«Модуляция системы комплемента человека пептидами и белками врождённого иммунитета in vitro» тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Кренев Илья Анатольевич

• Кренев Илья Анатольевич
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Кренев Илья Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Иммунитет. Врождённый иммунитет

1.2 Пептиды и белки врождённого иммунитета

1.2.1 Пептиды врождённого иммунитета

1.2.1.1 Краткая история изучения, механизмы действия и классификация пептидов врождённого иммунитета

1.2.1.2 Дефенсины

1.2.1.3 Ареницины

1.2.1.4 Тахиплезины

1.2.1.5 Гомезин

1.2.1.6 Капителлацин

1.2.1.7 Андроктонин

1.2.1.8 Пептид трематоды Echinostoma саргот

1.2.1.9 Танатин

1.2.1.10 Протегрины

1.2.1.11 Пептид С3Г системы комплемента

1.2.1.12 Перспективы и трудности применения препаратов на основе пептидов врождённого иммунитета

1.2.2 Белки врождённого иммунитета

1.2.2.1 Лизоцим

1.2.2.2 Лактоферрин

1.2.2.3 Активные формы кислорода и миелопероксидаза

1.2.3 Пептиды и белки врождённого иммунитета как регуляторы защитных функций организма и участники патологических процессов

1.3 Система комплемента

1.3.1 Архитектура комплемента

1.3.2 Физиологическая регуляция комплемента

1.3.3 Участие комплемента в типовых патологических процессах

1.3.3.1 Комплемент и воспаление

1.3.3.2 Комплемент и реакции гиперчувствительности

1.3.3.3 Комплемент и опухолевый рост

1.3.4 Нарушения физиологической регуляции комплемента

1.3.4.1 Пароксизмальная ночная гемоглобинурия

1.3.4.2 Атипичный гемолитико-уремический синдром

1.3.4.3 C3-гломерулопатии

1.3.5 Дефициты компонентов комплемента

1.4 Терапевтическая регуляция комплемента

1.4.1 Обзор ингибиторов комплемента

1.4.2 Клинически продвинутые пептидные ингибиторы комплемента

1.4.2.1 APL2 / пегцетакоплан

1.4.2.2 Cp40 / AMY-101

1.4.2.3 Зилукоплан / RA101495

1.4.2.4 PMX53, PMX205 / ALS205, JPE1375

1.4.3 Ограничения терапевтической модуляции комплемента

1.5 Белки и пептиды врождённого иммунитета как модуляторы активности комплемента

1.5.1 Пути действия пептидов и белков врождённого иммунитета на комплемент

1.5.2 Антимикробные пептиды и комплемент

1.5.3 Лизоцим и комплемент

1.5.4 Лактоферрин и комплемент

1.5.5 Миелопероксидаза, активные формы кислорода и комплемент

1.6 Заключение по обзору литературы

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Общий план исследования

2.2 Пептиды и белки врождённого иммунитета

2.2.1 Исследуемые полипептиды

2.2.2 Выделение а-дефенсинов человека

2.2.2.1 Обработка лейкоцитов

2.2.2.2 Твердофазная экстракция

2.2.2.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.2.3 Выделение лизоцима человека

2.2.3.1 Обработка ротовой жидкости

2.2.3.2 Твердофазная экстракция

2.2.3.3 Высокоэффективная жидкостная хроматография

2.2.3.4 Оценка чистоты и молекулярной массы

2.2.3.5 Оценка ферментативной активности лизоцима

2.2.3.6 Оценка антимикробной активности методом наложения геля

2.3 Модели активации комплемента с использованием эритроцитов

2.3.1 Общая характеристика используемых модельных систем

2.3.2 Модели классического и альтернативного путей активации

2.3.3 Модель пароксизмальной ночной гемоглобинурии in vitro

2.4 Иммуноферментный анализ

2.5 Оценка антимикробной активности разработанного пептида методом радиальной диффузии

2.6 Оценка гемолитической активности разработанного пептида

2.7 Выделение и характеристика белков, взаимодействующих с C3f

2.7.1 Подготовка бромциан-активированной сефарозы и иммобилизация C3f

2.7.2 Проведение аффинной хроматографии

2.8 Характеристика совместного антибактериального действия комплемента, лактоферрина и лизоцима

