Модуляция протеасом-опосредованного внутриклеточного протеолиза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Саратов Георгий Алексеевич

• Саратов Георгий Алексеевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Саратов Георгий Алексеевич

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2. ВВЕДЕНИЕ

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Убиквитин-протеасомная система: основные компоненты и функции

3.1.1. Компоненты системы: убиквитин, Е1, Е2, Е3-лигазы

3.1.2. Механизм деградации белков

3.1.3. Биологические функции убиквитин-протеасомной системы в норме

3.1.4. Роль убиквитин-протеасомной системы в патологии: рак, нейродегенерация, аутоиммунитет

3.2. Структура и каталитические фенотипы протеасом

3.2.1. Архитектура протеасом

3.2.2. Каталитические активности: химотрипсин-, трипсин- и каспазоподобная

3.2.3. Различия между конститутивным, иммунным, тимо и спермато фенотипом протеасом

3.2.4. Регуляторные субъединицы: РА28, 19Б, РА200

3.3. Механизмы модуляции протеасомной активности

3.3.1. Влияние рН, буферной среды и ионного состава

3.3.2. Роль низкомолекулярных соединений в активации и ингибировании протеасомы

3.3.3. Посттрансляционные модификации протеасомных субъединиц

3.4. Протеасом-опосредованная генерация эпитопов и участие в иммунном ответе

3.4.1. Роль иммунопротеасомы в презентации антигенов

3.4.2. НЬА-класс I: структура, полиморфизм, значение

3.4.3. Избирательность деградации и образование иммунных пептидов

3.4.4. Модели селективного связывания эпитопов с НЬА

3.4.5. Вклад в противовирусный и аутоиммунный ответ

3.5. Основной белок миелина как биологический партнер протеасомы

3.5.1. Структура, изоформы и модификации МБР

3.5.2. Вариабельность МБР при рассеянном склерозе

3.5.3. МБР как субстрат протеасомы

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Материалы исследования

4.2. Экспериментальные методы

4.2.1. Работа с нуклеиновыми кислотами

4.2.1.1. Полимеразная цепная реакция для амплификации фрагментов ДНК

4.2.1.2. Рестрикция

4.2.1.3. Лигирование

4.2.1.4. Выделение плазмидной ДНК

4.2.1.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле

4.2.1.6. Полимеразная цепная реакция c колоний e.coli

4.2.1.7. Создание генетических конструкций

4.2.2. Работа с белками

4.2.2.1. Денатурирующий электрофорез в ПААГ

4.2.2.2. Иммуноблоттинг

4.2.2.3. Выделение и очистка рекомбинантных белков

4.2.2.4. Получение образцов белкового окружения основного белка миелина методом проксимального мечения

4.2.2.5. Иммунопреципитация с помощью M2 FLAG Affinity Gel

4.2.2.6. Иммунофлуоресцентное окрашивание

4.2.2.7. Окрашивание лизосом с помощью реагента LysoID

4.2.2.8. Анализ слияния аутофагосом и лизосом с использованием конструкций mCherry-GFP-LC3 и GFP-LC3-RFP

4.2.2.9. Выделение высокогомогенных препаратов протеасом

4.2.2.10. Флуоресцентное окрашивание каталитических субъединиц протеасом с использованием зонда Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS

4.2.2.11. Неденатурирующий ПААГ-электрофорез препаратов протеасом

4.2.2.12. Протеасомопосредованный гидролиз основного белка миелина

4.2.3. Методы работы с бактериями E.coli

4.2.3.1. Трансформация в клетки Escherichia coli методом "теплового шока"

4.2.3.2. Электропорация высококомпетентных клеток E.coli

4.2.3.3. Ночная культура

4.2.3.4. Получение высокоэффективных химическикомпетентных клеток

4.2.3.5. Получение высокоэффективных электрокомпетентных клеток

4.2.4. Методы работы с эукариотическими клетками линии HEK239T

4.2.4.1. Выведение линии эукариотических клеток из заморозки

4.2.4.2. Поддержание в культуре эукариотических клеток

4.2.4.3. Трансфекция с помощью PEI/ Lipofectamin3000/2000

4.2.4.4. Сортировка клеток методом проточной цитометрии

4.2.5. Кинетические методы

5. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

5.1. Белковое окружение основного белка миелина

5.1.1. Двугибридная система

5.1.2. Классическая иммунопреципитация

5.1.3. Проксимальное мечение

5.1.4. MBP препятствует ингибированию аутофагии вызванному orf3a SARS-CoV-2

5.2. Модуляция протеасом-опосредованного протеолиза

5.2.1. Оптимизация выделения высокогомогенных препаратов протеасом

5.2.2. Влияние различных буферных систем на каталитическую активность протеасом

5.2.3. Фрагментация основного белка миелина

5.2.4. Предактивационное состояние 26S иммунопротеасомы

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

7. ВЫВОДЫ

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

AMP - аденозинмонофосфат (adenosine monophosphate)

APP - предшественник бета-амилоида (amyloid precursor protein)

ATP - аденозинтрифосфат (adenosine triphosphate)

BFP - синий флуоресцентный белок (blue fluorescent protein)

BSA - бычий сывороточный альбумин (bovine serum albumin)

CHX - циклогексимид (cycloheximide)

CKI - ингибитор циклин-зависимых киназ (Cdk inhibitor protein) DHFR - дигидрофолатредуктаза (dihydrofolate reductase) EBV - вирус Эпштейна-Барр (Epstein-Barr virus)

FACS - флуоресцентно-активированная сортировка клеток (fluorescence-activated cell sorting)

GAP - активирующий ГТФазу белок (GTPase-activating protein)

GFP - зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein)

HLA - человеческий лейкоцитарный антиген (human leukocyte antigen)

IDP - внутренне-неупорядоченный белок (intrinsically disordered protein)

IFN - интерферон (interferon)

IP - иммунопреципитация (immunoprecipitation)

IPTG - изопропил-Р-0-1-тиогалактопиранозид (isopropyl P-D-1-thiogalactopyranoside) IRES - сайт внутренней посадки рибосомы (internal ribosome entry site) MBP - основный белок миелина (myelin basic protein)

MHC - главный комплекс гистосовместимости (major histocompatibility complex)

MS - масс-спектрометрия (mass spectrometry)

ODC - орнитиндекарбоксилаза (ornithine decarboxylase)

PBS - фосфатно-солевой буфер (phosphate buffered saline)

PFA - параформальдегид (paraformaldehyde)

SDS - додецилсульфат натрия (sodium dodecyl sulfate)

SRP - частица распознавания сигнала (signal recognition particle)

TAP - транспортер антигенов (transporter associated with antigen processing)

TCR - Т-клеточный рецептор (T-cell receptor)

RFP - красный флуоресцентный белок (red fluorescent protein)

Ub - убиквитин (ubiquitin)

UPS - убиквитин-протеасомная система (ubiquitin-proteasome system) WB - иммуноблоттинг (western blotting) WCL - клеточный лизат (whole cell lysate) ДМСО - диметилсульфоксид (dimethyl sulfoxide)

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота (deoxyribonucleic acid) ИП - иммунопреципитация (immunoprecipitation) кДа - килодальтон (kilodalton)

ПААГ - полиакриламидный гель (polyacrylamide gel)

ПТМ - посттрансляционная модификация (post-translational modification)

ПЦР - полимеразная цепная реакция (polymerase chain reaction)

РС - рассеянный склероз (multiple sclerosis)

ЦНС - центральная нервная система (central nervous system)

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат (Ethylenediaminetetraacetic acid)

2. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модуляция протеасом-опосредованного внутриклеточного протеолиза»

Актуальность темы исследования.

Убиквитин-протеасомная система является ключевым регулятором внутриклеточного белкового гомеостаза, обеспечивая селективную деградацию короткоживущих, повреждённых и регуляторных белков. Протеасома, важнейший протеолитический белковый комплекс, обладает сложной многосубъединичной структурой и регулируемой каталитической активностью, критически важной для клеточной пролиферации, дифференцировки, иммунного ответа и адаптации к стрессу [1,2]. Нарушения в работе убиквитин-протеасомной системы ассоциированы с широким спектром патологий, включая нейродегенеративные, онкологические и аутоиммунные заболевания [3,4].

Модуляция активности протеасомы может происходить под влиянием как физико-химических параметров клеточной среды (рН, ионный состав, метаболиты), так и взаимодействий с белками-регуляторами, включая субстраты и регуляторные субъединицы [5,6]. Несмотря на существенный прогресс, молекулярные механизмы такой модуляции остаются недостаточно прояснёнными.

Важнейшая иммунная функция протеасомы — участие в образовании эпитопов, представляемых на НЬА I класса, — открывает перспективы для понимания тонкой настройки антигенной презентации [7]. Показано, что регуляция активности различных каталитических субъединиц протеасомы — 01, 02, 05 и их иммунных изоформ изменяет специфичность расщепления белков, тем самым формируя репертуар презентируемых эпитопов [8]. Это открывает возможности целенаправленного управления антигенной презентацией как в контексте противовирусного ответа, так и при разработке персонализированных терапевтических стратегий, включая противоопухолевые вакцины и иммунотерапию.

С терапевтической точки зрения рассматриваются два комплементарных подхода к фармакологической регуляции протеасомы. Во-первых, активация протеасомной деградации перспективна при нейродегенеративных заболеваниях, где накопление агрегированных и окисленных белков вносит существенный вклад в патогенез, стимуляция протеасомы может способствовать удалению токсичных белков и восстановлению протеостаза [3]. Во-вторых, ингибирование протеолитической активности протеасомы вызывает накопление убиквитинированных белков, нарушение клеточного гомеостаза и апоптоз, что особенно уязвимо для быстро пролиферирующих опухолевых клеток. Низкомолекулярные ингибиторы протеасомы доказали высокую эффективность при ряде гематологических злокачественных новообразований, включая множественную миелому и мантийно-клеточную лимфому [9].

В совокупности систематическое исследование молекулярных механизмов модуляции активности протеасомы, включая аллостерическое влияние белков и малых молекул, роли физико-химических характеристик среды, и оценка последствий этой модуляции для деградации аутоантигенов и вирусных белков представляют собой актуальную и значимую научную задачу.

Степень разработанности темы.

Фундаментальные принципы работы убиквитин-протеасомной системы интенсивно изучаются на протяжении последних десятилетий. Строение протеасомы, её сборка из 20S каталитического ядра и регуляторных частиц (19S, PA28, PA200), а также основные каталитические свойства субъединиц 01, 02, Р5 и их иммунных аналогов хорошо охарактеризованы в ряде структурных, биохимических и генетических работ [1,2]. Роль протеасомы в деградации регуляторных и дефектных белков, антигенной презентации, клеточном цикле и апоптозе подтверждена многочисленными исследованиями [4]. Фармакологическое ингибирование протеасомы, в частности бортезомибом, хорошо охарактеризовано и внедрено в клиническую практику при терапии множественной миеломы [9].

В то же время вопросы активации протеасомной активности, особенно избирательной модуляции конкретных каталитических центров, остаются разработанными существенно хуже [10]. Несмотря на то, что структура конститутивных 20S и 26S протеасом хорошо охарактеризована, структура иммунопротеасом и тимопротеасом в нативном и физиологически релевантных состояниях менее изучена. Особенно мало данных о динамике их аллостерических переходов и участии в формировании пептидных репертуаров [11]. Известно, что под действием №N-7 и воспалительных сигналов меняется состав протеасом с образованием иммунопротеасом [12], однако эндогенные механизмы регуляции уже собранных протеасомных комплексов т \1\о остаются слабо охарактеризованными.

Цель исследования.

Выявить молекулярные механизмы модуляции активности протеасомы низкомолекулярными соединениями и белковыми молекулами, охарактеризовать деградацию основного белка миелина - одного из главных аутоантигенов при рассеянном склерозе - различными фенотипами протеасом, а также проанализировать формирование иммунных эпитопов в контексте их связи с HLA I класса и патогенезом иммунозависимых состояний.

Задачи исследования.

1. Выявить белковое окружение основного белка миелина (MBP).

2. Проанализировать взаимодействие MBP с белком Bri2 и белками вируса SARS-CoV-2.

3. Оценить влияние физиологических модуляторов, включая полиамины, на каталитическую активность различных форм протеасом.

4. Изучить деградацию основного белка миелина конститутивной и иммунной протеасомами, сопоставить продукцию иммунных эпитопов и их аффинность к различным НЬА аллелям.

5. Охарактеризовать криоэлектронную структуру иммунной 26Б протеасомы человека, выявить её конформационные особенности.

Научная новизна исследования.

В настоящей работе набором нескольких методов установлено белковое окружение МБР в клетке, что позволило выявить ранее неописанные функциональные взаимодействия с компонентами протеасомного и аутофагического путей. Впервые показано влияние природных полиаминов на активность протеасом и сборку протеасомных комплексов. Впервые проведён сравнительный анализ формирования иммунных эпитопов при деградации основного белка миелина (МБР) различными формами протеасом, с оценкой их аффинности к НЬА аллелям, в том числе, ассоциированных с рассеянным склерозом. Осуществлена первая структурная реконструкция иммунной 26Б протеасомы человека методом криоэлектронной микроскопии (крио-ЭМ), охарактеризованы её каталитические и регуляторные особенности по сравнению с конститутивной формой.

Теоретическая и практическая значимость исследования.

Результаты работы расширяют представление о механизмах модуляции протеасомной активности и её роли в деградации аутоантигенов и вирусных белков. Охарактеризованная взаимосвязь основного белка миелина с белками Бп2 и ОЯБ3а вносит вклад в понимание клеточной регуляции в условиях нейродегенерации и вирусной инфекции. Полученные данные по модуляции активности протеасом природными полиаминами раширяют научное знание об активаторах протеасомы. Установленные зависимости между формой протеасомы, характером образуемых эпитопов и их аффинностью к НЬА-1 углубляют понимание процессов антигенной презентации и формирования адаптивного иммунного ответа. Выявление структурных особенностей иммунной 26Б протеасомы создаёт основу для понимания её функционирования и может объяснять более высокую скорость деградации клеточных субстратов по сравнению с конститутивной формой. Практическая значимость работы определяется сразу несколькими направлениями. Во-первых, полученные карты ближайшего окружения МБР и функциональные опыты с Бп2 формируют основу для таргетирования мембранного трафика и процессинга основного белка миелина при демиелинизирующих патологиях. Во-вторых, показанная способность спермина перенастраивать баланс 26Б/208 и селективно активировать

химотрипсиноподобную активность 20S открывает возможность фармакологической «тонкой настройки» протеостаза в контекстах старения, онкологии и нейровоспаления. В-третьих, описанные различия в спектре пептидов гидролизованного разными фенотипами протеасомы MBP и выделенные иммунодоминантные участки задают ориентиры для разработки иммунодиагностических и иммунотерапевтических подходов. Наконец, крио-ЭМ модель иммунной 26S-протеасомы человека предоставляет платформу для рационального дизайна селективных модуляторов её активности.

Положения, выносимые на защиту.

1. Охарактеризована белковая сеть взаимодействий основного белка миелина, показано, что MBP может выполнять не только структурную, но и регуляторную функцию.

