Молекулярная филогения и организация редактируемых митохондриальных генов у моногенетических и дигенетических трипаносоматид тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Мерзляк, Екатерина Марковна

• Мерзляк, Екатерина Марковна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мерзляк, Екатерина Марковна

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

Конверсия С—»и, и—>С

Растения

Цис-элементы

Транс-факторы

Эволюция процесса редактирования у растений

Миксомицеты

Котранскрипционная вставка незакодированных нуклеотидов

Редактирования за счет РНК-зависимой РНК-полимеразы

Редактирование у трипаносоматид

Модели редактирования

Белки редактирующего комплекса

Белки, взаимодействующие с гРНК р65 СгиИнЛа/аъасиЫа

ООН (р 110)

ТВКОС

Взаимодействие гРНК с пре-мРНК 33 - Отредактированные транскрипты являются матрицей для трансляции

Молекулярная эволюция трипаносоматид

Эволюция редактирования у трипаносоматид

Материалы и методы

Объекты исследования.

Ферменты и реактивы.

Культивирование моногенетических трипаносоматид

Выделение ДНК

Полимеразная цепная реакция (ГГЦР)

Клонирование ПЦР-продуктов

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ дц - двуцепочечный; гРНК - гидовая РНК; кДНК - копии ДНК; кпДНК - кинетопластная ДНК; мтДНК - митохондриальная ДНК; нт - нуклеотид;

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция, полимеразная цепная реакция; оц - одноцепочечный;

ПААГ - поликриламидный гель; по - пар оснований; пре-мРНК - предшественник матричной РНК;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

РД - редактируемый домен; рРНК - рибосомальная РНК; тпо - тысяч пар оснований; тРНК - транспортная РНК;

УФ - ультрафиолетовый

А6 - ген 6-ой субъединицы АТФазы; сох2 - ген цитохромоксидазы 2; Cyb - ген цитохрома Ъ\ DMSO - диметилсульфоксид; DTT - дитиотреитол;

EDTA - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусная кислота;

ND8 - ген 8-ой субъединицы NADH-дегидрогеназы;

ТАЕ - трисацетат ЭДТА;

TBE - трисборат ЭДТА;

ТЕ - трис ЭДТА;

TEMED - N,N,N',N' - тетраметилэтилендиамин;

PSA - персульфат аммония;

SDS - додецилсульфат натрия;

SSU - малая субъединица рибосомы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярная филогения и организация редактируемых митохондриальных генов у моногенетических и дигенетических трипаносоматид»

Изучение паразитических простейших, относящихся к семейству Trypanosomatidae, помимо фундаментального интереса имеет и социальную значимость. Так, эти организмы являются возбудителями тяжелых заболеваний человека (трипаносомозов и лейшманиозов), скота и растений. При этом вплоть до последнего времени не существует эффективных методов борьбы с этими возбудителями. Поэтому исследование фундаментальных молекулярно-биологических, биохимических и паразитологических аспектов жизнедеятельности трипаносоматид, а также их филогения, имеют большое значение.

Процесс реализации генетической информации является одной из основных проблем современной молекулярной биологии. Описание таких процессов как сплайсинг и РНК-редактирование значительно усложнило простую и однозначную схему Уотсона-Крика ДНК->РНК-^белок. На данный момент существует множество примеров этих процессов в разных систематических группах и в различных системах. Показана их значительная роль в увеличении структурного и функционального разнообразия белковых молекул и в осуществлении дополнительного контроля над экспрессией того или иного гена (Brennicke et al., 1998).

Одной из самых интригующих систем, где РНК-редактирование играет чуть ли не основную роль в реализации митохондриального генома, является группа паразитических простейших, относящаяся к отряду Kinetoplastida, включающего семейство Trypanosomatidae. У этих организмов процесс редактирования заключается в посттранскрипционной вставке, либо в вырезании уридиловых остатков в пре-мРНК. Для описания механизма уридилового редактирования предложена модель ферментативного каскада. Также показано, что процесс является матричным (сайт редактирования формируется за счет взаимодействия с малыми РНК митохондриального кодирования, так называемыми гидовыми РНК (гРНК)) и направлен от 3'->5' по пре-мРНК (Alfonzo et al., 1997; Estevez et al., 1999a; Schneider, 2001; Madison-AHTenucci et al., 2002).

Следует отметить, что редактированию подвергаются практически все митохондриальные гены, однако размер редактируемого домена (РД) для одного и того же криптогена может варьировать в различных группах этого отряда. При анализе распределения длины РД гена А6 (6-ой субъединицы АТФазы) Масловым с соав. (Maslov et al., 1994; Simpson et al., 1994) было высказано предположение о том, что наиболее протяженное редактирование характерно для более древних видов (в 6 частности, представителей рода Trypanosoma), а уменьшение длины РД напрямую связано с филогенетическим положением и присуще более позднедивергировавшим видам (например, представителям рода Leishmania). Однако, этот вывод был сделан на основании сопоставления последовательности гена А6 лишь у 5 видов.

Для определения филогенетических отношений в группе трипаносоматид были использованы различные молекулярные маркеры, так как морфологические признаки у этих организмов развиты слабо (Vickerman, 1994; Maslov et al., 1996; Подлипаев и др., 2000). Обнаружение всё новых изолятов, а также фрагментарность данных по одному маркеру делает картину крайне неопределённой и непригодной для систематического сравнения. Это диктует необходимость дополнительных систематических исследований с привлечением возможно большего числа представителей трипаносоматид.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Центральная догма молекулярной биологии: ДНК -> РНК белок, сформулированная Уотсоном и Криком в 1965 году, описывающая реализацию генетической информации, подвергалась в течение последних 35 лет многочисленным дополнениям. В результате эта схема сильно усложнилась. Первым наблюдением, которое привело к изменению схемы ДНК -> РНК -> белок, можно считать открытие некодирующих последовательностей внутри кодирующих, то есть открытие экзон— интронной структуры и, соответственно, явления РНК сплайсинга. Далее необходимо отметить открытие РНК редактирования, которое заключается во вставке и делеции уридиловых оснований в митохондриях простейших, относящихся к отряду Kinetoplastida. Оба этих наблюдения, по мнению самого Уотсона, принципиально изменили основную догму молекулярной биологии (Thieffry, 1998). Дальнейшие исследования показали, что редактирование РНК, приводящее к изменению той информации, которая закодирована в ДНК (ядерном, митохондриальном, либо хлоропластном геномах), является широко распространенным явлением, включает различные механизмы и встречается у широкого круга организмов (Smith et al., 1997, Brennicke et al., 1998, табл. 1).

Значение процесса редактирования для жизнедеятельности организмов не подлежит сомнению. Так, в случае Trypanosomatidae попытки вывести линии дефектные по белкам компонентов редактирующего комплекса не увенчались успехом. Поэтому можно предположить, что белки этого комплекса оказываются необходимыми для выживания и ничем не комплементируются. Хорошим примером необходимости редактирования могут служить также null мутанты по гену dADAR у Drosophila. Отсутствие продукта этого гена не приводит к летали, однако, наблюдаются дегенеративные расстройства нервной системы. Для 30-дневных мух характерно долгое пребывание в неактивном отдыхе, в периоды которого они лежат на спине. К 50-ому дню у мух постоянно подняты крылья, часто встречаются асимметричные позы с одним поднятым крылом и ногой (Palladino et al., 2000).

В большей части описанных примеров роль редактирования заключается в увеличении количества изоформ того или иного белка. Так, например, в гене cacophony - кодирующего белок кальциевого канала нервных клеток Drosophila, показано 10 сайтов редактирования. Таким образом, сочетание разных отредактированных сайтов дает более 1 ООО различных белковых продуктов и это, не считая сплайсинга (Keegan et 8 al., 2001). Однако, роль редактирования не всегда столь однозначна. Так, известны примеры, когда этот процесс происходит в некодирующих областях: интронах, а также 3' и 5' UTR (нетранслируемые области).

Можно думать, что необходимость сплайсинга и редактирования сводится к увеличению количества белковых продуктов, считываемых с одного гена, в результате чего организм становится более лабильным к внешним воздействиям. Например, по-разному отредактированный серотониновый рецептор 5-НТ2С человека имеет разную константу связывания к LSD и другим препаратам этого ряда (Keegan et al., 2001).

В обзоре литературы мы рассмотрим процессы редактирования РНК генов митохондриального и хлоропластного кодирования, также возможную роль редактирования в жизнедеятельности разных организмов. Наряду с этим, в обзоре будут приведены данные об эволюционном происхождении этих процессов. Особое внимание мы уделим процессу редактирования у Trypanosomatidae - организмам, у которых этот процесс был впервые обнаружен и достаточно много исследовался. Именно представители этого семейства явились объектом наших исследований.

Таблица 1. Типы РНК-редактирования, описанные в разных системах (по Smith et al., 1997, с дополнениями). В случаях дополнения приведены ссылки на оригинальные работы.

Тип редактирования Организм ¡органоид Субстрат Предположительные транс- и цис- элементы Механизм редактирования

Модификация основания

Конверсия С—>U, U—>С высшие растения (мхи, двудольные, однодольны€)/митохондрии и хлоропласты гены митохондри-ального и хлороп-ластного кодирования С - дезаминирование, U - аминирование.

Конверсия С—>U сумчатые/митохондрии тРНК (С1у—»Азр) в антикодоне трипаносоматиды/митохондрии (Alfonzo et al., 1999) тРНК (СОА->иСАТф) импортируемые тРНК млеко п итаю щи е/ядра Аполипопротеин В С1и-«и>р С6666 - фор-мировнаие двух типов белков переносчиков липидов разной плотности. АРОВЕС-1 , ASF (АРОВЕС1 -стимулирующий фактор) (Lellek et al., 2000) С - дезаминирование.

Дезам инирование А—>1 Млекопитающие/яс)/?а млекопитающие, Drosophila (Palladino et al., ЮЩ/ядра - человек, мышь (Maas et al., Ют)!ядра - дц мРНК серотонинового рецептора 5-НТ2с дц мРНК натриевых и кальциевых каналов тРНК, первый этап модификации ADAR? ADAR1, ADAR2, ADAR3 hADAT, mADAT А - дезаминирование (ADAR -металлофермент с Zn в активном центре - фермент близок к метилтрансферазам)

А37-^т'137

Замена и~>А человека/я<3/?£7 мРНК гена а-галактозидазы РИе—>Туг ? Замена основания

Замены С—>А, А—»в, и->в, и—>А АсамИотоеЬа са$1е11апШ митохондрии тРНК внутренние гидовые последовательности ? Замена основания

Редактирование за счет вставок и делеций

Вставки и делеции и отряд Клпе1ор1а5ис1а сем. Тгурапо5отайс1ае, Bodonidae/ митохондрии пре-мРНК, транскрипты митохондриального кодирования гРНК, белки редактирующего комплекса: эндонуклеаза, ТУТаза, экзонуклеаза, РНК-лигаза, дополнительные белки. Модель ферментативного каскада

Котранскрипционная вставка С, и, АА, Си, ви, ее РИухагит ро1усерИа1ит, и др. представители М^хотус^ав/ митохондрии мРНК, рРНК, тРНК Вставка сопряжена с транскрипцией

Посстранскнипционная достройка транскриптов человек, трипаносоматиды/ митохондрии - трипаносоматиды/лш/иохо«с)/?ии мРНК появление стоп кодонов и поли-А хвоста гРНК, поли-и хвосты поли-А полимераза, ТАТаза - ТУТаза

Посттранскрипционная достройка 3' конца тРНК Ь'икоЫш /офсШш, митохондрии (Ьаугоу е1 а1., 2000) тРНК последовательность комплементарной цепи является матрицей для достройки аминоакцепторного стебля. ? РНК-зависимая РНК-полимераза

Конверсия C—rfJ, U—>C

Как видно из таблицы 1, конверсия С—»U, U-»C как тип редактирования является одним из самых часто встречаемых. Наиболее широко этот вид редактирования распространен в растениях, так как затрагивает практически все митохондриальные и хлоропластные транскрипты. Этот тип редактирования будет подробно рассмотрен на примере растений, а также миксомицетов. Растения

Конверсия С—»U, U—»C обнаружена в митохондриях и хлоропластах сосудистых растений. У семенных растений чаще встречается конверсия С—»U, а у споровых — обе конверсии являются частыми и практически равновероятными. Обычно конверсии подвергается вторая позиция кодона. Описаны случаи, когда стоп-кодоны внутри рамки считывания редактируются с образованием Gin (Е) и Arg (R). Чаще этот тип редактирования происходит в экзоне, хотя может быть и в интроне. Было показано, что редактирование интрона типа II в гене nad7 приводит к усилению внутренней шпилечной структуры этого интрона (Carrillo, С. et al., 2001). Также имеются указания на роль редактирования в посттранскрипционной регуляции. Так, при низких температурах наблюдалось накопление несплайсированной мРНК гена сох2 пшеницы, но общее количество зрелых транскриптов оставалось прежним (Kurihara-Yonemoto et al., 2001). Однако, в этой же работе авторы показали, что низкие температуры могут частично ингибировать РНК редактирование, в том числе и те сайты, которые находятся внутри интрона гена сох2, делая тем самым процесс сплайсинга менее эффективным. На наш взгляд, в этом случае, скорее всего, подавляется не само редактирование, а каким-то образом, изменяется экспрессия транс-факторов (см. ниже).

Одной из особенностей этого типа редактирования (конверсия С—»U, U—>С) у растений, по-видимому, является полярность 3'—>5' по пре-мРНК. Так, при анализе кДНК библиотеки хлоропластов было показано, что существуют частично отредактированные транскрипты, причем полярность этого процесса 3'—>5' (Yoshinago et al., 1997).

Почти все митохондриальные гены подвергаются редактированию и число таких сайтов может быть до 1000 в одном гене. В хлоропластах это явление более редкое - до 50 сайтов в одном гене. Редактирование найдено в мутантных хлоропластах ячменя с почти полностью отсутствующими рибосомами (Zeitz et al., 1993). Эти данные могут свидетельствовать о том, что все белки участвующие в редактировании, импортируются из цитоплазмы, и, следовательно, имеют ядерную локализацию. Редактирование в растениях - это органоидоспецифичный процесс: попытка экспрессии митохондриальной мРНК с потенциальными сайтами редактирования в трансгенном хлоропласте не привела к конверсии.

В полном геноме Arabidopsis показано 8 открытых рамок считывания, имеющих протяженные участки гомологии с цитидиндезаминазой, фермента, претендующего на основную роль, осуществляющего дезаминирование С. Однако, какая из них реально участвует в этом процессе остается невыясненным (Bailey-Serres et al., 1999).

Интересным примером возможной роли редактирования в хлоропластах табака может быть появление Leu (вместо Ser) в гроА (а-субъединица РНК полимеразы (РНКП) хлоропластного кодирования) в результате замены С на U. Следует отметить, что позиция этого Leu является крайне консервативной во всех хлоропластных РНКП и эубактерий (Hirose et al, 1999). Исследование роли индивидуальных аминокислот а-субъединицы РНКП Е. coli показало, что этот Leu важен для активации транскрипции, так как связывается с транскрипционными факторами (сАМР receptor protein, enhancer elemeHTs). При анализе транскриптов гроА было показано, что 70% из них были отредактированы. Авторы предполагают, что существует два типа альтернативных белков гроА: 1) полученные с не отредактированной матрицы и не способные связываться с транскрипционными факторами и 2) изоформа белка, транслированная с транскрипта, в котором прошла конверсия (Hirose et al., 1999). Цис-элементы

Цис-элементы для процесса конверсии С—»U и U—>С охарактеризованы крайне недостаточно. Так для митохондриальных мРНК показана важность не более 100 фланкирующих нт и более значимой является 5' область перед сайтом редактирования. Для хлоропластов важны 50 нт, окружающие сайт редактирования, но есть варианты, где изменение одного из 80 нт приводит к понижению эффективности конверсии. Никаких консенсусных последовательностей в сайтах редактирования не выделено (Lamattina et al., 1991; Araya et al., 1992). В более поздней работе Йошинага (Yoshinago et al., 1997) для хлоропластного гена atbp Anthoceros formosae при попытке выделения потенциальных цис-элементов, показано существование вторичных структур в местах редактирования. Определены вторичные структуры двух типов: из 29 изученных сайтов 4 образовывали шпильки длиной 5-9 пар оснований, а остальные 25 - петли, стабилизированные в основании спаренными нт. Предположение о существовании вторичных структур может объяснить два феномена, показанных для редактирования в хлоропластах и митохондриях растений: отсутствие консенсусных последовательностей и специфическое действие транс-факторов (Yoshinago et al., 1997).

Развитие технологий по получению трансгенных растений, несущих гетерологические последовательности внутри пластид (Воск, 1998), дало возможность предпринять попытки по идентификации дополнительных цис-элементов и предпочтение в действии транс-элементов при редактировании. Так, в работе Херман (Hermann et al., 1999) анализировали сайты IV и V в гене ndhB табака (Nicotiana tabacum), которые разнесены на 9 нт, причем в самой последовательности содержится несколько С, которые не подвергаются конверсии. Были получены мутантные конструкции, в которых были изменены расстояния между сайтами редактирования (табл. 2). С помощью этих плазмид были получены трансгенные растения и проанализированы кДНК исследуемого гена на предмет конверсии С.

Таблица. 2. Эффективность редактирования при изменении расстояния между сайтами редактирования у растений за счет введения различных плазмид по данным Hermann et al. (1999). Позиции, подвергающиеся конверсии обозначены красным, зеленым - мутация, маленьким шрифтом дополнительный нт, который был вставлен в последовательность гена ndhB, желтым выделены компенсаторные С, которые оказались субстратом для дезаминирования. + означает частоту конверсии, сравнимую с диким типом, - соответствует отсутствию редактирования. Приведен процент конверсии по сравнению с диком типе.

Название Плазмиды Последовательность, подвергающаяся редактированию EIV ЕУ

Wt (дикий тип) pRB59 IV V ТТТССС CAGCCCCTTCTCATCAATGGACTCCTGACGTA + +

PRB67-A1 ТТТССС -'AGCCCTTCTCATCAATGGACTCCTGACGTA +

PRB68-A2 IV V' ТТТССС CAGCCTTCTCATCAATGGACTCCTGACGTA + + (конверсия в новой позиции)

PRB69-il TTTCCCcCAGCCCCTTCTCATCAATGGACTCCTGACGTA 20%

PRB73-Al/cm IV V' ТТТССС OAGCCCTTO TATCAATGGACTCCTGACGTA + 35% (конверсия в компенсаторной позиции)

Из таблицы видно, что для эффективного редактирования критичны расстояния между вышележащим (upstream) и нижележащими (downstream) редактируемыми сайтами, а также, видимо, контекст, в котором находится С (снижение эффективности конверсии в сайте V' pRB73-Al/cm). При попытке выделить какой-либо контекст, в котором чаще всего наблюдается конверсия, в работе Хирозе (Hirose et al., 1999) были подсчитаны все нт, которые чаще всего встречаются в +1 и -1 положениях. Оказалось, что в +1 положении находятся А, а в -1 - либо Т, либо С.

