влияния компонентов лакокрасочных покрытий на результаты биохимического анализа

3.5. Изучение влияния МЭА на результаты биохимического анализа

3.6. Изучение влияния перекиси водорода на результаты биохимического анализа

3.7. Изучение влияния меркаптанов на результаты биохимического анализа

3.8. Планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве источника АХЭ клеточной линии человеческой нейробластомы

3.9. Комплексный анализ проб с объекта УХО

3.9.1. Биохимический анализ

3.9.2. Анализ проб на цитотоксичность

Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биохимия», 03.01.04 шифр ВАК

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модификация биохимических методов оценки содержания фосфорорганических соединений в пробах сложного состава»

Актуальность проблемы

Известно, что на сегодняшний день в Российской Федерации остаются достаточно большие запасы химического оружия (ХО), в том числе зомана и RVX, относящихся к группе фосфорорганических отравляющих веществ (ФОВ). Согласно Конвенции по Химическому Разоружению 1993 года (вступившей в силу в апреле 1997 года) [Анон, 2005а] в РФ ведется непрерывная работа по их обезвреживанию на объектах уничтожения химического оружия (УХО). Обезвреживание ФОВ осуществляется с помощью различных дегазирующих растворов. В ходе этой работы необходимо вести непрерывный мониторинг остаточных количеств ФОВ на поверхностях технологического оборудования, в производственных сточных водах и объектах окружающей среды.

В Российской Федерации в качестве скриннинговых методов определения остаточных количеств ФОВ аттестованы и повсеместно применяются метод Эллмана и метод с бромтимоловым синим [Анон, 2004а, 20046, 2004в, 20056, 2005в, 2006а]. Однако очень часто компоненты дегазирующих растворов, продукты гидролиза ФОВ и другие примеси, мешают определению ФОВ указанными методами, что приводит к получению ложноположительных и, что особенно опасно, ложноотрицательных результатов, которые можно выявить только с помощью более специфического химического анализа. Однако химический анализ характеризуется гораздо более высоким пределом обнаружения по сравнению с биохимическим анализом, поэтому нет возможности проверять с его помощью все получаемые результаты. Кроме того, химический анализ не дешев. Для его проведения необходимо наличие дорогого высокопрецизионного оборудования и высококвалифицированного персонала. Для повышения специфичности более дешевого и простого в исполнении биохимического анализа необходимо установить точные границы применения уже существующих биохимических методов, то есть исследовать 6 их устойчивость к влиянию посторонних примесей. Затем по возможности расширить их границы или подобрать альтернативные методы, обладающие большей специфичностью и не уступающие в чувствительности аттестованным биохимическим методам.

К общим недостаткам аттестованных методов определения ФОВ можно отнести низкую специфичность, низкую производительность, большой расход реагентов, большой объем пробы необходимый для проведения анализа. Кроме того, данные методы не позволяют оценить опасность многокомпонентной пробы для человека. Метод с бромтимоловым синим [Wolfsie, Winter, 1954] был исключен нами из рассмотрения, поскольку кроме перечисленных выше недостатков для него характерны высокая трудозатратность и повышенная субъективность при оценке результатов анализа. В качестве альтернативы был выбран метод Хестрина [Hestrin, 1949], который по нашему суждению должен обладать наибольшей специфичностью при определении остаточных количеств ФОВ в пробах сложного состава. Для ускорения процесса биохимического анализа, снижения его стоимости и повышения производительности необходим перевод наиболее перспективных методов оценки антихолинэстеразной активности многокомпонентных проб на планшетный формат.

Помимо оценки антихолинэстеразной активности проб с объектов УХО, необходимо проводить оценку их токсичности, а затем опасности для человека. Традиционно это выполняют, проводя токсикологические эксперименты на гидробионтах [Саноцкий и др., 1986; Анон, 1998, 20076; Кокуричева и др., 2005], реже на теплокровных животных [Анон, 1980а, 19806, 2003], поскольку объем пробы всегда ограничен, а содержание ФОВ в пробе обычно не столь велико, чтобы привести к достоверному отличию показателей опытной и контрольной группы животных в острых опытах. Гидробионтов можно назвать специфичной тест-системой только применительно к оценке опасности для самих гидробионтов попадания отходов с предприятий УХО в водоемы. Экстраполяция полученных данных на человека крайне затруднительна. 7