2.8.1 Изучение совместного действия комплемента, лактоферрина и лизоцима на выживаемость E. coli

2.8.2 Оценка целостности мембран E. coli

2.8.3 Изучение влияния лизоцима на кинетику бактерицидного действия сыворотки в отношении E. coli

2.9 Изучение действия активных форм кислорода на активацию комплемента

2.9.1 Изучение действия H2O2 и радикалов HO^ на комплемент-зависимый гемолиз (10% сыворотка в присутствии Mg-ЭГТА)

2.9.2 Изучение действия H2O2 и HOCl в модели жидкофазной активации комплемента (80% сыворотка)

2.9.3 Изучение действия HOCl в 5% сыворотке в присутствии Mg-ЭГТА

2.9.4 Изучение действия HOCl в 70% сыворотке в отсутствие и присутствии зимозана

2.9.5 Определение концентрации H2O2 и HOCl

2.10 Методы аналитической биохимии

2.10.1 Аналитический электрофорез в полиакриламидном геле в кислой среде в присутствии мочевины

2.10.2 Аналитический диск -электрофорез в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях в присутствии додецилсульфата натрия

2.10.3 Определение концентрации белков методом Брэдфорда

2.11 Статистический анализ и программное обеспечение

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1 Выделение а-дефенсинов человека

3.2 Выделение лизоцима человека

95

96

3.3 Модуляция системы комплемента человека ß-шпилечными пептидами врождённого иммунитета

3.4 Разработка нового ингибитора комплемента на основе ß-шпилечных пептидов врождённого иммунитета

3.4.1 Выявление связи первичной структуры с характером модуляции комплемента

3.4.2 Модуляция комплемента разработанным пептидом в моделях классического и альтернативного путей

3.4.3 Действие пептида на комплемент в модели пароксизмальной ночной гемоглобинурии

3.4.4 Результаты оценки антимикробной активности пептида

3.4.5 Результаты оценки гемолитической активности пептида

3.5 Модуляция системы комплемента человека эндогенными пептидами и белками врождённого иммунитета

3.6 Выделение и характеристика белков, взаимодействующих с C3f

3.7 Совместное действие лизоцима, лактоферрина и комплемента на выживаемость E. coli и проницаемость мембран

3.8 Результаты изучения действия активных форм кислорода на активацию комплемента

3.8.1 Действие H2O2 и радикалов HO^ на комплемент-зависимый гемолиз (10% сыворотка в присутствии Mg-ЭГТА)

3.8.2 Действие H2O2 и HOCl в модели жидкофазной активации комплемента (80% сыворотка)

3.8.3 Действие HOCl в 5% сыворотке в присутствии Mg-ЭГТА

3.8.4 Действие HOCl в 70% сыворотке в отсутствие и присутствии зимозана

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

182

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему ««Модуляция системы комплемента человека пептидами и белками врождённого иммунитета in vitro»»

Актуальность темы исследования

Система комплемента играет важную роль в иммунной защите. Её запуск приводит к образованию анафилатоксинов, опсонинов и сборке мембраноатакующего комплекса; значимо участие комплемента в клиренсе клеточного дебриса и апоптотических телец. Кроме того, комплемент выполняет и другие иммунные и неиммунные функции [Merle et al., 2015a, 2015b]. В то же время комплемент вовлечён в патологические процессы. В ряду типовых патологических процессов с существенным вкладом комплемента находятся воспаление, реакции гиперчувствительности, опухолевый рост. Неконтролируемая активация комплемента вследствие мутаций или аутоиммунного процесса с нарушением функций естественных белков -ингибиторов является ведущим звеном патогенеза ряда тяжёлых заболеваний, таких как пароксизмальная ночная гемоглобинурия, атипичный гемолитико-уремический синдром, C3-гломерулопатии. С другой стороны, дефициты комплемента ассоциированы с повышенным риском инфекционных и аутоиммунных заболеваний [El Sissy et al., 2019; Brodszki et al., 2020; Jia et al., 2022; Coss et al., 2023].