В аналогичных работах при анализе генов psbL и ndhB в растениях табака было показано, что для редактирования необходимы как вышележащие, так и нижележащие последовательности. Это было продемонстрировано при использовании делеционных мутантов, у которых отсутствовали эти области. Также химерные транскрипты, которые содержали область редактируемого сайта гена psbL, слитого с аналогичной областью ndhB, и, наоборот, где эти области были поменяны местами, практически не подвергались редактированию (Hirose et al., 2001). Транс-факторы

Долгое время вопрос о существовании транс-факторов конверсии у растений оставался открытым, хотя имелись косвенные данные об их участии. Так, например, у табака при введении плазмиды, содержащей 93 нт гена psbL (редактируется инициаторный кодон ACG-+AUG), в котором содержался сайт редактирования, интенсивность редактирования в эндогенном районе снизилась вдвое. Из этого был сделан вывод, что транс-фактор(ы) существует и участка в 93 нт достаточно для его (или их) связывания (Chaudhuri et al., 1995). В аналогичной работе, где был выбран другой ген и участок меньшего размера, были получены дополнительные факты об участии цис- и транс-факторов (Reed et al., 2001). В этой работе были получены рекомбинантные плазмиды, которые содержали 27 нт (-20 - +6) второго сайта редактирования хлоропластного гена гроВ и ген селективного маркера. Надо отметить, что этот сайт редактируется в хлоропластах табака, но отсутствет в гомологичном участке этого гена черной сосны (Pinus thungerii), причем разница заключается всего в 4-х нт позициях (-20, -7, +1, +2). Для (+1) позиции показано, что аналогичная замена есть в гене кукурузы и редактирование происходит. Следовательно, эта замена не является критичной для протекания редактирования и, поэтому она была исключена из общего анализа. Плазмиды, которые содержали все возможные сочетания замен и отличающие соответствующие участки гена гроВ табака и сосны, были трансформированы в хлоропласты. Анализ транскриптов показал, что в редактировании соответствующего участка эндогенного гроВ не происходит никаких изменений, что, по мнению авторов, свидетельствует об отсутствии связывания с транс-фактором. С другой стороны, редактирование трансгенного участка полностью отсутствовало при введении нт соответствующего -20-му положению гена гроВ сосны. При увеличении трансгенного участка до 93 нт количество отредактированных транскриптов в эндогенном участке в сайте 2 снизилось в 3 раза (Reed et al., 2001).

В самых последних работах были оптимизированы условия1, для проведения РНК редактирования in vitro. В результате этого удалось проследить за появлением продуктов редактирования и была показана необходимость АТР для этого процесса конверсии. Однако, при редактировании ядерного транскрипта аполипопротеина В не было показано участие АТР (табл. 1). Это может указывать на то, что поиск сайта редактирования в митохондриальных и хлоропластных транскриптах является энергозависимым процессом. С использованием УФ-сшивок были выявлены белки р25 и ср31, являющиеся, по-видимому, транс-факторами. срЗ 1 содержит мотив узнавания нуклеиновых кислот, а делеция по этому домену приводит к отсутствию связывания белка и РНК. Одним из доказательств того, что срЗ 1 участвует в конверсии, является тот факт, что добавление антител к этому белку приводит к полному исчезновению продуктов редактирования (Hirose et al., 2001). Эволюция прогресса редактирования у растений

Вопрос о степени распространенности редактирования в разных группах растений был поднят относительно давно. В работе Хизел с соавт. (Hiesel et al., 1994) ^ было показано, что эта модификация митохондриальных транскриптов встречается во всех группах сосудистых растений (семенные, папоротники, хвощи) и в трех различных группах бриофит: мхи, стрелолистники и печеночники (Malek et al., 1996).

Детально вопрос редактирования в митохондриях растений рассмотрен в работе Штайнхаузера (Steinhauser et al., 1999). Авторы провели исследование двух митохондриальных генов сохЗ и nad5 и проанализирован широкий спектр растений, относящийся к различным филогенетическим группам. Сайты редактирования были картированы путем сравнения кДНК с геномными последовательностями. Было показано, что ген nad5 подвергается редактировании у 30 видов мхов, 2 видов стрелолистника, 7 видов печеночников (Jungermanniidae). РНК редактирование у представителей Jungermanniidae происходит в 6% кодонов. Однако этот процесс отсутствует у печеночников со сложным талломом (Marchantiidae) и зеленых Этот метод включает в себя получение транскрипта с избирательно меченым р*С. Олигорибонуклеотид лигируют с помощью Т4 РНК-лигазы с 5' меченым транскриптом. Такую полусинтетическую РНК инкубируют с хлоропластным лизатом. После чего обрабатывают нуклеазой PI и подвергают тонкослойной хроматографии; при этом С и U можно легко отделить на радиоавтографе. водорослей порядка СЬага1е8, которые считаются предковыми формами современных наземных растений. Полученные данные были соотнесены с филогенетическими деревьями, хотя до сих пор нет однозначной схемы происхождения тех или других групп растений. По многим маркерам, например, по наличию интронов 1-ого типа все мхи и печеночники объединяются в одну группу; при этом .Гиг^егтапппёае и МагсЬапШёае образуют сестринский кластер. Однако, как уже отмечалось, МагсЬапШёае - это практически единственная группа наземных растений, в которой не было найдено редактирования. Эти наблюдения предполагают, что в группе МагсЬапШёае произошла вторичная потеря процесса редактирования, либо, во всяком случае, его сильная редукция (рис. 1).

Аналогичные исследования были проведены для хлоропластных генов. При анализе генов п(Ш*> и гЬсЪ в разных эволюционных группах было показано, что редактирование присутствует практически во всех группах наземных растений; исключение (как и в случае митохондрий) составили некоторые печеночники, а также харовые водоросли (Ргеуег е1 а1., 1997). Отсутствие редактирования в одних и тех же группах, как в митохондриях, так и в хлоропластах, может свидетельствовать об одинаковом эволюционном происхождении этого процесса в обоих органоидах. В работе также было показано, что положение сайта редактирования не является консервативным, и оно может отличаться даже у близкородственных видов. Отсутствие какой-либо закономерности в организации сайтов редактирования, видимо, связано с их независимым неоднократным появлением и потерей в ходе эволюции. В другой работе (УоэЫг^о е1 а1., 1997) при анализе хлоропластного гена МрЪ отмечена

Lycopodtopsida0B(yopsjda

Charales

Marchantiopsida

Рис. 1. Наличие редактирования в разных группах Plantae: "+" -означает наличие редактирования в этой группе, "-" - отсутствие, соотнесенные с филогенетическим древом. Заштрихованный круг обозначает узел, в котором появилось редактирование.

Однако, видно, что у одной из групп мхов - Marchantiidae оно отсутствует. Черный круг объединяет две группы мхов, в которых обнаружены интроны I типа (по Steinhauser et al., 1999). тенденция к уменьшению числа сайтов редактирования в ряду: у Anthoceros formosae -29 сайтов, у Angiopteris - 3, у Pinus - 1, а у покрытосеменных растений редактируемые сайты полностью отсутствуют. Таким образом, на этом примере хорошо видно, что у более позднедивергировавших видов редактирование является не столь распространенным процессом. Авторы этой статьи предполагают, что этот тип редактирования возник в хлоропластах и митохондриях растений, вышедших на сушу (так как отсутствует у Chara), а далее постепенно редуцировался в хлоропластах до полного исчезновения у покрытосеменных. Однако в митохондриях растений аналогичной редукции, по-видимому, не произошло (Yoshinago et al., 1997).

Сравнение редактирования транскриптов, синтезированных с гомологичных генов, закодированных в хлоропластном и митохондриальном геномах, проведено для Arabidopsis thaliana (Lutz et al., 2001). Такими генами оказались следующие пары: ndhB и nad2\ ndhD и nad4 - субъединицы NAD(P)H дегидрогеназного комплекса. Количество сайтов редактирования сильно отличалось в исследованных парах. Так, например, для ndhB было показано 8 сайтов и для nad2 - 31, причем ни один из этих сайтов не совпадали. Аналогичная картина была показана и для второй пары. Из этих наблюдений авторы приходят к выводу, что позиции сайтов редактирования не являются консервативными и число сайтов эволюционируют независимо в митохондриях и хлоропластах.

В литературе существуют и другие мнения по вопросу о происхождении редактирования у растений. Так, Scott (1995) предполагает, что редактирование было у а-протеобактерий и цианобактерий, которые, согласно эндосимбиотической теории, явились предшественниками митохондрий и хлоропластов эукариот. Правда, у этих групп бактерий феномен редактирования, насколько нам известно, не был до сих пор показан. Тем не менее, автор считает, что бактерии утеряли редактирование, став симбионтами эукариотической клетки, а редактирование у низших растений возникло de novo у предковой формы наземных растений после ответвления мхов. Затем возник процесс вторичной частичной редукции, который мы наблюдаем как уменьшение числа сайтов редактирования у голо- и покрытосеменных растений (Scott, 1995).

Для проверки гипотезы о том, не имеет ли редактирование селективного преимущества было проведено сравнение количества редактируемых сайтов у однодольных и двудольных растений; при этом предполагалось, что если такое преимущество действительно существует, то такие позиции должны быть крайне консервативными (Shields et al., 1997). Было произведено выравнивание и подсчитано количество синонимических замен (то есть тех, которые не приводят к появлению другой аминокислоты) в сайтах редактирования и в местах, неподвергающихся процессингу. Оказалось, что замена С на Т в сайтах, где происходит конверсия C->U, происходит в среднем в 4 раза чаще, чем в аналогичных позициях, где конверсии нет (как у двудольных растений по сравнению с однодольными, так и наоборот). При этом частота замен в третьем редактируемом положении, которое не приводят к замене аминокислоты, происходит значительно чаще. Количество редактируемых сайтов в обеих линиях оставалось примерно одинаковым. При этом, видимо, сами сайты редактирования не несут на себе какой-либо регуляторной функции, так как исчезновение сайта происходит более или менее стохастически. Таким образом, отбор, как у однодольных, так и двудольных идет по пути уменьшения сайтов редактирования. Однако, остается неясным, как происходит замена редактируемого нт. Кажется маловероятным, что она идет по механизму генной конверсии, так как сайты в каждом отдельном случае распределены случайно, а не сгруппированы, что было бы более логичным, если происходила обратная транскрипция (ОТ) с частично отредактированных матриц. Либо надо предположить, что ОТ идет случайно с 20 нт участков, после чего такие короткие кДНК гомологично рекомбинируют с митохондриальным геномом.

Миксомицеты

Конверсия С—^U была также показана при редактировании некоторых митохондриальных генов Physarum. Но, так как основным типом редактирования у этих организмов является котранскрипционная вставка нуклеотидов (см. ниже) и конверсия у миксомицетов изучена крайне слабо, то трудно говорить о том насколько схожи процессы конверсии с теми, которые описаны для растений (Gott et al., 1993). Было показано, что процессы вставки нт и конверсии у миксомицетов не связаны между собой (Visomirski-Robic et al., 1997).

Котранскрипционная вставка незакодированных нуклеотидов

Этот специфический тип редактирования был открыт в митохондриях представителя миксомицетов Physarum polycephalum (см. Takano et al., 2001). В результате этой модификации в пре-мРНК вставляются С и U, а также динуклеотиды (АА, AU, CU, GU и GC). До последнего времени не установлены механизмы, по которым может происходить этот процесс. Секвенирование митохондриального генома показало, что в нем закодировано 12 белков, участвующих в функционировании электрон-транспортной цепи и окислительном фосфорилировании, а также один рибосомальный белок. Редактированию подвергаются многие гены; при этом зрелая мРНК значительно отличается от закодированной в геноме. Например, кДНК гена ND7 отличается вставкой 57 нт и в нем идентифицировано 46 сайтов редактирования. Также интересным наблюдением является тот факт, что сайты редактирования отличаются для одного гена у разных штаммов Physarum (Takano et al., 2001).

Одним из безусловных достижений в исследовании этой необычной системы было выделение транскрипционно-редактирующей растворимой фракции, которая обладала обеими активностями в реакциях in vitro (Cheng et al., 2000). Наличие такой системы дает возможность исследователям охарактеризовать цис- и транс- факторы, участвующие в этом процессе.

Для изучения эволюционного происхождения процессов редактирования у миксомицетов был проведен сравнительный анализ редактирования гена col у разных представителей этой группы (Horton et al., 2000). Результаты этого исследования приведены в таблице 3.

Таблица 3. Количество редактируемых сайтов в транскриптах гена col (по Horton et al., 2000).

Вид Вставка LI Вставка С Вставка динуклеотидов Конверсия С—»U

Physarum polycephalum 1 35 3 4

Dydium nigripes 2 40 i j 4

Stemonitis flagovenita 4 34 л j 0

Arcyria cinerea 4 1 0 2

Clastoderma debaryanum 4 0 0 0

Для того чтобы соотнести полученные результаты с филогенетическим положением этих организмов были получены последовательности гена 18S рРНК, на основе которых были построены филогенетические деревья. Виды P. polycephalum, D. nigripes, S. ßavogenita оказались максимально близки по этому маркеру, тогда как А. cinerea и С. debaryanum формировали другой кластер. Эти построения коррелируют с полученными данными на основе сравнения количества сайтов вставки С и динуклеотидов. Предполагается, что эти два типа редактирования появились у более позднеотделившихся видов и после возникновения вставки U. Наличие или отсутствие редактирования по типу конверсии не соотносится с полученным древом. На этом основании авторы предполагают, что процесс появления и утери этого типа редактирования происходил в этой группе неоднократно.

Редактирования за счет РНК-зависимой РНК-полимеразы

Недавно был описан еще один тип митохондриального РНК-редактирования. При секвенировании полного генома многоножки Lithobius forficatus было показано, что часть закодированных тРНК перекрываются как между собой, так и с другими генами. При анализе кДНК копий тРНК было показано, что аминоакцепторный стебель полностью восстанавливается; таким образом может быть добавлено до 5 нт. Предполагается, что такое изменение производит РНК-зависимая РНК-полимераза. (Lavrov et al., 2000).

Редактирование у трипаносоматид

РНК-редактирование - первый пример такого типа модификации РНК, был описан Бенне в 1986 году (Benne, 1986). Этот процесс был открыт при изучении структуры митохондриального генома (кинетопластной ДНК=кпДНК) трипаносоматид. кпДНК этих простейших состоит из двух типов катенированных молекул: макси- (20-40 kb) и миниколец (0,45-8 kb) (Simpson, 1987; Jirku et al., 1995). Количество этих молекул отличается на порядки: 20-50 максиколец и до 103-104 миниколец. Эти молекулы образуют плотную сеть (Perez-Morga et al., 1993). Надо отметить, что при определении первичной структуры максиколец не было показано ни одной открытой 'рамки считывания, которая не прерывалась бы стоп-кодонами. Однако было обнаружено, что для восстановления открытой рамки считывания в гене СОИ необходима вставка 4-х уридиловых остатков (U). Это и явилось первым указанием на существование столь необычного процесса уридилового редактирования. Далее было показано, что практически для всех митохондриальных генов (для 12 из 18) трипаносоматид необходима вставка/делеция U. Число таких сайтов может достигать нескольких десятков, а количество таких U может составлять несколько сотен. По характеру редактирования митохондриальные гены могут быть разделены на 3 типа: полностью или пан-редактируемые, частично редактируемые (чаще всего редактирование у таких генов подвергается 5' концевая область) и нередактирумые гены (Alfonzo et al., 1997, Stuart et al., 1997, Estevez et al., 1999a).

Многими авторами были предприняты попытки описания механизма процесса уридилового редактирован ия. Одними из первых появились свидетельства о 3'->5'направленности этого процесса по пре-мРНК, а также существовании матрицы, которая определяет место (сайт) редактирования, где произойдет вставка/делеция U. Такого рода матрицами оказались малые РНК митохондриального кодирования, так называемые, гидовые РНК (гРНК). Размер этих молекул составляет 50-80 нт. Это открытие определило функцию миниколец, которая до этого оставалась неясной. Таким образом (рис. 2) было показано, что транскрипты (гРНК), считывающиеся с миниколец, являются основной матрицей (хотя гРНК частично закодированы в максикольце) для редактирования (цитировано по обзорам Alfonzo et al., 1997, Stuart et al., 1997, Estevez et al., 1999a).

В структуре гРНК можно выделить (Blum et al., 1990) три элемента (5'->3'): якорный конец (20 нт), который полностью комплементарен участку пре-мРНК, собственно редактирующий домен (35-40 нт) и поли-U хвост (4-15 нт), который является посттранскрипционной модификацией и, видимо, результатом действия ТУТазы (терминальной уридил трансферазы). Используя различные эндонуклеазы (Т1, Т2, VI) было показано, что гРНК (gND7-506) организована в сложную третичную структуру с двумя структурами типа стебель-петля и с внутримолекулярными тройными взаимодействиями. «Открытым», не вовлеченным во взаимодействие, оказался только поли-U хвост. Вопрос об универсальности такого рода организации, например, как это показано для тРНК, остается открытым, так как эти молекулы крайне разнородны по нуклеотидной последовательности (Hermann et al., 1997). г

Рис. 2. Схема РНК редактирования у трипаносоматид (МасНзоп-Антеписа е1 а1., 2002). Сверху представлена кпДНК (сеть катенированных молекул: мини-и максиколец). Максикольца являются матрицей для пре-мРНК, собственно подвергающиеся редактированию, миникольца - гРНК, которые являются матрицей для этого процесса. В круге обозначен комплекс белков эдитосома), который участвует в редактировании. В результате получаются зрелые транскрипты; с них происходит синтез белков митохондриального кодирования.

Модели редактирования

Механизм процесса редактирования является важным для понимания его роли в реализации митохондриальной генетической информации этих простейших. Данные накопленные к концу 90-х суммированы в нескольких обзорах (Alfonzo et al., 1997, Sloof et al., 1997, Stuart et al., 1997, Estevez et al., 1999a, Simpson et al., 2000, Schneider 2001, Madison-AHTenucci et al., 2002), поэтому здесь будут рассмотрены только основные положения и большее внимание будет уделено работам последних 5 лет. Первоначально для описания этого процесса было предложено три модели: ТЕ - транс-этерификации (механизм аналогичный сплайсингу), предложенная Чехом (Cech 1986-1987, 1991). В этой модели предполагалось, что З'ОН З'-концевого U гРНК атакует фосфодиэфирную связь между теми нуклеотидами пре-мРНК, где будет находиться сайт редактирования. Таким образом, образуются химерная молекула гРНК*пре-мРНК и 5' конец пре-мРНК. Обратный процесс заключается в атаке З'ОН конца 5' отрезанного участка пре-мРНК на фосфодиэфирную связь редактируемого сайта химерной молекулы. В результате восстанавливается исходная молекула пре-мРНК. Эта модель предполагала использование в качестве донора U поли-U хвоста и обязательную стадию образования химерной молекулы. Однако, от этой модели быстро отказались, так как было показано, что источником U является свободный пул UTP. Так, если модифицировать 3' конец гРНК, то все равно наблюдается включение UTP. Это свидетельствует, во всяком случае, против того факта, что поли-U хвост является донором U (Riley et al., 1995, Byrne et al., 1996, Burgess et al., 1999).