2. Показано, что физиологические концентрации полиаминов могут активировать химотрипсиноподобную активность 20S протеасомы и опосредованно регулировать ее субъединичный состав.

3. Основной белок миелина (MBP) подвергается деградации как конститутивной, так и иммунной протеасомой, с образованием иммуногенных эпитопов, взаимодействующих с HLA I класса, включая те, что ассоциированы с рассеянным склерозом.

4. Получена и охарактеризована крио-ЭМ структура иммунной 26S протеасомы, выявлены конформационные особенности, отличающие её от конститутивной формы.

Личный вклад диссертанта.

Автор внёс существенный вклад в формулировку целей и постановку задач исследования, осуществлял поиск и обработку литературных источников, проводил теоретический анализ и разрабатывал стратегию работы, проводил научные эксперименты, обрабатывал и интерпретировал полученные данные. Кроме того, принимал участие в подготовке публикаций по теме исследования и представлял полученные результаты на научных конференциях. Изучение белкового окружения основного белка миелина было выполнено совместно с к.б.н. Смирновой Е.В. (ИБХ РАН), к.х.н. Ракитиной Т.В. (ИБХ РАН), Тимофеевым В.И. (Курчатовский институт), к.б.н. Петренко Д.Е. (Курчатовский институт), д.ф.-м.н. Бочаровым Э.В. (ИБХ РАН), к.х.н. Зиганшиным Р.Х. (ИБХ РАН) и к.б.н. Арапиди Г.П. (МФТИ). Оптимизация методики выделения протеасом выполнена совместно с к.х.н. Владимировым В.И. (ИБХ РАН), а исследование активности протеасом в различных буферных системах на основе аминов с Барзиловичем П.Ю. (ИБХ РАН). Аффинность спектра пептидов к HLA I класса, полученных фрагментацией основного белка миелина была изучена совместно с к.х.н. Зиганшиным Р.Х. (ИБХ РАН) и Новоселовым А.Л. (ИБХ РАН). Все эксперименты по крио-ЭМ реконструкции

выполнены в коллаборации с Баймухаметовым Т.Н. (Курчатовский институт) и к.ф.-м.н. Коневегой А.Л. (Курчатовский институт). Все опубликованные работы были подготовлены вместе с д.х.н., профессором РАН Белогуровым А.А. (ИБХ РАН) и к.х.н. Кудряевой А.А. (ИБХ РАН).

Апробация результатов исследования.

Главные положения и полученные данные по теме диссертации были вынесены для обсуждения на следующих научных конференциях.: 45th FEBS Congress, Molecules of Life: Towards New Horizons (Любляна, Словения, 2021), Школа молодых учёных «Процессинг и презентация антигенов при канцерогенезе, аутоиммунитете и инфекционных заболеваниях» (Москва, 2022), XXXV Зимняя молодежная научная школа (Москва, 2023), 65-я Всероссийская научная конференция МФТИ (Долгопрудный, 2024), Курчатовский форум «Исследования с применением синхротронного излучения, нейтронов и электронов» (Москва, 2024), XXXVII Зимняя молодежная научная школа (Москва, 2025).

Публикации.

По материалам диссертационной работы опубликовано 8 статей в российских и иностранных журналах

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 3.1. Убиквитин-протеасомная система: основные компоненты и функции 3.1.1. Компоненты системы: убиквитин, Е1, Е2, Е3-лигазы

Убиквитин-протеасомный путь деградации представляет собой селективный механизм разрушения белков, основанный на ковалентном связывании субстратов с убиквитином — высококонсервативным белком массой приблизительно 8,5 кДа. Связывание убиквитина осуществляется по 8-аминогруппе лизина на мишени, чаще всего через цепочки, связанные по остаткам Lys48, которые направляют белок в 26S протеасому для деградации [13]. Процесс убиквитинирования начинается с активации убиквитина ферментом E1 с образованием высокоэнергетического тиоэфирного комплекса, продолжается его переносом на фермент E2 и завершается ковалентным присоединением убиквитина к субстрату при участии E3-лигазы [14].

Рисунок 1. Последовательный перенос убиквитина от E1 через E2 с помощью Е3 к субстрату [15].

В настоящее время идентифицированы единицы E1-фермента, десятки E2-конъюгирующих ферментов и сотни E3-лигаз. Последние классифицируются на три основных типа — RING, HECT и RBR. RING-лигазы выполняют функцию адаптеров, сближающих E2 и белок-мишень, в то время как HECT и RBR-лигазы непосредственно участвуют в образовании промежуточного тиоэфирного комплекса с убиквитином [16]. Структура E3-лигаз определяет их функциональные возможности: HECT-домены, например, включают в себя активные цистеиновые остатки, участвующие в ковалентной передаче убиквитина. В то же время RING-домены, несмотря на отсутствие каталитической активности, играют ключевую роль в пространственном сближении ферментов E2 и субстратов, что обеспечивает высокую скорость и специфичность убиквитинирования [14].

Дополнительные уровни регуляции системы включают молекулы, направляющие специфические белки на убиквитинирование и последующую деградацию. Одним из ярких

12

примеров являются РЯОТАС-конъюгаты, состоящие из лигандов к интересующему белку и Е3-лигазе, соединённых линкером, что создаёт искусственный мост между ними и инициирует убиквитинирование [17]. Подобные технологии открывают возможности для таргетной терапии, позволяя разрушать ранее недоступные лекарственные мишени.

Тип полиубиквитиновой цепочки оказывает прямое влияние на судьбу белка. Полиубиквитиновые цепи, сформированные через Ьув48, служат сигналом для протеасомной деградации белков, тогда как модификации по остаткам Ьув6,11,27,29,33,63 и МеИ задействованы в регуляции внутриклеточной транслокации белков, сигнальных каскадов, воспаления, репарации ДНК и аутофагии [18]. Так как один и тот же белок может быть мишенью для разных вариантов убиквитиновых цепочек, процесс распознавания сигналов усложняется и требует привлечения рецепторов с особой чувствительностью к их топологии.

Рисунок 2. Кристаллическая структура человеческого убиквитина (РББ: 1UBQ), где обозначены все функциональные остатки лизина (К6, К11, К27, К29, К33, К48, К63), а также N концевой остаток метионина (М1) [19].

Известно, что мутации или дефекты функционирования генов, ответственных за компоненты убиквитинирующих каскадов, особенно Е3-лигаз, ассоциированы с развитием ряда патологий, включая болезнь Паркинсона, синдром Ангельмана, некоторые онкологические заболевания и воспалительные нарушения [20-22]. В онкологии интерес представляет мутация или сверхэкспрессия Е3-лигаз, участвующих в деградации супрессоров опухолей, таких как р53, что может усиливать пролиферацию и выживание злокачественно трансформированных клеток [18].

3.1.2. Механизм деградации белков

Присоединение одной или нескольких молекул убиквитина к целевому белку формирует сигнал к распознаванию протеасомой. Убиквитинированный белок распознаётся регуляторной частицей 19S протеасомы, обладающей рецепторными доменами для полиубиквитиновых цепей. Этот процесс требует энергии АТФ и включает следующие стадии: связывание, депротективирование убиквитина, разворачивание субстрата и его транслокация в каталитическую полость 20S протеасомы [23].

Регуляторный комплекс 19S включает AAA+ АТФазы, образующие кольцевую структуру и обеспечивающие разворачивание белка и его транслокацию внутрь 20S частицы. Одновременно происходит отщепление убиквитина с помощью связанных с протеасомой деубиквитиназ, например Rpn11, что предотвращает деградацию самого убиквитина и обеспечивает его повторное использование [24].

Каталитическое ядро 20S протеасомы представляет собой цилиндр из четырех гептамерных колец: двух внешних а- и двух внутренних Р-колец. Протеолитическая активность сосредоточена в субъединицах Р1 (каспазоподобная), Р2 (трипсиноподобная) и Р5 (химотрипсиноподобная), которые обладают различной субстратной специфичностью [25]. Белок-субстрат последовательно расщепляется на олигопептиды длиной от 3 до 25 аминокислот, после чего они могут быть дополнительно гидролизованы цитоплазматическими пептидазами или представлены молекулами HLA-I в случае генерации эпитопов.

На настоящий момент удалось изучить и описать молекулярный механизм, который лежит в основе гидролиза полиубиквитинированных субстратов протеасомой [26]. На первом этапе субстрат связывается посредством полиубиквитиновой цепи с ШМ-доменами в составе убиквитиновых рецепторов регуляторной субчастицы протеасомы. Далее неструктурированный участок субстрата взаимодействует с верхними элементами субъединиц АТФазного кольца. Каскадный гидролиз АТФ в субъединицах Rpt1-6 приводит к перестройке АТФазного кольца в новую конфигурацию, вызывая уширение и выравнивание центрального канала, ведущего в протеолитическую полость 20S субчастицы. Одновременно с этим Rpn11 смещается в центральное положение непосредственно над входом в протеолитическую полость, благодаря чему активный сайт деубиквитиназы получает возможность отделить полиубиквитиновую цепь от субстрата по мере его транслокации. Ключевое значение имеют аминокислотные остатки тирозина в составе Rpt-субъединиц, которые формируют спиральную опоясывающую структуру вокруг транслоцируемой полипептидной цепи субстрата [27]. Каскадный гидролиз молекул АТФ в Rpt-субъединицах приводит к их кооперативному смещению вниз, которое, в свою очередь, поступательно проталкивает полипептидную цепь субстрата в протеолитическую полость.

Связывание Связывание субстрата Начало трансклокации Деубиквитинирование Разворачивание и

убиквитина субстрата деградация субстрата

Рисунок 3. Структурная модель иллюстрирует процесс связывания субстрата с 26Б протеасомой и его дальнейший гидролиз. На схематическом разрезе показаны две реконструкции комплекса — с присоединённым субстратом и в его отсутствие. На первом этапе субстрат (красный) посредством убиквитиновой цепи (фиолетовый) взаимодействует с ШМ-доменом субъединицы Ярп10 (жёлтый цилиндр). В таком состоянии неструктурированный участок белка способен проникать в канал и контактировать с верхними АТФазными субъединицами. После захвата субстрата АТФазы Яр1;1-6 перестраиваются, формируя новую конформацию, которая открывает доступ к каналу, ведущему в протеолитическую камеру и выравнивающемуся со входом в 20Б протеасому (серый). Одновременно субъединица Ярп11 (зелёный) смещается в центральную область над входом в канал. Благодаря этому её активный сайт деубиквитиназы (розовая точка) получает возможность удалять убиквитиновые метки по мере продвижения субстрата внутрь. Таким образом, проходя через Ярп11 (жёлтая точка связывания), субстрат освобождается от всех убиквитинов, что облегчает его транслокацию, разворачивание и деградацию [26].

Существуют механизмы деградации белков и без полиубиквитинирования. Некоторые короткоживущие белки, повреждённые или содержащие открытые гидрофобные участки, могут быть распознаны и расщеплены 20Б протеасомой без участия 19Б субъединицы [28]. Такие пути приобретают особое значение в условиях окислительного или метаболического стресса, когда активируются независимые от убиквитина механизмы удаления белков.

3.1.3. Биологические функции убиквитин-протеасомной системы в норме

Убиквитин-протеасомная система обеспечивает деградацию около 80-90 % всех цитозольных и ядерных белков клетки и играет фундаментальную роль в поддержании клеточного гомеостаза. Её функции выходят далеко за рамки простого удаления дефектных или отслуживших белков: она активно участвует в регуляции ключевых клеточных процессов, включая контроль клеточного цикла, пролиферации, апоптоза, транскрипции, репарации ДНК и дифференцировки [29]. Одной из функций является участие в регуляции клеточного цикла.

Деградация циклинов и ингибиторов циклин-зависимых киназ (СК1) осуществляется строго по фазам и обеспечивает необратимость прохождения клеткой ключевых контрольных точек. Протеасома также регулирует уровни транскрипционных факторов и их активность, включая КБ-кВ, тем самым влияя на клеточную судьбу, ответы на стресс и воспаление [30].

Протеасомная система участвует в развитии иммунного ответа за счёт генерации пептидных эпитопов, которые способны загружаться на молекулы МНС I класса (Н^А-1) и представляются цитотоксическим Т-лимфоцитам. При этом спектр эпитопов зависит от каталитического фенотипа протеасомы и регуляторных условий в клетке. В норме, например, в клетках иммунной системы, повышена экспрессия иммунных субъединиц РН, P2i и Р5^ что обеспечивает образование эпитопов с оптимальной аффинностью к Н^А [31].

Кроме деградации регуляторных белков, убиквитин-протеасомная система выполняет функции по удалению повреждённых или агрегированных белков, в том числе окисленных или денатурированных. Это особенно важно в условиях клеточного стресса и старения, где повышается риск накопления токсичных белковых структур. 20S протеасома в отсутствие 19S-регулятора способна деградировать такие белки даже без полиубиквитиновой цепи [32].

Также работа убиквитин-протеасомной системы зависима и от других систем деградации, включая аутофагию, формируя взаимосвязанную сеть контроля над протеостазом. В нормальных физиологических условиях деградация в протеасоме и аутофагия действуют согласованно, перераспределяя нагрузку между собой в зависимости от типа и количества субстратов [33].

3.1.4. Роль убиквитин-протеасомной системы в патологии: рак, нейродегенерация, аутоиммунитет

Дисфункция убиквитин-протеасомной системы тесно связана с широким спектром патологических состояний, включая онкологические, нейродегенеративные и аутоиммунные заболевания. Нарушения в работе отдельных элементов системы могут приводить к двум противоположным эффектам — чрезмерной деградации функциональных белков или, напротив, к накоплению повреждённых, агрегированных и иммуногенных белков.

В онкологии основное внимание уделяется дерегулированной деградации онкопротеинов и супрессоров опухолей. Например, гиперактивация специфических Е3-лигаз может способствовать снижению уровня р53, что ослабляет контроль над клеточным циклом и апоптозом [34]. Увеличение активности протеасомы в некоторых типах опухолей, например при множественной миеломе, объясняет чувствительность таких клеток к ингибиторам протеасомы, включая бортезомиб, который применяется в терапии и направлен на индукцию апоптоза путём накопления токсичных белков и стресс-индуцированных факторов [35].

В контексте нейродегенерации дисфункция работы убиквитин-протеасомного пути приводит к снижению деградации патологически модифицированных белков, таких как тау, альфа-синуклеин или мутантный хангтинтин. Эти белки склонны к агрегации, что нарушает функции нейронов и способствует прогрессированию таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Хантингтона [36]. Установлено, что в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера наблюдаются снижение активности 20S и 26S протеасом, а также изменения в составе регуляторных субъединиц, что ведёт к нарушению протеостаза [37].