Принципиально новым подходом в этой области могло бы стать использование в качестве тест-объектов клеточных культур, особенно человеческих клеточных линий [Tiffany-Castiglioni et al., 1999; Tiffany-Castiglioni et al., 2006]. Человеческая линия нейробластомы SH-SY5Y представляется нам уникальным объектом, позволяющим проводить определение цитотоксичности проб с объектов УХО параллельно с определением количества ФОБ в этих пробах модифицированным вариантом метода Эллмана, поскольку в плазматической мембране этих клеток довольно большое количество АХЭ [Ehrich et al., 1995]. Большинство ложных результатов, получаемых биохимическими методами, связано с непосредственным контактом компонентов исследуемой пробы с реагентами этих методов. Поскольку клетки нейробластомы являются адгезионными, добавление в анализ дополнительной процедуры отмывки клеток от исследуемых проб поможет значительно сократить количество ложных результатов.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключалась в поиске наиболее перспективных с точки зрения оценки остаточных количеств ФОВ биохимических методов определения активности ацетилхолинэстеразы (АХЭ), переводе этих методов на планшетный формат и установлении границ применения данных методов.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

1. Перевод методов Эллмана и Хестрина на планшетный формат, определение границ линейных диапазонов и пределов обнаружения методов для двух ФОВ: зомана и RVX.

2. Изучение причин возникновения ложноположительных и ложноотрицательных результатов биохимического анализа.

3. Моделирование ложноположительных и ложноотрицательных результатов с использованием известных веществ и с учетом особенностей состава проб с объектов УХО.

4. Поиск способов устранения ложных результатов биохимического анализа.

5. Перевод метода Эллмана на планшетный формат с использованием в качестве «носителя» АХЭ человеческой нейробластомы линии SH-SY5Y и его апробация на двух ФОВ: зомане и RVX.

Положения диссертации, выносимые па защиту

1. Планшетные варианты методов Эллмана и Хестрина, разработанные для оценки содержания ФОВ в водных растворах, не уступают в чувствительности традиционным методам, отличаются большей

• производительностью, меньшим расходом реагентов и объемом тестируемой пробы.

2. Основные продукты гидролиза ФОВ, МЭА, а также компоненты лакокрасочных покрытий не влияют на результаты биохимических методов в исследованном диапазоне концентраций.

3. Метод Хестрина более специфичен по сравнению с методом Эллмана при анализе проб, содержащих перекись водорода.

4. Метод Хестрина более селективен по сравнению с методом Эллмана при анализе проб, содержащих меркаптаны.

5. Планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве «носителя» АХЭ человеческой нейробластомы линии SH-SY5Y не уступает по чувствительности другим вариантам метода Эллмана.

Научная новизна работы

Для определения содержания ФОВ в пробах сложного состава впервые применен метод Хестрина. Разработанный планшетный вариант данного метода значительно превосходит разработанный планшетный вариант метода Эллмана по специфичности и селективности проводимого анализа, не уступая ему по чувствительности и по диапазону линейности. Впервые предложено использование клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y как для оценки содержания ФОВ в пробах сложного состава так и для определения их цитотоксичности.

Теоретическое и практическое значение работы

Разработка и аттестация новых методик выполнения измерений (МВИ) на основании полученных данных позволит сократить количество ложноположительных и ложноотрицательных результатов, получаемых биохимическими методами при анализе проб сложного состава, в частности проб с объектов УХО. Перевод существующих биохимических методов на планшетный формат повысит их производительность, а также снизит стоимость анализа. Кроме того, существенно уменьшится объем исследуемой пробы, который иногда является лимитирующим фактором при проведении анализа.

Использование клеток человеческой нейробластомы SH-SY5Y дня анализа многокомпонентных, проб позволяет оценивать не только содержание в них ФОВ планшетным вариантом метода Эллмана, но также их цитотоксичность. С помощью данной тест-системы возможно проведение исследований механизмов действия ФОВ, которые к настоящему моменту детально не изучены.

Апробация работы

Результаты исследований доложены на 12-й Международной конференции по химическому разоружению (CWD 2009, Стратфорд-на-Эйвоне), Международной конференции "рецепция и внутриклеточная сигнализация" (Пущино, 2009), 61-й Международной конференции и специализированной выставке аналитической химии, технологий, прикладной спектроскопии и смежных отраслей (PITTCON 2010, Орландо), 49-й Ежегодной токсикологической конференции и специализированной выставке (SOT 2010, Солт Лейк Сити), Съезде Аналитиков России "Аналитическая химия - новые методы и возможности" (Москва, 2010).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц и 25 рисунков. Состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, описания экспериментальной части и ее обсуждения, заключения, списка цитируемой литературы, который включает в себя 23 отечественных и 76 зарубежных источников.