В настоящее время имеется потребность в терапевтических модуляторах комплемента, в особенности препаратов, ингибирующих активность данной системы, в связи с чем их поиск и характеристика является актуальной задачей.

Не до конца понятной остаётся роль эндогенных пептидов и белков врождённого иммунитета в модуляции функций комплемента. Формы поведения фагоцитов, связанные с высвобождением внутриклеточных компонентов во внеклеточную среду, - дегрануляция и нетоз - образование ловушек с полипептидами, проявляющими антимикробную активность [Vorobjeva, Chernyak, 2020; Gierlikowska et al., 2021]. Признаётся роль высвобождаемых из нейтрофильных гранулоцитов белков и пептидов врождённого иммунитета в патогенезе аутоиммунных заболеваний [Biswas et al., 2023]. Данные факторы способны действовать на систему комплемента. В свою очередь, активация комплемента приводит к выработке анафилатоксинов, способствующих активации нейтрофилов, в следствие чего завязывается петля обратной связи. Кроме того, полипептиды врождённого иммунитета в барьерных эпителиях и секретах желёз присутствуют совместно с компонентами комплемента. Модуляция комплемента этими факторами может способствовать как более эффективной реализации резистентности, опосредуемой барьерами и секретами, так и вносить вклад в патологические процессы, разворачивающиеся в тех или иных компартментах организма. Действие молекулярных факторов врождённого иммунитета на активацию различных путей комплемента, роль такого действия в патогенезе, перспективы использования пептидов и

белков врождённого иммунитета как мишеней действия препаратов для патогенетической коррекции комплемент-опосредованных процессов или как прототипов для создания таких препаратов в литературе охарактеризованы недостаточно.

В контексте нарастающей антибиотикорезистентности в качестве альтернативных антимикробных препаратов рассматриваются антимикробные пептиды, проявляющие высокую активность в модельных системах [Li et al., 2022]. Хотя наиболее существенным фактором, сдерживающим имплементацию данных соединений в клинику, является их цитотоксичность, обусловленная лизисом мембраны клеток макроорганизма, недостаточно описано стороннее действие на гуморальные мишени, в частности комплемент.

Таким образом, актуальность темы исследования обусловлена необходимостью поиска новых терапевтических ингибиторов комплемента, изучения побочных эффектов перспективных антимикробных пептидов и расширения представлений о взаимодействии эндогенных полипептидов врождённого иммунитета и комплемента.

Степень разработанности темы исследования

К настоящему времени одобрены два ингибитора комплемента на основе соединений пептидной природы - пегцетакоплан и зилукоплан [Shirley, 2024; West et al., 2024], для ряда пептидов описана комплемент-модулирующая активность. Известные пептидные и другие ингибиторы комплемента остаются малодоступными препаратами, их терапевтическое применение имеет свои недостатки и ограничения. На основе литературных данных и оригинальных результатов мы рассматриваем природные ß -шпилечные пептиды врождённого иммунитета различного видового происхождения и их аналоги как новый класс потенциальных терапевтических ингибиторов комплемента. Для некоторых ß -шпилечных пептидов (тахиплезин I, протегрин-1) описана способность взаимодействовать с белками комплемента человека и влиять на активность классического пути [Panyutich et al., 1994; Umnyakova et al., 2019]. Данная группа соединений привлекательна разнообразием природных и искусственных последовательностей, сочетающихся с относительной устойчивостью к действию протеаз и высокой антимикробной активностью, а также широкими возможностями модификации для улучшения желаемых свойств [Mahlapuu et al., 2016]. ß-Шпилечные антимикробные пептиды являются одними из перспективных кандидатов в качестве альтернативных антибиотиков [Panteleev et al., 2015b]. Важно отметить, что наличие антимикробной активности у ингибиторов комплемента - ценное терапевтическое свойство, поскольку блокирование функции комплемента как ключевого участника защитных реакций повышает восприимчивость к инфекциям [McNamara et al., 2017; Konar, Granoff, 2017]. С другой стороны, разработка противоинфекционных терапевтических агентов на основе пептидов должна включать анализ

возможных побочных эффектов, в т.ч. влияние на активность комплемента. Исследование действия эндогенных факторов врождённого иммунитета на комплемент ведётся с середины XX в., однако неполными и противоречивыми являются данные о действии на комплемент а -дефенсинов [Groeneveld et al., 2007; Prohâszka et al., 1997], лизоцима [Heesterbeek et al., 2019; Ogundele, 1998; Schiller et al., 1984], лактоферрина [Samuelsen et al., 2004], активных форм кислорода [Shingu, Nobunaga, 1984; Vogt et al., 1987; Vogt, 1996]. Это определяет необходимость более глубокого изучения данной проблемы.