Протеасомная система тесно вовлечена в аутоиммунитет: она генерирует эпитопы, которые затем загружаются на молекулы HLA класса I и представляются СБ8+ Т-клеткам [38,39]. Иммунопротеасомы, формируя состав Н^А-1-пептидома, способны модифицировать иммунную толерантность, это показано как при полном отсутствии иммунопротеасом, так и на уровне тимопротеасомы, определяющей позитивный отбор СБ8+ Т-клеток [40-42]. Изменения в каталитических субъединицах (P1i/PSMB9, p2i/PSMBШ, p5i/PSMB8) или в регуляторных активаторах (РЛ28аР) перестраивают спектр генерируемых эпитопов и, следовательно, иммунное распознавание [43]. В контексте рассеянного склероза показано, что полиморфизм LMP2/PSMB9 ^60Н) снижает образование иммунодоминантного эпитопа МВР111-119 и ассоциирован с меньшим риском заболевания у Н^А-А*02+ женщин; кроме того, селективное ингибирование P5i (ОКХ-0914) ослабляет тяжесть ЕАЕ у мышей [44,45].

3.2. Структура и каталитические фенотипы протеасом

3.2.1. Архитектура протеасом

Протеасома представляет собой высокоорганизованный мультисубъединичный протеолитический комплекс, функционирующий в цитозоле и ядре эукариотических клеток. Её каталитическое ядро — 20S протеасома — состоит из 28 субъединиц, организованных в четыре концентрических гептамерных кольца. Два внешних а-кольца формируют структуру «ворот», регулирующих доступ субстратов внутрь протеолитической камеры, а два внутренних Р-кольца содержат каталитически активные субъединицы [46].

Каждое кольцо включает по семь субъединиц, упорядоченных в строго определённой последовательности. Внутренние Р-субъединицы, расположенные симметрично, включают три каталитически активных: 01, Р2 и Р5, тогда как остальные Р-субъединицы выполняют структурную и стабилизирующую функцию [25]. Каталитические центры располагаются внутри замкнутой камеры, изолированной от цитозольного пространства, что обеспечивает высокую степень специфичности и контроля протеолиза.

В условиях физиологической активности 20S протеасома может функционировать в свободном виде, но часто она ассоциируется с регуляторными частицами, образуя более крупные

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Саратов Георгий Алексеевич, 2025 год

- + - +

250 150< 100/ 75 50

37

Rpn11

" + + ATP + " + IFNy

19S

i i i i Ii an и in i .и 11 Ii i an j i и

__— ш --

Coomassie

(42 —— ()1 —— Ц5 - —~ UblQ18 ___

j-tlä-HS Lii2 ///i® У/^Щш

P1I — —

—Sei- ——

UbiOlS (overexposure)

20S

Рисунок 36. (А) Анализ протеасом, очищенных с АТФ или без него и элюированных со стрептавидин-агарозы в присутствии или в отсутствие 100 мМ KCl. Сверху вниз: электрофорез в SDS-ПААГ с окраской Кумасси и Sypro Orange, флуоресцентное окрашивание в геле с использованием флуоресцентного протеасомного зонда Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS (UbiQ18), электрофорез в нативном ПААГ с субстратом Suc-LLVY-AMC. (Б) Репрезентативные изображения, полученные с помощью негативного электронного микроскопа образцов протеасом, как показано на геле, окрашенном Кумасси на панели А. (В) Анализ протеасом, очищенных с АТФ или без него из клеток, обработанных или необработанных IFNy.

5.2.2. Влияние различных буферных систем на каталитическую активность протеасом.

Полиамины являются важными биоактивными агентами, которые регулируют ключевые клеточные процессы, и их суммарная внутриклеточная концентрация может достигать миллимолярных значений [201]. Концентрация полиаминов, а также экспрессия генов и активность ферментов, участвующих в биосинтезе полиаминов, выше в опухолевых клетках по

сравнению с нормальными тканями. Ранее было показано, что полиамины могут увеличивать активность ферментов, таких как а-химотрипсин [202], и действовать как химические шапероны [203]. Раковые клетки имеют тенденцию повышать внутриклеточный pH и в то же время, как известно, интенсивно продуцируют и поглощают полиамины, такие как спермин. Кроме того известно, что полилизин способен увеличивать протеасомную активность. Чтобы найти другие соединения, способные к подобной модуляции, было решено проанализировать различные буферные системы на основе полиаминов.

Высокогомогенные препараты протеасом анализировали с помощью электрофореза в ПААГ в денатурирующих (Рис. 37(А)) и неденатурирующих (Рис. 37(Б)) условиях. Активность препаратов протеасом полностью подавлялась в присутствии специфического ингибитора MG132. При добавлении 0,02% SDS в рабочий буфер активность 26S протеасомы подавлялась, а 20S увеличивалась (Рис. 37(В)).

Рисунок 37. (А) Очищенные протеасомы 20S (1,5 мкг) и 26S (5,0 мкг) анализировали методом электрофореза в ПААГ. Указаны субъединицы 19S регуляторной частицы и маркер молекулярной массы. (Б) Субъединичный состав протеасом 20S и 26S контролировали с помощью нативного электрофореза, и флуоресценции Suc-LLVY-AMC в геле (В) Активность протеасом измеряли в присутствии или в отсутствии 0,02% SDS и ингибитора протеасом MG132.

В исследуемых нами классических аминосодержащих буферах, таких как MES, Tris, HEPES, глицилглицин, бицин и бис-трис-пропан профиль протеасомной активности имеет асимметричное распределение с максимумом при pH 7,0-7,5. Между тем, буферы, содержащие имидазол и бис-трис, поддерживали протеасомную активность почти на одном уровне в пределах изучаемого диапазона pH.

Третий тип активации наблюдался в буферах на основе аминокислот аргинина и орнитина, и природных полиаминов спермина (Spm) и спермидина (Spd). Активность протеасом в этих буферах резко увеличивалась при значениях pH более 8.0. В число проанализированных веществ входили синтетические разветвленные полиамины (bPEI) с молекулярной массой от 0,6

82

до 1,8 кДа. Буферные системы на их основе выявили четвертый тип активации, который характеризуется удлиненной кривой активности с насыщением при уровне pH>8,0. Не было очевидной корреляции типа активации с присутствием первичной, вторичной или третичной аминогруппы, тем не менее активность протеасом достигает максимума вблизи значения pKa буферной системы. Профиль активности протеасомы 20S почти во всех буферах повторял профиль активности 26S. В случае «асимметричного распределения» максимальная активность протеасомы 20S была сдвинута на половину единицы pH в сторону щелочной области (Рис. 38(А-

Г)).

Анионные буферные системы, такие как цитрат, карбонат и фосфат, подавляли активность протеасом при повышенном pH (Рис. 38(Д)). На активность протеасомы 20S в меньшей степени повлияло повышение значения pH в анионных буферах по сравнению с протеасомой 26S, что означает, что ингибирование 26S может происходить из-за перестройки субчастицы 19S или частичной диссоциации протеасомы 26S до 20S и 19S. Абсолютная активность протеасомы 26S в различных буферах при оптимальном значении pH для каждой буферной системы показана на Рис. 38(Е). Поскольку и различные амины, и значение pH практически одинаково влияют на 26S и 20S протеасомы, возможно, что активация протеасом скорее вызвана их влиянием на каталитическую коровую частицу 20S.

Рисунок 38. Зависимость химотрипсин-подобной активности протеасомы от pH в различных буферах, содержащих (поли) амины (А - Г) и анионные буферы (Д). Уровни активности протеасом 26S и 20S измеряли с использованием химотрипсиноподобного субстрата протеасомы Suc-LLVY-AMC при концентрации каждой буферной системы равной 25 мМ.

Относительную активность рассчитывали как отношение активности при определенном pH к максимальной активности в исследуемом диапазоне pH. (Е) Сравнение абсолютной активности 26S протеасомы в различных буферах при оптимальном значении pH для каждой буферной системы. Данные представляют собой среднее значение и стандартное отклонение четырех независимых измерений. Природные полиамины (Spm, Spd) и разветвленные полиамины (bPEI) использовали в концентрации 5 мМ, все остальные буферы в концентрации 25 мМ. Физиологически значимый диапазон pH показан жирной линией.

Измерение каспазоподобной и трипсиноподобной активности протеасом в буферах на основе HEPES, имидазола и природных полиаминов Spm и Spd при различных уровнях pH (Рис. 39) показало, что каспазоподобная активность протеасомы 26S следует профилю химотрипсинподобной активности во всех буферах. Трипсиноподобная, химотрипсиноподобная и каспазоподобная активности были увеличены в буферах на основе Spm и Spd. В буферах на основе HEPES и имидазола трипсиноподобная активность протеасом имеет свой собственный профиль с насыщением при значениях pH более 7,5-8,0.

А Б В Г

НЕРЕ3 25тМ, рн ИпЮагсНв 25 тМ, рн 8рс15тМ, рн Зрт5тМ,рН

Рисунок 39. Зависимость химотрипсиноподобной (фиолетовый), трипсиноподобной (синий) и каспазоподобной (красный) активности 26S протеасомы от pH в буферах, содержащих HEPES (А), имидазол (Б), спермидин (В) и спермин (Г). Активность 26S протеасомы измеряли кинетическими методами с использованием субстратов протеасомы Suc-LLVY-AMC (химотрипсиноподобный), Boc-LRR-AMC (трипсиноподобный) или Z-LLE-AMC (каспазоподобный) в буферах, содержащих 25 мМ HEPES или имидазола и 5 мМ спермидина или спермина. Относительную активность рассчитывали как отношение активности при определенном pH к максимальной активности в исследуемом диапазоне pH. Данные представляют собой среднее значение и стандартное отклонение (планки ошибок) четырех независимых измерений. Данные были апроксимированы к полиномиальному квадрату экспоненциальной функции или функции Гаусса. Физиологически значимый диапазон pH показан жирной линией.

Далее было исследовано, могут ли полиамины, например, Spm, увеличивать активность протеасом в присутствии карбонат-фосфатного буфера, имитирующего физиологически-релевантные условия цитозоля клетки. С этой целью были протестированы различные концентрации Spm при разных уровнях pH в диапазоне от 6,5 до 8,5 (Рис. 40(А)). Максимальная активность протеасомы 26S наблюдалась при концентрации Spm 3 мМ и pH 8,0-8,5. Интересно отметить, что повышение концентрации имидазола в том же диапазоне pH не показало какого-либо максимума в профиле активности протеасомы 26S (Рис. 40(Б, В)), что позволяет предположить, что полиамины, в отличие от других аминов, могут ингибировать активность 26S протеасомы в высоких концентрациях. В 25 мМ карбонатно-фосфатном буфере (24:1) с увеличением pH раствора активность протеасомы падала, тогда как добавление 10 мМ Spm обеспечило поддержание половины максимальной активности на всем исследуемом диапазоне pH (Рис. 40(Г)). Добавление полиаминов к карбонатно-фосфатному буферу сохраняло активность протеасомы 26S при щелочном pH, предположительно, потому что Spm компенсирует управляемое карбонатом ингибирование протеасомы. Активность протеасомы 20S при добавлении различных концентраций Spm постоянно увеличивалась, и не наблюдалось максимума (Рис. 40(Д)). Как и в случае с 26S протеасомой, максимальная активация протеасомы 20S наблюдалась при pH 8,0-8,5. Профилирование активности 20S протеасомы в карбонатно-фосфатном буфере с добавлением 10 мМ Spm привело к асимметричному распределению, достигающему максимума при pH 7,5 (Рис. 40(Е)). Причина различных профилей активации протеасом 26S и 20S с помощью Spm в настоящее время полностью не ясна. Возможно, что высокая концентрация полиаминов вместе с активацией каталитической частицы 20S также влияет на регулирующую частицу 19S и, следовательно, структурно нарушает диффузию субстрата в частицу 20S. Сравнение отношения химотрипсиноподобной активности протеасомы 26S, измеренной в карбонатно-фосфатном буфере, дополненном аргинином, орнитином, Spd или Spm, с активностью протеасомы 26S, измеренной только в карбонатно-фосфатном буфере, показало, что спермин обладает наиболее выраженной способностью противодействовать ингибированию протеасом, вызванной карбонатами, при щелочном pH (7,5-8,0) (Рис. 40(Ж)). Наиболее разумным объяснением этого экспериментального наблюдения является депротонирование протеасом карбонат-ионами при щелочном pH, что приводит к ингибированию протеасом. Если мы сравним активность 20S и 26S в анионных буферах, можно предположить, что эти буферы в меньшей степени влияют на 20S и, следовательно, наблюдаемое ингибирование 26S скорее вызвано перестройкой или диссоциацией регуляторной субчастицы. Spm, как донор протонов, защищает протеасомы от депротонирования при одновременном воздействии Spm и карбоната и, таким образом, сохраняет свою активность (Рис. 40(З)).

Активирующая способность Spm по отношению к протеасоме изучалась не только на модельном пептидном субстрате, но и на полноразмерном белковом субстрате. С этой целью мы проэкспрессировали убиквитин, зеленый флуоресцентный белок с прикрепленным к нему моноубиквитином, а также Е1 убиквитин-активирующий фермент hUba1 и убиквитин-конъюгирующий фермент Е2 иЬсН5с. Был воссоздан каскад убиквитинирования путем инкубации убиквитина с рекомбинантным иЬуу-Та§ОБР2 и лигазами Е1 и Е2. После убиквитинирования субстрата его добавляли к протеасоме 26S в присутствии или в отсутствии Spm, а также присутствии или отсутствии ингибитора протеасомы М0132 в концентрации 200 мкМ при различных уровнях рН (Рис. 40(И)). Полученные данные показали, что 26S протеасома инактивируется при щелочном рН, тогда как Spm восстанавливает активность протеасомы в отношении убиквитинированного Та§ОБР2.

Исходя из полученных данных можно предположить, что внутриклеточное защелачивание, свойственное злокачественно трансформированным клеткам, может привести к нарушению функции протеасом. Следовательно, злокачественно трансформированным клеткам необходимо увеличивать активность протеасом за счет использования различных путей, например, усиленной экспрессии субъединиц протеасомы. Синтез и активный транспорт полиаминов может представлять собой альтернативный путь активации протеасом, который не требуют ее оверэкспрессии. Таким образом, полиамины, которые необходимы для раковых клеток потенциально могут иметь еще одну важную функцию, связанную с поддержанием активности протеасом за счет аллостерического связывания. Ингибирование синтеза и активного транспорта полиаминов может стать новой клинически значимой терапевтической стратегией для избирательного блокирования протеасом в опухолевых клетках.

Рисунок 40. Спермин усиливает химотрипсиноподобную активность протеасомы pH-зависимым образом и противодействует вызванному карбонатом ингибированию протеасом при щелочном pH. Химотрипсиноподобная активность протеасом 26S (А, Г) или 20S (Д, Е) измерялась при разных pH и концентрациях Spm (А, Д) или при разных pH в буферных системах аминов (Г, Е), содержащих 25 мМ карбонат-фосфатный (24:1) (фиолетовый), 10 мМ Spm (красный) или их смесь (голубой). (Б, В) Зависимость активности протеасомной химотрипсиноподобной пептидазы от pH в буферах, содержащих различные концентрации имидазола при различных pH. Активность 26S протеасомы измеряли с помощью Suc-LLVY-AMC при указанных концентрациях имидазола и значениях pH. Данные представляют собой среднее значение и стандартное отклонение (планки ошибок) четырех независимых измерений.

