Морфологические особенности восстановления дефектов склеры при трансплантации клеток тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат медицинских наук Баранов, Петр Юрьевич

• Баранов, Петр Юрьевич
• кандидат медицинских наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Баранов, Петр Юрьевич

Введение.

Обзор литературы.

Строение склеры.

Репаративная регенерация соединительной ткани.

Способы восстановления дефектов соединительной ткани.

Материалы и методы исследования.

Выделение фибробластов дермы и склеры.

Выделение и активация лейкоцитов периферической крови.

Влияние супернатанта активированных лейкоцитов на пролиферацию фибробластов.

Влияние лейкоцитов на ангиогенез.

Прижизненная окраска фибробластов и мононуклеаров флуоресцентными красителями.

Оценка адгезии фибробластов и мононуклеаров к склере.

Операция склерэктомии.

Гистологическая маркировка операционного дефекта.

Трансплантация клеток крови/фибробластов дермы.

Выведение животных из эксперимента, формирование групп исследования.

Морфометрическая характеристика и статистическая обработка результатов исследования.

Результаты собственных исследований и их обсуждение.

Культура фибробластов дермы и склеры in vitro.

Выделение и активация лейкоцитов периферической крови.

Влияние супернатанта активированных лейкоцитов на пролиферацию фибробластов.

Влияние лейкоцитов на ангиогенез.

Прижизненная окраска фибробластов и мононуклеаров флуоресцентными красителями.

Адгезия фибробластов и мононуклеаров к склере in vitro.

Операция склерэктомии как биологическая модель дефектов склеры.

Маркировка операционного дефекта.

Регенерация склеры после склерэктомии.

Регенерация склеры после склерэктомии с введением аутологичных фибробластов дермы.:.

Регенерация склеры после склерэктомии с введением активированных аутологичных лейкоцитов.

Морфометрические характеристики склеры при регенерации и трансплантации клеток.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Морфологические особенности восстановления дефектов склеры при трансплантации клеток»

Восстановление структурных и функциональных дефектов склеры — важная проблема в современной экспериментальной морфологии и практической о фтальмо логии.

Актуальность решения этой проблемы обусловлена отсутствием эффективных методов консервативного лечения таких состояний склеры, как прогрессирующая миопия [3, 28, 42], травмы глаза — химические и термические ожоги, механические повреждения [11, 13, 65, 70, 74, 76], стафилома и фистула склеры как осложнения антиглаукоматозной операции и использования цитостатиков; атрофические состояния склеры, связанные с нарушениями иннервации или осложнением воспаления [11, 13]. Эти заболевания приводят к существенному истончении склеры и потере ей механических свойств. Нарушения проявляются как на клеточном (снижение синтетической и митотической активности), так и на тканевом (уменьшение общего числа клеток, изменение состава и соотношения компонент межклеточного вещества) уровне.

До сегодняшнего дня единственным эффективным методом лечения подобных состояний остаются склероукрепляющие операции, суть которых состоит в хирургическом укреплении склеры различными материалами. Подобный подход чреват интра- и послеоперационными осложнениями, кроме того, лишь косвенно влияет на причину истончения склеры, что приводит к необходимости повторных вмешательств, затрудненных рубцовой тканью, формирующейся после первой операции. Консервативные методы лечения и физиотерапевтический подход не обладают достаточной эффективностью, что делает поиск новых методов восстановления дефектов склеры актуальным и перспективным. Одним из таких малоизученных направлений является клеточная терапия, использующая в качестве активного компонента аутологичные или аллогенные живые клетки. Подобный подход отвечает предъявляемым к потенциальному методу лечения требованиям: он безопасен при использовании аутологичного материала, и способен усилить репаративную регенерацию. В" зависимости от типа клеток и их предварительной стимуляции/селекции эффект от трансплантации может существенно отличаться, а результат реализовываться по одному или нескольким из следующих механизмов: антиапоптотическое действие, противорубцовое действие, ангиогенный и митотический эффекты.

На модели асептических разрезов сухожилия и связок уже изучен эффект трансплантации фибробластов дермы и сухожилий, мезенхимальных стволовых клеток при восстановлении дефектов плотной оформленной соединительной ткани. Положительные результаты этих исследований легли в основу данной работы.

Целью исследования стало оценить морфологические изменения в склере кролика при репаративной регенерации и в условиях трансплантации клеток.

Для достижения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи:

1. In vitro выбрать потенциально эффективные объекты для трансплантации (фибробласты дермы или склеры, активированные лейкоциты);

2. Сформировать биологическую модель объемных дефектов склеры;

3. Изучить закрытие дефекта склеры кролика на предлагаемой модели;

4. Изучить закрытие дефекта склеры кролика на той же модели при трансплантации клеток;

5. Оценить темпы и характер репаративной регенерации склеры и восстановления дефекта в условиях трансплантации клеток.

Научная новизна исследования:

1.Впервые проведено сравнение фибробластов склеры и дермы кролика и человека в культуре клеток in vitro.

2.Продемонстрировано положительное влияние активированных лейкоцитов периферической крови на ангиогенез и пролиферацию фибробластов дермы и склеры.

3.Разработан метод и проведена оценка адгезии лейкоцитов и фибробластов к склере за счет окраски флуоресцентными красителями.

4.Разработана новая биологическая модель объемных дефектов склеры с описанием репаративной регенерации.

5.Впервые проведено исследование трансплантации аутологичных фибробластов дермы и лейкоцитов кролика в область дефекта склеры с использованием объективных морфометрических методов.