Цель и задачи исследования

Цель: Установить характер действия пептидов и белков врождённого иммунитета на активацию системы комплемента человека in vitro для идентификации потенциальных терапевтических модуляторов комплемента, а также обоснования их участия в реализации защитных функций организма.

Задачи:

1) Охарактеризовать действие экзогенных ß -шпилечных пептидов врождённого иммунитета - ареницин-1, ареницин-1[С/А], ареницин-1^8Я], ALP1, ареницин-2, тахиплезин I, тахиплезин III, гомезин, капителлацин, андроктонин, антимикробный пептид трематоды Echinostoma caproni, танатин, протегрин -1 - на активацию системы комплемента человека в моделях классического и альтернативного путей in vitro;

2) На основе сравнительной характеристики функциональной активности ß -шпилечных пептидов разработать новый пептид с перспективными для терапевтического применения свойствами, оценить его комплемент-ингибирующую способность in vitro в моделях классического и альтернативного путей активации, пароксизмальной ночной гемоглобинурии, а также гемолитическую и антимикробную активность;

3) Охарактеризовать действие эндогенных факторов врождённого иммунитета человека - а-дефенсины, лизоцим (белок сравнения - лизоцим курицы), лактоферрин, активные формы кислорода, пептиды C3f и C3f-desArg - на комплемент in vitro.

4) Охарактеризовать совместное действие лизоцима и лактоферрина на классический путь комплемента, а также лизоцимов, лактоферрина и комплемента на выживаемость Escherichia coli и пермеабилизацию её мембран в присутствии комплемента.

Научная новизна

Впервые описана комплемент-модулирующая активность ряда природных и искусственных пептидов врождённого иммунитета. На основе сравнительной характеристики

их функциональной активности разработан новый пептид, ингибирующий активность комплемента, проявляющий антимикробное действие и не обладающий гемолитической активностью в отношении эритроцитов человека. Впервые показана способность лизоцима человека усиливать активность классического и альтернативного путей комплемента, предложена новая модель совместного действия лизоцима и комплемента. Впервые показана способность HOCl усиливать выработку анафилатоксинов в условиях с преимущественной жидкофазной активацией комплемента, но ингибировать комплемент в условиях с преимущественной поверхностной активацией системы. Впервые показана способность C3f и C3f-desArg усиливать выработку анафилатоксинов, причём избирательно в модели классического пути активации комплемента. Уточнено представление о функциональном взаимодействии лактоферрина и лизоцима в контексте модуляции классического пути комплемента, а также комплемент-зависимого бактериолиза и киллинга грамотрицательных бактерий.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Подтверждённые литературные и полученные новые данные о взаимодействии а-дефенсинов, лизоцима, лактоферрина с системой комплемента уточняют и расширяют представления о молекулярных механизмах защитно-приспособительных реакций, в т.ч. при инфекционном процессе. Выявленная активность C3f и C3f-desArg позволяет выдвинуть тезис о наличии ранее неизвестной положительной обратной связи в работе комплемента при его активации по классическому пути. Описание HOCl как уникального модулятора комплемента связывает комплемент с кислород-зависимой системой фагоцитов и предлагает дальнейшее исследование взаимодействия HOCl с биологическими молекулами, содержащими тиоэфирную связь.

Практическая значимость работы заключается в том, что изучена способность различных Р-шпилечных пептидов влиять на активность системы комплемента, а также разработан новый пептид с перспективными терапевтическими качествами (способность ингибировать комплемент, наличие антимикробной и отсутствие гемолитической активности). Эти соединения можно рассматривать прототипы препаратов для патогенетической коррекции комплемент-опосредованных заболеваний.