(Ж) Отношение химотрипсиноподобной активности 26S протеасомы, измеренной в 25 мМ карбонатно-фосфатном буфере с добавлением 10 мМ аргинина (синий), орнитина (фиолетовый), Spd (зеленый) или Spm (красный), к активности 26S протеасомы, измеренная в 25 мМ карбонатно-фосфатном буфере. Звездочки обозначают статистически значимую разницу. (З) Депротонирование 26S протеасомы карбонатными ионами при щелочном pH или Spm при нейтральном pH приводит к ингибированию протеасомы. Одновременное воздействие на 26S протеасому Spm и карбоната приводит к переносу протонов между бикарбонатом и Spm при нейтральном pH и протонированию карбонат-ионов протонами от Spm при щелочном pH. Присутствие Spm в качестве донора протонов при щелочном pH защищает протеасому и, таким образом, сохраняет ее активность. (И) Ub-TagGFP2 убиквитинировали in vitro с помощью восстановленного каскада E1-UbcH5c и затем смешивали с протеасомой 26S при различных уровнях pH в присутствии или в отсутствии Spm. Полосы справа представляют процент диубиквитинированного TagGFP2, гидролизованного протеасомой 26S, по сравнению с контрольным образцом. Показаны стандартные отклонения. Физиологически значимый диапазон pH показан жирной линией.

Далее мы сосредоточились на анализе влияния спермина на модулирование активности 20S протеасом в буфере, максимально приближенном к физиологическим условиям (100мМ KCl, 10mM Na2CO3, 20mM KH2PO4, 1mM TCEP, pH 7.2). Анализ профилей активности всех каталитических субъединиц выявил значительную активацию химотрипсиноподобной активности протеасомы спермином, но эта активация наблюдалась исключительно при расщеплении после тирозина, в отличии от, например, фенилаланина (Рис. 41(А, Б)). Вероятно, спермин способен координировать тирозин в каталитическом кармане именно конститутивной химотрипсинподобной каталитической субъединицы PSMB5, но не иммунной химотрипсинподобной PSMB8, что и приводит к ускоренному гидролизу пептидного субстрата Suc-LLVY-AMC.

А

Б

ИУУ-ЛМС

ДДР-ДМС

Э • . Я " Д " N ' М

В

Ц_Е-АМС

ААР-АМС 10000

800 -

■| 600 с 400

200 -

100

265

1

С20Э ¡20Э

100 10000

100 1000 Брт, цМ

ш

10000

Рисунок 41. (А) Структурные формулы субстратов LLVY-AMC и AAF-AMC (Б) Активность протеасом в засимости от концентрации спермина по четырем субстратам: химотрипсинподобные (LLVY-AMC; AAF-AMC), трипсинподобный (LRR-AMC), каспазоподобный (LLE-AMC) (Б) Химотрипсинподобная активность конститутивной (голубой, c20S) и иммунной (синий, i20S) протеасом в зависимости от концентрации спермина, проанализированная с помощью субстрата LLVY-AMC.

На следующем этапе мы анализировали влияние высокой концентрации спермина на протеом клеток линий SH-SY5Y. После обработки клеток 1мМ спермина в течение 6ти часов методом масс-спектрометрического анализа было обнаружено увеличение количества белков PSMD5 и PSMD9 в обработанных спермином клетках по сравнению с интактными, в 3.96 и 2.31 раза соответственно (Рис. 42). Оба этих белка — шапероны сборки основания 19S, которые предотвращают формирование 26S протеасом [204]. PSMD9 связывается с субъединицей Rpt5 тем самым, блокируя ассоциацию 19S к 20S [205-207]. Оверэкспрессия PSMD5 снижает долю 26S и вызывает накопление полиубиквитинированных белков, тогда как инактивация PSMD5, напротив, повышает сборку 26S [208,209].

Рисунок 42. Результат анализа протеомных данных обработанных и необработанных 1мМ спермина клеток линии 8И-8У5У.

Протеомные данные были подтверждены при анализе лизатов клеток линий 8И-8У5У и МСБ7 методом вестерн-блоттинга с использованием антител простив субъединицы Р8МБ5. Количество этого белка значительно увеличивалось со временем при обработке клеток 1мМ спермина в течение 8 часов (Рис. 43(А)). Субъединичный состав протеасом при такой же обработке был проанализирован методом электрофореза в нативных условиях, он показал существенное уменьшение отношения 268/208 протеасом в клеточных лизатах при воздействии спермина (Рис. 43(Б)).

Рисунок 43. Анализ лизатов клеток линий 8Н-8У5У и МСБ7 при обработке 1мМ спермина в течение 8 часов (А) иммуноблоттинг с использованием антител к Р8МБ5 и Р-актину (Б) электрофорез в нативных условиях с визуализацией флуоресценции в геле зонда

Ме4Боё1руЕЬ-АЬхзЬеизУ8 (ЦЫ018) и последующего иммуноблоттинга с использованием

антител к альфа субъединицам протеасомы Р8МА2.

Таким образом, спермин не только способен модулировать активность протеасомы, но и является фактором сборки/разборки протеасом, опосредованно влияя на ее внутриклеточный субъединичный состав. С учётом этих данных, можно предположить, что спермин способен поддерживать «здоровое старение», противоопухолевую защиту и снижать нейровоспаление. 20S протеасома является основным исполнителем быстрой утилизации окисленных и неструктурированных белков, причём при клеточном стрессе 26S быстро диссоциирует, высвобождая 20S для убиквитин-независимой деградации утративших свою функцию белков [32]. Поддержание такой функции 20S противодействует возрастному спаду протеасомной активности, связанному с ослаблением химотрипсиноподобной активности [210] и

возможностью поддержания нормального протеостаза в целом [211]. Интересно также, что высокие концентрации полиаминов ассоциированы с увеличением продолжительности жизни в популяционных исследованиях [212]. Активация 20S ускоряет удаление онкобелков: показано, что малые молекулы-активаторы 20S стимулируют деградацию внутренне-неупорядоченных белков, включая а-синуклеин и тау [213] и снижают уровень MYC, подавляя пролиферацию раковых клеток и рост опухоли [214], что указывает на потенциальную пользу смещения баланса к 20S в онкологии. Наконец, для аутоиммунных нейродегенеративных состояний полиамины проявляют противовоспалительные свойства: спермин ослабляет течение EAE через подавление активации CD4+ Т-клеток [215], а спермидин уменьшает тяжесть EAE за счёт индукции M2-подобных макрофагов [216].

5.2.3. Фрагментация основного белка миелина

Природный полиамин спермин активирует Р5 субъединицу протеасомы в физиологически релевантных условиях, что может изменять спектр пептидов при гидролизе белка, увеличения количество ^концевых гидрофобных аминокислот, предпочтительных для связывания HLA-I. Поскольку протеасомы являются главным источником 8-10-аминокислотных пептидов для загрузки на HLA I класса, а их ингибирование практически блокирует презентацию антигенов, повышение химотрипсиноподобной активности теоретически должно увеличивать количество эпитопов [217,218]. Это особенно релевантно для MBP: он подвержен протеасомной деградации, в том числе по убиквитин-независимому механизму [136]. Поскольку данные об образовании эпитопов при гидролизе основного белка миелина различными генотипами протеасом недостаточно представлены в литературе, мы решили проанализировать спектр пептидов, образующихся при фрагментации MBP.

Для оценки, какой спектр пептидов MBP может образовываться при деградации протеасомами с различными каталитическими фенотипами и далее может презентироваться на молекулах HLA класса I, были использованы очищенные из клеток HEK293T и HeLa 20S и 26S конститутивные протеасомы и иммунопротеасомы, индуцированные длительной инкубацией HeLa с №N7. MBP инкубировали с очищенными комплексами, а полученные в результате гидролиза пептиды анализировали методом LC-MS/MS. Как и ранее проведенных экспериментах, MBP расщепляется как 26S, так и 20S протеасомой [136,139]. Важно, что несвязанная с регулярными субъединицами 20S протеасома широко представлена в клетках и относительно устойчива к стрессу, что оправдывает учет её вклада в формирование пула пептидов MBP [219,220]. Во всех исследуемых образцах основная масса сайтов расщепления приходилась на центральную часть белка (Рис. 44(В)), а иммунопротеасомы, демонстрировали увеличение химотрипсиноподобной активности и снижение каспазоподобной (Рис. 44(Б)), что

приводило к большей генерации 9-10 аминокислотных пептидов — оптимальной длины последовательности для загрузки на НЬА I класса (Рис. 44(Д)).

Рисунок 44. (А) Флуоресцентное окрашивание в геле протеасом, очищенных в присутсвии или отсутствии АТФ, обработанных и необработанных IFNy с использованием флуоресцентного протеасомного зонда Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS (UbiQ18). (Б) N- и C-концевые аминокислоты пептидов, полученных с помощью протеасом, очищенных из клеток линии HEK293T и клеток линии HeLa, обработанных IFNy, во время гидролиза MBP. Количество пептидов с соответствующими комбинациями первой и последней аминокислот было подсчитано и нормализовано по отношению к общему количеству пептидов MBP. (В) Фрагментация MBP протеасомами из клеток линии HEK293T и клеток линии HeLa, обработанных IFNy. Количество участков гидролиза было подсчитано и нормализовано по отношению к общему количеству. (Г) Все пептиды MBP, полученные с помощью протеасом, очищенных из клеток линии HeLa, обработанных IFNy, по сравнению с протеасомами из клеток линии HEK293T (левый график) и протеасомами, выделенными из клеток линии HeLa, необработанных IFNy, и клеток HEK293T (средний график), наложение (справа). (Д) Пептиды MBP из 9-10 аминокислот, полученные с помощью протеасом, очищенных из клеток линии HeLa, обработанных IFNy, по сравнению с протеасомами из клеток линии HEK293T (левый график), протеасомы, выделенные из клеток HeLa, необработанных IFNy, и клеток HEK293T (средний график) и наложение (справа). Относительное количество пептидов было нормализовано по общему ионному току (TIC).

Молекулы HLA I класса, ассоциированные с РС, которые могут напрямую связывать пептиды MBP, в основном продуцируемые иммунопротеасомой, кодируются аллелями HLA-A*03, -A*23, -A*24, -A*26, -A*30, -A*31, -A*33, -B*07, -B*08, -B*15 и -B*51. Биоинформатическое предсказание связывания показало, что именно пептиды, полученные иммунопротеасомой, чаще соответствуют требованиям к загрузке на HLA I класса. Мы идентифицировали как минимум пять иммунодоминантных участков MBP: LPRHRDTGIL, SLPQKSHGR, QDENPVVHFF, KGRGLSLSRF и GYGGRASDY (Рис. 45).

Рисунок 45. Последовательность МБР (изоформа Р02686-5) с выделенными пептидами (жирным), которые потенциально могут презентироваться НЬЛ-классом I, ассоциированным с рассеянным склерозом (жирным красным) и с защитным эффектом (жирным чёрным). Вычисленное процентильное значение представлено в виде цветового градиента от белого до синего (0.01-1)

Пептид ОУООЯЛБВУ образуется иммунопротеасомой значительно чаще, чем конститутивной, и является потенциальным лигандом НЬЛ-Л30:02, частота которого повышена у пациентов с РС в Бахрейне [221].

Пептид МБР КОЯОЬ8Ь8Я, продуцируемый исключительно протеасомами, очищенными из клеток НеЬа, обработанных №N7, является потенциальным высокоаффинным лигандом для молекул, кодируемых аллелями НЬЛ-Л*30:01 и ИЬЛ-Л*31:01. Этот же пептид может связываться с НЬЛ-Л*03:01, который чаще встречается у пациентов с РС из Ирана [222]. Интересно, что у пациентов с рассеянным склерозом аллель НЬЛ-Л*31 часто сочеталась с НЬЛ-Л*03 и НЬЛ-Л*24 [223]. Таким образом, мы предполагаем, что синергетическая презентация миелиновых пептидов гетерозиготными аллелями, кодируемыми НЬЛ-Л, может значительно повышать риск развития рассеянного склероза.

Молекулы НЬЛ-Б*07:02, -Б*08:01 и -Б*51:01 могут связывать пептид МБР ЬРЯНКОТСТЬ с умеренно высокой аффинностью. Количество этого пептида было увеличено в 50 раз в образцах МБР, гидролизованного протеасомами, очищенными из клеток линии НеЬа, обработанных №N7, по сравнению с протеасомами из клеток линии НЕК293Т. Показано, что НЬЛ-Б*07:02-ограниченный и ЕБУ-специфический ответ СБ8+ Т-клеток нарушен у пациентов с рассеянным склерозом [224]. Можно предположить, что способность молекул, НЬЛ-Б*07:02, презентировать эпитопы МБР и EBNA-3 может служить дополнительным доказательством, подтверждающим теорию молекулярной мимикрии, связывающую вирус Эпштейна-Барр и РС [225,226]. Эти результаты особенно важны в свете недавно обнаруженной ассоциации этих двух заболеваний [227].

Среди аллелей НЬЛ, протективных при рассеянном склерозе, мы обнаружили, что

молекулы НЬЛ-Б*44 могут связывать пептид МБР QDENPVVHFF, тогда как молекула,

96

кодируемая HLA-A*02:06, может связывать RTQDENPVV. Примечательно, что оба пептида охватывают классический иммунодоминантный эпитоп MBP [228]. Аллели HLA-A*02 и HLA B*44 снижают восприимчивость к рассеянному склерозу, однако только HLA-B*44, по-видимому, влияет на течение заболевания, сохраняя объём мозга и уменьшая тяжесть заболевания у пациентов с рассеянным склерозом [229]. В данной работе мы продемонстрировали, что прогнозируемое сродство HLA класса I к пептиду MBP QDENPVVHFF молекул HLA-A*23, -A*24, -A*26 и -B*51, ассоциированных с РС, как правило, находится в диапазоне от умеренного до низкого. Напротив, молекулы, кодируемые протективными аллелями HLA-A*44, могут связывать этот пептид с беспрецедентно высокой аффинностью.

Нейродегенерация характеризуется активацией иммунопротеасомы в ущерб конститутивной протеасоме [230,231]. Наши данные позволяют сделать вывод, что разработка ингибиторов, специфичных к иммуносубъединицам протеасомы, может представлять собой новые терапевтические подходы к различным формам РС и другим нейродегенеративным и нейроиммунологическим заболеваниям, особенно для людей, имеющих аллели HLA I класса, связанные с риском развития РС.

5.2.4. Предактивационное состояние 26S иммунопротеасомы

26S протеасома — это уникальный мультикаталитический протеиназный комплекс, который совместно с системой убиквитинирования обеспечивает контролируемую деградацию большинства внутриклеточных белков эукариот. Наиболее существенная методологическая проблема при её изучении — множественность внутриклеточных форм, возникающих благодаря модульности процессов сборки и активации комплекса [64,232]. В настоящем исследовании с помощью крио-ЭМ мы впервые описали структуру 26S иммунопротеасомы человека в сопоставлении с её конститутивной формой с разрешением 3.6 А.