CL (cleavage-ligation), впоследствии переименованная в модель ферментативного каскада. Она заключалась в последовательном действии различных ферментов: эндонуклеазы, ТУТазы (терминальной дезоксинуклеотид трансферазы), экзонуклеазы и РНК-лигазы на дуплекс гРНК*пре-мРНК (Blum et al., 1990).

CL-C (cleavage-ligation-chimeras) Эта модель также предполагала ферментативный каскад, однако, в ней был использован тот факт, что существуют химерные молекулы (Koslowsky, et al., 1992), аналогичные тем, которые описывались в ТЕ модели. Позднее было показано, что эти химерные молекулы являются артефактами (Riley et al., 1995, Byrne etal., 1996, Burgess et al., 1999).

Таким образом, в настоящее время основной признанной моделью является модель ферментативного каскада. Ее можно представить в виде следующей схемы (рис.

Рис. 3. Схема редактирования - модель ферментативного каскада (цитировано по МасЦэоп-Антепшхп е1 а1., 2002). пре-мРНК изображена в каждом отдельном рисунке сверху, гРНК - снизу. В обоих случаях и во вставке и в делеции по окончании дуплекса эндонуклеаза вносит разрыв в пре-мРНК. Далее под действием ТУ Тазы или экзонуклеазы происходит достройка либо отрезание и до восстановления комплиментарности в дуплексе. На третьем этапе происходит лигирование разрыва в пре-мРНК. После этого последовательность событий может повториться снова.

В последние 3 года вышло несколько работ, в которых ферменты, участвующие в редактировании, были выделены из митохондриального лизата трипаносоматид, проклонированы, определены их первичные структуры и охарактеризованы субстраты. Надо отметить, что группы исследователей, занимающиеся поиском этих белков, по подходу можно поделить на две.

1. Первые использовали градиентное центрифугирование в глицерине для выделения высокомолекулярных комплексов, в которых были показаны те или иные активности. Существование таких комплексов привело авторов к мысли о том, что эти белки редактирования не разнесены в митохондрии, а, напротив, объединены в единый агрегат - эдитосому (Shu et al., 1995). Также было показано, что эти комплексы обладают рядом других активностей, которые, видимо, не играют никакой роли в редактировании, а участвуют в созревании полицистронных митохондриальных транскриптов.

Так, в митохондриальном лизате Trypanosoma brucei были выделены комплексы с коэффициентами седиментации 19S и 35-40S (Pollard et al., 1992). Надо отметить, что в составе первого были показаны только короткие РНК - гРНК, а собственно пре-мРНК соосождались со вторым большим комплексом. На основании этого наблюдения было высказано предположение, что 19S участвует в созревании гРНК, а собственно редактирующим является комплекс 35-40S. В 19S фракции было показано наличие ряда

ВСТАВКА ДЕЛЕЦИЯ т

--G<?V?rm—" ~-AUUUUGG

II CAG А А С

11

АССendonuclease

-RGUC~ --AUUU 1 1 1111 CAG "

UGG

Mill АСС TUTase З'-U-exo

-GUU „

GUC-~ "-A

1 ' 1 1111 CAG" A I

UGG i i I

АСС" gu j RNA iigase |

GUUGUC-,, -AUGG-- ' 1 ' 1 i 111 I ><<>iim CAACAG--7 UACC ~—

Белки редактирующего комплекса активностей, предписанных редактирующему комплексу: ТУТаза, терминальная уридил-экзонуклеаза и РНК-лигаза (Rusche et al., 1997). Позднее было обнаружено, что в этот комплекс также входит и РНК-эндонуклеаза, фермент вносящий первоначальный разрыв в пре-мРНК. То обстоятельство, что эта активность не была описана ранее, связано с тем фактом, что она может быть маскирована РНК-лигазной активностью (Adler et al., 1997). Всего на белковом форезе 19S комплекса было зарегистрировано 8 полос. Интересный факт, подтверждающий гипотезу об участии 19S комплекса в созревании гРНК, был получен в работе Грамса (Grams et al., 2000). Ранее было показано, что в миникольце Trypanosoma brucei содержится 3 гРНК (Pollard et al., 1990), закодированные в одной цепи и фланкированные инвертированными повторами (Sturm et al., 1990; Yasuhira et al., 1995). В уже упоминавшейся работе (Grams et al., 2000) было показано, что инициация транскрипции гРНК начинается с трех разных точек, перед каждым функциональным транскриптом. Однако, терминация происходит в одной единственной точке. Таким образом получается 3 типа транскриптов, содержащие все 3, 2 и 1 гРНК. Показано, что отрезается 5'-концевая часть транскрипта, а остальная часть подвергается деградации. Такого типа полицистронные гРНК, а также эндонуклеазная активность, участвующая в созревании гРНК, были идентифицированы в 19S комплексе. В другой работе (McManus et al., 2000) по изучению созревания гРНК обсуждается вопрос посттранскрипционной модификации 3' конца гРНК ТУТазой с образованием поли-U хвоста. Дело в том, что в 19S комплексе, как впрочем, и в 35-40 S, активность ТУТазы компенсируется 3' U-экзонуклеазной активностью. Возникает вопрос, как, в таком случае, происходит присоединение поли-U хвоста? В результате своей работы авторы приходят к выводу, что основная часть U присоединяется к гРНК в 35-40S комплексе. Это объясняется тем фактом, что в большом комплексе гРНК находится в дуплексе с пре-мРНК; при этом, видимо, 3' конец гРНК также частично взаимодействует с пре-мРНК, а последовательно присоединенные U сразу входят в состав дуплекса. Таким образом, происходит «защита» поли-U хвоста от действия экзонуклеазы (рис. 4).

Complex I

19S)

Complex II (35-40S) f^ gRNA

Рис. 4. Модель созревания гРНК (McManus et al., 2000). В 19S комплексе происходит нарезание полицистронной гРНК; при этом гРНК не модифицированы на 3' конце. Затем происходит ассоциация 19S с другими белками и пре-мРНК. Зрелый редактирующий комплекс имеет коэффициент седиментации 35-40S. В нем происходит полное созревание гРНК - полимеризация поли-U хвоста и редактирование пре-мРНК.

Аналогичные комплексы с близкими коэффициентами седиментаци были получены для другого объекта: Leishmania tarentolae. В работе Периса (Pens et al., 1997) показано существование двух РНП комплексов, выделенных при скоростном центрифугировании митохондриального лизата Leishmania tarentolae в глицерине. Первый комплекс с коэффициентом седиминтации 1 OS, так называемая Т фракция (в ней показана ТУТазная активность и гРНК), дает 6 хорошо различимых полос при белковом электрофорезе. Второй комплекс 25 S - G фракция, содержит гРНК и может проявлять «редактирующую» активность (Frech et al., 1995).

В работе Мэдисон-Антенучи (Madison-AHTenucci et al., 1998) были получены моноклональные антитела к 35-40S комплексу. С помощью этих антител в комплексе был обнаружен белок р45 с неизвестной функцией, получивший название REAP-1 (RNA-editing-associated protein 1 - ассоциированный с РНК редактированием белок 1). В его нуклеотидной последовательности обнаружен необычный 21-членный высоко консервативный мотив, повторенный 7 раз. Этот белок не проявляет значимой гомологии с каким-либо из известных белков. Существенно, что добавление антител против него ингибировало редактирование.

2. Второе направление исследований заключается в очистке и характеристике индивидуальных ферментов редактирующего комплекса. Первым ферментом, который удалось выделить и охарактеризовать, явилась РНК-лигаза (Blanc et al., 1999). Этот белок был выделен из митохондриального лизата Leishmania tarentolae. Способность к аденилированию была выявлена у белков с Mr 45 и 50 kDa. Различия в молекулярной массе авторы объяснили существованием интермедиатов фермента в комплексе с субстратом. Этот белок потенциально может участвовать в процессе редактирования и описана его субстратная специфичность:

Опыты с негидролизуемыми аналогами АТР: добавление AMPPNP (с негидролизуемой ß-y связью, которая является необходимой для работы Т4 РНК-лигазы) не приводила к снижению активности, а использование АМРСРР (блокирована a-ß связь) вызывало полное подавление лигазной активности. Таким образом, предполагается, что этот фермент использует АМР-РНК активированные молекулы.

Как и в случае Т4 РНК-лигазы, мтРНК-лигаза лейшмании использует 5'Р04 и З'ОН РНК молекул.

Основным доказательством участия этого белка в редактировании является обнаружение активности этого фермента с моделированными субстратами РНК-лигазы in vitro. Редактируемый участок пре-мРНК ND7 и последовательность гРНК образовывали дуплекс таким образом, что гРНК стягивала искусственно нанесенный разрыв в последовательность пре-мРНК, что является потенциальным субстратом для лигазы такого типа. Показано, что увеличение длины 3' якорной последовательности до 7 нт приводит к максимальной активности (при фиксированном 5' якорной последовательности длиной в 9 нт). Лучший субстрат для фермента является дц РНК с тупыми разрывами. Появлении 3 нт выступающего конца приводит уменьшению активности фермента (в 416 раз) и повышению вероятности образования химерных молекул. В отличие от Т4 РНК-лигазы, активность мтРНК-лигазы не зависит от типа концевого нт.

Показано, что для взаимодействия гРНК с пре-мРНК поли-U хвост не является обязательным, что находится в противоречии с работой Блюма (Blum et al, 1990), однако, длина поли-U хвоста важна для эффективности реакции лигирования. Таким образом, возможная функция поли-U хвоста состоит в формировании протяженного 3' (более 7 нт) дуплекса, необходимого для удерживания лигируемых молекул, особенно при редактировании последнего сайта (Seiwert et al., 1996).

Аналогичная работа была проведена для другого модельного объекта: Trypanosoma brucei (Rusche et al., 2001). По способности аденилироваться меченым АТР на радиавтографе было идентифицировано несколько полос. Полученные частичные последовательности пептидов дали возможность заклонировать гены, кодирующие эти белковые продукты. Было показано, что существует, по крайней мере, два разных белка, проявляющих РНК-лигазную активность, с молекулярной массой 47,5 и 57 kDa. Оба белка имеют мотивы, характерные для РНК-лигаз, но гомология между ними крайне мала. Оба имеют ядерное кодирование и импортируются в митохондриальный матрикс за счет N-концевой препоследовательности. р57, также как и в предыдущем случае, не может использовать в качестве субстрата разорванные оц РНК (тРНК). Роль р47,5 остается неясной. Авторы предполагают, что в лизате существует две разные РНК-лигазы с различными функциями, но возникшие от одного предшественника.

МкМанусом с соав. (McManus et al., 2001) была проведена работа по идентификации митохондриальной РНК-лигазы; только в отличие от предыдущего исследования эти авторы шли от обратного. Используя базы данных РНК-лигаз (надо сказать, что это семейство включает в себя кэпирующие ферменты, тРНК-лигазы, АТР и NAD-зависимые ДНК-лигазы) и геном Trypanosoma brucei, были найдены 2 потенциальные рамки, которые претендовали на роль РНК-лигаз, как и в предыдущем случае с Mr 48 и 52 kDa. Экспрессия р48 в клетках E.coli позволила получить белок для иммунизации. Антитела к р48 выявили, что этот белок входит в состав 19S фракции.

В более поздней работе (Cruz-Reyes et al., 2001) высказано предположение, что вставки и делеции U осуществляют разные ферменты, которые находятся в одном редактирующем комплексе. Эти авторы утверждают, что разные РНК-лигазы, которые были описаны в двух упомянутых выше статьях (McManus et al., 2001; Rusche et al., 2001), как раз и принимают участие в разных реакциях редактирования: вставке и делеции. Однако, в опытах по РНК-интерференции (Drozdz et al., 2002) введение антисенс копии гена р48 не привело ни к каким драматическим изменением в жизнедеятельности трипаносоматид. Линии, несущие эти копии, были жизнеспособными, а в митохондриальном лизате были найдены отредактированные транскрипты, что свидетельствует о том, что процесс редактирования не был нарушен.

Основным успехом в работах по идентификации индивидуальных белков, можно считать выделение ТУТазы (терминальной уридилтрансферазы) - основного фермента редактирующего комплекса (Aphasizhev et al., 2002). Этот фермент был выделен путем многоступенчатой очистки митохондриального лизата Leishmania tarentolae. Фракция гомогенного белка представляла собой олигомерные формы. По-видимому, функциональный белок в норме организован в тетрамер. Была получена полноразмерная последовательность этого белка. По базе данных белковых мотивов были выделены домены: мононуклеотид-связывающий, кор домен поли-А полимеразы и поли-А полимеразы ассоциированный. По наличию первого домена этот белок был отнесен к суперсемейству р ДНК-полимераз (нуклеотид-трансфераз). Были оптимизированы условия проведения этой реакции in vitro и обнаружена необходимость ионов Mg2+. Оказалось, что субстратом для этого фермента может служить brRNA (bridged RNA - дц РНК с отсутствующим фрагментом по одной из цепей). Наличие активности при использовании такого типа РНК является прямым указанием на то, что этот фермент, действительно, участвует в редактировании. Еще одним доказательством участия этого фермента в редактировании является тот факт, что добавление антител к ТУТазе в митохондриальном лизате полностью ингибирует реакцию переноса U на различные субстраты.

В той же лаборатории был выделен еще один белок редактирующего комплекса: 3' U-специфическая экзонуклеаза - 3' экзоуридилаза (Aphasizhev et al., 2001). Активность, характерная для этого фермента, уже давно была показана в митохондриальном лизате трипаносоматид (Cruz-Reyes et al., 1996). Было показано, что in vitro субстратом для этого фермента является оц РНК и он специфически отщепляет только U из пре-мРНК. Это было продемонстрировано в следующих экспериментах, если редактируемый сайт мутировать, так, чтобы для восстановления комплементарное™ было необходимо удалить какой-нибудь другой нт (кроме U), то экзонуклеазной реакции не наблюдалось (Lawson et al., 2001).

Еще одним белком редактирующего комплекса оказался белок, в состав которого входят два разнесенных мотива, характерных для Zn пальцев (Huang et al., 2002). Антитела против этого белка выявили этот белок в составе изучаемой фракции редактирующего комплекса. В опытах по РНК интерференции было показано, что трипаносомы плохо растут в условиях, имитирующих стадию в насекомом (проциклической форме). Было показано, что такие линии дефектны по эндонуклеазной активности в обоих случаях: как в вставке, так и в вырезании U. Авторы предполагают, что роль исследованного белка заключается собственно в разрезании пре-мРНК или же он является необходимым фактором для процесса разрезания. Кроме того, отсутствие этого фермента снижало активность РНК-лигазы. Возможно, это связано с тем фактом, что этот белок участвует в сборке функционального редактирующего комплекса.

Практически для всех редактирующих систем предполагается участие хеликаз, которые необходимы для эффективного связывания транскриптов между собой, либо для эффективной посадки белковых факторов. Но только для некоторых систем показано реальное участие хеликазы, например, при дезаминировании А—>1 у Drosophila (Seeburg, 2000). Надо отметить, что ранее была показана соответствующая активность в митохондриальном лизате Trypanosoma brucei (Missel et al., 1994). При попытке обнаружить ферменты этого семейства в редактировании у трипаносоматид, был использован тот факт, что все хеликазы имеют характеристический DEAD мотив (Schmid et al., 1992). К нему и были сконструированы вырожденные праймеры для получения потенциальных последовательностей хеликаз. Действительно, белок с таким мотивом был найден и получил название шНе161р. Антитела к этому белку выявили его присутствие в митохондриальном матриксе. Дизрупция этого гена в обеих аллелях привела к значительному снижению роста трипаносоматид в культуре, а количество отредактированных транскриптов уменьшилось (Missel et al., 1997). Белки, взаимодействующие с гРНК

Другой путь для изучения механизма и регуляции процесса редактирования является идентификация белков, взаимодействующих с гРНК. Основным экспериментальным подходом для определения этих белков является метод ультрафиолетовых сшивок. Для этого синтетически синтезированные меченые транскрипты гРНК инкубируют с митохондриальным лизатом, после чего проводят сшивку и полученный РНП комплекс подвергает гель-электрофорезу. Отдельные белковые фракции анализируют на специфичность взаимодействия с гРНК. Предполагают, что такого рода белки, взаимодействующие с гРНК, могут быть необходимы для транслокации, расплетания и позиционирования гРНК относительно пре-мРНК (Allen et al, 1998). р65 Crhh 'ulia fasciculata

Методом ультрафиолетовых сшивок (Leegwater et al., 1995) с синтетической gRNA ND7 и митохондриальными белками Crithidia fasciculata было выделено три белка с Mr 65, 30 и 88 kDa. Далее, изменяя длину различных участков гРНК, изучали роль того или иного фрагмента в этих взаимодействиях. Авторы показали, что при полной делеции U-хвоста эти белки вообще не сшиваются с гРНК. Инкубация химерных молекул пре-mRNA ND7*gRNA с выделенными белками с последующей сшивкой показала, что белки 30 и 88 kDa взаимодействуют и с таким субстратом. Таким образом, лишь белок с молекулярной массой 65 kDa специфически связывается с гРНК. При изучении конкурентного взаимодействия олигонуклеотидов с этим белком было показано практически полное ингибирование взаимодействия 65 kDa белка с гРНК при введении 100 кратного избытка (над гРНК) поли-U олигонуклеотида. Неожиданным оказался тот факт, что этот белок также связывается с U-xboctom митохондриальных 9S и 12S рРНК (для Trypanosoma brucei показано, что мт рРНК уридинилированы на 3' конце (Adler et al., 1991); видимо, такая же модификация характерна и для С. fasciculata).