Методология и методы исследования

Исследование опирается на принятые в данной области методы и модели. Выделение пептидов и белков выполнено с применением современных хроматографических и аналитических методов. Изучение модуляции комплемента различными соединениями

проведено с применением стандартных гемолитических тестов в моделях классического и альтернативного пути активации и с помощью иммуноферментного анализа для определения анафилатоксинов C3a и C5a. Модуляция комплемента разработанным пептидом оценена в модели пароксизмальной ночной гемоглобинурии с использованием эритроцитов человека, обработанных восстанавливающим агентом. Модуляция комплемента исследована и в других моделях - в условиях жидкофазной активации, а также активации, опосредуемой зимозаном. Антимикробная активность оценивалась методами наложения гелей, инкубации в планшете с высевом и подсчётом колоний, а также в тестах по изучению целостности бактериальных мембран.

Основные положения, выносимые на защиту

1) ß-Шпилечные пептиды различаются по характеру модуляции активности системы комплемента человека в моделях классического и альтернативного путей in vitro. Наиболее эффективные ингибиторы комплемента - ареницин-1[V8R], ареницин-2, пептид трематоды Echinostoma caproni [M3L].

2) Разработанный пептид ареницин -2[V8R] ингибирует комплемент в моделях классического и альтернативного путей, а также в модели пароксизмальной ночной гемоглобинурии in vitro. Комплемент-модулирующие эффекты проявляются в концентрациях, в которых пептид проявляет антимикробную активность и не проявляет гемолитическую.

3) а-Дефенсины и лактоферрин выступают в роли ингибиторов классического пути комплемента, лизоцим человека активирует комплемент по классическому и альтернативному путям, пептиды C3f и C3f-desArg усиливают активность классического пути. Хлорноватистая кислота выступает в роли активатора жидкофазной, но ингибитора поверхностной активации комплемента.

4) Лизоцим и лактоферрин разнонаправлено и независимо модулируют активность классического пути комплемента. Лактоферрин не отменяет комплемент-зависимую бактерицидную активность сыворотки. Лизоцимы человека и курицы усиливают бактерицидную активность сыворотки в отношении Escherichia coli и ускоряют пермеабилизацию внутренней мембраны E. coli. Лизоцим курицы и в большей степени лизоцим человека ускоряют киллинг бактерии.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность результатов исследования обусловлена применением адекватных задачам и современных методов. Достоверность подтверждается воспроизводимостью результатов при проведении независимых опытов, верификацией в различных экспериментальных условиях.

Результаты диссертационной работы апробированы на следующих конференциях: XXII, XXV Международные медико-биологические конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина. Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2019 и 2022 гг.), VII Международный симпозиум «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2019 г.), 17th and 19th European Meetings on Complement in Human Disease (Мадрид, 2019 г. и Берн, 2022 г.), II Студенческий биохимический форум (Москва, 2020 г.), XXXII и XXXV Зимние молодёжные школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2020 и 2023 гг.), II, III и IV Мини-конференции с международным участием «Antimicrobial peptides as prototypes of novel antibiotics» (Санкт-Петербург, 2022, 2023 и 2024 гг.), XXVII и XXX Конференции молодых учёных «Актуальные проблемы биомедицины» (Санкт-Петербург, 2022 и 2024 гг.), 29th International Complement Workshop (Ньюкасл, 2023 г.).

Публикация результатов исследования

По результатам диссертации соискателем опубликованы 8 статей: 6 статей, включённых в Scopus и/или Web of Science, и 1 статья в журнале из списка ВАК по специальности диссертации, 1 статья в другом издании.