Похожие диссертационные работы по специальности «Биохимия», 03.01.04 шифр ВАК

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Прокофьева, Дарья Станиславовна

выводы

1. Для оценки содержания ФОВ в водных растворах разработаны планшетные варианты методов Эллмана и Хестрина, которые не уступают по своим характеристикам традиционным методам, отличаются большей производительностью, меньшим объемом тестируемой пробы и расходом реагентов.

2. Ложноположительные и ложноотрицательные результаты биохимического анализа не связаны с наличием продуктов гидролиза ФОВ, МЭА, а также компонентов лакокрасочных покрытий в исследуемых пробах.

3. Присутствующая в анализируемом растворе перекись водорода влияет на результаты, получаемые по методу Эллмана, начиная с концентрации 40 мкМ. IC50 для перекиси водорода по методу Хестрина составляет 80 мМ, что почти на 2,5 порядка выше той же величины для метода Эллмана (325 мкМ).

4. Присутствие в исследуемых пробах меркаптанов в концентрациях, превышающих 10 мкМ, приводит к ложноотрицательным результатам по методу Эллмана. Ложноположительный эффект меркаптанов на метод Хестрина начинает проявляться с концентрации 10 мМ.

5. Для оценки содержания ФОВ в водных растворах разработан планшетный вариант метода Эллмана с использованием в качестве «носителя» АХЭ человеческой нейробластомы линии SH-SY5Y, которая может быть использована для оценки цитотоксичности проб сложного состава.

СПИСОК РАБОТ И ПУБЛИКАЦИЙ

В реферируемых журналах

Martynova M.G., Bystrova О.А., Shabelnikov S.V., Margulis B.A., Prokofjeva D.S. Hsp70 in the atrial neuroendocrine units of the snail, Achatina fulica II Cell Biology International. - 2007. - V.31. - №4. - P.413-419.

Краснов И.А., Гончаров H.B., Бабаков B.H., Глашкина Л.М., Ермолаева Е.Е., Дубровский Я.А., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Смолихина Т.И., Поляков Н.Б., Радилов А. С., Краснов Н.В. Изменения спектра производных фибринопептида в плазме крови при действии 0-изобутил-8-(2-диэтиламиноэтил) метилтиофосфоната // Научное приборостроние. — 2008. — Т. 18. - №4. - С.29-36.

Краснов И.А., Гончаров Н.В., Бабаков В.Н., Глашкина Л.М., Ермолаева Е.Е., Дубровский Я.А., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Смолихина Т.И., Поляков Н.Б., Радилов А.С., Краснов Н.В. Идентификация алкилированного аддукта сывороточного альбумина человека методами масс-спектрометрии // Научное приборостроние. - 2008. - Т. 18. - №4. - С.46-53.

Бабаков В.Н., Гончаров Н.В., Радилов А.С., Глашкина Л.М., Подольская Е.П., Ермолаева Е.Е., Шилов В.В., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Егоров Н.А. Новые подходы к раннему выявлению хронической интоксикации фосфорорганическими веществами у работников объектов уничтожения химического оружия. // Медицина труда и промышленная экология. - 2009. -№4. - С.26-29.

Прокофьева Д.С. Разработка и сравнительный анализ микропланшетных биохимических методов определения фосфорорганических отравляющих веществ на примере зомана // Токсикологический Вестник. — 2009. - №6. - С.39-46.

Goncharov N., D. Prokofieva, N. Voitenko, L. Gustyleva, E. Savelieva, A. Radilov, V. Babakov, E. Ermolaeva, N. Khlebnikova, Y. Pechenevsky and V. Rembovsky Elaboration of microplate spectroscopic method for biomonitoring of warfare organophosphates soman and Russian VX. // The Toxicologist. - 2010. - V.99. - #1. - P.397 (A1866).

Гончаров H.B., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Бабаков В.Н., Глашкина JI.M. Молекулярные механизмы холинергической регуляции и дисрегуляции // Токсикологический вестник.- 2010. - № 2. - С.5-10.