В данной работе мы получили и обработали данные криоэлектронной микроскопии препаратов 26S конститутивной протеасомы и 26S иммунопротеасомы. В результате распознавания частиц из экспериментальных данных криоэлектронной микроскопии был получен массив из 239 705 и 146 134 проекций для конститутивной и иммунной форм 26S протеасомных субчастиц соответственно. Финальный результат классификации, вместе с характерными исходными усредненными изображениями, приведен на рис. 46. После уточнения карт их разрешение составило 3.6 А. Карты электронных плотностей депонированы в базу данных EMDB (Electron Microscopy Data Bank) под референсными номерами EMD-19571 и EMD-19572.

Рисунок 46. (А) - Характерное исходное крио-ЭМ-изображение протеасомных субчастиц конститутивной (с268) и иммунной (¡268) формы; (Б) - результат двумерной классификации исходного набора проекций; (В) - подвыборки проекций 268 протеасомных субчастиц.

Сопоставление полученной 3,6 А общей структуры комплексов с референсной структурой 268 протеасомы человека не выявило принципиальных отличий в общей архитектуре комплекса (Рис. 47) [233].

Рисунок 47. Сравнительный анализ глобальной структуры 268 протеасомы человека в конститутивной (е268) и иммунной (1268) формах. Структура 268 протеасомы человека РББ 50Ж дана в качестве референса.

Анализ электронной плотности в субстрат-связывающих карманах гексамерного АТФазного кольца подтвердил наличие всех шести молекул АТФ в связанном состоянии в обоих комплексах (Рис. 48(А)), а также заякоривание ИЬУХ-мотивов субъединиц Яр13 и Яр16 в гидрофобные полости гептамерного а-кольца (Рис. 48(Б)). В иммунопротеасоме конститутивные каталитические субъединицы 01, 02 и Р5 под действием ^N7 заменяются на P1i, P2i и 051. Мы подтвердили наличие иммуносубъединиц в протеасоме, выделенной из клеток ИеЬа, предварительно обработанных ^N7, на основании изменения электронной плотности (Рис. 48(В)) в положениях характеристических аминокислотных остатков протеасомы иммунного фенотипа [66].

Рисунок 48. (А) - Анализ электронной плотности в субстрат-связывающих карманах гексамерного АТФазного кольца; (Б) - заякоривание НЬУХ-мотивов субъединиц ЯрЗ и Яр16 в гидрофобные полости гептамерного а-кольца; (В) - присутствие иммуносубъединиц в протеасоме, изолированной из клеток НеЬа, предварительно обработанных №N7, на основании

изменения электронной плотности в положениях характеристических аминокислотных остатков протеасомы иммунного фенотипа.

Сравнительный анализ проксимального (непосредственно взаимодействующего с 19S регуляторной субчастицей) и аксиального (удаленного) гептамерного а-кольца выявил кооперативный сдвиг N-концевых областей а-субъединиц в структуре иммунопротеасомы в сравнении с протеасомой конститутивного фенотипа (Рис. 49). N-концевые фрагменты субъединиц PSMA1, PSMA4 и PSMA6 поступательно сместились в направлении субъединицы PSMA2.

Рисунок 49. Сравнительный анализ проксимального (непосредственно взаимодействующего с 198 регуляторной субчастицей) и аксиального (удаленного) гептамерного а-кольца (А) ^концевых областей а-субъединиц в структуре иммунопротеасомы в сравнении с

протеасомой конститутивного фенотипа (Б); (В) - кооперативный сдвиг N-концевых фрагментов субъединиц PSMA1, PSMA4 и PSMA6 в направлении субъединицы PSMA2.

Визуализация электронной плотности проксимального a-кольца в области входа во внутреннюю камеру каталитической 20S субчастицы выявила снижение стерической затрудненности в центральном канале иммунопротеасомы в сравнении с конститутивной формой (Рис. 50(A)). Подобный эффект вызван разобщением системы ионных связей, наблюдаемой в случае конститутивной протеасомы, между аминокислотными остатками Arg5 субъединицы PSMA7 и аспартатом субъединицы PSMA5 в положении 9, Arg10 субъединицы PSMA5 и Asp7 субъединицы PSMA1, а также аспарагина субъединицы PSMA1 в положении 8 и Arg3 субъединицы PSMA4 в структуре иммунопротеасомы (Рис. 50(Б)). При этом наблюдаемый сдвиг У-концевых последовательностей субъединиц PSMA способствует образованию п-п-укладки между остатками Tyr5 и Phe9 субъединиц PSMA4 и PSMA6 соответственно, что, в свою очередь, фиксирует их У-концевые фрагменты в удалении от центрального канала (Рис. 50(B)).

Учитывая, что транслокация субстрата в каталитическую полость 20S является одной из ключевых и лимитирующих стадий протеолиза, сравнение структур, представленное в нашем исследовании, позволяет обсудить факторы, облегчающие открытие входа во внутреннюю камеру и продвижение субстрата внутрь нее. Ранее показано, что удаление N-концевого участка субъединицы a3 приводит к ускорению деградации как субстратов in vitro, так и белков в клетке [234]. Существуют данные, что 26S иммунопротеасома в целом быстрее гидролизует клеточные субстраты [89]. Это особенно наглядно продемонстрировано для белков с высокой изоэлектрической точкой, отмечено значительное ускорение их деградации иммунопротеасомами [142], это верно и в случае основного белка миелина [143]. Вероятной причиной является избирательный захват положительно заряженных участков субстратов протеасомами с регуляторными частицами семейства PA28 [138,139]. Кроме того, для иммунопротеасомы описаны альтернативная укладка каталитических иммуносубъединиц в 0-кольце и отличный от конститутивной формы механизм активации 20S комплексами PA28, что подтверждается крио-ЭМ-данными [66].

Рисунок 50. (А) - Визуализация электронной плотности проксимального а-кольца в области входа во внутреннюю камеру каталитической 20S субчастицы. (Б) - разобщение системы ионных связей, наблюдаемой в случае конститутивной протеасомы, между аминокислотными остатками Arg5 PSMA7 и Asp9 PSMA5, Arg10 PSMA5 и Asp7 PSMA1, а также

Asn8 PSMA1 и Arg3 PSMA4 в структуре иммунопротеасомы. (В) - образование п-п-укладки между остатками Tyr5 и Phe9 субъединиц PSMA4 и PSMA6.

Сопоставив эти наблюдения с полученными нами структурными результатами, можно предположить, что аллостерический эффект иммуносубъединиц, размещённых непосредственно под внешним а-кольцом, способствует более выраженному разведению N-концевых фрагментов а-субъединиц при присоединении регуляторной 19S-чaстицы и, как следствие, формированию у 26S иммунопротеасомы «предактивационного» фенотипа даже при отсутствии связанного субстрата.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выполненная работа комплексно раскрывает молекулярные механизмы модуляции протеасом-опосредованного протеолиза. В совокупности полученные результаты развивают современные представления о регуляции протеостаза, иммунных функциях протеасомы и последствиях изменения её состава и фенотипа. Поставленная задача — уточнить, как клеточные условия, регуляторные субъединицы и свойства субстратов определяют работу протеасомы и формирование иммунного пептидома, — решена с помощью взаимодополняющих подходов структурной биологии, биохимии и протеомики.

Создана и реализована схема картирования белкового окружения МБР, сочетающая дрожжевую двугибридную систему (У2Н), иммунопреципитацию и метод проксимального мечения ТигЬоГО. Такое сочетание позволило одновременно фиксировать бинарные контакты, устойчивые комплексы и непосредственное клеточное окружение МБР. Полученные данные показали, регуляторное участие МБР в различных клеточных процессах, связанными, в частности, с ферроптозом и везикулярным транспортом. На модели взаимодействия МБР с Бп2 показано, что коэкспрессия этих белков ослабляет фурин-опосредованный процессинг Бп2 и изменяет его мембранный трафик, согласуясь с вычислительной гипотезой маскировки сайта расщепления и шаперонной функцией олигомеризованного Бп2. Установлена функциональная связь между выявленным окружением МБР и аутофагией: в составе ближайших партнёров МБР обнаружены компоненты SNARE-аппарата. Показано, что МБР частично противодействует блокаде поздней стадии аутофагии - слиянию аутофагосом с лизосомами, индуцируемой белком ORF3a SARS-CoV-2, что проявляется нормализацией аутофагического пути и уменьшением накопления несформированных аутолизосом. Эти экспериментальные данные дополняют ранее обсуждаемую перекрёстную регуляцию между убиквитин-протеасомной системой и аутофагией и помещают МБР как аллостерический заряд-опосредованный активатор протеасомы и модулятор слияния аутофагосом и лизосом в контекст двух путей деградации.

Ключевым блоком стало выяснение роли полиаминов в регуляции каталитических субъединиц и сборки протеасом. Показано, что спермин в физиологически релевантных условиях селективно активирует химотрипсиноподобную активность конститутивной 208-протеасомы P5/PSMB5, тогда как иммунный аналог p5i/PSMB8 к такой активации нечувствителен. Кроме того, высокие концентрации спермина снижают отношение 268/208 в клеточных лизатах и увеличивают внутриклеточные уровни ингибиторов сборки 268 протеасомы — PSMD5 и PSMD9, что указывает на сдвиг равновесия в сторону свободных 208 протеасом. Совокупно это свидетельствует, что спермин — не только модулятор активности, но и фактор, опосредованно влияющий на состав протеасом в клетке. Такие эффекты согласуются с наблюдаемым

функциональным «переключением» клетки в сторону 20S протеасом при окислительном стрессе и подчеркивают потенциальную пользу природных полиаминов для поддержания 20S-зависимой деградации в качестве профилактики возрастного снижения активности протеолиза и регуляции концентрации онкобелков.

Систематический анализ фрагментации MBP различными фенотипами протеасом - еще один ключевой элемент данной работы. Иммунопротеасомы демонстрируют более выраженный химотриптический профиль расщепления белка и генерируют больше пептидов длиной 9-10 аминокислот, оптимальных для загрузки на молекулы HLA I класса. На основании LC-MS/MS-данных и биоинформатического предсказания связывания с аллелями HLA I класса, ассоциированными с риском или защитой при РС, идентифицировано по меньшей мере пять иммунодоминантных участков MBP. Эти результаты уточняют источники иммуногенных пептидов MBP и подкрепляют концепцию детерминантно-зависимого участия иммунопротеасомы в антигенной презентации при демиелинизирующих процессах.

Наконец, важнейшим методологическим и концептуальным достижением работы является получение крио-ЭМ структур 26S иммунопротеасомы человека с разрешением 3.6 Â. Сравнительный анализ выявил признаки предактивационного состояния иммунного комплекса, включая более раскрытый вход в протеолитическую полость 20S, перераспределение сети ионных связей в а-кольце и л-л-укладку между субъединицами PSMA4/PSMA6. Эти структурные наблюдения органично стыкуются с функциональными данными об отличиях скорости деградации субстратов иммунопротеасомами, предлагая модель активированной иммунопротеасомы даже при отсутствии связанного субстрата.

7. ВЫВОДЫ

1. Белковое окружение основного белка миелина включает элементы трансляционного аппарата, систем процессинга РНК, везикулярного транспорта, убиквитин-протеасомной системы и ферроптоза. Показано, что основной белок миелина способен противодействовать вирус-индуцированному ингибированию аутофагии, вызванному белком ORF3a SARS-CoV-2, и регулирует процессинг нейродегенеративно-ассоциированного белка Bri2, препятствуя его фурин-зависимому расщеплению.

2. Впервые показано, что активность протеасом может модулироваться физиологическими концентрациями полиаминов, таких как спермин, который способен не только селективно повышать химотрипсин-подобную активность конститутивной протеасомы, но и опосредованно ингибировать сборку 26S протеасом.

3. Анализ деградации основного белка миелина различными формами протеасом показал, что MBP фрагментируется с образованием пептидов, способных связываться как с ассоциированными с рассеянным склерозом, так и с защитными аллелями HLA класса I. При этом гидролиз MBP иммунопротеасомой имеет очевидный аутоимунный пептидный ландшафт.

4. Впервые охарактеризована структура иммунной 26S протеасомы человека методом криоэлектронной микроскопии с разрешением 3.6 Â. Выявленные структурные особенности, такие как раскрытие входа в каталитический канал и специфические п-п-взаимодействия субъединиц, предполагают наличие предактивационного состояния иммунопротеасомы даже в отсутствие связанного субстрата.

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Collins G.A., Goldberg A.L. The Logic of the 26S Proteasome // Cell. - 2017. - Т. 169. - №. 5. - С. 792-806.

2. Gallastegui N., Groll M. The 26S proteasome: assembly and function of a destructive machine // Trends in Biochemical Sciences. - 2010. - Т. 35. - №. 11. - С. 634-642.

3. Dantuma N.P., Bott L.C. The ubiquitin-proteasome system in neurodegenerative diseases: precipitating factor, yet part of the solution // Front Mol Neurosci. - 2014. - Т. 7. - С. 70.

4. Basler M., Kirk C.J., Groettrup M. The immunoproteasome in antigen processing and other immunological functions // Current Opinion in Immunology. - 2013. - Т. 25. - №. 1. - С. 74-80.

5. Toste Rego A., da Fonseca P.C.A. Characterization of Fully Recombinant Human 20S and 20S-PA200 Proteasome Complexes // Mol Cell. - 2019. - Т. 76. - №. 1. - С. 138-147.

6. Cascio P. PA28aP: the enigmatic magic ring of the proteasome? // Biomolecules. - 2014. - Т. 4. -№. 2. - С. 566-584.

7. Kammerl I.E., Meiners S. Proteasome function shapes innate and adaptive immune responses // American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. - 2016. - Т. 311. - №. 2.

- С. L328-L336.

8. Rock K.L., Goldberg A.L. Degradation of cell proteins and the generation of MHC class I-presented peptides // Annu. Rev. Immunol. - 1999. - Т. 17. - №. 1. - С. 739-779.

9. Kumar S.K. et al. Risk of progression and survival in multiple myeloma relapsing after therapy with IMiDs and bortezomib: a multicenter international myeloma working group study // Leukemia. -2012. - Т. 26. - №. 1. - С. 149-157.

10. Huang L., Chen C. Proteasome regulators: activators and inhibitors // CMC. - 2009. - Т. 16. - №. 8. - С. 931-939.

11. Kniepert A., Groettrup M. The unique functions of tissue-specific proteasomes // Trends in Biochemical Sciences. - 2014. - Т. 39. - №. 1. - С. 17-24.

12. Ferrington D.A., Gregerson D.S. Immunoproteasomes: structure, finction, and antigen presentation // Progress in Molecular Biology and Translational Science. - 2012. - Т. 109. - С. 75-112.

13. Hershko A., Ciechanover A. The ubiquitin system // Annu. Rev. Biochem. - 1998. - Т. 67. - №. 1.

- С. 425-479.

14. Zheng N., Shabek N. Ubiquitin Ligases: Structure, Function, and Regulation // Annu. Rev. Biochem.

- 2017. - Т. 86. - №. 1. - С. 129-157.

15. Deol K.K., Lorenz S., Strieter E.R. Enzymatic Logic of Ubiquitin Chain Assembly // Front. Physiol.

- 2019. - Т. 10. - С. 835.