GDH(pllO)

В митохондриальном экстракте Leishmania tarentolae показано взаимодействие гРНК (к гену ND7) с белком pi 10 (Bringaud et al., 1997). Для этого митохондриальный лизат подвергали гель-фильтрации. После этого фракцию, в которой была идентифицирована ТУТазная активность, инкубировали с меченой гРНК. Далее производили УФ сшивку. Использовав вырожденные праймеры, авторы определили N-конец белка и получили полноразмерный продукт, соответствующий исследуемому гену. Удивительным оказался тот факт, что эта последовательность давала максимальное число совпадений с геном глутамат дегидрогеназы Neurospora crassa (37% - совпадений и 57% - сходства). Авторы пришли к выводу, что полученный ген является гомологом этого фермента. Антитела к экспрессированному в Е. coli pllO показали, что этот белок локализован в митохондриальном матриксе и отсутствует в мембранных фракциях. В состав этого белка входит препоследовательность, характерная для белков импортируемых в митохондрии. Авторы показали, что белок связывается с поли-U хвостом (хотя, видимо, это не единственная детерминанта, которая узнается этим белком) - доменом, который взаимодействует с динуклеотидами (NADPH+). Таким образом, избыток восстановительных эквивалентов ингибирует связывание глутаматдегидрогеназы с гРНК. Этот вывод (Bringaud et al., 1997) выглядел крайне заманчивым, поскольку это было первым указанием на то, как энергетический статус клетки напрямую связан с количеством отредактированных транскриптов а, следовательно, и с «работой» самой митохондрии. Однако, при проведении двойного нокаута (knockout) гена GDH (Estevez et al., 1999b) никаких критических изменений не произошло: клетки Trypanosoma brucei были жизнеспособны, а уровень отредактированных транскриптов не снизился. Следует обратить внимание, что хотя в этой работе был использован другой объект, но эти данные ставят под сомнение реальное участия белкового продукта гена GDH в редактировании. gBP-21

Аналогичным методом был идентифицирован белок gBP-21 (Koller et al., 1997), связывающийся с высокой аффинностью с U-хвостом гРНК Trypanosoma brucei. Отличительной особенностью этого белка является необычно высокое содержание аргининовых остатков - 18; причем эта особенность, видимо, не связана напрямую со взаимодействием с гРНК, так как полиаргининовые пептиды не обладают такой способностью. Белок gBP-21 закодирован в ядре и содержит 19 аминокислот препоследовательности, как сигнал митохондриальной локализации. В нем нет протяженных гидрофобных последовательностей, поэтому, скорее всего, - это растворимый белок. Для получения моноклональных антител против gBP-21 мышей иммунизировали митохондриальным лизатом; в результате было получено несколько МАЬ, которые давали четкий сигнал с исследуемым белком (Allen et al., 1998). Эти антитела in vitro преципитировали РНК-редактирующие активности. В этом комплексе были обнаружены следующие активности: эндонуклеазная, ТУТазная и РНК-лигазные, а также редактированные и нередактированные транскрипты. Основываясь на этих наблюдениях, был сделан вывод, что gBP-21 входит в состав РНП, катализирующего РНК-редактирование. Иммунофлуоресцентный анализ выявил этот белок внутри митохондрий. Добавление антител против gBP-21 может частично ингибировать реакцию редактирования in vitro (Lambert et al., 1999). Однако, gBP-21' трипаносомы оказались жизнеспособны в кровяной форме и содержали отредактированные мРНК. Но эти линии не дифференцировались из кровяных в проциклические формы. Таким образом, этот белок не является столь необходимым для редактирования, как это предполагалось ранее. В более поздней работе (Muller et al., 2001) роль gBP-21 стала более очевидной: добавление этого белка стимулировало in vitro отжиг гРНК на пре-мРНК, а добавление антител против него приводит к снижению этого эффекта. Из этого следует, что такого рода белки, видимо, ускоряют образование дуплекса между якорем гРНК и пре-мРНК. В последующий работе те же авторы (Muller et al., 2002) пришли к заключению, что у gBP-21 есть, как минимум, две функции: первая, как и предполагалось, заключается в «подготовке» гРНК к взаимодействию с пре-мРНК (matchmaker function), то есть, скорее всего, она состоит в поддержании малой РНК в расплетенном состоянии для эффективного связывания с пре-мРНК; вторая - в снижении электростатического отталкивания между двумя РНК, способствуя образованию стабильного дуплекса (Muller et al., 2002).

RBP 16

Белок RBP 16 был выделен из митохондриального лизата Trypanosoma brucei аффинной очисткой на поли-А сефарозе, полагая, что детерминантой узнавания гРНК может являться только поли U-хвост, как элемент присутствующий во всех гРНК (Hayman et al., 1999). Полученный белок имел Mr 16kDa. С выделенным белком провели УФ сшивку с синтетической радиоактивно меченой молекулой гРНК А6 (gA6). В результате этого опыта был получен сильный сигнал образующейся сшивки. Для получения первичной структуры полноразмерного гена были сконструированы вырожденный праймер к внутреннему пептиду и праймер к последовательности SL (splice leader, см. ниже). Эта последовательность имела 17 дополнительных аа, которые, видимо, являются сигналом импорта в митохондрию. Анализ аминокислотной последовательности RBP16 (RNA-binding protein 16) показал наличие CSD (cold shock domain - домен холодового шока), а также большое количество основных аминокислот (RGG мотивов), которые могут обеспечивать неспецифическое взаимодействие с РНК. Для изучения субстратной специфичности белка RBP16 его экспрессировали в клетках Е. coli и очищали с помощью аффинной хроматографии на колонках. Было показано, что с белком взаимодействует 30% гРНК, также копреципитируют рРНК, которые полиуридинилированы у трипаносоматид, и некоторые мРНК. Однако, характер этого взаимодействия остаётся не ясным, возможно, из-за протяженных внутренних поли-U трактов. Для CSD показано, что такого рода мотивы являются РНК-шаперонами. Можно предположить, что в данном случае этот белок расплетает вторичные структуры гРНК, делая ее доступной для взаимодействия с пре-мРНК. Более детальное изучение взаимодействия этого белка с gA6 было проведено в работе Пелетье (Pelletier et al., 2000). Комплекс был стабилен даже при добавлении большого количества соли, на основании чего был сделан вывод, что в этом взаимодействии электростатические силы не являются основными. Для изучения роли остатков Arg во взаимодействии с гРНК белок обработали фенилглиоксалем, агентом, который специфически окисляет гуанидиновую группу. Такая модификация полностью ингибировала взаимодействие RBP 16 с гРНК. Таким образом, можно предположить, что существует хотя бы один Arg, который взаимодействует с гРНК с образованием водородной связи. В опытах по минимизации длины субстрата было показано, что для эффективного взаимодействия длина гРНК не должна быть менее 32 нт, а минимальная длина U-тракта не менее 4 нт (однако, при увеличении до 10 сила связывания возрастает). Наиболее прочное взаимодействие наблюдалось, если тетрауридиновый тракт находился в 3' конце

-1

J) J молекулы гРНК; по мере смещения U4 внутрь молекулы связывание ослабевало. Переиодатное окисление 3' конца гРНК не ингибировало связывания с изучаемым белком.

TBRGG1

Обнаружение белка TBRGG1 было несколько необычным, так как авторы (Vanhamme et al., 1998) изучали транскрипцию и процессинг poll транскриптов (полимераза 1 у трипаносоматид осуществляет синтез поверхностных гликопротеинов и проциклинов). У позвоночных белок, осуществляющий процессинг poll транскриптов, называется нуклеолином. При поиске гомологичного белка у трипаносоматид произвели скрининг библиотеки кДНК Trypanosoma brucei. Таким образом были идентифицированы две изоформы одного белка, которые отличались в результате альтернативного сплайсинга. В составе белка было обнаружено несколько RGG мотивов (эта особенность отражена в его названии TBRGG1); подобная аа последовательность характерна для РНК связывающих белков. Белок проэкспрессировали в клетках E.coli и использовали для иммунизации. Антитела выявляли этот белок в митохондриальном матриксе; более того - он находился в составе 35-40S комплекса. TBRGG1 эффективно связывался с поли-U последовательностями. Наличие такой субстратной специфичности делает его кандидатом на роль еще одного белка, взаимодействующего с гРНК, либо, авторы предполагают, его участие в процессинге рРНК (напомним, что рРНК у трипаносоматид несут несколько U на 3' конце).

Взаимодействие гРНК с пре-мРНК

Как уже неоднократно отмечалось, гРНК взаимодействует с пре-мРНК с образованием антипараллельного дуплекса. Самое прочное взаимодействие обеспечивает 5' концевой якорь гРНК, формирующий Уотсон-Криковские пары с пре-мРНК. Отсутствие комплементарности между гРНК и пре-мРНК является сигналом для эндонуклеазы, которая вносит оц разрыв в пре-мРНК и запускает процесс редактирования. Также в формировании этого дуплекса допускаются неканонические G-U пары. Роль поли-U хвоста, видимо, заключается в поддержании этого взаимодействия, а также в стягивании/удерживании молекулы пре-мРНК во время и после акта редактирования. Так, ранее было показано, что отсутствие поли-U хвоста не приводит к снижению количества рестриктных пре-мРНК, но количество отредактированных продуктов значительно уменьшается (Seiwert et al., 1996). В опытах по картированию взаимодействия пре-мРНК с гРНК с помощью фотоактивных агентов, которыми были модифицированы 3' и 5' концы гРНК, а также с использованием различных нуклеаз, MPE-Fe(II) (комплекс метидиумбромид-пропил-ЕДТА - железо), было продемонстрировано, что якорь гРНК однозначно спаривается с комплементарным районом. Посадка поли-U хвоста не столь однозначна и может варьировать в пределах нескольких сайтов редактирования (Leung et al., 1999, 2001а). Хотя, надо отметить, что отличия в посадке оказались не столь значительны. Так, был проделан эксперимент, в котором изменяли длину якорной последовательности и следили за сайтом отжига поли-U хвоста; во всех случаях место посадки было практически одинаковым: за 2-3 сайтом от первого сайта редактирования (Leung et al., 2001b). Предполагается, что поли-U хвост вместе с якорной последовательностью участвует в плавлении или разглаживании вторичной структуры пре-мРНК (Sheldon et al., 1999). На основе данных по сшивкам было проведено компьютерное моделирование вторичной структуры дуплекса: для всех изученных систем они оказались схожими. Протяженные дуплексы наблюдались между якорем, поли-U хвостом и пре-мРНК, а собственно редактирующий домен выпетливался с образованием двух структур типа шпилька-петля. Возможно, что именно вторичная структура дуплекса узнается редактирующим комплексом.

Ранее было показано, что модификация 3' конца гРНК не влияет на процесс редактирования; это было основным аргументом против гипотезы использования поли-U хвоста в качестве донора уридиновых остатков (см. выше). Однако, в работе Бургесса с соав. (Burgess et al., 1999) было показано, что введение циклического фосфата, связанного с З'и 5' концами гРНК, может частично ингибировать редактирование в реакциях in vitro. Предполагается, что эта модификация, каким-то образом влияет на взаимодействие гРНК с белком, который осуществляет дополнительное удерживание дуплекса. Возможно, что одним из таких факторов может быть один из белков, связывающихся с гРНК (см. выше).

До последнего времени основная роль направляющей молекулы отводилась гРНК, а пре-мРНК, согласно этим представлениям, играла «пассивную» роль. Однако, в недавней работе (Kabb et al., 2001) был сделаны эксперименты, в которых мутировали пурин-богатую 5' область пре-мРНК, следующую за сайтом редактирования. Обычно это участок, с которым взаимодействует поли-U хвост. Соответствующие мутации вводили и в синтетически синтезированную гРНК, для того чтобы полностью скомпенсировать это замены. Таким образом, количество спаренных оснований осталось прежним, то есть таким же, как в диком типе. Неожиданно, оказалось, что такие молекулы не подвергаются редактированию. Из этого был сделан вывод, что сама по себе последовательность пре-мРНК является важной для этого процесса и, видимо, несет какую-то дополнительную информацию.

Другим интригующим открытием, является тот факт, что не только конец дуплекса между гРНК*пре-мРНК является детерминантой в выборе сайта, куда будет вносить разрыв эндонуклеаза. Так в работе Лаусона (Lawson et al., 2001) показано, что если изменить последовательность после сайта редактирования, то разрыв вносится не по окончанию дуплекса. Авторы предполагают, что это наблюдение свидетельствует о существовании дополнительных факторов, отвечающих за выбор сайта разрезания.

Одной из нерешенных проблем во взаимодействии гРНК с пре-мРНК является вопрос о том, за счет чего происходит уход гРНК после того как завершилось редактирование, которое осуществлялось за счет данной малой РНК. В результате редактирования восстанавливается почти полная комплементарность между этими молекулами и сила такого взаимодействия сильно возрастает. При попытке поиска ответа на этот вопрос были получены Т7 транскрипты гена ND7 слитые с гРНК, направляющие редактирование в первых сайтах (таким образом, молекула гРНК оказалась в цис-положении и взаимодействие между гРНК и пре-мРНК можно считать внутримолекулярным). Такие гРНК осуществляли редактирование более чем в 10 раз эффективнее по сравнению с транс гРНК. Однако, никакого отделения этой молекулы от пре-мРНК после завершения полного акта редактирования не было показано (Kapushos et al., 1999).

Интересным наблюдением было обнаружение редактирования без участия гРНК, которое было показано для гена Cyb трипаносоматид. Инкубация синтетической пре-мРНК с митохондриальным лизатом без гРНК выявила, что эта РНК может самостоятельно направлять редактирование внутри молекулы; при этом, видимо, сама по себе пре-мРНК, складываясь, мимикрирует под дуплекс гРНК*пре-мРНК и таким образом привлекает редактирующий комплекс (Connell et al., 1997).

Отредактированные транскрипты являются матрицей для трансляции

Другая проблема, которая стояла до последнего времени перед исследователями - это показать транслируются ли отредактированные матрицы в митохондриальном матриксе или этот процесс является вещью в себе (das Ding an sich). Ответ на этот вопрос был получен относительно недавно в работе Хорвата (Horvath et al., 2000а,b).

Авторам удалось разделить в двумерном электрофорезе белки митохондриальной мембраны и идентифицировать их. Анализ аминокислотной последовательности показал, что матрицей для трансляции белков митохондриального кодирования Cyb и COI электрон-транспортной цепи, действительно, являются зрелые отредактированные транскрипты.

Подводя итог этому разделу обзора литературы можно сделать следующие заключения. В результате значительного числа работ достигнут определенный прогресс в идентификации индивидуальных компонентов системы редактирующего комплекса трипаносоматид. Однако, из приведенных данных видно, что большинство из охарактеризованных белковых факторов либо несут второстепенные функции, либо вообще не играют никакой роли в редактировании. Представляется, что ответом на вопрос, как происходит процесс редактирования, может быть получен только в результате характеристики всех компонентов системы и проведением этой реакции in vitro таким образом, чтобы все элементы системы будут добавлены в виде индивидуальных продуктов.

Молекулярная эволюция трипаносоматид.

За последние 10 лет филогения простейших претерпела существенные изменения в связи с накоплением молекулярно-биологических данных (Vickerman, 1994; Stevens et al., 2001). Основным маркером, на основании которого были произведены эти сравнения, является ген 18S рРНК. Древо, построенное на основе этих данных включает в себя три части: нижнюю часть занимают амитохондриальные простейшие (микроспоридии и трихомонады), среднюю - Euglenozoa (к которой собственно и отнесен отряд Kinetoplastida), а также амебойдные и амебоидно-жгутиковые формы, и, наконец, крону древа формируют плохо разрешимые группы, составляющие разнообразные типы простейших, грибов, растений и т.д. (Philippe et al., 1998). Отряд Kinetoplastida включает в себя два семейства Trypanosomatidae и Bodonidae и характеризуется рядом важных особенностей, которые отличают эти организмы от других эукариот:

1. Ядерный геном Trypanosoma brucei состоит из двух типов молекул: больших и минихромосом. Больших хромосом 20, а их размер варьирует от 0,2^6 Mb; минихромосом до 100 молекул на ядро и размером от 50-150 kb. Минихромосомы кодируют нетранскрибируемые копии белков поверхностных антигенов (VSG -variant surface glycoprotein). Изменяя поверхностные антигены, паразит уходит от иммунного ответа хозяина. Минихромосомы занимают периферическое положение в ядре; во время митоза они собираются в единую точку у центра веретена, после чего они расходятся на 2 кластера по обоим концам веретена. Хотя плоидность минихромосом неясна, по размерам в каждую новую клетку попадают все типы этих молекул, что может свидетельствовать об их важной роли в биологии паразита (Ersfeldet al., 1997).

2.В рамках программы полного секвенирования генома Leishmcinia major определены последовательности некоторых больших хромосом этого паразитического простейшего. Показано, что гены этого организма не содержат интронов и транскрибируются в составе полицистрона; причем в отличие от прокариот считывающиеся транскрипты не содержат каких-либо функциональных оперонов. Отсутствие специфических промоторных последовательностей предполагает, что основным уровнем регуляции является посттранскрипционный: разрезание полицистронных транскриптов, транссплайсинг, 3' разрезание и полиаденилирование, стабильность транскриптов и белковых продуктов. Также неожиданным оказался тот факт, что транскрипция разных хромосом идет в разных направлениях. Так, для первой хромосомы показано, что транскрипция идет от центромеры к теломерам, тогда как для 3-ей - наоборот (Donelson et al., 1999).

3. Полицистронные транскрипты процессируются до моноцистрона за счет транссплайсинга. В данном случае он заключается в переносе универсального 39 нт рибоолигонуклеотида, так называемого сплайс-лидера (SL RNA). Так как обе РНК являются полицистронными, то во время переноса образуется промежуточная Y-подобная структура. Этот процесс гомологичен цис-сплайсингу: для успешного прохождения реакции необходимы малые ядерные РНК (мяРНК), гомологичные U2, U4 и U6 (Roberts et al., 1996, Goncharov et al., 1998, Campbell et al., 2000).

4. Особенное строение жгутика. Показано, что аксонема жгутика связана со специальным стержнем, который идет вдоль жгута. Описано как минимум два белка, которые относятся к PFR семейству (paraflagellar rod - жгутиковый стержень) для Leishmania mexicana, Trypanosoma brucei, Т. cruzi и Euglena gracilis. Попытки получить null мутанты по этим генам, либо в опытах по РНК-интерференции с введением антисенс РНК к этим генам, оказались неудачными, что свидетельствует о том, что такого рода фенотип нежизнеспособен. Однако очень интересным наблюдением является тот факт, что в эндосимбионтной группе эти белки и соответственно структура полностью отсутствуют (Maga et al., 1999).

5. Существование специализированной изолированной структуры - гликосомы, в которой происходит гликолиз. В них локализовано семь первых ферментов гликолиза. Нет четких представления о происхождении этой органеллы, однако, по некоторым данным она близка пероксисомам эукариот. Эти органоиды: пероксисомы и гликосомы, имеют сходную ультраструктуру, плавучую плотность и импорт белковых молекул в них происходит по сходным сигнальным препоследовательностям PTS1 и PTS2 (Lorenz et al., 1998).

6. Необычно высокое содержание митохондриальной ДНК, которая организована в плотную сеть. Синхронность деления митохондриального и ядерного геномов. Следует также отметить уридиловое редактирование, которое подробно обсуждалось выше и импорт из цитоплазмы в митохондрии и редактирование тРНК (Schneider, 2001).