Личный вклад соискателя в проведение исследования

Соискатель лично участвовал в реализации всех основных этапов работы. Соискатель анализировал литературные данные, проводил экспериментальную работу, обрабатывал и критически рассматривал полученные результаты, писал текст диссертации. Некоторые полипептиды, использованные в исследовании, были любезно предоставлены сотрудниками других подразделений и организаций: д.б.н., проф. А.В. Соколов, отдел молекулярной генетики ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» - лактоферрин; д.б.н., проф. Т.В. Овчинникова, к.х.н. П.В. Пантелеев, ФГБУН «Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» - ряд рекомбинантных в -шпилечных пептидов; д.б.н., чл.-корр. О.В. Шамова, к.х.н. М.М. Хайдукова, А.С. Комлев, отдел общей патологии и патофизиологии ФГБНУ «Институт экспериментальной медицины» - ряд синтетических пептидов. Публикации оригинальных и обзорных статей и тезисов докладов по теме исследования - плод совместной работы соискателя с соавторами. Личный вклад соискателя составляет не менее 90%.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 194 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список сокращений, список литературы, приложение. Работа содержит 12 таблиц и 42 рисунка. Список литературы включает 482 наименования.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Иммунитет. Врождённый иммунитет

Живые организмы на протяжении всей эволюции находятся в постоянном взаимодействии с другими видами. Одна из его форм состоит в инфекции, т.е. попадании чужеродного начала (выражаясь языком И.И. Мечникова, «вредного деятеля») в организм, что потенциально может привести к нарушению гомеостаза и к смерти. Соответственно, в процессе эволюции у многоклеточных возникла потребность в развитии механизмов устойчивости к инфекциям. Мечников в фундаментальном труде «Невосприимчивость в инфекционных болезнях» писал: «Под невосприимчивостью к заразным болезням надо понимать общую систему явлений, благодаря которым организм может выдерживать нападение болезнетворных микробов. В настоящее время невозможно дать более точного определения, так что бесполезно настаивать на этом» [Мечников, 2019]; первый перевод на русский язык, одобренный автором, был опубликован в 1903 г., спустя полтора года после французского издания. Термин, переведённый на русский научный язык того времени как «невосприимчивость», на языке оригинала - immunité, т.е. «иммунитет» (от лат. immunitas - избавление от налогов); перевод на английский язык 1905 г. содержал слово immunity. С тех пор разные авторы предлагали множество определений терминам «иммунитет» и «иммунная система». Анализируя и суммируя их, мы можем определить иммунитет как само состояние невосприимчивости к конкретному патогенному организму, а под системой иммунитета понимать всю ту совокупность анатомических структур, клеточных элементов и молекул, которая обеспечивает иммунитет.

Первым и необходимым этапом иммунного ответа всегда является распознавание патогена, т.е. дискриминация «своего» (self) и «чужого» (non-self) за счёт рекогнисцировочных механизмов. Вслед за этим эффекторные механизмы обеспечивают элиминацию патогена. Таким образом, «иммунный ответ состоит из распознавания возбудителя или иного чужеродного материала и в развёртывании цепи реакций, направленных на их устранение» [Кокряков, 2006].

Сейчас к пониманию роли иммунной системы в защите от «заразных болезней» следует добавить представление о ней как участнике противораковой защиты (избавление от собственных, но изменённых клеток) и широкого спектра процессов, в которых её компоненты играют важную роль (морфогенез, удаление клеточного дебриса, беременность и др.).

Мечников проводил границу между невосприимчивостью врождённой и приобретённой, а также естественной и искусственной. «Первая [врождённая] всегда естественна, т.е.

независима от непосредственного вмешательства человеческого искусства. Приобретённый иммунитет часто также может быть естественным, так как устанавливается вследствие самостоятельного выздоровления после заразных болезней, но в очень значительном числе случаев приобретённая невосприимчивость может быть результатом прямого вмешательства человека, как в применении предохранительных прививок» [Мечников, 2019]. В конце XIX -начале XX в. двумя теориями иммунитета были клеточная, или фагоцитарная, теория Мечникова и гуморальная теория Пауля Эрлиха, обе из которых нашли своё подтверждение.