16. Swatek K.N., Komander D. Ubiquitin modifications // Cell Res. - 2016. - Т. 26. - №. 4. - С. 399422.

17. Sakamoto K.M. et al. Protacs: chimeric molecules that target proteins to the Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation // Proceedings of the National Academy of Sciences. -2001. - T. 98. - №. 15. - C. 8554-8559.

18. Hoeller D., Dikic I. Targeting the ubiquitin system in cancer therapy // Nature. - 2009. - T. 458. -№. 7237. - C. 438-444.

19. Pan X. et al. Structural and Functional Basis of JAMM Deubiquitinating Enzymes in Disease // Biomolecules. - 2022. - T. 12. - №. 7. - C. 910.

20. Liang Y. et al. The Role of Ubiquitin-Proteasome System and Mitophagy in the Pathogenesis of Parkinson's Disease // Neuromolecular Med. - 2023. - T. 25. - №. 4. - C. 471-488.

21. Watanabe Y., Taguchi K., Tanaka M. Ubiquitin, Autophagy and Neurodegenerative Diseases // Cells. - 2020. - T. 9. - №. 9. - C. 2022.

22. Faqeih E.A. et al. Biallelic variants in HECT E3 paralogs, HECTD4 and UBE3C, encoding ubiquitin ligases cause neurodevelopmental disorders that overlap with Angelman syndrome // Genet Med. -2023. - T. 25. - №. 2. - C. 100323.

23. Finley D. Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome // Annu Rev Biochem. - 2009. - T. 78. - C. 477-513.

24. Verma R. et al. Role of Rpn11 metalloprotease in deubiquitination and degradation by the 26S proteasome // Science. - 2002. - T. 298. - №. 5593. - C. 611-615.

25. Groll M. et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution // Nature. - 1997. - T. 386. - №. 6624. - C. 463-471.

26. Matyskiela M.E., Lander G.C., Martin A. Conformational switching of the 26S proteasome enables substrate degradation // Nat Struct Mol Biol. - 2013. - T. 20. - №. 7. - C. 781-788.

27. De La Pena A.H. et al. Substrate-engaged 26 S proteasome structures reveal mechanisms for ATP-hydrolysis-driven translocation // Science. - 2018. - T. 362. - №. 6418. - C. eaav0725.

28. Ben-Nissan G., Sharon M. Regulating the 20S proteasome ubiquitin-independent degradation pathway: 3 // Biomolecules. - 2014. - T. 4. - №. 3. - C. 862-884.

29. Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway // Cell. - 1994. - T. 79. - №. 1. - C. 13-21.

30. Mitch W.E., Goldberg A.L. Mechanisms of muscle wasting. The role of the ubiquitin-proteasome pathway // N Engl J Med. - 1996. - T. 335. - №. 25. - C. 1897-1905.

31. Kloetzel P.-M. Antigen processing by the proteasome // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2001. - T. 2. - №. 3. - C. 179-187.

32. Raynes R., Pomatto L.C.D., Davies K.J.A. Degradation of oxidized proteins by the proteasome: Distinguishing between the 20S, 26S, and immunoproteasome proteolytic pathways // Molecular Aspects of Medicine. - 2016. - T. 50. - C. 41-55.

33. Nedelsky N.B., Todd P.K., Taylor J.P. Autophagy and the ubiquitin-proteasome system: collaborators in neuroprotection // Biochimica et Biophysica Acta. - 2008. - T. 1782. - №. 12. - C. 691-699.

34. Popovic D., Vucic D., Dikic I. Ubiquitination in disease pathogenesis and treatment // Nat Med. -2014. - T. 20. - №. 11. - C. 1242-1253.

35. Richardson P.G. et al. A phase 2 study of bortezomib in relapsed, refractory myeloma // N Engl J Med. - 2003. - T. 348. - №. 26. - C. 2609-2617.

36. Tai H.-C., Schuman E.M. Ubiquitin, the proteasome and protein degradation in neuronal function and dysfunction // Nat Rev Neurosci. - 2008. - T. 9. - №. 11. - C. 826-838.

37. Keller J.N., Hanni K.B., Markesbery W.R. Impaired proteasome function in Alzheimer's disease // Journal of Neurochemistry. - 2000. - T. 75. - №. 1. - C. 436-439.

38. Kloetzel P.-M. The proteasome and MHC class I antigen processing // Biochimica et Biophysica Acta. 2004. - T. 1695. - №. 1. - C. 225-233.

39. Groettrup M., Kirk C.J., Basler M. Proteasomes in immune cells: more than peptide producers? // Nat Rev Immunol. - 2010. - T. 10. - №. 1. - C. 73-78.

40. Kincaid E.Z. et al. Mice completely lacking immunoproteasomes show major changes in antigen presentation // Nat Immunol. - 2012. - T. 13. - №. 2. - C. 129-135.

41. Sasaki K. et al. Thymoproteasomes produce unique peptide motifs for positive selection of CD8(+) T cells // Nat Commun. - 2015. - T. 6. - №. 1. - C. 7484.

42. Xing Y., Jameson S.C., Hogquist K.A. Thymoproteasome subunit-ß5T generates peptide-MHC complexes specialized for positive selection // Proceedings of the National Academy of Sciences. -2013. - T. 110. - №. 17. - C. 6979-6984.

43. De Graaf N. et al. PA28 and the proteasome immunosubunits play a central and independent role in the production of MHC class I-binding peptides in vivo // Eur J Immunol. - 2011. - T. 41. - №. 4. -C. 926-935.

44. Mishto M. et al. Immunoproteasome LMP2 60HH variant alters MBP epitope generation and reduces the risk to develop multiple sclerosis in Italian female population // PLOS ONE. - 2010. - T. 5. - №. 2. - C. e9287.

45. Basler M. et al. Inhibition of the immunoproteasome ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis // EMBO Molecular Medicine. - 2014. - T. 6. - №. 2. - C. 226-238238.

46. Löwe J. et al. Crystal structure of the 20 S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 Ä resolution // Science. - 1995. - T. 268. - №. 5210. - C. 533-539.

47. Baumeister W. et al. The proteasome: paradigm of a self-compartmentalizing protease // Cell. -1998. - T. 92. - №. 3. - C. 367-380.

48. Spyracopoulos L. The Proteasome: More Than a Means to an End // Structure. - 2016. - T. 24. - №. 8. - C. 1221-1223.

49. Whitby F.G. et al. Structural basis for the activation of 20S proteasomes by 11S regulators // Nature.

- 2000. - T. 408. - №. 6808. - C. 115-120.

50. Ben-Nissan G. et al. Biology of the Extracellular Proteasome // Biomolecules. - 2022. - T. 12. - №. 5. - C. 619.

51. Kisselev A.F., Goldberg A.L. Proteasome inhibitors: from research tools to drug candidates // Chemistry & Biology. - 2001. - T. 8. - №. 8. - C. 739-758.

52. Orlowski M., Wilk S. Catalytic activities of the 20 S proteasome, a multicatalytic proteinase complex // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2000. - T. 383. - №. 1. - C. 1-16.

53. Abi Habib J. et al. Functional Differences between Proteasome Subtypes // Cells. - 2022. - T. 11. -№. 3. - C. 421.

54. Groll M., Huber R. Substrate access and processing by the 20S proteasome core particle // The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. - 2003. - T. 35. - №. 5. - C. 606-616.

55. Tanaka K. The proteasome: overview of structure and functions // Proceedings of the Japan Academy, Series B. - 2009. - T. 85. - №. 1. - C. 12-36.

56. Frantzeskakis M., Takahama Y., Ohigashi I. The Role of Proteasomes in the Thymus // Front Immunol. - 2021. - T. 12. - C. 646209.

57. Nitta T. et al. Thymoproteasome shapes immunocompetent repertoire of CD8+ T Cells // Immunity.

- 2010. - T. 32. - №. 1. - C. 29-40.

58. Murata S. et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes // Science.

- 2007. - T. 316. - №. 5829. - C. 1349-1353.

59. Kincaid E.Z. et al. Specialized proteasome subunits have an essential role in the thymic selection of CD8(+) T cells // Nat Immunol. - 2016. - T. 17. - №. 8. - C. 938-945.

60. Takada K. et al. TCR affinity for thymoproteasome-dependent positively selecting peptides conditions antigen responsiveness in CD8(+) T cells // Nat Immunol. - 2015. - T. 16. - №. 10. - C. 1069-1076.

61. Griffin T.A. et al. Immunoproteasome assembly: cooperative incorporation of interferon y (IFN-y)-inducible subunits // J Exp Med. - 1998. - T. 187. - №. 1. - C. 97-104.

62. Watanabe A. et al. The Molecular Mechanisms Governing the Assembly of the Immuno- and Thymoproteasomes in the Presence of Constitutive Proteasomes // Cells. - 2022. - T. 11. - №. 9. -C. 1580.

63. Gomez-H L. et al. The PSMA8 subunit of the spermatoproteasome is essential for proper meiotic exit and mouse fertility // PLOS Genetics. - 2019. - T. 15. - №. 8. - C. e1008316.

64. Lander G.C. et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle // Nature. -2012. - T. 482. - №. 7384. - C. 186-191.

65. Rechsteiner M., Hill C.P. Mobilizing the proteolytic machine: cell biological roles of proteasome activators and inhibitors // Trends in Cell Biology. - 2005. - T. 15. - №. 1. - C. 27-33.

66. Chen J. et al. Cryo-EM of mammalian PA28aP-iCP immunoproteasome reveals a distinct mechanism of proteasome activation by PA28aP // Nat Commun. - 2021. - T. 12. - №. 1. - C. 739.

67. Ustrell V. et al. PA200, a nuclear proteasome activator involved in DNA repair // The EMBO Journal.

- 2002. - T. 21. - №. 13. - C. 3516-3525.

68. Ostrowska H. et al. Human platelet 20S proteasome: inhibition of its chymotrypsin-like activity and identification of the proteasome activator PA28. A preliminary report // Platelets. - 2003. - T. 14. -№. 3. - C. 151-157.

69. Liu C.-W. et al. ATP binding and ATP hydrolysis play distinct roles in the function of 26S proteasome // Molecular Cell. - 2006. - T. 24. - №. 1. - C. 39-50.

70. Tsvetkov P. et al. NADH binds and stabilizes the 26S proteasomes independent of ATP // Journal of Biological Chemistry. - 2014. - T. 289. - №. 16. - C. 11272-11281.

71. Kuo C.-L., Goldberg A.L. Ubiquitinated proteins promote the association of proteasomes with the deubiquitinating enzyme Usp14 and the ubiquitin ligase Ube3c // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2017. - T. 114. - №. 17. - C. E3404-E3413.

72. Kuo C.-L., Collins G.A., Goldberg A.L. Methods to Rapidly Prepare Mammalian 26S Proteasomes for Biochemical Analysis // Methods Mol Biol. - 2018. - T. 1844. - C. 277-288.

73. Kisselev A.F., Kaganovich D., Goldberg A.L. Binding of hydrophobic peptides to several non-catalytic sites promotes peptide hydrolysis by all active sites of 20 S proteasomes. Evidence for peptide-induced channel opening in the a-rings // Journal of Biological Chemistry. - 2002. - T. 277.

- №. 25. - C. 22260-22270.

74. Hideshima T. et al. The proteasome inhibitor PS-341 inhibits growth, induces apoptosis, and overcomes drug resistance in human multiple myeloma cells // Cancer Res. - 2001. - T. 61. - №. 7.

- C. 3071-3076.

75. Kuhn D.J. et al. Potent activity of carfilzomib, a novel, irreversible inhibitor of the ubiquitin-proteasome pathway, against preclinical models of multiple myeloma // Blood. - 2007. - T. 110. -№. 9. - C. 3281-3290.

76. Muchamuel T. et al. A selective inhibitor of the immunoproteasome subunit LMP7 blocks cytokine production and attenuates progression of experimental arthritis // Nat Med. - 2009. - T. 15. - №. 7.

- C. 781-787.

77. Adams J. et al. Proteasome inhibitors: a novel class of potent and effective antitumor agents // Cancer Res. - 1999. - T. 59. - №. 11. - C. 2615-2622.

78. Djakovic S.N. et al. Phosphorylation of Rpt6 regulates synaptic strength in hippocampal neurons // J. Neurosci. - 2012. - Т. 32. - №. 15. - С. 5126-5131.

79. Wang D. et al. Regulation of acetylation restores proteolytic function of diseased myocardium in mouse and human // Molecular & Cellular Proteomics. - 2013. - Т. 12. - №. 12. - С. 3793-3802.

80. Arendt C.S., Hochstrasser M. Eukaryotic 20S proteasome catalytic subunit propeptides prevent active site inactivation by N-terminal acetylation and promote particle assembly // The EMBO Journal. - 1999. - Т. 18. - №. 13. - С. 3575-3585.

81. Qian M.-X. et al. Acetylation-mediated proteasomal degradation of core histones during DNA repair and spermatogenesis // Cell. - 2013. - Т. 153. - №. 5. - С. 1012-1024.

82. Bowe D.B. et al. O-GlcNAc integrates the proteasome and transcriptome to regulate nuclear hormone receptors // Molecular and Cellular Biology. - 2006. - Т. 26. - №. 22. - С. 8539-8550.

83. Zhang F. et al. O-GlcNAc modification is an endogenous inhibitor of the proteasome // Cell. - 2003. - Т. 115. - №. 6. - С. 715-725.

84. Overath T. et al. Mapping of O-GlcNAc sites of 20 S proteasome subunits and Hsp90 by a novel biotin-cystamine tag // Molecular & Cellular Proteomics. - 2012. - Т. 11. - №. 8. - С. 467-477.

85. Wang X. et al. Regulation of the 26S proteasome complex during oxidative stress // Sci Signal. -2010. - Т. 3. - №. 151. - С. ra88.

86. Aiken C.T. et al. Oxidative stress-mediated regulation of proteasome complexes // Molecular & Cellular Proteomics. - 2011. - Т. 10. - №. 5. - С. R110.006924.

87. Pickering A.M., Davies K.J.A. Differential roles of proteasome and immunoproteasome regulators Pa28aß, Pa28y and Pa200 in the degradation of oxidized proteins // Archives of Biochemistry and Biophysics. - 2012. - Т. 523. - №. 2. - С. 181-190.

88. Li J., Powell S.R., Wang X. Enhancement of proteasome function by PA28&alpha; overexpression protects against oxidative stress // FASEB J. - 2011. - Т. 25. - №. 3. - С. 883-893.

89. Seifert U. et al. Immunoproteasomes preserve protein homeostasis upon interferon-induced oxidative stress // Cell. - 2010. - Т. 142. - №. 4. - С. 613-624.

90. McCarthy M.K., Weinberg J.B. The immunoproteasome and viral infection: a complex regulator of inflammation // Front. Microbiol. - 2015. - Т. 6. - С. 21.

91. Heink S. et al. IFN-y-induced immune adaptation of the proteasome system is an accelerated and transient response // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2005. - Т. 102. - №. 26. -С. 9241-9246.

92. Gaczynska M., Rock K.L., Goldberg A.L. y-interferon and expression of MHC genes regulate peptide hydrolysis by proteasomes // Nature. - 1993. - Т. 365. - №. 6443. - С. 264-267.