Представители семейства Trypanosomatidae отличается одним жгутиком. Оно включает в себя исключительно паразитические формы (хозяевами могут выступать беспозвоночные, позвоночные и растения), тогда как у представителей семейства Bodonidae, как правило, имеется 2 жгутика. Описаны как свободноживущие, так и паразитические формы. Основываясь на сравнении гена 18S рРНК, считается, что общим предком современных свободноживущих и паразитических форм кинетопластид были свободноживущие организмы, родственные ныне живущим бодонидам. Было установлено, что группа Bodonidae является полифилетичной (в отличие or Trypanosomatidae), а переход к паразитизму, видимо, был неоднократным (Dolezel et al., 2000). Древность группы Bodonidae по сравнению с Trypanosomatidae можно показать и на других примерах: показано, что у Euglena gracilis глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа, фермент гликолиза, полностью растворим, тогда как у Trypanosplasma borreli (представителя семейства Bodonidae) происходит дупликация этого гена и вторая копия этого гена уже кодирует гликосомальный фермент. У всех представителей семейства Trypanosomatidae обнаружено три копии этого гена. прослеживается организационные изменения в структуре кпДНК. Так, для Cryptobia helicis (Cryptobia) митохондриальный геном представлен отдельными молекулами, никак между собой не связанными, тогда как у Trypanoplasma borreli наблюдается структуризация этих молекул, а у всех представителей Trypanosomatidae вся митохондриальная ДНК организована в плотную сеть из катенированных молекул. Причем по сравнению с другими семействами произошла значительная дупликация миниколец.

Семейство Trypanosomatidae включает в себя моногенетические и дигенетические виды, то есть организмы, которые имеют в своем жизненном цикле соответственно одного или двух хозяев. Еще в начале прошлого века существовали две противоположные гипотезы. Первая, предложенная Легером и развитая далее Грассе, Хоаре и Бекером (Baker, 1974), утверждает, что эволюция этих простейших шла по усложнению жизненного цикла, то есть от моногенетических паразитов к дигенетическим. Авторы этой гипотезы предполагают, что заражение позвоночных животных произошло от кровососущих насекомых и пиявок. Напротив, согласно второй гипотезе, выдвинутой Минхиным и развитой в группах Лавиера и Уолласа (Wallace, 1966), первые трипаносоматидные паразитарные системы возникли у водных позвоночных в пищеварительном тракте, а затем внедрились в кровяное русло. Переносчиками же оказались сначала пиявки, затем насекомые, питающиеся кровью, таким образом, произошло их распространение среди различных групп позвоночных.

В последние годы благодаря развитию и применению молекулярных методов анализа генома в систематике трипаносоматид произошли значительные изменения. Для геносистематики этих организмов был выбран традиционный маркер - ген 18S рРНК, и с его использованием проведен филогенетический анализ. Следует отметить, что в связи с социальной значимостью этих организмов основное число работ посвящено изучению именно патогенных представителей этого семейства Trypanosoma и Leishmania, тогда как относительно паразитов насекомых и растений информация достаточно скудна. На основании последовательности гена 18S рРНК установлено, что род Trypanosoma и Leishmania формируют монофилитические кластеры (Lukes et al., 1997). Надо отметить, что до появления этой работы род Trypanosoma считался полифилитичным, так группа африканских трипаносом Trypanosoma brncei формировала отдельный кластер" (Maslov et al., 1996). Но добавление дополнительных Критика филогенетических построений на основе молекулярных маркеров

Следует отметить, что в литературе часто встречаются противоречия в филогенетических построениях и высказывается много критики в адрес применения молекулярных методов в геносистематике; в частности, некоторые из них приведены в работе (Philippe et al., 2000).

1. Было отмечено, что некоторые маркеры дают эффект так называемых длинных ветвей, что может быть связано с использованием тандемно повторенных генов в качестве молекулярного маркера. В этом случае существует вероятность, что последовательность, которая используется для сравнения, оказывается не функциональной. Также отмечалось, что ни один из использованных маркеров для классификации кинетопластид не отражает концепцию «молекулярных часов». представителей во внешнюю группу (outgroup) и использование большего числа изолятов Trypanosoma изменило эту ситуацию. На основании полученных сравнений в группе Trypanosoma было выделено, по крайней мере, четыре группы: 1-ая Trypanosoma brucei (Salivarían), 2-ая Trypanosoma cruzi (Stercoraria), 3-я - трипаносомы рыб и 4-ая - трипаносомы пресмыкающихся и птиц (Stevens et al., 2001).

Опубликовано большое число работ, посвященных изучению разных молекулярных маркеров группы Leishmania, и сделаны попытки отразить происхождение и дальнейшую эволюцию этих организмов. Надо отметить, что эти дигенетические паразиты распространены в Южной и Центральной Америке, Африке и Средней Азии и включают в себя паразитов ящериц (Sauroleishmania), внутриклеточных паразитов эритроцитов ленивцев (Endotrypanum), собственно Leishmania (паразиты мелких грузынов и человека). Среди лейшманий выделяют две группы: Viannia и Leishmania, распространеные соответсвенно в Новом и Старом свете. Для группы Endotrypanum-Leishmania введено дополнительное название Paraleishmnaia. в отличие от всех остальных Euleishmania (табл. 4). Следует также отметить, что штаммы, отнесенные к руппе Endotrypanum, крайне разнообразны, многие из них не могут становиться внутриклеточными паразитами в модельных системах и не образуют характерных морфологических форм в культуре клеток. Возможно, это связано, либо с их неверной идентификацией, либо с долгим культивированием на искусственных средах.

Таблица 4. Условное распределение лейшманий по группам, для примера указаны некоторые виды (по Мотеп, 2000, с дополнениями).

Род. вид Позвоночный хозяин Секция Распространение

Sauroleishmania L. lareniolae L. gymnodactiW Ящерицы i Старый свет, Восточная Африка

L. (Leishmnia) L. aeihiopica L. major L. mexicana L. brasil icnsis Мелкие грызуны, Человек Euleishmnia По всему миру

Старый свет, Африка, Средняя Азия

Новый свет: Центральная и Южная Америка

2. Концептуальная критика молекулярной филогении в целом. Высказывается мнение, что филогения организма и эволюция отдельных молекул - не одно и тоже.

3. Известно много указаний на существование горизонтального переноса генов и участков генома между организмами. В частности, для геномов Escherichia coii и Sallmonella показано 234 примера (т.е. около 17% генома) такого рода переносов.

РОСПУСКА ц

ГОСУДа^ВДЗа*

Б íf й Л i • ОТЕКА hertigi L. deanei 9 Paraleishmania Новый свет

Endotrypanum /,. herrén L e(/ualonensis Ленивцы Paraleishmania Новый свет

Существует три основные гипотезы происхождения лейшманий:

1 Первая предполагает африканское происхождение лейшманий, а появление и их расселение в Новом свете - уже в историческое время. При этом все существующие в Новом Свете лейшманий произошли от L. infantum (Noyes et al., 2000).

2 Противоположные представления основаны на том основании, что L. mexicana (Северная Америка, Техас) и L. major (Азия) крайне схожи между собой по многим характеристикам. Основываясь на этом факте, предположено, что группа Leishmania возникла в Палеоарктике и распространилась в Неоарктику с мышами в качестве хозяина в эоцене, когда ещё Берингов пролив не существовал. Затем лейшмании распространились по всей Северной Америке и перешли в плеоцене по Панамскому перешейку в Южную Америку (Kerr et al., 2000). Однако эта гипотеза сталкивается с рядом проблем, связанных с современными представлениями о коэволюции москитов (Phlebotomus) и грызунов (соответственно, переносчиков и хозяев), необходимостью предположений множественной адаптации к мышевидным грызунам в Неотропиках, Неоарктике и Палеоарктике, обратной миграцией паразитов через Берингов пролив и др. (Ready, 2000).

3 Альтернативная гипотеза, заключается в следующем. Euleishmania появились еще во времена существования общего континента Гондваны, который разделился в мезоцене. Таким образом, лейшмании оказались в Африке, a L.(Viannia) - Южной Америке. На данной момент, основываясь на нескольких маркерах, причем генах, имеющих лишь одну копию в геноме (EF-1 - элонгационный фактор 1, HSP70 - белок-теплового шока 70kJDa, GAPDH - глицеральдегиддегидрогеназа), предложена комплексная модель. Эта модель предполагает африканское происхождение лейшманий и Sauroleishmania, а затем четыре независимых линии развития: Leishmnaia в Неотропиках, L.(Viannia) в связи с разделением Гондваны - в Америке, Paraleleishmania с распространением грызунов и L. mexicana после формирования Панамского перешейка в плиоцене - в Южной Америке (Momen et al., 2000).

Для моногенетических трипаносоматид с помощью молекулярных маркеров было охарактеризовано очень малое количество видов. Были получены только предварительные данные с использованием RAPD-анализа, шизодемного анализа и т.п. (Bulat, et al., 1999; Podlipaev, 2000). Сравнение последовательности гена 18S рРНК было проведено только для группы эндосимбионтсодержащих паразитических простейших. Оказалось, что эта группа является монофилетической, хотя включает виды разной родовой идентификации.

Эволюция редактирования у трипаносоматид

Итак, как видно из предыдущего параграфа, в систематике трипаносоматид были достигнуты определенные успехи. Это дает основания для анализа тех изменений, которые процесс редактирования претерпел в процессе эволюции этой группы простейших.

Начиная с 1994 года, появился целый ряд работ, в которых проведены сравнения редактируемых генов трипаносоматид с филогенетическим положением этих организмов (Landweber et al., 1994; Maslov, et al., 1994; Simpson et al., 1994). Было выявлено, что редактируемые митохондриальные гены можно условно поделить на три группы: полностью редактируемые (pan editing genes), частично редактируемые и нередактируемые гены. На основе анализа сравнения гена А6 по гипотезе Маслова-Симпсона была предложена модель, по которой в процессе эволюции происходит частичная редукция редактирования. Было показано, что длина редактируемого домена (РД) уменьшается в ряду: Trypanosoma - редактируется весь ген, Leishmania - 100 нт, Herpetomonas muscarum - 75 нт, Blastocrithidia culicis (представитель моногенетических эндосимбионтсодержащих простейших) - 35 нт. При этом по данным сравнения последовательности гена 18S рРНК трипаносомы занимают самое низкое положение, то есть являются более древними по сравнению со всеми остальными исследованными видами. Однако, в положении остальных простейших есть некоторое несоответствие этой теории. Так, при такого рода филогенетических построениях, лейшмании формируют крону, а группа эндосимбонтсодержащих простейших - промежуточную ветвь (клад) между трипаносомами и лейшманиями, то есть она не являются наиболее позднедивергировавшей.

Такое распределение редактируемых доменов дало возможность авторам сформулировать положение о том, что редактирование является древним процессом, который постепенно редуцировался у более «молодых» групп. Предположения о древности возникновения процесса редактирования представляется крайне интригующим, так как может свидетельствовать о том, что этот процесс является одним из древнейших способов регуляции активности генов и имеет свои корни в РНК-мире (RNA world). Следует отметить, что эту группу простейших (Kinetoplastida) считают одной из самых древних представителей эукариот (Phillipe, 2000). Однако, при анализе митохондриального генома представителей семейства Bodonidae было показано, что во-первых, этот процесс модификации встречается не у всех организмов (есть у представителей рода Bodo, но отсутствует у Cryptobia), а во-вторых, даже если оно обнаруживается, то затрагивает меньшее число генов и протяженность редактируемых доменов внутри самого гена несравнимо короче, чем у трипаносоматид (Blom et al., 1998). Таким образом, авторы предполагают, что редактирование возникло в группе бодонид и распространилось и получило свой расцвет у трипаносоматид.

На основании этих наблюдений была предложена ретропозиционная модель, которая предполагала, что частично отредактированные транскрипты подвергаются обратной транскрипции (соответствующая ревертазная активность была показана в митохондриальном лизате трипаносоматид). Затем происходит гомологичная рекомбинация с последовательностью митохондриального генома. Такое уменьшения редактирования также приводит к потере необходимости существования соответствующей гРНК и, следовательно, в процессе сегрегации мт генома может также произойти потеря миниколец, кодирующие эти гРНК (Simpson et al., 1994).

Как уже отмечалось, вопрос об эволюции, а тем более о структуре митохондриального генома моногенетических трипаносоматид, практически не обсуждался в литературе. Поэтому целью этой работы явилось попытка ответить на следующие основные вопросы: насколько широко распространен процесс уменьшения редактируемого домена в гене А6 у разных представителей трипаносоматид и насколько правомочно это утверждение для других митохондриальных генов, связан ли процесс редактирования РНК с эволюцией трипаносоматид, как соотносятся митохондриальные и ядерные маркеры в геносистематике трипаносоматид.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. 1. Объекты исследования.

Объектами исследования служили моно- и дигенетические трипаносоматиды:

Тип: Protozoa,

Класс: Mastigophora,

Подкласс: Zoomastigina,

Отряд: Kinetoplastida,

Подотряд: Trypanosomatina,

Семейство: Trypanosomatidae.

Таблица 5. Виды трипаносоматид, использованные в данной работе. Приведены источники откуда получена данная культура, где и из какого хозяина была выделена.

Род Вид Откуда выделен Номер ATCC/WHO Комментарии

Blastocrithidia В. gerricola (KV1) Gerris lacustris Калининград, Россия Культуры предоставлены д.б.н. С. Под.пи-паевым, ЗИН, Санкт Петербург, Россия.

В. tri ato та Tri atom а infestans, Аргентина Предоставлена Др-ом Г. Шаубом, Германия культивировалась на спец. среде (см. ниже)

Crithidia С. oncopelti штамм COM Выделена в Санкт- Петербурге, хозяин неизвестен

Herpetomonas И. megaselia ДНК предоставлена др-ом Д. Масловым, США

Н. pessoai Zelus leucogrammus

Н. sp ТСС263

Leishmania L. arabica Препараты ДНК предоставлены Дом Г. Шониан, Германия, Берлин

L. brasiliensis MHOM/BZ/75/M29C13

L. chagasi

L. donovani

L. gerbili reper №88984

L. guyanensis MHOM/SR/87/TRUUS1

L. infantum

L. major MHOM/WA/87/NEL2

L. mexicana MHOM/MX/85/MNR3

L. panamensis MHOM/CR/87/NEL3

L. tropica K-27 L. tropica KD-51 MHOM/SU/80/K28

L. turanica M-87 M-107 MHOM/MN/83/MNR1

Leptomonas L. collosoma Gerris dissortis, Выделен в США АТСС302621 Культуры предоставлены д.б.н. С.А. Подли-паевым, ЗИН, Санкт-Петербург, Россия.

L. peterhoffi 101 Nabicula ßavomarginata, С.-Петербург, Россия

L. seymouri Dysdercus sulurel/us США АТСС30220

L. sp Cfm9 Nabicula flavomarginata, Псковская обл., Россия

L. sp F6 Nabicula flavomarginata, Карелия,Россия

L. sp Nfm Nabicula flavomarginata, Псковская обл., Россия

Trypanosoma T. avium паразиты птиц Препараты ДНК предоставлены д-ром Ю. Лукешем, Чехия

T. boisson! Ray sp. паразиты рыб

T.carassius паразиты рыб

T. triglea Trig/a corax -паразиты рыб

T.scelopori Sceloporus jarrovi, паразиты ящериц, Аризона, США

Wallaceina W. brevicula NBR Nabis brevis Псковская обл., Россия Культуры предоставлены д.б.н. С.А. Подли-паевым, ЗИН, Санкт Петербург. Россия.

W. inconstans ZK Calocoris (Grypocoris) sexguttatus Псковская обл., Россия

2. Ферменты и реактивы.

В работе были использованы:

- Специфические эндонуклеазы рестрикции HindIII, BamHI, EcoRI "Promega",

- термостабильная ДНК-полимераза из Thermus aquaticus (Taq-полимераза) "Promega",

- T7 ДНК-полимераза "Fermentas",

- ДНКаза RQl(6e3 РНКазной активности) "Promega",

- AMV, M-MLV обратная транскриптаза "Promega", "Fermentas", "Gibco",

- РНКазин "Promega","Fermentas",

- T4 ДНК-лигаза "Promega","Fermentas".

- в табл. 6 представлены олигонуклеотиды, использованные в качестве праймеров для амплификации, производства "Syntol" (Россия); "TIB Molbiol Syntheselabor" (Берлин, Германия); "Max-Planck Institute for Molecular Physiology" (Дортмунд, Германия).

Таблица 6. Использованные в работе праймеры.

Название Для амплификации какого участка Последовательность праймера Примечание

DNAP (for) Амлификация и секвенирование DNAP 5'-AACGAGCGCGC(A/G)CTGCT(C/T)GA CTGG-3' Upstream, использованного (Croan et al., 1997).

DP02 (rev) 5'-GCCGAGGCAGCCATACAT-3' (Croan et al., 1997)

RPOF1 Амлификация и секвенирование большой субъединицы РНК-полиме-разы 5'-GACACAGCCGTCAAGAC-3' (Croan et al., 1997)

RNAPin(f) 5 '-G AAC AAGCTC AAG ATG ААСС-3' Внутренний (+350 nt)

RPOR1 5 '-GC AGCCGCACAATGCGCT-3' (Croan et al., 1997)

RNAPin(rev) 5 '-AA(A/C)CGG AACAA(C/T)CG (C/T)TT(C/T)TG-3' Внутренний (-350 nt)

12S5F Амплификация участка мтДНК: ND8, ND9, MURF5 5'- TTGGATCCAAATCGTTGTAAAGCAG- -i i j Введен сайт узнавания эндонуклеазы BamHI

9S5F 5'- TTAAGCTTGTTGCCCACCATTCT TTGTAATAA AG AC AACGTGCAGT-3' HindII II

960coin 5'- TTGGATCC(C/T)TG(C/T)TC(A/T)A C(A/T) (C/G)TTTTATATTC(A/G)CATAA CTTTTCTGTACC-3' BamHI

ND8fl синтез и амплификация кДНК гена ND8 S'-TTTTTGGATCCGTTTGTTTTTATA TGTGTTTTTTATGTTGTG-3' BamHI

ND8rev 5'.TTTTTAAGCTTAACAACCAAA(C/T) AA(A/C/T)ACAAA(C/T)TT(G/T)GG(C/T) GC-3' HindIIII

LcybF4 синтез и амплификация кДНК, ДНК гена А6 (моноге-нетичесие трип, и Leishmania 5' -GCTAGTTGTATGTAG ATTAG-3'

ViLeiAÓRl 5'-TTGGATCCAT(A/G/T)DATTAA(C/T) TGCATTATC-3' BamHI

LeiAóFl А6 - Leishmania 5'-TATGCATTAGA(C/T)ATGTTTTG(C/T) GCATT-3' Внутренний

865 (Cyb) амплификация гена А6 у Trypanosoma 5'-TTTAAGCTTATGATTTGT(G/T)TAT TGTAGAAGTTCATTATT(A/G)TG-3' HindIII

866 (MURF1) 5'-TTATCGATTCC(A/T)ATTGTATTTGG ATTTTTT(A/T)T(A/C) A AGT-3' Clal

S-762 амплификация I8S рРНК Использованы для секвенирования 5 '-GACTTTTGCTTCCTCTA(A/T)TG-3 ' (Maslov, et al., 1996)

S-763 5'-CATATGCTTGTTTCAAGGAC-3'

S-713 5'-CCGCGGTAATTCCAGCTCC-3'

S-714 5'-CGTCAATTTCTTTAAGTTTC-3'

S-825 5 ACCGTTTCGGCTTTTGTTGG-3 '

S-826 5'-CCAACAAAAGCCGAACGGT-3'

Т7 Для секвенирования рекомбинантных плазмид 5 AATACG ACTCACTATAG-3 ' Универсальные праймеры

Reverse 5'-AACAGCTATGACCATG-3'

Секвенирование ДНК проводили с использованием набора для секвенирования "Cycle Reader™ DNA Sequencing Kit" "Fermentas" и "Sequenase Kit" с использованием T7 полимеразы и "RedDye" (с использованием автоматического секвенатора "ABIPRIZM") "Amersham-Pharmacia-Biotech", fmol® "Promega" (США). По протоколам фирм производителей.