Во второй половине XX в. доминирующей была парадигма, в которой иммунитет - это «исключительно те защитные процессы, которые реализуются с участием лимфоцитов», при этом иммунная система отождествлялась с лимфоидной [Хаитов и др., 2000]. Так иммунитет строго отделялся от всех остальных защитных механизмов, среди которых система комплемента, белки острой фазы, фагоцитоз и «эндогенные пептиды -антибиотики» рассматривались как «доиммунные биологические механизмы резистентности к инфекциям» [Хаитов и др., 2000]. В случае лимфоцитов рецепторами, участвующими в распознавании патогена, являются белки иммуноглобулинового суперсемейства, разнообразие вариабельных доменов которых генерируется за счёт соматической рекомбинации генов [Hozumi, Tonegawa, 1976]. B-лимфоциты также претерпевают соматическую гипермутацию, в результате которой достигается большее разнообразие и более высокая аффинность антител [Steele, 2017]. Это представляет собой молекулярную основу теории клональной селекции, предложенной Burnet (1957). Формирование рецепторов за счёт рекомбинации и клональная селекция, а также иммунологическая память - характерные черты приобретённого, или адаптивного, иммунитета.

Возвращение к концепции врождённого иммунитета началось в конце 1980-х гг., уже после того, как значение иммуноглобулинов как рецепторных молекул лимфоидных клеток было признано. На основании накопленных данных, в т.ч. факта необходимости использования адъювантов для стимуляции продукции антител против конкретного антигена, Janeway (1989) высказал идею, что «иммунная система эволюционировала, чтобы распознавать и отвечать на инфекционные микроорганизмы, и что это включает не только распознавание специфических антигенных детерминант, но также определённых характеристик или паттернов общих для инфекционных агентов, но отсутствующих у хозяина <...> рекогнисцировочная функция, необходимая для иммунной респонсивности, проистекает из рецепторов, которые не являются клонально распределёнными». В этой работе Janeway впервые ввёл термины патоген-ассоциированные молекулярные паттерны (англ. pathogen-associated molecular patterns; ПАМП) и паттерн-распознающие рецепторы (англ. pattern recognition receptors; ПРР). В более полном виде концепция ПАМП и ПРР была опубликована в 2002 г. [Janeway, Medzhitov, 2002].

Первым подтверждённым ПРР стал TLR (анг. Toll-like receptor, Toll-подобный рецептор), который определяет противогрибковый иммунитет у дрозофилы [Lemaitre et al., 1996]. К настоящему времени идентифицировано множество ПРР. Каждый ПРР распознаёт определённый ПАМП, характерный сразу для больших групп патогенов: липополисахарид (ЛПС), липотейхоевые кислоты, двухцепочечные РНК вирусов, триациллипопептиды, флагеллины и др. [Li, Wu, 2021]. Взаимодействие ПРР с ПАМП приводит к запуску биологического ответа клетки, что может выражаться в индукции синтеза / секреции антимикробных пептидов, цитокинов, активации внутриклеточных бактерицидных систем, стимуляции фагоцитоза, дегрануляции и т.д., за счёт чего и реализуется иммунная защита.

Не все ПРР имеют клеточную локализацию. Некоторые из них присутствуют в циркулирующем виде или в секретах. Так, разнообразные лектины врождённого иммунитета распознают углеводные паттерны, характерные для бактериальных или грибковых клеток [Кокряков, 2006]. В частности, маннан-связывающий лектин и фиколины запускают лектиновый путь системы комплемента (разд. 1.3.1). В свою очередь, некоторые из подобных ПРР связываются со своими клеточными рецепторами. Тем не менее, в системе врождённого иммунитета распознавание патогена, его отличие от своего, может реализовываться не только с помощью канонических клеточных или циркулирующих ПРР. Спектр механизмов распознавания оказывается гораздо шире. Так, лизоцим (разд. 1.2.2.1) относят к системе врождённого иммунитета, но лизоцим - белок, присутствующий в секретах конститутивно; его синтез или секреция не обязательно индуцируются активацией ПРР, а его эффекты не опосредуются действием на клеточный рецептор. В данном случае распознавание патогена основано на субстратной специфичности фермента, который распознаёт и действует только на определённую гликозидную связь в молекуле пептидогликана, отсутствующую в молекулах хозяйского организма. Антимикробные пептиды (разд. 1.2.1), независимо от того, предшествует ли их действию рецептор-опосредованная активация клетки-продуцента, различают поверхность патогена и хозяйской клетки за счёт разницы в величине их поверхностного электрического заряда. Альтернативный путь комплемента регулируется присутствием сиаловых кислот на поверхности и рядом белков -ингибиторов (разд. 1.3.2) и в норме тоже действует только на чужеродные клетки.