Бабаков В.Н., Подольская Е.П., Гончаров Н.В., Глашкина Л.М., Краснов И.А., Поляков Н.Б., Войтенко Н.Г., Прокофьева Д.С., Краснов Н.В., А.С. Радилов. Новые маркеры интоксикации фосфорорганическими соединениями в пептидной фракции плазмы крови крыс // Токсикологический вестник.- 2010. -№2.-С.31-38.

Прокофьева Д.С., Бабаков В.Н., Войтенко Н.Г., Гончаров Н.В. Определение токсичности фосфорорганических соединений на клетках нейробластомы линии SH-SY5Y // Биологические Мембраны. - 2010. - Т.27. - №3. - С. 1-4.

Материалы научных конференций

Краснов И.А., Прокофьева Д.С., Подольская Е.П., Гончаров Н.В., Бабаков В.Н., Глашкина Л.М., Поляков Н.Б., Радилов А.С., Краснов Н.В. Поиск вероятных маркеров интоксикации фосфорорганическими соединениями в плазме крыс // Бюллетень северного государственного медицинского университета. - 2008. - №1. - С.71.

Прокофьева Д.С., Бабаков В.Н., Войтенко Н.Г., Гончаров Н.В. Метод Эллмана в планшетном варианте с использованием нейробластомы линии SH-SY5Y как носителя ацетилхолинэстеразы // В сб.: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Труды международной конференции. — 2-4 июня 2009, Пущино. - С.722-727.

Бабаков В.Н., Прокофьева Д.С., Войтенко Н.Г., Подольская Е.П., Фатеенко В.Н., Ермолаева Е.Е., Радилов А.С., Гончаров Н.В. Влияние отравляющих веществ на активность ключевых внутриклеточных сигнальных систем в клетках нейробластомы человека SK-N-MC // В сб.: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Труды международной конференции. — 2-4 июня 2009, Пущино. - С.321-326.

Войтенко Н.Г., Глашкина JI.M., Прокофьева Д.С., Бабаков В.Н., Гончаров Н.В. N-ацетилирование: новые возможности старых методов // В сб.: «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Труды международной конференции. — 2-4 июня 2009, Пущино. - С.335-338.

Goncharov N.V., Prokofieva D.S., Glashkina L.M., Savelieva E.I., Koryagina N.L., Voitenko N.G., Dobrylko I.A., Ermolaeva E.E., Radilov A.S. Biochemical and cytotoxicity studies for developing a methodology of combined express analysis and risk assessment at chemical weapon destruction facilities // 12th International Chemical Weapons Demilitarisation Conference (CWD 2009). - 19-21th May 2009, Stratford-upon-Avon. - P.69.

Podolskaya E.P.,.Goncharov N.V, Babakov V.N., Glashkina L.M., Ermolaeva E.E., ProkoFeva D.S., Krasnov I.A., Polyakov N.B., Radilov A.S., Krasnov N.V. Effects of organophosphates on peptide fraction of human blood serum. // Proceedings of HUPO-2008 World Congress 16-20 August 2008, Amsterdam.

Prokofieva D.S., Gustyleva L.K., Voitenko N.G., Babakov V.N., Goncharov N.V. Biochemical methods to estimating organophosphates in environmental objects // 61th Pittsburgh Conference (PITTCON 2010). - 28 February-4 March 2010. -Orlando.

Gustyleva L.K., Prokofieva D.S., Savelieva E.I., Khlebnikova N.S., Goncharov N.V. Comparative capabilities of biochemical and chromatographic methods for trace analysis of toxic substance VX in complex matrices //61th Pittsburgh Conference (PITTCON 2010). - 28 February-4 March 2010. - Orlando.

Савельева Е.И., Гончаров H.B., Радилов A.C., Густылева JI.K., Прокофьева Д.С., Хлебникова Н.С. Определение токсичных ФОС в сложных матрицах хромато-масс-спектрометрическим и биохимическим методами // Съезд аналитиков России. — 25-30 апреля 2010. - Клязьма.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе показано, что разработанные планшетные варианты биохимических методов не уступают аттестованным в Российской Федерации методам анализа остаточных количеств ФОВ по чувствительности и значительно превосходят их по производительности и ширине линейного диапазона. Они позволяют на порядок уменьшить объем исследуемых проб и расход реактивов, что снижает стоимость анализа и делает возможным проведение анализа проб объемом 0,5 мл.

Исследования специфичности двух биохимических методов с применением соединений, присутствие которых наиболее вероятно в пробах с объектов УХО, показало, что основной вклад в ложные результаты, получаемые методом Эллмана, вносят меркаптаны и перекись водорода (табл. 3.26).