Очистка ПЦР-продуктов проводилась с использованием набора "QIAquick PCR purification kit" "QIAGEN" (Германия);

Выделение плазмид проводилось с использованием набора "QIAprep spin miniprep kit" "QIAGEN" (Германия);

В работе также использовались реактивы следующих фирм: ацетат натрия, проназа Е - "Merck"; N-лауринсаркозин, ДТТ, агароза, бромистый этидий. гуанидинизотиоцанат "Serva"; пептон, дрожжевой экстракт "Difco"; акриламид, бисакриламид, TEMED, персульфат аммония - "Reanal"; дезоксинуклеозидтрифосфаты - "Amersham-Pharmacia-Biotech", гуанидинхлорид "Pierce", ß-меркаптоэтанол "Fluka"; - Дезоксинуклеозидтрифосфаты, радиоактивно меченые по а и у положениям, были получены из г. Обнинска, либо использовались препараты производства "Amersham-Pharmacia-Biotech";

Неорганические реактивы, кроме обозначенных выше, были отечественного производства, марки "осч", "чда" и "хч".

3. Культивирование моногенетических трипаносоматид

Культуры моногенетических трипаносоматид выращивали на среде BHI "Difco" (37 г на 1л среды, pH - 7,5), либо с использованием среды STAR следующего состава (на 1 литр):

Пептон

Ыа2НР04 * 12Н20

К2Н2РО4

ЫаС1

12,5 г, 1,2 г, 0,5 г, 5 г, 2 г,

КС1

Витамин

В] до концентрации 6 %, 2 г, до концентрации 2 %, 0,1 г.

Глюкоза

Гемин

Антибиотик

Культуры растили до стадии позднего логарифмического роста (около 7 дней) при температуре 25°С в воздушном термостате. Исключение составляла культура В1а.ч1осгИИ1сИа /гкиота, которую выращивали на среде для клеток насекомых ТС-100 "ОПсо". с добавлением инактивированной фетальной сыворотки до конечной концентрации 10% "01&о" и антибиотиков. Причем максимальной скорости роста и плотности она достигала при добавлении в культуру клеток насекомых. Такие исключительные особенности в культивировании коррелируют с данными по организации некоторых генов (см. результаты и обсуждения).

4. Выделение ДНК

Выделение суммарной ДНК.

Производили по стандартной методике (ЗатЬгоок е1 а1., 1989). Культуру выращивали на среде ВН1 до плотности 5*107 клеток в 1 мл культуры. Далее центрифугировали 10 мин при 2500 об/мин (К-23 'Мап^эку"). Клеточный осадок промывали 2 объёмами дистиллированной воды, центрифугировали в тех же условиях. После осаждения клетки суспендировали в буфере ИЕТ-20 (20 шМ Тпб-НС1 рН 7,5; 20 гпМ БЭТА рН 8.0, 100 шМ ЫаС1) из расчета 10-20 мл буфера на I г сырого веса клеток. После эго добавляли протеиназу К (20 мкг/мл), РНКазу (50 мкг/мл) и ББЗ (до 2%) и инкубировали 3 ч на бане при 65°С. Лизат осветляли центрифугированием при 12000 об/мин в течение 10 мин. Далее проводили фенольную экстракцию, отбирали водную фазу. ДНК экстрагировали из водной фазы с добавлением 1/10 об. ЫаОАс и 2 об. ЕЮН. Антибиотик - пенициллин или/и стрептомицин

Полученный в результате центрифугирования (13000g*30MHH) осадок ДНК промывали 70% этиловым спиртом, сушили и растворяли в необходимом количестве mQ воды (Millipor, градации Q).

Выделение кп ДНК (Маслов, 1992).

После семидневной инкубации клетки центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин на центрифуге К-70, осадок промывали водой, суспендировали в буфере NET-100 (100 мМ NaCl, 100 мМ EDTA, 10 мМ Tris-HCl рН=8) с помощью гомогенизатора Поттера (на 1 г сырого веса добавлялось 5 мл буфера). Затем добавляли лаурилсаркозил до конечной концентрации 1.5 % и проназу Е до концентрации 100 мкг/мл. Раствор инкубировали в течение 2 ч при температуре 60°С и вновь проводили гомогенизацию описанным выше способом. Гомогенат центрифугировали при 8000 об/мин в течение 10 мин на центрифуге Beckman JA-21 с ротором J-20 при 10°С. Супернатант отбирали и центрифугировали при 20000 об/мин в течение 1 ч при 10°С. Осадок суспендировали в^20 мл) буфере NET-100, добавляли NaCl до конечной концентрации 1 М и 1 объём смеси хлороформ-изоамиловый спирт (24:1, по об.). После интенсивного встряхивания пробы центрифугировали при 4000 об/мин в течение 25 мин на центрифуге К-23. Водную фазу аккуратно отбирали и центрифугировали при 20000 об/мин в течение 1 ч при 10°С. Осадок суспендировали в 1/2 объема ТЕ-буфера (10 мМ Tris-HCl Н=7.4, 1 мМ EDTA рН=8) и поводили центрифугирование при 20000 об/мин в течение 1 ч при 10°С. Осадок растворяли в 1 объеме ТЕ-буфера, добавляли 3 объема спирта (96% С2Н5ОН) и СН3СООК до концентрации 1 М и инкубировали 8 ч при -20°С. Раствор центрифугировали при 15000 об/мин в течение 15 мин на центрифуге Beckman JA-21 с ротором J-20. супернатант удаляли, а осадок промывали 96 % спиртом, высушивали и растворяли в воде.

Концентрацию ДНК определяли спектрофотометрически по оптической плотности при 260 нм (s=50 см"1 М"1).

5. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

5.1 Стандартная ПЦР-амплификация.

Амплификацию кинетопластной ДНК и кДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции в буфере для ПЦР "Promega". Состав 1 Ох ПЦР-буфера:

100 m M Tris-HCl pH 9,0, 500 mM KCl, 1% тритон Х-100. Реакционная смесь в объеме

25 мкл содержала :

2,5 мкл 1 Ох ПЦР буфера,

1 мкл каждого праймера (15 рМ),

2.5 мкл dNTP's (по 2 шМ каждого),

2.0 мкл MgCl2 ( 25 mM),

1-2 U Тац-полимеразы,

0.1-0.2 мкг ДНК, вода до 25 мкл.

Состав 1 Ox dNTP's: по 2 шМ каждого дезоксинуклеозидтрифосфата в воде. Для предотвращения испарения на реакционную смесь наслаивали вазелиновое масло. Реакцию проводили на амплификаторе "Сус1оТешр-5". Режим амплификации подбирался для каждой пары праймеров индивидуально. Продукты реакции разделяли с помощью электрофореза в 0,8-2,5% агарозном геле, либо 4-8% ПААГ.

5.2 ПЦР с клонов

При скринировании колоний после клонирования применяли ПЦР с клонов. В реакционную смесь вместо ДНК вносили равный объем воды, в который помещали сколотую с твердой среды колонию. Остальные реагенты и условия были аналогичны описанным выше.

6. Клонирование ПЦР-продуктов.

6.1 Использованные плазмиды, штаммы бактерий и среды для их выращивания.

Для клонирования ПЦР-продуктов и последующего секвенирования были использованы вектора серии pBluescript и pCR 2*1 ("Invitrogene"), pST-Bluel ("Novagene").

Использованные штаммы Е. coir.

XLIBlue: A(mcr A)183, Д(шсг CB-hsp SMR)173, end AI, thi 1, rec A, gyr A96, rel Al, lac, К, [F', pro AB, lac IqZAM15, TnlO, ( tetR)];

DH5a: (j)80d lacZAM15, recAl, endAl, GirA96, thi-l,hsdR17(rk",mk+), supE44, relAl,deoR,

A(lacZ YA-arGF)U 169.

1) Среды для выращивания E. coli:

Среда LB (Sambrook et al., 1989): 10 г пептона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl в 1 литре среды при pH 6,7-7.

Среда McConkey: 10 г лактозы, 20 г пептона, 5 г NaCl, 5 г дезоксихолата натрия и 1 мл 1% бромкрезолового пурпурного в 1 литре среды при рН 7,2.

Твердые среды того же состава получали добавлением агара до конечной концентрации 1,5%. 2) Среды для трансформации

Среда SOB (Inoue et al., 1990): 0,5% (вес /объем) дрожжевого экстракта, 2% (вес/объем) триптона, 10 mM NaCl, 2,5 mM КС1, 10 mM MgCl2,10 mM MgS04 в 1 литре среды при рН 6,7-7,0.

Среда ТВ (Inoue et al., 1990): 10 mM Pipes, 55 mM MnCl2, 15 mM CaCl2, 250 mM KC1 в 1 литре среды при рН 6,7.

6.2 Рестрикция.

Рестрикцию ПЦР-продуктов и вектора проводили в буферах соответствующих фирм производителей. После рестрикции эндонуклеазы рестрикции инактивировали инкубацией при температуре 65°С в течение 15 мин (Sambrook et al., 1989).

6.3 Лигирование.

Рестрицированные ПЦР-продукты лигировали с вектором Bluescript SK+, расщепленным по тем же сайтам. Для лигирования использовали ДНК-лигазу фага Т4 ("Ртон^а") и десятикратный лигазный буфер: 66 mM Tris-HCl (рН 7,6), 6 mM MgCb, 1 mM DTT, 0,66 mM ATP ("Promega"). Лигирование проводили при 14°C в течение 14 часов (Sambrook, et al., 1989). Инактивацию и очистку от лигазы проводили в тех же условиях, что и очистку от рестриктаз (см. выше).

6.4 Трансформация клеток Е. coli. 6.4.1 Солевая трансформация. Приготовление компетентных клеток.

1)1 мл ночной культуры, выращенной в LB, переносили в 10 мл среды LB и растили на 37°С до оптической плотности D6oo=0,8 (до стадии средней логарифмической фазы). Клетки переносили в эппендорфы по 1,4 мл и осаждали на микроцентрифуге (15000 g) в течение 5-10 с; супернатант удаляли. К осадку добавляли 0,7 мл 0,1М MgCl2 и центрифугировали в тех же условиях, супернатант удаляли. К осадку добавляли по 0,1 мл 0,1М МпСЬ и 0,1М СаС12. Клетки ресуспендировали при помощи автоматической пипетки.

2) 25 мл ночной культуры, выращенной на среде LB, переносили в 250 мл SOB среды и растили при 18°С пока оптическая плотность Ббоо не достигла 0,6. Далее, полученную культуру помещали на лед на 10 мин и центрифугировали при 2500g

10 мин при 4° С. Осадок клеток ресуспендировали в 80 мл охлажденной во льду среды ТВ, 10 мин инкубировали на льду, центрифугировали в тех же условиях. Осадок ресуспендировали в 20 мл ТВ и добавляли ОМБО до конечной концентрации 7%. Далее клетки переносили на лед на 10 мин. Полученные клетки замораживали жидким азотом и хранили при -70°С.

Трансформация.

Очищенную лигированную смесь охлаждали на льду и добавляли к 200 мкл компетентных клеток и инкубировали 20 мин на льду. Далее смесь прогревали в водяном термостате при 42°С в течение 1,5 мин и вновь помещали на лед на 5 мин. К осадку клеток добавляли 1 мл среды ЬВ и инкубировали при 37°С на качалке 40-60 мин. Клетки осаждали центрифугированием и переносили на селективную среду (твердая ЬВ или среда МсСопкеу с конечной концентрацией ампициллина 100 мкг/мл). Для селекции полученных колоний использовали: 1) в случае ЬВ - бело-голубую селекцию (на поверхность агара наносили 25 мкл 1РТО (20 мг/мл) и 25 мкл Х-Оа1 (20 мг/мл) и 2) если использовали среду МсСопкеу, то клетки наносили прямо на твердую среду. Для дополнительного отбора клонов, содержащих плазмиду со встройкой, проводили ПЦР с клонов (см. выше).

6.4.2 Трансформация электропорацией. Приготовление компетентных клеток.

5 мл ночной культуры, выращенной на среде ЬВ, переносили в 250 мл ЬВ среды и растили при 37°С пока оптическая плотность Ббооне достигала 0,6. Далее полученную культуру помещали на лед на 10 мин и центрифугировали при 2500g 10 мин при 4° С. Супернатант удаляли, к клеткам добавляли 1 объем стерильной дистиллированной воды и центрифугировали в тех же условиях. К осадку клеток добавляли 1/10 от исходного объема стерильной дистиллированной воды и центрифугировали в тех же условиях. После удаления супернатанта к осадку клеток добавляли 1/50 от исходного объема глицерина (10%), клетки осаждали в тех же условиях. Клеточный осадок ресуспендировали в 2 мл 10% глицерина и замораживали в жидком азоте. Трансформация.

Очищенную лигированную смесь охлаждали на льду и добавляли к 100 мкл компетентных клеток, инкубировали 5 мин на льду, после чего помещали в кювету 2 мм (1 мм) для электорпорации. Элетропорацию проводили при 2,5 кУ (1,8 кУ) на электропораторе ("Bio-Rad"). После пропускания тока к клеткам немедленно добавляли 1 мл нагретой до 37°С среды LB и помещали на качалку на 37°С на 45-60 мин для фенотипической экспрессии гена устойчивости к ампициллину.

Клетки осаждали центрифугированием и переносили на селективную среду (твердую LB или среду McConkey с конечной концентрацией 100 мкг/мл ампициллина). Селекцию клонов проводили по описанной в пункте 6.4.1.

7. Выделение плазмидной ДНК.

Колонии, содержащие плазмиду, пересевали в 5 мл среды LB с ампициллином и растили в течение ночи.

1)Для выделения плазмиды использовали набор "QIAprep Miniprep Kit". выделение проводили по стандартной методике ("QIAGEN").

2) 1-3 мл ночной культуры центрифугировали 1-2 мин на микроцентрифуге. Осадок суспендировали в 200 мкл ТЕ (50 гаМ Tris-HCl (pH 7), 10 mM EDTA). Затем добавляли 200 мкл лизирующего раствора*. 0,2 М NaOH, 1% SDS. Перемешивали переворачиванием пробирки до полного просветления, после чего добавляли 200 мкл 1,32 М КАс (pH 4,8). Смесь центрифугировали 7-8 мин и супернатант переносили в чистый эппендорф. ДНК переосаждали этанолом (96%), промывали 70% этанолом и растворяли в 50 мл воды или ТЕ.

8. Определение первичной структуры ДНК по Сэнгеру .

Использовали стандартный метод ПЦР-секвенирования с включением дидезоксинуклеотидов в качестве терминаторов ("Cycle Reader,м DNA Sequencing Kit" 'ifermentas", fmol® "Promega").

Для секвенирования с Т7 полимеразой (секвеназой) использовали стандартный метод секвенирования с включением дидезоксинуклеотидов в качестве терминаторов ("Sequenase Kit" фирмы "Amersham - Pharmacia-Biotech").

Пробы наносили на 5 - 8% ПААГ с 8 М мочевиной. После проведения электрофореза гель фиксировали 10% уксусной кислотой, высушивали и радиоавтографировали в течение 12-48 ч.

9. Выделение суммарной и митохондриальной РНК.

Культуры выращенные на среде STAR (состав см. выше). После семидневной инкубации клетки центрифугировали при 2500 об/мин в течение 15 мин на центрифуге К70, осадок промывали водой. Промытые водой клетки или митохондрии, выделенные. как описано в пункте 10, гомогенизировали в 20 об. буфера (по отношению к сырому весу клеток), содержащего:

ЗМ гуанидинизотиоцианата, 0,5 % лаурилсаркозила, 0.1М меркаптоэтанола, 25мМ цитрата Na.

Обломки клеток осаждали центрифугированием при 8500g в течение 10 мин. Далее проводили фенольную экстракцию (кислым фенолом, т.е. уравновешенным водой). РНК осаждали из супернатанта двумя объемами этанола и затем центрифугировали при 8500g в течение 10 мин. Осадок растворяли в буфере, содержащем: 7,5М гуанидилхлорида, 5мМ DTT, 25мМ цитрата Na.

РНК из раствора осаждали этанолом, затем переосаждали 5-7 раз и полученный препарат РНК хранили в спиртовом растворе при -20°С.

10. Выделение митохондрий (Harris et al., 1990 с модификациями).

Зл семидневной культуры трипаносоматид центрифугировали на центрифуге К-70 при 2500 об/мин, затем промывали равным объемом воды для удаления остатков среды и гемина и осаждали клетки в тех же условиях. Клетки промывали 200-300 мл охлажденным на льду раствором 150 mM NaCl, 20 гаМ глюкозы, 20 mM NaHPÜ4 pH 7.9. Все последующие стадии проводили на льду. Клеточный осадок ресуспендировали в буфере ТЕ (1 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA) из расчета: 1,2x109 клеток на 1 мл буфера и проводили гипоосмотический шок в течение 30 мин. Клетки разрушали с помощью ножевого гомогенизатора на максимальной скорости в течение 3 мин, после чего добавляли раствор 60% сахарозы до конечной концентрации 250 mM. Далее лизат центрифугированием при 15800 об/мин (ротор JA-20 центрифуги Beckman JA-21). Осадок суспендировали в 1/5 объема лизата в буфере: 250 mM сахарозы, 20 mM Tris-HCl pH 8, 2 mM EDTA. Полученный раствор наносили на линейный градиент перколла 20-35% (Percoll) Градиент центрифугировали в течение 75 мин при 21000 об/мин (ротор JA-21 центрифуги Beckman JA-21). После чего отбирали фракцию, имеющую бурую окраску и соответствующую 25-28%) перколла. Митохондрии промывали 4 раза раствором, содержащим 250 шМ сахарозы, 10 гаМ Tris-HCl pH 8 и 1 mM EDTA (осаждение проводили в настольной центрифуге типа "Eppendorf при максимальной скорости). Осажденные митохондрии использовали для выделения митохондориальной РНК, согласно протоколу, изложенному выше (см. 9).

11. Обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция (RT-PCR).

Препарат суммарной РНК обрабатывали ДНКазой RQ1 (без РНКазной активности) в течение 10 мин при 37°С. Далее концентрацию РНК определяли спектрофотометрически, измеряя оптическую плотность при 260 нм и используя коэффициент поглощения £2бо=40 см' -'М". 2-5 мкг РНК вносили в реакцию обратной транскрипции. РНК прогревали 2 мин при 65°С с обратным праймером (40 рМ) для его отжига и денатурации вторичных структур в РНК. В реакционную смесь добавляли 2мкл 5х буфера,

1 мкл dNTP's (по 0,5 шМ каждого),

JU обратной транскриптазы (в зависимости от используемого фермента), 1 мкл - 40 U РНКазина (ингибитора РНКаз "Promega"), до 10 мкл mQ воды, обработанной DEPC.

Реакционную смесь инкубировали на 37°С в течение 1 ч. кДНК амплифицировали с помощью ПЦР (протокол см. выше), используя не более 1/10 объема исходной реакции ОТ-ПЦР. Продукты ПЦР-реакций разделяли в 1-2% агарозном геле и в 4-6% ПААГ.

12. Электрофоретические методы.

Для идентификации молекул ДНК использовали электрофорез в агарозном геле, для секвенирования и определения качества выделения РНК - в ПААГ и в смешанном ПААГ-агарозном геле. В обоих случаях в качестве маркеров по длине прогона использовали бромфеноловый синий и ксиленцианол.

Электрофорез ДНК проводили в 0.7 - 2% агарозных гелях в стандартном ТАЕ-буфере (40 юМ Tris-ацетат, 2 mM EDTA, рН 7.8) и 4-6 % не денатурирующем ПААГе в стандартном ТВЕ-буфере (89 шМ Tris-борат, 2mM EDTA). В качестве маркеров размеров ДНК использовали маркер lkb Ladder фирмы "Promega" или "Gibco'\

Электрофорез РНК проводили в 6% денатурирующем ПААГ геле и в смешанном ПААГ-агарозном в денатурирующих условиях, содержащем 0.5% агарозы, 2.85% акриламида и 0.15% бисакриламида на ТВЕ-буфере.

Гели окрашивали бромистым этидием и фотографировали на трансиллюминаторе С-61 на фотопленку Микрат-300, используя красный фильтр, либо на цифровую камеру "Casio" в режиме ручного управления макросъемкой.

Для секвенирования использовали 5-8% денатурирующий ПААГ (содержащий 8М мочевину) длиной 60 см. Электрофорез проводили в буфере ТВЕ. В работе использовали короткий прогон (до выхода бромфенолового синего), длинный прогон (до выхода ксиленцианола) и сверхдлинный прогон (до выхода второго ксиленцианола).

13. Компьютерный анализ.

В работе были использованы следующие программы и интерент ресурсы:

1) PCGENE.

2) ClustalW Multiple Sequence Alignment (@BCM) http://dot.iMgen.bcm.tmc.edu:9331/multi-align/Options/clustalw.html

3) LALIGN. hltp://vega.i.gh.cnrs.fr/bin/laliKn-Q;uess.cgi

4) RNA secondary structure prediction http://www.genebee.msu.su/services/rna2 reduced.html

5) Graphe : ADN riche en (L'Atelier Biolnformatique de Marseille (A.B.I.M.)) http:/Avww-biol.univ-mi's.fr/dabim/riche-adn.html

6) RNA secondary structure prediction (Genebee) http://www.genebee.msu.su/services/rna2 reduced.html

7) Basic BLAST http://vvww,ncbi.nlm.nih.gov/cgi-bin/BLAST/nph-newblast

8) Fasta3 http://www2.ebi.ac.uk/fasta3/

9) Screening protein sequence against PROSITE databank http://vvww.genebee.msu.su/services/prosite reduced.html

10) Программа Treecon v. 1.3

11) Программа MultiEdit for Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В 1994 году были опубликованы работы Маслова и Симпсона, в которой предполагалось, что в процессе эволюции трипаносоматид происходит редукция РД митохондриальных генов (Maslov et al., 1994, Simpson et al., 1994). Этот вывод был сделан на основании сравнения гена А6 у 5 видов Trypanosomatidae: Leishmania tarentolae, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Herpetomonas muscarum и Blastocrithidia culicis. Однако оставался целый ряд не выясненных вопросов и, в частности, насколько широко распространен процесс уменьшения РД в гене А6, насколько правомочно это утверждение для других митохондриальных генов и, действительно ли, этот процесс напрямую связан с эволюцией трипаносоматид.

На наш взгляд, для ответа на эти вопросы необходимо было проанализировать большее число видов трипаносоматид, определить их геносистематическое положение с помощью молекулярных маркеров и исследовать последовательности митохондриальных генов, подвергающихся редактированию. Наложение этих признаков на одну дендрограмму позволило бы сделать более обоснованный вывод о корреляции эволюции трипаносоматид с изменением степени редактирования их генов.

Для решения этих задач были использованы несколько систематических групп, относящихся к группе Trypanosomatidae:

При анализе рода Leishmania для определение филогенетических отношений внутри этой отдельной систематической группы были использованы различные молекулярные маркеры. Пристальный интерес к этому роду вызван паразитарным циклом, в который как один из хозяев входит человек, и его крайней полиморфностью. Практически на всех филогенетических деревьях группа Leishmania формирует плохо разрешенный кластер. Однако 4 группы хорошо разделимы и поддерживаются практически всеми использованными маркерами (сравнением рибосомных генов, генов РНК и ДНК-полимеразы, ITS и т.д.): 1). собственно Leishmania - лейшмании Старого Света, 2). Viannia -лейшмании Нового Света, 3). ветвь Leishmania-Endotrypanum - паразиты ленивцев и 4). группа Sauroleishmania, паразитирующие на ящерицах. Были определены длины редактируемых доменов для генов А6, ND8 и cyb.

Группа моногенетических трипаносоматид была недостаточно описана с точки зрения общепринятых молекулярных маркеров. Поэтому для сравнения полученных данных о структуре их генов, сначата было необходимо вписать эту группу в общую филогенетическую схему. Для этого построения был использован ген 18S рРНК и были проанализированы 10 новых изолятов моногенетических трипаносоматид. Для большинства из них также были определены первичные структуры генов А6 и ND8. Кроме того, для некоторых видов удалось подобрать пары праймеров для получения последовательности отредактированных транскриптов. на основе сравнения 18S рРНК в монофилетической группе рода Trypanosoma было выделено как минимум 3 ветви (Lukes et al., 1997). Эти ветви коррелируют с группой хозяев, на которых они паразитируют: 1). трипаносомы рыб, 2). паразиты амфибий, пресмыкающихся, а также птиц (деление внутри этой группы имеет маленький коэффициент достоверности) и 3). группа африканских трипаносом, паразитирующих на теплокровных животных. Такое деление поддерживается высоким бутстрепом. В настоящей работе был поставлен вопрос о том, существует ли изменение гена А6 у этих отдельных групп.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Мерзляк, Екатерина Марковна

ВЫВОДЫ

1. На примере рода Leishmania показано, что полученные на основе сравнения последовательностей митохондриальных генов кластеры, аналогичны тем, которые формируются при анализе генов, закодированных в ядре. При этом редактируемые гены или редактируемые части генов являются более консервативными по сравнению с нередактируемыми районами.

2. На основании сравнения гена 18S рРНК построено филогенетическое древо, в которое внесено 10 новых изолятов моногенетических трипаносоматид. Показано существование как минимум четырёх новых кластеров, что может свидетельствовать о том, что разнообразие этих организмов отнюдь не исчерпывается известными на данный момент видами.

3. Для ряда митохондриальных генов трипаносоматид показана редукция РД. Корреляция с филогенетическими построениями не является столь явной, и в случае моногенетических трипаносоматид, видимо, носит адаптивный характер. С другой стороны, отсутствие редукции в группе дигенетических простейших свидетельствует о необходимости сохранения этого процесса для осуществления контроля со стороны ядра над процессом реализации митохондриального генома.

4. Показано, что после редактирования транскриптов митохондриальных генов трипаносоматид степень совпадения между последовательностями отредактированных мРНК значительно возрастает, а по аминокислотной последовательности белков достигает 80%, свидетельствуя о том, что отличия на уровне ДНК нивелируются редактированием.

5. Для гена А6 у представителей моногенетических простейших показана потенциальная возможность существования альтернативных продуктов редактирования. Это наблюдение позволяет нам сделать предположение о дополнительной функции редактирования, которая заключается в увеличении разнообразия белковых молекул.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мерзляк, Екатерина Марковна, 2002 год

1. Бессолицына, Е. Моно- или полицистронные мРНК считываются с кинетопластного генома Leptomonas seymouri? Дипломная работа, каф. Молекулярной биологии МГУ, 2001.

2. Маслов, Д., Энтелис, Н., Колесников, А., Зайцева, Г. Кинетопластная ДНК Crithidia oncopelti. Рестрикционное картирование максикольцевой ДНК. Биорг. хим., 1982. т. 8, 676-685.

3. Подлипаев, С., Фролов, А. Филогения трипаносоматид: молекулярный и морфологические подходы. Паразитология, 2000, # 3, 169-182.

4. Adler, В., Harris, М., Bertrand, К., Hajduk, S. Modification of Trypanosoma brucei mitochondrial rRNA by posttranscriptional 3' polyuridine tail formation. Mol. Cell. Biol. 1991, 11, 5878-5884.

5. Adler, В., Hajduk, S. Guide RNA Requirement for editing-site-specific endonucleolytic cleavage of preedited mRNA by mitochondrial ribonucleoprotein particles in Trypanosoma brucei. Mol. Cell Biol., 1997, v. 17, # 9, 5377-5385.

6. Alfonzo, J., Thiemann, O., Simpson, L., The mechanism of U insertion/deletion RNA editing in kinetoplastid mitochondria. Nucleic Acids Res. 1997;25.3751-3759.

7. Alfonzo, J., Blanc V., Estevez, A., Rubio, M., Simpson, L. С to U editing of the anticodon of imported mitochondrial tRNA (Trp) allows decoding of the UGA stop codon in Leishmania tarentolae. EMBO J., 1999,v. 18(24),7056-7062.

8. Allen, Т., Heidmann, S., Reed, R., Myler, P., Goringer, H., Stuart, K. Association of Guide RNA Binding Protein gBP21 with Active RNA Editing Complexes in Trypanosoma brucei. Mol. Cell Biol., 1998, v. 18, No. 10, 6014-6022.

9. Aphasizhev, R., Simpson, L. Isolation and characterization of a U-specific 3'-5' exonuclease from mitochondria Leishmania tarentolae. J. Biol. Chem., 2001, v. 276. 21280-21284.

10. Araya, A., Domec, C., Begu, D., Litvak, S. An in vitro system for the editing of ATP synthase subunit 9 mRNA using wheat mithochondrial extract. Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 1992, 89, 1040-1044.

11. Bailey-Serres, J., Rochaix, J.-D., Wassenegger, M., Filipowicz, W. Plants, their organelles, viruses and transcripts reveal the mechanisms and relevance of posttranscriptional processes. EMBO J., 1999, v. 18, # 19, 5153-5158.

12. Baker, J. The evolutionary origin and speculation of the genus Trypanosoma. In: Symposia of the Society for General Microbiology. # XXIV, Evolution in the Microbial World, 1974, pp. 343-366.

13. Benne, R., Van den Burg, J., Brakenhoff, J., Sloof, P., Van Boom J., Tromp M., Major transcript of frameshifted coxll gene form trypanosome mitochondria contains four nucleotides that are not encoded in the DNA. Cell, 1986, v. 46, 819-826.

14. Blanc, V., Alfonzo, J., Aphasizhev, R., Simpson, L., The mitochondrial ligase from Leishmania tarentolae can join RNA molecules bridged by complementary RNA, J. Biol. Chem., 1999, v.274, #34, 24289-24296.

15. Blom, D., de Haan, A., van den Berg, M., Sloof, P., Jirku, M., Lukes, J., Benne, R. RNA editing in the free-living bodonid Bodo saltans. Nucleic Acids Res., 1998, v. 26(5), 12051213.

16. Blum, B., Bakalara, N., Simpson. L. A model for RNA editing in kinetoplastid mitochondria: "Guide" RNA molecules transcribed from maxicirle DNA provide the edited information. Cell, 1990, v.60, 189-198.

17. Bock, R. Analysis of RNA editing in plastids. Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 1998, v. 15,75-83.

18. Boore, J. Survey and summary animal mitochondrial genomes. Nucleic Acids Research, 1999; 27, 1767-1780

19. Brennicke, A., Marchfelder, A., Binder, S., RNA editing. FEMS Microbiol. Reviews, 1998; 23,297-316.

20. Brewster, S., Barker, D. The ATPase subunit 6 gene sequence predicts that RNA editing is conserved between lizard- and human-infecting Leishmania. Gene, 1999, v. 235, 77-84.

21. Bringaud, F., Stripecke, R., Freeh, G.C., Freedland, S., Turck, C., Byrne, E.M., and Simpson, L. Mitochondrial glutamate degidrohenase from Leishmania tarentolae is a guide RNA-binding protein. Mol. Cell. Biol., 1997, v. 17, 3915-3923.

22. Bulat, S., Mokrousov, I., Podlipaev, S. Classification of trypanosomatids from insects and plants by UP-PCR (universally primed PCR) technique and cross dot blot hybridization of PCR products. Europ. J. Protistol., 1999, v. 35, 319-326.

23. Burgess, M., Heidmann, S., Stuart, K. Kinetoplastid RNA editing does not require the 3' hydroxyl of guide RNA, but modifications to the guide RNA terminus can inhibit in vitro U insertion. RNA, 1999, 5, 883-892.

24. Byrne, E.M., Conell, G.J., Simpson, L. Guide RNA-directed uridine insertion RNA editing in vitro. EMBO J., 1996, v. 15, 6758-6765.

25. Campbell, D., Sturm, N., Yu, M. Transcription of the kinetoplastid splice leader RNA genes. Parsitol. Today, 2000, v. 16, # 2, 78-82.

26. Carrillo, C., Chapdelaine, Y., Bönen, L. Variation in sequence and RNA editing within core domains of mitochondrial group II introns among plants. Mol. Gen. Genet., 2001, v. 264,595-603.

27. Carrillo, R., Thiemann, O., Alfonzo, J., Simpson, L. Uridine insertion/deletion RNA editing in Leishmania tarentolae mitochondria shows cell cycle dependence. Mol. Biochem. Parasitol., 2001, v. 113, 175-181.

28. Cech T. R., A model for the RNA-catalyzed replication of RNA. Proc. Natl. Acad. Sei USA, 1986, v. 83(12), 4360-4363.

29. Cech. T. The chemistry of self-splicing RNA and RNA enzymes. Science, 1987, 236, 1532-1539.

30. Cech, T. RNA editing: world's smallest introns? Cell, 1991, v.64(4), 667-669.

31. Chaudhuri, S., Carrer, H., Maliga, P. Site-specific factors mediate RNA editing of the psbL mRNA in tabacco plastids. EMBO J., 1995, v. 12, 2951-2957.

32. Cheng, Y.-W., Gott, J. Transcription and RNA editing in soluble in vitro system from Physarum mitochondria. Nucleic Acids Res., 2000, v.28, # 19, 3695-3701.

33. Connell, G., Byrne, M., Simpson, L. Guide RNA-independent and guide RNA-dependent uridine insertion into cytochrome b mRNA in a mitochondrial lysate from Leishmania tarentolae. J. Biol. Chem., 1997, v.272, 4212-4218.

34. Croan, D., Ellis, J. Phylogenetic relations between Leishmania, Viannia and Sauroleishmania inferred from comparison of a variable domain within the RNA polymerase II largest subunit. Mol. Biochem. Parasitol., 1996, v. 79, 97-102.

35. Croan, D., Marrison, D., Ellis, J. Evolution of the genus Leishmania revealed by comparison of DNA and RNA polymerase gene sequence. Mol. Biochem. Parasitol., 1997, v. 89, 149-159.

36. Cruz-Reyes, J., Sollner-Webb, B. Trypanosome U-deletional RNA editing involves guide RNA-directed endonuclease cleavage, terminal U exonuclease, and RNA ligase activities. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1996, v. 93(17), 8901-8906.

37. Cruz-Reyes, J., Zhelonkina, A., Rusche, L., Sollner-Webb, B. Trypanosome RNA editing: simple guide RNA features enhance U deletion 100-fold. Mol. Cell. Biol., 2001, v.21, #3, 884-892.

38. Devenish, R., Prescott, M., Roucou, X., Nagley, P. Insight into ATP synthase assemble and function through the molecular genetic manipulation of subunits of the yeast mitochondrial enzyme complex. Biochim. Biophys. Acta, v. 1458, 428-442.

39. Dolezel, D., Jirku, M., Maslov, D., Lukes, J. Phylogeny of the bodonid flagellates (Kinetoplastida) based on small-subunit rRNA gene sequences. IUMS, 2000, v. 50, 19431951.

40. Donelson, J., Gardner, M., El-Sayed, N. More surprises from Kinetoplastida. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1999, v. 96, 2579-2581.

41. Drozdz, M., Palazzo, S., Salavati, R., O'Rear, J., Clayton, C., Stuart, K. TbMP81 is required for RNA editing in Trypanosoma brucei. EMBO J., 2002, v. 21(7), 1791-1799.

42. Ersfeld, K., Gull, K. Partitioning of large and minichromosomes in Trypanosoma brucei. Science, 1997, v. 276, 611-614.

43. Estevez, A., Simpson, L. Uridine insertion/deletion RNA editing in trypanosome mitochondria a review. Gene. 1999a, v. 240, 247-260.

44. Feagin, J. Mitochondrial genome diversity in parasites. Int. J. Parasitol., 2000, v.30. 371390.

45. Frech, G., Bakalara, N., Simpson, L., Simpson, A.M. In vitro RNA editing-like activity in mitochondrial extract from Leishmania tarentolae. EMBO J. 1995, 14, 178-187.

46. Freyer, R., Kiefer-Meyer, M.-C., Kossel, H. Occurrence of plastid RNA editing in all major lineages of land plants. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1997, v. 94, 6285-6290.

47. Goncharov, I., Xu, Y., Zimmer, Y., Sherman, K., Michaeli, S. Structure-function analysis of trypanosomatid spliced leader RNA. Nucleic Acids Res., 1998, v. 20, #9, 2200-2207.

48. Gott, J., Visomirski, L., Hunter, J. Substitutional and insertional RNA editing of the cytochrome c oxidase subunit 1 mRNA of Physarumpolycephalum. J. Biol. Chem., 1993, v. 268(34), 25483-25486.