93. Driscoll J. et al. MHC-linked LMP gene products specifically alter peptidase activities of the proteasome // Nature. - 1993. - Т. 365. - №. 6443. - С. 262-264.

94. Murata S. et al. The immunoproteasome and thymoproteasome: functions, evolution and human disease // Nat Immunol. - 2018. - T. 19. - №. 9. - C. 923-931.

95. Bjorkman P.J., Parham P. Structure, function, and diversity of class I major histocompatibility complex molecules // Annual Review of Biochemistry. - 1990. - T. 59. - C. 253-288.

96. Neefjes J. et al. Towards a systems understanding of MHC class I and MHC class II antigen presentation // Nat Rev Immunol. - 2011. - T. 11. - №. 12. - C. 823-836.

97. Robinson J. et al. The IPD and IMGT/HLA database: allele variant databases // Nucleic Acids Res.

- 2015. - T. 43. - №. D1. - C. D423-431.

98. Klein L. et al. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don't see) // Nat Rev Immunol. - 2014. - T. 14. - №. 6. - C. 377-391.

99. Carosella E.D., Dausset J., Rouas-Freiss N. Immunotolerant functions of HLA-G // Cell. Mol. Life Sci. - 1999. - T. 55. - №. 3. - C. 327-333.

100. Karre K. NK cells, MHC class I molecules and the missing self // Scand J Immunol. - 2002. - T. 55. - №. 3. - C. 221-228.

101. Kloetzel P.-M., Ossendorp F. Proteasome and peptidase function in MHC-class-I-mediated antigen presentation // Current Opinion in Immunology. - 2004. - T. 16. - №. 1. - C. 76-81.

102. Verteuil D. de et al. Deletion of immunoproteasome subunits imprints on the transcriptome and has a broad impact on peptides presented by major histocompatibility complex I molecules // Molecular & Cellular Proteomics. - 2010. - T. 9. - №. 9. - C. 2034-2047.

103. Wearsch P.A., Cresswell P. The quality control of MHC class I peptide loading // Current Opinion in Cell Biology. - 2008. - T. 20. - №. 6. - C. 624-631.

104. Ritz U., Seliger B. The transporter associated with antigen processing (TAP): structural integrity, expression, function, and its clinical relevance // Mol Med. - 2001. - T. 7. - №. 3. - C. 149-158.

105. Herget M., Tampe R. Intracellular peptide transporters in human - compartmentalization of the "peptidome" // Eur J Physiol. - 2007. - T. 453. - №. 5. - C. 591-600.

106. Cresswell P. et al. The nature of the MHC class I peptide loading complex // Immunol Rev. - 1999.

- T. 172. - C. 21-28.

107. Saric T. et al. An IFN-y-induced aminopeptidase in the ER, ERAP1, trims precursors to MHC class I-presented peptides // Nat Immunol. - 2002. - T. 3. - №. 12. - C. 1169-1176.

108. York I.A. et al. The ER aminopeptidase ERAP1 enhances or limits antigen presentation by trimming epitopes to 8-9 residues // Nat Immunol. - 2002. - T. 3. - №. 12. - C. 1177-1184.

109. Kanaseki T. et al. ERAAP synergizes with MHC class I molecules to make the final cut in the antigenic peptide precursors in the endoplasmic reticulum // Immunity. - 2006. - T. 25. - №. 5. - C. 795-806.

110. Papakyriakou A. et al. The partial dissociation of MHC class I-bound peptides exposes their N terminus to trimming by endoplasmic reticulum aminopeptidase 1 // Journal of Biological Chemistry. - 2018. - T. 293. - №. 20. - C. 7538-7548.

111. de Castro J.A.L., Stratikos E. Intracellular antigen processing by ERAP2: Molecular mechanism and roles in health and disease // Human Immunology. - 2019. - T. 80. - №. 5. - C. 310-317.

112. Schmidt K. et al. ERAP1-Dependent Antigen Cross-Presentation Determines Efficacy of Adoptive T-cell Therapy in Mice // Cancer Res. - 2018. - T. 78. - №. 12. - C. 3243-3254.

113. Liepe J. et al. A large fraction of HLA class I ligands are proteasome-generated spliced peptides // Science. - 2016. - T. 354. - №. 6310. - C. 354-358.

114. Rammensee H.-G. et al. SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs // Immunogenetics. - 1999. - T. 50. - №. 3. - C. 213-219.

115. Jurtz V. et al. NetMHCpan-4.0: Improved Peptide-MHC Class I Interaction Predictions Integrating Eluted Ligand and Peptide Binding Affinity Data // J Immunol. - 2017. - T. 199. - №. 9. - C. 33603368.

116. Paul S. et al. HLA class I alleles are associated with peptide-binding repertoires of different size, affinity, and immunogenicity // J Immunol. - 2013. - T. 191. - №. 12. - C. 5831-5839.

117.Tenzer S. et al. Antigen processing influences HIV-specific cytotoxic T lymphocyte immunodominance // Nat Immunol. - 2009. - T. 10. - №. 6. - C. 636-646.

118. Boggs J.M. Myelin basic protein: a multifunctional protein // Cell Mol Life Sci. - 2006. - T. 63. -№. 17. - C. 1945-1961.

119. Bamm V.V. et al. Structured functional domains of myelin basic protein: cross talk between actin polymerization and Ca(2+)-dependent calmodulin interaction // Biophysical Journal. - 2011. - T. 101. - №. 5. - C. 1248-1256.

120. Min Y. et al. Interaction forces and adhesion of supported myelin lipid bilayers modulated by myelin basic protein // Proc Natl Acad Sci USA. - 2009. - T. 106. - №. 9. - C. 3154-3159.

121. Campagnoni A.T., Skoff R.P. The pathobiology of myelin mutants reveal novel biological functions of the MBP and PLP genes // Brain Pathol. - 2001. - T. 11. - №. 1. - C. 74-91.

122. Moscarello M.A., Mastronardi F.G., Wood D.D. The role of citrullinated proteins suggests a novel mechanism in the pathogenesis of multiple sclerosis // Neurochem Res. - 2007. - T. 32. - №. 2. - C. 251-256.

123. Harauz G., Boggs J.M. Myelin management by the 18.5-kDa and 21.5-kDa classic myelin basic protein isoforms // J Neurochem. - 2013. - T. 125. - №. 3. - C. 334-361.

124. Smith G.S.T. et al. Classical 18.5-and 21.5-kDa isoforms of myelin basic protein inhibit calcium influx into oligodendroglial cells, in contrast to golli isoforms // J Neurosci Res. - 2011. - T. 89. -№. 4. - C. 467-480.

125. Wang C. et al. Charge isomers of myelin basic protein: structure and interactions with membranes, nucleotide analogues, and calmodulin // PLOS ONE. - 2011. - T. 6. - №. 5. - C. e19915.

126. Kim J.K. et al. Multiple sclerosis: an important role for post-translational modifications of myelin basic protein in pathogenesis // Molecular & Cellular Proteomics. - 2003. - T. 2. - №. 7. - C. 453462.

127. Wood D.D. et al. Myelin localization of peptidylarginine deiminases 2 and 4: comparison of PAD2 and PAD4 activities // Laboratory Investigation. - 2008. - T. 88. - №. 4. - C. 354-364.

128. Calabrese R. et al. Methylation-dependent PAD2 upregulation in multiple sclerosis peripheral blood // Mult Scler. - 2012. - T. 18. - №. 3. - C. 299-304.

129. Friedrich M.G. et al. Isoaspartic acid is present at specific sites in myelin basic protein from multiple sclerosis patients: could this represent a trigger for disease onset? // Acta Neuropathologica Communications. - 2016. - T. 4. - №. 1. - C. 83.

130. Musse A.A., Boggs J.M., Harauz G. Deimination of membrane-bound myelin basic protein in multiple sclerosis exposes an immunodominant epitope // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2006. - T. 103. - №. 12. - C. 4422-4427.

131. Ishiyama N. et al. The effects of deimination of myelin basic protein on structures formed by its interaction with phosphoinositide-containing lipid monolayers // Journal of Structural Biology. -2001. - T. 136. - №. 1. - C. 30-45.

132. Cao et al. Rapid release and unusual stability of immunodominant peptide 45-89 from citrullinated myelin basic protein // Biochemistry. American Chemical Society. - 1999. - T. 38. - №. 19. - C. 6157-6163.

133. Martin R. et al. Citrulline-containing myelin basic protein is recognized by T-cell lines derived from multiple sclerosis patients and healthy individuals // Neurology. - 1994. - T. 44. - №. 1. - C. 123-129.

134. Tranquill L.R. et al. Enhanced T cell responsiveness to citrulline-containing myelin basic protein in multiple sclerosis patients // Mult Scler. - 2000. - T. 6. - №. 4. - C. 220-225.

135. Seze J. de et al. IgG reactivity against citrullinated myelin basic protein in multiple sclerosis // Journal of Neuroimmunology. - 2001. - T. 117. - №. 1. - C. 149-155.

136. Belogurov A. et al. Multiple sclerosis autoantigen myelin basic protein escapes control by ubiquitination during proteasomal degradation // Journal of Biological Chemistry. - 2014. - T. 289.

- №. 25. - C. 17758-17766.

137. Bacheva A.V. et al. Analysis of myelin basic protein fragmentation by proteasome // Acta Naturae.

- 2009. - T. 1. - №. 1. - C. 84-87.

138. Belogurov A. et al. Ubiquitin-independent proteosomal degradation of myelin basic protein contributes to development of neurodegenerative autoimmunity // FASEB J. - 2015. - T. 29. - №. 5.

- C. 1901-1913.

139. Kudriaeva A. et al. Charge-mediated proteasome targeting // FASEB J. - 2019. - T. 33. - №. 6. -C.6852-6866.

140. Kuzina E.S. et al. Deimination of the myelin basic protein decelerates its proteasome-mediated metabolism // Dokl Biochem Biophys. - 2016. - T. 469. - №. 1. - C. 277-280.

141. Kuzina E. et al. Glatiramer acetate and nanny proteins restrict access of the multiple sclerosis autoantigen myelin basic protein to the 26S proteasome // Biomed Res Int. - 2014. - T. 2014. - C. 926394.

142. Raule M., Cerruti F., Cascio P. Enhanced rate of degradation of basic proteins by 26S immunoproteasomes // Biochim Biophys Acta. - 2014. - T. 1843. - №. 9. - C. 1942-1947.

143. Kuzina E.S. et al. Immunoproteasome enhances intracellular proteolysis of myelin basic protein // Dokl Biochem Biophys. - 2013. - T. 453. - C. 300-303.

144. Smirnova E.V. et al. Deconvolution of the MBP-Bri2 Interaction by a Yeast Two Hybrid System and Synergy of the AlphaFold2 and High Ambiguity Driven Protein-Protein Docking // Crystals. -2022. - T. 12. - №. 2. - C. 197.

145. Fields S., Song O. A novel genetic system to detect protein-protein interactions // Nature. - 1989.

- T. 340. - №. 6230. - C. 245-246.

146. Chien C.T. et al. The two-hybrid system: a method to identify and clone genes for proteins that interact with a protein of interest. // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1991. - T. 88. - №. 21. - C. 9578-9582.

147. Martin L. et al. Regulated intramembrane proteolysis of Bri2 (Itm2b) by ADAM10 and SPPL2a/SPPL2b // Journal of Biological Chemistry. - 2008. - T. 283. - №. 3. - C. 1644-1652.

148. Kim J. et al. BRI2 (ITM2b) inhibits Aß deposition in vivo // J. Neurosci. Society for Neuroscience.

- 2008. - T. 28. - №. 23. - C. 6030-6036.

149. Matsuda S. et al. Maturation of BRI2 generates a specific inhibitor that reduces APP processing at the plasma membrane and in endocytic vesicles // Neurobiology of Aging. - 2011. - T. 32. - №. 8. -C. 1400-1408.

150. Harauz G., Libich D.S. The classic basic protein of myelin-conserved structural motifs and the dynamic molecular barcode involved in membrane adhesion and protein-protein interactions // Curr Protein Pept Sci. - 2009. - T. 10. - №. 3. - C. 196-215.

151. Boggs J.M., Rangaraj G. Interaction of lipid-bound myelin basic protein with actin filaments and calmodulin // Biochemistry. American Chemical Society. - 2000. - T. 39. - №. 26. - C. 7799-7806.

152. De Avila M. et al. The proline-rich region of 18.5 kDa myelin basic protein binds to the SH3-domain of Fyn tyrosine kinase with the aid of an upstream segment to form a dynamic complex in vitro // Biosci Rep. - 2014. - T. 34. - №. 6. - C. e00157.

153. DuPai C.D., Davies B.W., Wilke C.O. A systematic analysis of the beta hairpin motif in the Protein Data Bank // Protein Sci. - 2021. - T. 30. - №. 3. - C. 613-623.

154. Hoyer W. et al. Stabilization of a ß-hairpin in monomeric Alzheimer's amyloid-ß peptide inhibits amyloid formation // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2008. - T. 105. - №. 13. -C.5099-5104.

155. Aggarwal S. et al. Myelin membrane assembly is driven by a phase transition of myelin basic proteins into a cohesive protein meshwork // PLOS Biology. - 2013. - T. 11. - №. 6. - C. e1001577.

156. Aggarwal S. et al. A size barrier limits protein diffusion at the cell surface to generate lipid-rich myelin-membrane sheets // Developmental Cell. - 2011. - T. 21. - №. 3. - C. 445-456.

157. Leppert A. et al. A new kid in the folding funnel: Molecular chaperone activities of the BRICHOS domain // Protein Sci. - 2023. - T. 32. - №. 6. - C. e4645.

158. Sánchez-Pulido L., Devos D., Valencia A. BRICHOS: a conserved domain in proteins associated with dementia, respiratory distress and cancer // Trends in Biochemical Sciences. - 2002. - T. 27. -№. 7. - C. 329-332.

159. Smirnova E.V. et al. Comprehensive Atlas of the Myelin Basic Protein Interaction Landscape // Biomolecules. - 2021. - T. 11. - №. 11. - C. 1628.

160. Bhardwaj A. et al. Characterizing TDP-43 interaction with its RNA targets // Nucleic Acids Res. -2013. - T. 41. - №. 9. - C. 5062-5074.

161. Tollervey J.R. et al. Characterizing the RNA targets and position-dependent splicing regulation by TDP-43 // Nat Neurosci. - 2011. - T. 14. - №. 4. - C. 452-458.

162. Hoch-Kraft P. et al. Dual role of the RNA helicase DDX5 in post-transcriptional regulation of myelin basic protein in oligodendrocytes // J Cell Sci. - 2018. - T. 131. - №. 9. - C. jcs204750.

163. Zhan R. et al. A DEAD-box RNA helicase Ddx54 protein in oligodendrocytes is indispensable for myelination in the central nervous system // J Neurosci Res. - 2013. - T. 91. - №. 3. - C. 335-348.

164. Perrin-Tricaud C., Rutishauser U., Tricaud N. P120 catenin is required for thickening of Schwann cell myelin // Molecular and Cellular Neuroscience. - 2007. - T. 35. - №. 1. - C. 120-129.