Способы устранения ложноположительных и ложноотрицательных результатов по методу Эллмана сформулированы нами следующим образом:

1. Постановка дополнительной холостой пробы для каждого анализируемого раствора, которая поможет установить факт взаимодействия реактивов метода Эллмана с компонентами анализируемого раствора, а в случае присутствия в пробе только меркаптанов (восстановителей) постановка такого типа проб позволяет устранить получение ложноотрицательных результатов.

2. Использование иммобилизованного фермента, например, адгезионной клеточной линии человеческой нейробластомы SH-SY5Y, что при определенной организации анализа позволяет избежать прямого контакта анализируемой пробы с реактивами метода Эллмана. Кроме того, такой вариант анализа позволяет ферменту находиться в нативном окружении в составе плазматических мембран клеток.

3. Комбинация двух биохимических методов или замена метода Эллмана на метод Хестрина при анализе проб сложного состава.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Прокофьева, Дарья Станиславовна, 2010 год

1. Анон. Конвенция о запрещении разработки, производства, накопления и применения химического оружия и об его уничтожении, русская версия // Технический Секретариат Организации по Запрещению Химического Оружия. 2005а. - 181 с.

2. Анон. Аттестованные методики выполнения измерений содержания отравляющих веществ, токсичных химикатов, указанных в списках Конвенции о запрещении химического оружия // Отдельный раздел 1 -ХО федерального реестра МВИ. — 2007а. 241 с.

3. Анон. Методика выполнения измерений уровня загрязнения веществом типа VX поверхности технологического оборудования ферментативным методом // Свидетельство об аттестации МВИ №031-04-157-05. 20056. -23 с.

4. Анон. Методика выполнения измерений уровня загрязнения зарином поверхности технологического оборудования ферментативным методом // Свидетельство об аттестации МВИ №031-04-176-05. 2005в. - 19 с.

5. Анон. Методика выполнения измерений уровня загрязнения зоманом поверхности технологического оборудования ферментативным методом // Свидетельство об аттестации МВИ №031-04-217-06. 2006а. - 23 с.

6. Анон. Методика определения токсичности воды и водных вытяжек из почв, осадков сточных вод, отходов по смертности и изменению плодовитости дафний // Федеральный реестр 1.39.2007.03222., Москва. — 20076.

7. Анон. Методические рекомендации по установлению эколого-рыбохозяйственных > нормативов (ПДК и ОБУВ) загрязняющих веществ для воды водных объектов, имеющих рыбохозяйственное значение // Москва, изд-во ВНИРО. 1998.

8. Анон. Об утверждении концепции метрологического обеспечения уничтожения химического оружия и его бывших производств в Российской Федерации // Государственный комитет Российской Федерации по стандартизации и метрологии / Приказ №78. — 2001а. 10с.

9. Анон. Определение класса опасности токсичных отходов производства и потребления // Санитарные правила № 2.1.7.1386-03, М: Министерство здравоохранения Российской Федерации. 2003. - 28 с.

10. Анон. Оценка воздействия вредных химических соединений на кожные покровы и обоснование предельно допустимых уровней загрязнений кожи // Методические указания № 2102-79, Москва. — 1980а. 23 с.

11. Анон. Постановка исследований для обоснования санитарных стандартов вредных веществ в воздухе рабочей зоны // Методические указания № 2163-80., Москва. 19806. - 19 с.

12. Каган Ю.С. Токсикология фосфорорганических пестицидов // Москва «Медицина». 1977. - 298 с.

13. Кокуричева М.П., Чинарева И.Д., Екимова С.Б. Использование методов биотестирования для экологического мониторинга на примере токсикологической оценки снега и льда с Калининской АС // Межвузовские научные труды, С-Петербург. 2005.

14. Лошадкин Н.А., Курляндский Б.А., Беженарь Г.В., Дарьина Л.В. // Военная токсикология. Глава 2. 2006. - С.67-100.

15. Саноцкий И.В., Монаенкова A.M., Курляндский Б.А. и др. Токсикометрия химических веществ, загрязняющих окружающую среду // Москва. -1986. С.252-315.

16. Ammon R. Die fermentative Spaltung des Acetylcholine // Pfliigcrs. Arch. Ges. Physiol. 1934. - V.233. -P.486-491.

17. Anon. Sigma Technical Bulletin No.420. -1969.

18. Aurbek N., Thiermann H., Szinicz L., Eyer P., Worek F. Analysis of inhibition, reactivation and aging kinetics of highly toxic organophosphorus compounds with human and pig acetylcholinesterase // Toxicology 2006. -V.224. - #1-2. - P.91-99.