Некоторые исследователи наряду с иммунитетом многоклеточных выделяют «иммунитет» бактерий, ввиду одноклеточности носителей имеющий исключительно молекулярные основы: препятствование адсорбции фагов за счёт элиминации или маскирования рецепторов, ингибирование транслокации чужерожной ДНК, система рестрикции/модификации, CRISPR/Cas-система [Aymeric, 2014]. Несмотря на то что в основе действия этих защитных систем тоже лежит молекулярная дискриминация «своего» и

«чужого», в настоящей работе термин «иммунитет» применяется только для многоклеточных организмов - животных, растений, грибов.

В заключение данного раздела необходимо подчеркнуть, что врождённый иммунитет, наиболее древняя форма иммунитета, присущая всем многоклеточным, определяет первичный ответ на инфекцию, а у позвоночных также способствует реакции системы приобретённого иммунитета (презентация антигена, модуляция лимфоцитарного ответа цитокинами и т.д.). Эффекторное звено врождённого иммунитета обеспечивается кооперацией различных факторов, клеточных и гуморальных. Дальнейшие разделы обзора включают данные об участии компонентов врождённого иммунитета в ряде нормальных и патологических процессов, а в фокусе настоящего диссертационного исследования находятся патогенетическая роль комплемента и его терапевтическая регуляция.

1.2 Пептиды и белки врождённого иммунитета

Сообразно разделению ранней иммунологии на гуморальную и клеточную теорию, поиск антимикробных веществ вёлся в биологических жидкостях (сыворотка крови, секреты желёз) и в фагоцитах. Антитела (исторические термины: «сенситезаторы», «амбоцепторы»; относятся к системе приобретённого иммунитета), комплемент («алексин», «а-лизин»), лизоцим (разд. 1.2.2.1) и «ß-лизин» находятся в ряду гуморальных белково-пептидных факторов.

Бактерицидные компоненты фагоцитов Мечников называл «цитазом». В течение последующих десятилетий события, приводящие к гибели поглощённой бактерии внутри фагоцита, называли «перевариванием», имея в виду сходство с клеточным пищеварением, присущим некоторым животным. Сам Мечников считал, что бактерицидные компоненты фагоцитов могут и не быть ферментами по своей биохимической природе. Долгое время единственным признанным антимикробным веществом фагоцитов был лизоцим и также имелись свидетельства о роли кислот в бактерицидной активности фагоцитов. К началу 1960-х гг. сложилось некоторое, скудное, на взгляд современного специалиста, представление об антимикробных компонентах в различных тканях и жидкостя, проблематичным был вопрос о таковых в фагоцитах. Было уже известно об антимикробной активности жирных кислот, стероидных липидов, порфиринов, лизоцима, гистонов, глобина, протаминов, спермина и спермидина, компонентов тромбоцитов и лимфатических узлов, но вещества, ответственные за инактивацию бактерий в ходе фагоцитоза мононуклеарами и нейтрофилами, не были точно установлены, но предполагалось, что лизоцим, кислоты (такие как молочная), гистоны и «фагоцитин» могут являться ключевыми компонентами [Hirsch, 1960a]. «Фагоцитин» был

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кренев Илья Анатольевич, 2025 год

/ / / /

4 /.

V I «

7 ХУ ^

У\ > '

Рисунок П.9 (к главе 4) - Сравнение структур лизоцимов человека и курицы. Панель сверху -выравнивание первичных структур лизоцима человека (сверху; ИшРгО ГО Р61626) и лизоцима

курицы (снизу; ИшРго! ГО Р00698), чёрные линии показывают дисульфидные связи. Ниже приведено сравнение третичных структур лизоцима человека (слева; РББ ГО 2BQA) и лизоцима курицы (справа; РББ ГОШРХ), показаны К- и С-конец. Пурпурным цветом выделены а.о. с похожими физико-химическими свойствами, жёлтым - с непохожими. Остальные а.о.

идентичны.