165. Cosgaya J.M., Chan J.R., Shooter E.M. The neurotrophin receptor p75NTR as a positive modulator of myelination // Science. - 2002. - T. 298. - №. 5596. - C. 1245-1248.

166. Salehi A.H. et al. NRAGE, a novel MAGE protein, interacts with the p75 neurotrophin receptor and facilitates nerve growth factor-dependent apoptosis // Neuron. - 2000. - T. 27. - №. 2. - C. 279288.

167. Lee A.K., Potts P.R. A Comprehensive Guide to the MAGE Family of Ubiquitin Ligases // Journal of Molecular Biology. - 2017. - T. 429. - №. 8. - C. 1114-1142.

168. Wüst H.M. et al. Egr2-guided histone H2B monoubiquitination is required for peripheral nervous system myelination // Nucleic Acids Res. - 2020. - T. 48. - №. 16. - C. 8959-8976.

169. Xie W. et al. The H2B ubiquitin-protein ligase RNF40 is required for somatic cell reprogramming // Cell Death Dis. - 2020. - T. 11. - №. 4. - C. 287.

170. Karpiuk O. et al. The histone H2B monoubiquitination regulatory pathway is required for differentiation of multipotent stem cells // Molecular Cell. - 2012. - T. 46. - №. 5. - C. 705-713.

171. Smirnova E.V. et al. Identification of Myelin Basic Protein Proximity Interactome Using TurboID Labeling Proteomics // Cells. - 2023. - T. 12. - №. 6. - C. 944.

172. Kim S. et al. ER-to-Golgi transport and SEC23-dependent COPII vesicles regulate T cell alloimmunity // American Society for Clinical Investigation. - 2021. - T. 131. - №. 2. - C. e136574.

173. Ayala J. et al. The product of rab2, a small GTP binding protein, increases neuronal adhesion, and neurite growth in vitro // Neuron. - 1990. - T. 4. - №. 5. - C. 797-805.

174. Itoh T., Fukuda M. Identification of EPI64 as a GTPase-activating protein specific for Rab27A // J Biol Chem. - 2006. - T. 281. - №. 42. - C. 31823-31831.

175. Söllner T. et al. SNAP receptors implicated in vesicle targeting and fusion // Nature. - 1993. - T. 362. - №. 6418. - C. 318-324.

176. Ravichandran V., Chawla A., Roche P.A. Identification of a novel syntaxin- and synaptobrevin/VAMP-binding protein, SNAP-23, expressed in non-neuronal tissues // J Biol Chem. - 1996. - T. 271. - №. 23. - C. 13300-13303.

177. Salaün C., Gould G.W., Chamberlain L.H. The SNARE proteins SNAP-25 and SNAP-23 display different affinities for lipid rafts in PC12 cells. Regulation by distinct cysteine-rich domains // J Biol Chem. - 2005. - T. 280. - №. 2. - C. 1236-1240.

178. Bernstein A.M., Whiteheart S.W. Identification of a cellubrevin/vesicle associated membrane protein 3 homologue in human platelets // Blood. - 1999. - T. 93. - №. 2. - C. 571-579.

179. Lam M. et al. CNS myelination requires VAMP2/3-mediated membrane expansion in oligodendrocytes // Nat Commun. - 2022. - T. 13. - №. 1. - C. 5583.

180. Bijlard M. et al. Transcriptional expression of myelin basic protein in oligodendrocytes depends on functional syntaxin 4: a potential correlation with autocrine signaling // Molecular and Cellular Biology. - 2015. - T. 35. - №. 4. - C. 675-687.

181. Müller C. et al. Making myelin basic protein -from mRNA transport to localized translation // Front. Cell. Neurosci. - 2013. - T. 7. - C. 169.

182. Kocaturk N.M., Gozuacik D. Crosstalk Between Mammalian Autophagy and the Ubiquitin-Proteasome System // Front. Cell Dev. Biol. - 2018. - T. 6. - C. 128.

183. Itakura E., Kishi-Itakura C., Mizushima N. The hairpin-type tail-anchored SNARE syntaxin 17 targets to autophagosomes for fusion with endosomes/lysosomes // Cell. - 2012. - T. 151. - №. 6. -C. 1256-1269.

184. Michelucci A. et al. SARS-CoV-2 ORF3a accessory protein is a water-permeable channel that induces lysosome swelling // Commun Biol. - 2025. - T. 8. - №. 1. - C. 170.

185. Miao G. et al. ORF3a of the COVID-19 virus SARS-CoV-2 blocks HOPS complex-mediated assembly of the SNARE complex required for autolysosome formation // Dev Cell. - 2021. - T. 56. - №. 4. - C. 427-442.e5.

186. Zhang Y. et al. The SARS-CoV-2 protein ORF3a inhibits fusion of autophagosomes with lysosomes // Cell Discov. - 2021. - T. 7. - №. 1. - C. 31.

187. Zhu H. et al. SARS-CoV-2 ORF3a expression in brain disrupts the autophagy-lysosomal pathway, impairs sphingolipid homeostasis, and drives neuropathogenesis // FASEB J. - 2023. - T. 37. - №. 5. - C. e22919.

188. Hayn M. et al. Systematic functional analysis of SARS-CoV-2 proteins uncovers viral innate immune antagonists and remaining vulnerabilities // Cell Rep. - 2021. - T. 35. - №. 7. - C. 109126.

189. Banerjee A.K. et al. SARS-CoV-2 Disrupts Splicing, Translation, and Protein Trafficking to Suppress Host Defenses // Cell. - 2020. - T. 183. - №. 5. - C. 1325-1339.e21.

190. Klein S. et al. SARS-CoV-2 structure and replication characterized by in situ cryo-electron tomography // Nat Commun. - 2020. - T. 11. - №. 1. - C. 5885.

191. Harrison N.L. et al. How many SARS-CoV-2 "viroporins" are really ion channels? // Commun Biol. - 2022. - T. 5. - №. 1. - C. 859.

192. Singh Tomar P.P., Arkin I.T. SARS-CoV-2 E protein is a potential ion channel that can be inhibited by Gliclazide and Memantine // Biochem Biophys Res Commun. - 2020. - T. 530. - №. 1. - C. 1014.

193. Kern D.M. et al. Cryo-EM structure of SARS-CoV-2 ORF3a in lipid nanodiscs // Nat Struct Mol Biol. - 2021. - T. 28. - №. 7. - C. 573-582.

194. Tanida I., Ueno T., Kominami E. LC3 and Autophagy // Methods Mol Biol. - 2008. - T. 445. - C. 77-88.

195. Coleman J. et al. A live-cell fluorescence microplate assay suitable for monitoring vacuolation arising from drug or toxic agent treatment // Journal of Biomolecular Screening. - 2010. - T. 15. -№. 4. - C. 398-405.

196. Kimura S., Noda T., Yoshimori T. Dissection of the autophagosome maturation process by a novel reporter protein, tandem fluorescent-tagged LC3 // Autophagy. - 2007. - T. 3. - №. 5. - C. 452-460.

197. Jian F. et al. The STX17-SNAP47-VAMP7/VAMP8 complex is the default SNARE complex mediating autophagosome-lysosome fusion // Cell Res. - 2024. - T. 34. - №. 2. - C. 151-168.

198. Wood D.D. et al. Acute multiple sclerosis (Marburg type) is associated with developmentally immature myelin basic protein // Ann Neurol. - 1996. - T. 40. - №. 1. - C. 18-24.

199. Barzegar M. et al. Multiple sclerosis is associated with worse COVID-19 outcomes compared to the general population: A population-based study // Mult Scler Relat Disord. - 2023. - T. 79. - C. 104947.

200. Conway S.E. et al. COVID-19 severity is associated with worsened neurological outcomes in multiple sclerosis and related disorders // Mult Scler Relat Disord. - 2022. - T. 63. - C. 103946.

201. Russell D.H., Buchrach U. Clinical relevance of polyamines // CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences. - 1982. - T. 18. - №. 3. - C. 261-311.

202. Farhadian S., Shareghi B., Saboury A.A. Exploring the thermal stability and activity of a-chymotrypsin in the presence of spermine // J Biomol Struct Dyn. - 2017. - T. 35. - №. 2. - C. 435448.

203. Singh B.P. et al. Spermine and spermidine act as chemical chaperones and enhance chaperone-like and membranolytic activities of major bovine seminal plasma protein, PDC-109 // Biochem Biophys Res Commun. - 2017. - T. 493. - №. 4. - C. 1418-1424.

204. Budenholzer L. et al. Proteasome Structure and Assembly // J Mol Biol. - 2017. - T. 429. - №. 22. - C. 3500-3524.

205. Satoh T. et al. Structural basis for proteasome formation controlled by an assembly chaperone nas2 // Structure. - 2014. - T. 22. - №. 5. - C. 731-743.

206. Singh C.R. et al. 1.15 Ä resolution structure of the proteasome-assembly chaperone Nas2 PDZ domain // Acta Crystallogr F Struct Biol Commun. - 2014. - T. 70. - №. Pt 4. - C. 418-423.

207. Lee S.Y.-C., De la Mota-Peynado A., Roelofs J. Loss of Rpt5 protein interactions with the core particle and Nas2 protein causes the formation of faulty proteasomes that are inhibited by Ecm29 protein // J Biol Chem. - 2011. - T. 286. - №. 42. - C. 36641-36651.

208. Shim S M. et al. Role of S5b/PSMD5 in proteasome inhibition caused by TNF-a/NFKB in higher eukaryotes // Cell Rep. - 2012. - T. 2. - №. 3. - C. 603-615.

209. Levin A. et al. PSMD5 Inactivation Promotes 26S Proteasome Assembly during Colorectal Tumor Progression // Cancer Res. - 2018. - T. 78. - №. 13. - C. 3458-3468.

210. Kapphahn R.J., Bigelow E.J., Ferrington D.A. Age-dependent inhibition of proteasome chymotrypsin-like activity in the retina // Exp Eye Res. - 2007. - T. 84. - №. 4. - C. 646-654.

211. Vilchez D., Saez I., Dillin A. The role of protein clearance mechanisms in organismal ageing and age-related diseases // Nat Commun. - 2014. - T. 5. - №. 1. - C. 5659.

212. Kiechl S. et al. Higher spermidine intake is linked to lower mortality: a prospective population-based study // Am J Clin Nutr. - 2018. - T. 108. - №. 2. - C. 371-380.

213. Jones C.L. et al. Small Molecule Enhancement of 20S Proteasome Activity Targets Intrinsically Disordered Proteins // ACS Chem Biol. - 2017. - T. 12. - №. 9. - C. 2240-2247.

214. Njomen E. et al. Small Molecule 20S Proteasome Enhancer Regulates MYC Protein Stability and Exhibits Antitumor Activity in Multiple Myeloma // Biomedicines. - 2022. - T. 10. - №. 5. - C. 938.

215. Zheng R. et al. Spermine alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis via regulating T cell activation and differentiation // Int Immunopharmacol. - 2022. - T. 107. - C. 108702.

216. Yang Q. et al. Spermidine alleviates experimental autoimmune encephalomyelitis through inducing inhibitory macrophages // Cell Death Differ. - 2016. - T. 23. - №. 11. - C. 1850-1861.

217. Sijts E.J. a. M., Kloetzel P.M. The role of the proteasome in the generation of MHC class I ligands and immune responses // Cell Mol Life Sci. - 2011. - T. 68. - №. 9. - C. 1491-1502.

218. Rock K.L. et al. Inhibitors of the proteasome block the degradation of most cell proteins and the generation of peptides presented on MHC class I molecules // Cell. - 1994. - T. 78. - №. 5. - C. 761771.

219. Fabre B. et al. Label-free quantitative proteomics reveals the dynamics of proteasome complexes composition and stoichiometry in a wide range of human cell lines // J Proteome Res. - 2014. - T. 13. - №. 6. - C. 3027-3037.

220. Reinheckel T. et al. Comparative resistance of the 20S and 26S proteasome to oxidative stress // Biochem J. - 1998. - T. 335. - №. 3. - C. 637-642.

221. Al-Nashmi M. et al. Distinct HLA class I and II genotypes and haplotypes are associated with multiple sclerosis in Bahrain // Biomed Rep. - 2018. - T. 9. - №. 6. - C. 531-539.

222. Galehdari H. et al. Analysis of HLA-A*03 in Multiple Sclerosis Patients in Khuzestan Province, Iran // Gene, Cell and Tissue. - 2018. - T. 5. - №. 3. - C. e68293.

223. Rajaei S.J., Shakhsi-Niaei M., Etemadifar M. Highly association of HLA-A03/A31 and HLA-A24/A31 haplotypes with multiple sclerosis // JCMR. - 2022. - T. 13. - №. 2. - C. 121-128.

224. Jilek S. et al. HLA-B7-restricted EBV-specific CD8+ T cells are dysregulated in multiple sclerosis // J Immunol. - 2012. - T. 188. - №. 9. - C. 4671-4680.

225. Lomakin Y. et al. Exposure to the Epstein-Barr Viral Antigen Latent Membrane Protein 1 Induces Myelin-Reactive Antibodies In Vivo // Front Immunol. - 2017. - T. 8. - C. 777.

226. Gabibov A.G. et al. Combinatorial antibody library from multiple sclerosis patients reveals antibodies that cross-react with myelin basic protein and EBV antigen // FASEB J. - 2011. - T. 25. -№. 12. - C. 4211-4221.

227. Bjornevik K. et al. Longitudinal analysis reveals high prevalence of Epstein-Barr virus associated with multiple sclerosis // Science. - 2022. - T. 375. - №. 6578. - C. 296-301.

228. Ota K. et al. T-cell recognition of an immuno-dominant myelin basic protein epitope in multiple sclerosis // Nature. - 1990. - T. 346. - №. 6280. - C. 183-187.

229. Healy B.C. et al. HLA B*44: protective effects in MS susceptibility and MRI outcome measures // Neurology. - 2010. - Т. 75. - №. 7. - С. 634-640.

230. Limanaqi F. et al. A Sentinel in the Crosstalk Between the Nervous and Immune System: The (Immuno)-Proteasome // Front Immunol. - 2019. - Т. 10. - С. 628.

231. Tundo G.R. et al. At the Cutting Edge against Cancer: A Perspective on Immunoproteasome and Immune Checkpoints Modulation as a Potential Therapeutic Intervention // Cancers (Basel). - 2021.

- Т. 13. - №. 19. - С. 4852.

232. Ciechanover A. Intracellular protein degradation: From a vague idea thru the lysosome and the ubiquitin-proteasome system and onto human diseases and drug targeting // Best Pract Res Clin Haematol. - 2017. - Т. 30. - №. 4. - С. 341-355.

233. Huang X. et al. An atomic structure of the human 26S proteasome // Nat Struct Mol Biol. - 2016.

- Т. 23. - №. 9. - С. 778-785.

234. Choi W.H. et al. Open-gate mutants of the mammalian proteasome show enhanced ubiquitin-conjugate degradation // Nat Commun. - 2016. - Т. 7. - №. 1. - С. 10963.