19. Biedler J.L., Roffler-Tarlov S., Schachner M., Freedman L.S. Multiple neurotransmitter synthesis by human neuroblastoma cell lines and clones // Cancer Res. 1978. - V.38. - P.3751-3757.

20. Brogdon W.G., Dickinson C.M. A microassay system for measuring esterase activity and protein concentration in small samples and in high-pressure liquid chromatography eluate fractions // Anal. Biochem. — 1983. V.131. - #2.-P.499-503.

21. Caraway W.T. Photometric determination of serum cholinesterase activity // Am. J. Clin. Pathol. 1956. - V.26. - #8. -P.945-955.

22. Carvalho F.A., Gra?a L.M., Martins-Silva J., Saldanha C. Biochemical characterization of human umbilical vein endothelial cell membrane bound acetylcholinesterase // FEBS J. 2005. - V.272. - #21. - P.5584-5594.

23. Clark A.J., Raventos J., Stedman E. and Ellen Stedman. Kinetics of choline esterase //Exp. Physiol. 1938. -P.77-86.

24. Correll L., Ehrich M. A microassay method for neurotoxic esterase determinations. //Fundam. Appl. Toxicol. 1991. - V. 16. - #1. -P. 110-116.

25. Costa L.G. Current issues in organophosphate toxicology // Clinica Chimica Acta. 2006. - V.3 66. - P. 1 -13.

26. Crane C.R., Sanders D.C., Abbott J.K. A comparison of serum cholinesterase methods: II // FAA Civil Aeromedical Institute. Report № AM-72-12. March 1972. - 6 pages

27. Crane C.R., Sanders D.C., Abbott J.K. A comparison of three serum cholinesterase methods // Dept. of Transportation, Office of Aviation Medicine, Report No. AM-70-13. 1970. - 7 pages

28. De la Huerga J., Yesinick C., Popper H. Colorimetric method for the determination of serum cholinesterase // Am J Clin Pathol. 1952. — V.22. -#11.-P.1126-1133.

29. Doctor B.P., Toker L., Roth E., Silman I. Microtiter assay for acetylcholinesterase // Anal. Biochem. 1987. - V.166. - #2. - P.399-403.

30. Ehrich M., Veronesi B. Esterase comparison in neuroblastoma cells of human and rodent origin // Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 1995. - V.22. - #5. -P.385-386.

31. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups // Arch. Biochem. Biophys. 1959. -V.82. — P.70-77.

32. Ellman G.L., Courtney K.D., Andres VJr., Feather-Stone R.M. A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity // Biochem. Pharmacol. 1961. V.7.-P.88-95.

33. Eyer P., Worek F., Kiderlen D., Sinko G., Stuglin A., Simeon-Rudolf V., Reiner E. Molar absorption coefficients for the reduced Ellman reagent: reassessment // Anal. Biochem. 2003. - V.312. - P.224-227.

34. Fremaux I., Mazeres S., Brisson-Lougarre A., Arnaud M., Ladurantie C., Fournier D. Improvement of Drosophila acetylcholinesterase stability byelimination of a free cystein // BMC Biochemistry. 2002. - V.3. - #21. -P.1471-1476.

35. Gajewski D. Acetylcholinesterase activity in several rat liver cell fractions after repeated poisoning with some organophosphates // Acta Physiol. Pol. -1980. — V.13. — P.575-580.

36. Garcia-Lopez J.A., Monteoliva M. Physiological changes in human erythrocyte cholinesterase as measured with the "pH-stat" // Clin. Chem. 1988. - V.34. -#10. — P.2133-2135.

37. Glick D. A micro method for the determination of choline esterase and the activity-pH relationship of this enzyme // The Journal of General Physiology. -1937. — V.21. -P.289-295.

38. Glick D. Methods of Biochemical Analysis // John Wiley & Sons, Inc. V.5. -P.552.

39. Hammond P.S., Forster J.S. A microassay-based procedure for measuring low levels of toxic organophosphorus compounds through acetylcholinesterase inhibition // Anal. Biochem. 1989. - V. 180. -P.3 80-383.

40. Hestrin S. The reaction of acetylcholine and other carboxylic acid derivatives with hydroxylamine, and its analytical application // J Biol Chem. 1949. -V.180. - #1. -P.249-261.