49. Grams, J., McManus, M., Hajduk, S. Processing of polycistronic guide RNAs is associated with RNA editing complexes in Trypanosoma brucei. EMBO J., 2000, v. 19. 5525-5532.

50. Gray, M. Unusual pattern of ribonucleic acid components in the ribosome of Crithidia fasciculata a trypanosomatid protozoan. Mol. Cell Biol., 1981, v. 1(4), 347-357.

51. Harris, M., Moore, D., Hajduk, S. Addition of uridines to edited RNAs in trypanosome mitochondria occurs independently of transcription. J. Biol. Chem., 1990, v. 265(19). 11368-11376.

52. Hayman, M., Read, L., Trypanosoma brucei RBP 16 is a mitochondrial Y-box family protein with gRNA binding activity. J. Biol. Chem., 1999, v 274, # 17, 12067-12074.

53. Hermann, T., Schmid, B., Heumann, H., Goringer, H. A three-dimensional working model for a guide RNA from Trypanosoma brucei. Nucleic Acids Res., 1997, v.25, #12, 23112318.

54. Hermann, M., Bock, R. Transfer of plastid RNA-editing activity to novel sites suggests a critical role for spacing in editing-site recognition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, v. 96,4856-4861.

55. Hiesel. R., Combettes, B., Brennicke, A. Evidence for RNA editing in mitochondria of all major groups of land plants except Bryophyta. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v. 91. 629-633.

56. Hirose, T., Kusumegi, T., Tsudzuki, T., Suguira, M. RNA editing sites in tabacco chloroplasts transcripts: editing as a possible regulator of chloroplast RNA polymerase activity. Mol. Gen. Genet., 1999, v. 262, 462-467.

57. Hirose, T., Sugiura, M. Involvement of a site-specific trans-acting factor and a common RNA-binding protein in the editing of chloroplast mRNAs: development of chloroplast in vitro editing system. EMBO J., 2001, v. 20, #5, 1144-1152.

58. Horton, T., Landweber, L. Evolution of four types of RNA editing in myxomycetes. RNA, 2000, v. 6, 1339-1346.

59. Horvath, A., Berry, E., Maslov, D., Translation of the edited mRNA for cytochrome b in trypanosome mitochondria. Science, 2000a, v. 287(5458), 1639-40.

60. Huang, C., O'Hearn, S., Sollner-Webb, B. Assembly and Function of the RNA Editing Complex in Trypanosoma brucei Requires Band III. Mol. Cell. Biol., 2002, v. 22(9), 3194-3203.

61. Inoue, H., Nojima, H., Okayama, H. High efficiency of transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 1990, v. 96, 23-28.

62. Jirku, M., Kolesnikov, A.A., Benada, O., Lukes, J. Marine fish and ray trypanosoma have large kinetoplast minicircle DNA. Mol. Biochem. Parasitol., 1995, v. 73, 279-283.

63. Kabb, A. Oppegard, L., McKenzie, B., Connell, G. A mRNA determinant of gRNA-directed kinetoplastid editing. Nucleic Acids Res., 2001, v. 29, # 12, 2575-2580.

64. Kapushos, S., Simpson, L. In vitro uridine insertion RNA editing mediated by m-acting guide RNAs. RNA, 1999, v. 5, 656-669.

65. Keegan, L., Gallo, A., O'Connell, M. The many roles of an RNA editor. Nature Reviews. 2001, v. 2., 869-878.

66. Kerr, S., Markelz, R., MacKinnon, C. Further support for palaearctic origin of Leishmania. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2000, v. 95(4), 579-581.

67. Koller, J., Muller, U.F., Schmid, B., Kruft, V., Stuart, K., Goringer, H. Trypanosoma brucei gBP21 an arginine-rich mitochondrial protein that binds to guide RNA with high affinity. J. Biol. Chem., 1997, v. 272, 3749-3757.

68. Koslowsky, D., Goringer, H., Morales, T., Stuart, K. In vitro guide RNA/mRNA chimaera formation in Trypanosoma brucei RNA editing. Nature, 1992, v. 356(6372), 807-809.

69. Koslowsky, D., Yahampath, G. Mitochondrial mRNA 3' cleavage/polyadenylation and RNA editing in Trypanosoma brucei are indepedent events. Mol. Biochem. Parasitol., 1997, 90, 81-94.

70. Kurihara-Yonemoto, S., Hands, H. Low temperature affects the processing pattern and RNA editing status of mitochondrial cox2 transcripts in wheat. Cur. Genet., 2001. v. 40. 203-208.

71. Lamattina, L., Grienenberger, M. RNA editing of the transcript coding for subunit 4 of NADH dehydrogenase in wheat mitochondria: uneven distribution of the editing sites among the four exons. Nucleic Acids Res., 1991, v. 19, 3275-3276.

72. Lambert, L., Muller, U., Souza, A., Goringer, H. The involvement of gRNA-binding protein gBP21 in RNA editing an in vitro and in vivo analysis. Nucleic Acids Res. 1999. v. 27, 1429-1436.

73. Landweber, L., Gilbert, W. Phylogenetic analysis of RNA editing: a primitive genetic phenomenon. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1994, v. 91(3), 918-921.

74. Lavrov, D., Brown, W., Boore, J. A novel type of RNA editing occurs in the mitochondrial tRNAs of the centipede Lithobias forficatus. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2000, v. 97, # 25, 13738-13742.

75. Lawson, S., Igo, R., Salavati, R., Stuart, K. The specificity of nucleotide removal during RNA editing in Trypanosoma brucei. RNA, 2001, v. 7, 1793-1802.

76. Leegwater, P., Benne, R. Identification by UV cross-linking of oligo(U)-binding proteins in mitochondria of the insect trypanosomatid Crithidia fasciculata. FEBS Lett., 1995, v. 227, 780-786.

77. Lellek, H., Kirsten, R., Diehl, I., Apostel, F., Buck, F., Greeve, J. Purification and molecular cloning of a novel essential component of the apolipoprotein B mRNA editing enzyme-complex. J. Biol. Chem., 2000, v. 275, 19848-19856.

78. Leung, S., Koslowsky, D. Mapping contacts between gRNA and mRNA in trypanosome RNA editing. Nucleic Acids Res., 1999, v. 27, # 3, 778-787.

79. Leung, S., Koslowsky, D. Interactions of mRNAs and gRNAs involved in trypanosome mitochondrial RNA editing: structure probing of an mRNA bound to its cognate gRNA. RNA, 2001a, v. 7, 1803-1816.

80. Leung, S.S., Koslowsky, D. J. RNA editing in Trypanosoma brucei: characterisation of rRNA U-tail interaction with partially edited mRNA substrates. Nucleic Acids Res., 2001b, v.29, # 3,703-709.

81. Lorenz, P., Maier, A., Baumgart, E., Erdmann, R., Clayton, C. Elongation and clustering of glycosomes in Trypanosoma brucei overexpressing the glycosomal Pexl lp. EMBO J., 1998, v. 17, # 13,3542-3555.

82. Lukes, J., Jirku, M., Dolesel, D., Kral'ova, I., Hollar, L., Maslov, D.A. Analysis of ribosomal RNA genes suggest that Trypanosomes are monophyletic. J. Mol. Evol.,1997, v. 44, 521-527.

83. Lutz, K., Maliga, P. Lack of conservation of editing sites in mRNAs that encode subunits of the NAD(P)H dehydrogenase complex in plastids and mitochondria of Arabidopsis thahana. Curr. Genet., 2001, v. 40, 214-219.

84. Maas, S., Kim, Y.-G., Rich, A. Sequence, genomic organization and functional expression of the murine tRNA-specific adenosine deaminase ADAT1. Gene, 2000, v. 243, 59-66.

85. Madison-Antenucci, S., Sabatini, R., Pollard, V., Hajduk, S. Kinetoplastid RNA-editing associated protein 1 (REAP-1): a novel editing complex protein with repetitive domains. EMBO J., 1998, v.17, #21, 6368-6376.

86. Madison-Antenucci, S., Grams, J., Hajduk, S. Editing machines: the complexities of trypanosome RNA editing. Cell, 2002, v. 108, 435-438.

87. Maga, J., LeBowitz, J. Unravelling the kinetoplastid paraflagellar rod. TICB, 1999, v. 9, 409-413.

88. Malek, O., Lattig, K., Hiesel, R., Brennicke, A., Knoop, V. RNA editing in bryophytes and molecular phylogeny of land plands. EMBO J., 1996, v. 15, 1403-1411.

89. Marienfeld, J., Unseld, M., Brandt, P., Brennicke, A. Genomic recombination of the mitochondrial atp6 gene in Arabidopsis thaliana at the protein processing site creates two different presequences. DNA Res., 1996, v. 31, #3(5), 287-290.

90. Maslov, D., Avila, H., Lake, J., Simpson, L. Evolution of the RNA editing in kinetoplastid protozoa. Nature, 1994, 368, 345-348.

91. Maslov, D., Lukes, J., Jirku, M., Simpson, L. Phylogeny of trypanosomes as inferred from small and large subunit rRNAs: implications for the evolution of trypanosomatid protozoa. Mol. Biochem. Parasitol., 1996, v. 75, 197-205.

92. McManus, M., Adler, B., Pollard, V., Hajduk, S. Trypanosoma brucei Guide poly(U) tail formation is stabilized by cognate mRNA. Mol. Cell Biol., 2000, v.20, # 3, 883-891.

93. McManus, M., Shimamura, M., Grams, J., Hajduk, S. Identification of candidate mitochondrial RNA editing ligases from Trypanosoma brucei. RNA, 2001, v. 7(2), 167175.

94. Missel, A., Goringer, H. Trypanosoma brucei mitochondria contain RNA helicase avtivity. Nucleic Acids Res., 1994, v. 22, 4050-4056.

95. Missel, A., Souza, A., Norskau, G., Goringer, H. Disruption of a gene encoding a novel mitochondrial DEAD-box protein in Trypanosoma brucei Affects Edited mRNAs. Mol. Cell Biol., 1997, v. 17, #9, 4895-4903.

96. Momen, H., Cupolillo, E. Speculation on the origin and evolution of the genus Leishmania. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2000, v. 95(4), 583-585.

97. Muller, U., Lambert, L., Goringer, H. Annealing of RNA editing substrates facilitated by guide RNA-binding protein gBP21. EMBO J., 2001, v. 20, # 6, 1394-1404.

98. Muller, U., Goringer, U. Mechanism of the gBP-21 mediated RNA/RNA annealing reaction: matchmaking and charge reduction. Nucleic Acids Res., 2002, v. 30, #2, 447455.

99. Noyes, H., Morrison, D., Chance, M., Ellis, J. Evidence for Neotropical origin of Leishmania. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2000, v. 95(4), 575-578.

100. Palladino, M., Keegan, L., O'Connell, M., Reenan, R. A-to-1 pre-mRNA editing in Drosophila is primarily involved in adult nervous system function and integrity. Cell, 2000, v.102, 437-449.

101. Pelletier, M., Miller, M., Read, L. RNA-binding properties of the mitochondrial Y-box protein RBP16. Nucleic Acids Res., 2000, v 28, #5, 1266-1275.

102. Perez-Morga, D., Englund, P.The structure of replicating kinetoplast DNA networks. J. Cell Biol., 1993, v. 123(5), 1069-1079.

103. Peris M., Simpson, A., Grunstein, J., Liliental, J., Frech, G., Simpson, L. Native gel analysis of ribonucleoprotein complexes from a Leishmania tarentolae mitochondrial extract. Mol. Biochem. Parasitol., 1997, v.85(l), 9-24.

104. Philippe, H., Adoutte, A. The molecular phylogeny of Eukaryota: solid facts and uncertainties. In: Evolutionary Relationships among Protozoa (edited by G.H.Coombs, K.Vickerman, M.Sleigh, A.Warren), 1998, Chapman & Hall, London, pp. 25-56.

105. Philippe, H., Germot, A. Phylogeny of eukaryotes based on ribosomal RNA: long-branch attraction and models of sequence evolution. Mol. Biol. Evol., 2000, v. 17(5), 830834.

106. Podlipaev, S. Insect trypanosomatids: the need to know more. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2000, v. 95(4), 517-522.

107. Pollard, V., Rohrer, S., Michelotti, E., Hancock, K., Hajduk, S. Organization of minicircle genes for guide RNAs in Trypanosoma brucei. Cell, 1990, v. 16, #63(4), 783790.

108. Pollard, V., Harris, M., Hajduk, S. Native mRNA editing complexes from Trypanosoma brucei mitochondria. EMBO J., 1992, v. 11(12), 4429-4438.

109. Ready, R., Sand fly evolution and its relationship to Leishmania transmission. Mem. Inst. Oswaldo Cruz, 2000, v. 95(4), 589-590.

110. Reed, M., Peeters, N., Hanson, M. A single alteration 20 nt 5' to an editing target inhibits chloroplast RNA editing in vivo. Nucleic Acids Res., 2001, v. 29, #7, 1507-1513.

111. Riley, G., Myler, P., Stuart, K. Quantitation of RNA editing substrates, products and potential intermediates: implications for development regulation. Nucleic Acids Res., 1995, v. 23, 708-712.

112. Roberts, T., Gungan, J., Watkins, K., Agabian, N. The SLA RNA gene of Trypanosoma brucei is organised in a tandem array which encodes several small RNAs. Mol. Biochem. Parasitol., 1996, v. 83, 163-174.

113. Rusche, L., Cruz-Reyes, J., Piller, K., Sollner-Webb, B. Purification of a functional enzymatic editing complex from Trypanosoma brucei. EMBO J., 1997, v. 16, #.13, 40694081.

114. Rusche, L., Huang, C., Piller, K., Hemann, M., Wirtz, E., Sollner-Webb, B. The Two RNA Ligases of the Trypanosoma brucei RNA Editing Complex: Cloning the Essential Band IV Gene and Identifying the Band V Gene. Mol. Cell Biol., 2001, v.21, #4, 979-989.

115. Sambrook J., Fritsche. F., Maniatis T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, published by Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989.

116. Scott, J. A place in the world for RNA editing. Cell, 1995, v. 81, 833-836.

117. Shields, D., Wolfe, K. Accelerated evolution of sites undergoing mRNA editing in plant mitochondria and chloroplasts. Mol. Biol. Evol., 1997, v. 14(3), 344-349.

118. Schmid, S., Linder, P. DEAD protein family of putative RNA helicases. Mol. Microbiol., 1992, v. 6, 283-291.

119. Schneider, A. Unique aspects of mitochondrial biogenesis in trypanosomatids. Int. J. Parasitol., 2001, v. 31, 1403-1415.

120. Shu, H.-H., Stuart K., Mitochondrial transcripts are processed but are not edited normally in Trypanosoma equiperdum (ATCC 30019) which has kDNA sequence deletion and duplication. Nucleic Acids Res., 1994, v. 22, 1696-1700.

121. Shu, H.H, Stuart K, Goringer H.U. Guide RNA molecules not engaged in RNA editing form ribonucleoprotein complexes free of mRNA. Biochim. Biophys. Acta., 1995, v. 26, 1261(3), 349-359.

122. Seeburg, P. RNA helicase participates in the editing game. Neuron, 2000, v. 25, 261263.

123. Seiwert, S., Heidmann S., Stuart, K. Direct visualization of uridilate deletion in vitro suggests a mechanism for kinetoplastid RNA editing. Cell, 1996, v.84, 831-841.

124. Sheldon, S., Koslowsky, L., Koslowsky, D.J., Mapping contacts between gRNA and mRNA in trypanosome RNA editing. Nucleic Acids Res., 1999, v. 27, #3, 778-787.

125. Simpson, L. The mitochondrial genome of kinetoplastid protozoa: genomic organization, transcription, replication, and evolution. Ann. Rev. Microbiol., 1987, v. 41, 363-382.

126. Simpson, L., Maslov, D. Ancient origin of RNA editing in kinetoplastid protozoa. Cur. Opinion Genet. Develop., 1994, v. 4, 887-894.

127. Simpson, L. Thiemann, O. H., Savill, N. J., Alfonzo, J. D., Maslov, D.A. Evolution of RNA editing in trypanosome mitichondria. Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 2000, v. 97, # 13, 6986-6993.

128. Sloof, P., Benne, R., RNA editing in kinetoplastid parasites: what to do with U. TIM. 1997. v. 5. # 5, 189-195.

129. Smith, H„ Gott, J., Hanson, M. A guide to RNA editing. RNA,1997, v. 3, 1105-1123.

130. Steinhauser, S., Beckert, S., Capesius, I., Malek, O., Knoop,V. Plant mitochondrial RNA evolution. J. Mol. Evol., 1999, v. 48, 303-312.

131. Stevens, J., Noyes, H., Schofield, C., Gibson, W. The molecular evolution of Trypanosomatidae, Adv. Parasitol., 2001, v. 48, 1-56.

132. Stuart K., Allen T., Heidmann S., Seiwert S., RNA editing in kinetoplastid protozoa. Microb. Molec. Biol. Rev., 1997, v. 61, 105-120.

133. Sturm N., Simpson L. Kinetoplast DNA minicircles encode guide RNAs for editing of cytochrome oxidasesubunit III mRNA. Cell, 1990, v. 61, 879-884.

134. Takano, H., Abe, T., Sakuri, R., Moriyama, Y., Miyazawa, Y., Nozaki, H., Kawana. S., Sasaki, N., Kuroiawa, T. The complete DNA sequence of the mitochondrial genome of Physarumpolycephalum. Mol. Genet., 2001, v. 264, 539-545.

135. Thieffry, D. Forty years under the central dogma. TIBS, 1998, v. 23, 312-316.

136. Tielens, A., Hallemond, J. Differences in energy metabolsim between Trypanosomatidae. Parasitol. Today., 1998, v. 14, # 7, 265-271.

137. Vickerman, K., The evolutionary expansion of the Trypanosomatid Flagellates. Int. J. Parasitol., 1994, v. 24, 1317-1331.

138. Visomirski-Robic, L., Gott J., Insertional editing of nascent mitochondrial RNAs in Physarum. Biochem., 1997, v. 94, 4324-4329.

139. Wallace, F. The trypanosomatid parasites of insects and arachnids. Exp. Parasitol. 1966, v. 18, 124-193.

140. Yasuhira, S., Simpson, L. Minicircle-encoded guide RNAs from Crithidia fasciculata. RNA, 1995, v. 1,634-643.96

141. Yoshinago, K., Kakehi, T., Shima, Y., Linuma, H., Masuzawa, T., Ueno, M. Extensive RNA editing and possible double-stranded structures determing editing sites in the atpB transcripts of hornwort chloroplasts. Nucleic Acids Res. 1997, v. 25, 4830-4834.

142. Zeltz, P., Hess, W., Neckermann, K., Borner, T., Kossel, H. Editing of the chloroplast rpoB transcript is independent of chloroplast translation and shows different patterns in barley and maize. EMBO J., 1993, v. 12(11), 4291-4296.