41. Hiraki K., Kitayama M., Shibata S., Takahashi H. A simple procedure for the estimation of serum cholinesterase applicable to routine clinical biochemistry // Bull. Yamaguchi Med. School. 1955. - V.3. - #1. - P. 19-25.

42. Holmstedt B.O. Distribution and determination of cholinesterases in mammals //Bull. Org. Mond. Sante, Bull. Wld. Hlth. Org. 1971. - V.44. -P.99-107.

43. Johnson C.D., Russell R.L. A rapid, simple radiometric assay for cholinesterase, suitable for multiple determinations // Analytical Biochemistry.- 1975.-V.64. -#1. — P.229-238.

44. Kalow W., Lindsay H.A. A comparison of optical and manometric methods for the assay of human serum cholinesterase // Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 1955. - V.33. -P.568-574.

45. Kawashima K., Fujii T. Basic and clinical aspects of non-neuronal acetylcholine: overview of non-neuronal cholinergic systems and their biological significance //J. Pharmacol. Sci. -2008. V.106. -P.167-173.

46. Kreimer D.I., Dolginova E.A., Raves M., Sussman J.L., Silman I., Weiner L. A metastable state of Torpedo californica acetylcholinesterase generated by modification with organomercurials // Biochemistry. 1994. - V.6. - #33(48).1. P.14407-14418.

47. Limperos G., Ranta К. E. A Rapid Screening Test for the Determination of the Approximate Cholinesterase Activity of Human Blood // Science. — 1953. -V.117. P.453 - 455.

48. Lockridge O., Adkins S., La Du B.N. Location of disulfide bonds within the sequence of human serum cholinesterase // J. Biol. Chem. 1987. — V.262. -P. 12945-12952.

49. Lockridge O., Eckerson H.W., La Du B.N. Interchain disulfide bonds and subunit organization in human serum cholinesterase // J. Biol. Chem. 1979. -V.254. - P.8324-8330.

50. Massoulie J., Bon S. The molecular forms of cholinesterase and acetylcholinesterase in vertebrates // Annu. Rev. Neurosci. 1982. - V.5. -P.57-106.

51. Michel H.O. An Electrometric method for the determination of red blood cell and plasma cholinesterase activity // J. Lab. Clin. Med. 1949. - V.34. -P.1564-1568.

52. Morel N., Bon S., Greenblatt H.M., Van Belle D., Wodak S J., Sussman J.L., Massoulie J., Silman I. Effect of mutations within the peripheral anionic site on the stability of acetylcholinesterase // Molecular Pharmacology. 1999. - V.55.- P.982-992.

53. Munro N.B., Talmage S.S., Griffin G.D., Waters L.C., Watson A.P., King J.F., Hauschild V. The sources, fate, and toxicity of chemical warfare agent degradation products // Environ Health Perspect. 1999. - V.107. - #12. - P. 933-974.

54. Nabb D.P., Whitfield F. Determination of cholinesterase by an automated pH stat method // Arch Environ Health. 1967. - V.15. - #2. - P.147-154.

55. Nakashima K., Sera Y., Nakano K. A rapid and simple ultramicromethod for the estimation of serum pseudocholinesterase with butyrylthiocholine as substrate //Bull. Yamaguchi Med. School. 1968. - V.15. - #4. - P.257-268.

56. Newman M.A., Que Нее S.S. Interconversion and comparison of the results of three methods for cholinesterase in serum // Clin. Chem. 1984. - V.30. -#2. -P.308-310.

57. Pedzikiewicz J., Piaskowska E., Pytasz M. Acetylcholinesterase (E.C.3.1.1.7.) in the skeletal muscle and brain of rats after exercise and long-term training // Acta Physiol. Pol. 1984. - V.35. - P.469-474.

58. Rappaport F., Fischl J., Pinto N. An improved method for the estimation of cholinesterase activity in serum // Clin. Chim. Acta 4. 1959. - P.227-230.

59. Roberts W.L., Doctor B.P., Foster J.D., Rosenberry T.L. Bovine brain acetylcholinesterase primary sequence involved in intersubunit disulfide linkages // J. Biol. Chem. 1991. - V.266. - P.7481-7487.

60. Roszell L.E., Kramer B.C., Leach G.J. A microassay method using a neuroblastoma cell line to examine neurotoxicity of organophosphate mixtures // Alternative toxicological methods / edited by Katz S.A., Salem H. 2003. -P.341-346.

61. Russell W.M. The development of the three Rs concept // Altern. Lab. Anim. -1995. V.23. - #3. - P.298-304.

62. Sasaki M. An ultramicromethod for the estimation of serum cholinesterase using metanitrophenol as an indicator // Rinshybyori. — 1964. V.12. - P.555-558.

63. Schumacher M., Maulet Y., Camp S., Taylor P. Multiple messenger RNA species give rise to the structural diversity in acetylcholinesterase // J. Biol. Chem.- 1988.- V.263. -P.l8979-18987.

64. Shibata S., Takahashi H. A simple procedure for the estimation of serum cholinesterase by means of comparator with phenol red as indicator // Bull. Yamaguchi Med. School. 1953. - V.l. - #3. -P. 188-196.

65. Sikorav J.L., Duval N., Anselmet A., Bon S., Krejci E., Legay C., Osterlund M., Reimund В., Massoulie J. // EMBO J. 1988. - V.7. - P.2983-2993.

66. Stedman E., Stedman E. The relative choline-esterase activities of serum and corpuscles from the blood of certain species // Biochem. J. 1935. - V.29. -P.2107-2111.

67. Stedman E., Stedman E., Easson L.H. Choline-esterase. An enzyme present in the blood-serum of the hourse // Biochem. J. 1932. - V.26. - P.2056-2066.

68. Steinberg N., Roth E., Silman I. Torpedo acetylcholinesterase is inactivated bythiol reagents //Biochem. Int. 1990. -V.21. - P.l043-1050.122

69. Szinicz L. History of chemical and biological warfare agents // Toxicology. -2005. V.214. -P.167-181.

70. Takahashi H. Studies on serum cholinesterase I. A method for the estimation of serum cholinesterase activity which is useful in the routine work of clinical laboratory // Bull. Yamaguchi Med. School. 1956. - V.3. - #3. - P. 155-164.

71. Takahashi H., Shibata S. A simple method for the serum cholinesterase determination applicable to routine examination // Igaku to Seibutsugaku. — 1951.- V.20. — P.96-98.

72. Thullbery M.D., Cox H.D., Schule Т., Thompson C.M., George K.M. Differential localization of acetylcholinesterase in neuronal and non-neuronal cells // J Cell Biochem. 2005. - V.96. - #3. - P.599-610.

73. Tiffany-Castiglioni E., Ehrich M., Dees L., Costa L.G., Kodavanti R.S., Lasley S.M., Oortgiesen M., Durham H.D. Bridging the gap between in vitro and in vivo models for neurotoxicology // Toxicological Sciences. 1999. - V.51. — P.178-183.

74. Tiffany-Castiglioni E., Hong S., Qian Y., Tang Y., Donnelly K.C. In vitro models for assessing neurotoxicity of mixtures // Neuro Toxicology. — 2006. — V.27. P.835-839.

75. Tomoda A., Sugimoto K., Suhara M., Takeshita M., Yoneyama Y. Haemichrome formation from haemoglobin subunits by hydrogen peroxide // Biochem. J. 1978. - V.171. -P.329-335.

76. Veronesi В., Ehrich M. Differential cytotoxic sensitivity in mouse and human cell lines exposed to organophosphate insecticides // Toxicol. Appl. Pharmacol. 1993. - V.120. - #2. - P.240-246.

77. Weiner L., Kreimer D., Roth E., Silman I. Oxidative stress transforms acetylcholinesterase to a molten-globule-like state // Biochem. Biophys. Res. Com. 1994. - V.198. - P.915-922.

78. Wolfsie J.H., Winter G.D. Bromothymol blue screening test value for determination of blood cholinesterase activity // A. M. A. Arch. Ind. Hyg. Occup. Med. 1954. - V.9. - #5. — P.396-401.

79. Worek F., Koller M., Thiermann H., Szinicz L. Diagnostic aspects of organophosphate poisoning // Toxicology. 2005. - V.214. - P. 182-189.

80. Worek, F., Reiter, G., Eyer, P., Szinicz, L. Reactivation kinetics of acetylcholinesterase from different species inhibited by highly toxic organophosphates // Arch. Toxicol. 2002. - V.76. - P.523-529.

81. Yang Y., Szafraniec L.L., Beaudry W.T., Rohrbaugh D.K., Procell L.R., Samuel J.B. Autocatalytic hydrolysis of V-type nerve agents // J. Org.Chem. — 1996. V.61. - P.8407-8413.

Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.