Научно-практическая значимость работы

Разработана и описана биологическая модель объемных дефектов склеры, позволяющая оценивать эффективность новых методов лечения. Предложенный метод клеточной терапии - субконъюнктивальная трансплантация аутологичных активированных лейкоцитов, может быть рекомендован для дальнейших клинических испытаний.

Основные положения, выносимые на защиту

1.Активированные лейкоциты периферической крови усиливают ангиогенез на модели хорион-аллантоисной мембраны куриного эмбриона.

2.Супернатант активированных лейкоцитов периферической крови усиливает пролиферацию фибробластов склеры и дермы in vitro.

3.Операция склерэктомии глубиной 75 мкм в верхне-внутреннем квадранте глаза кролика приводит к формированию объемного дефекта склеры, и может служить биологической моделью для изучения неполной регенерации плотной соединительной ткани.

4.Субконъюнктивальная трансплантация аутологичных активированных лейкоцитов периферической крови приводит к достоверному усилению регенерации объемных дефектов склеры.

Внедрение результатов работы

Материалы диссертации (биологическая модель дефектов склеры, метод для оценки адгезии клеток, метод клеточной терапии дефектов склеры) внедрены в научно-исследовательскую практику НИИ ГБ РАМН, кафедры Морфологии

Медико-Биологического факультета ГОУ ВПО РГМУ им Н.И. Пирогова, педагогическую практику кафедры Морфологии.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на межкафедральной конференции кафедры морфологии ГОУ ВПО РГМУ им Н.И. Пирогова (Москва, сентябрь 2010), конференции молодых исследователей НИИ ГБ РАМН (Москва, апрель 2007), 14 международном студенческом медицинском конгрессе в г. Гронинген, Нидерланды (июнь 2007), 2 международной медицинской студенческой конференции в г.Нови Сад, Сербия (июль 2007), Всероссийской конференции «Современные методы диагностики лечения заболеваний роговицы и склеры» (Москва, сентябрь 2007), Всероссийском Иммунологическом Конгрессе (Санкт-Петербург, июль 2008), Всероссийской конференции «Глаукома: реальность и перспективы» (Москва, сентябрь 2008), VI Всероссийском съезде анатомов, гистологов и эмбриологов России (Саратов, октябрь 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и 3 ~ в иностранных журналах и сборниках, из них - 6 в журналах, рекомендуемых ВАК Минобразования и науки Российской Федерации.

Структура и объем работы

Диссертация изложена на 136 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, описывающей материал и методы исследования, главы собственных экспериментальных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций; библиография включает 344 работы: 77 источников отечественной и 267 - иностранной литературы. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 33 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Баранов, Петр Юрьевич

Выводы

1. В культуре in vitro был показан положительный эффект супернатанта лейкоцитов периферической крови кролика, активированных процессами свертывания и комплексом полиА:У, на пролиферацию фибробластов склеры и дермы кролика.

2. На модели хорион-аллантоисной мембраны куриного эмбриона доказан стимулирующий эффект активированных свертыванием и полиА:У лейкоцитов на ангиогенез, достоверно превышающий эффекты от каждого из компонентов в отдельности.

3. Операция, склерэктомии с удалением поверхностного слоя склеры в верхне-внутреннем квадранте глаза кролика является стандартизуемой и воспроизводимой биологической моделью для* изучения объемных дефектов плотной оформленной, соединительной ткани1. Репаративная регенерация дефекта склеры идет за счет миграции и пролиферации фибробластов поверхностных слоев склеры вокруг зоны операции.

4. При- трансплантации аутологичных фибробластов дермы кролика в область дефекта наблюдается интенсивная интеграция и пролиферация клеток, сопровождающаяся чрезмерным утолщением склеры, новообразованием соединительной ткани склеры с неупорядоченным- ходом волокон и новообразованными «очагами» в конъюнктиве, это свидетельствует против данного метода как способа восстановления объемных дефектов склеры.

5. При трансплантации активированных лейкоцитов в область дефекта достоверно увеличивается плотность клеток склеры, возрастает количество новообразованных сосудов. Удаленный объем склеры полностью восстанавливается t через 1 месяц после трансплантации, эффект сохраняется вплоть до 6 месяца. Упорядоченный ход соединительнотканных волокон склеры и отсутствие реактивных изменений в конъюнктиве и сосудистой оболочке, делают этот метод перспективным в восстановлении объемных дефектов склеры.

Практические рекомендации

1. Для изучения дистрофических состояний склеры и новых методов лечения предложена биологическая модель объемных дефектов плотной оформленной соединительной ткани.

2. Углеродный материал «Карботекстим-М» хорошо подходит для маркировки зоны операции склеры, хорошо сохраняется и не вызывает изменений в окружающих тканях.

3. Мы не рекомендуем использовать фибробласты дермы для восстановления дефектов склеры из-за их высокой пролиферативной активности, сохраняющейся и после трансплантации.

4. Лейкоциты периферической крови, стимулированные процессами свертывания и комплексом полиА:У обладают выраженной стимулирующей активностью на пролиферацию фибробластов и ангиогенез, что подтверждает перспективность использования этого препарата в терапии дистрофических состояний соединительной ткани.

5. Продемонстрирована безопасность и эффективность предложенного метода восстановления дефектов склеры за счет трансплантации активированных лейкоцитов, мы рекомендуем его для ограниченных клинических испытаний в терапии дистрофических состояний склеры.

6. При морфометрическом анализе параметров регенерации склеры мы рекомендуем использовать расчетные показатели относительной толщины и относительной плотности клеток, как обладающие наибольшей чувствительностью.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Баранов, Петр Юрьевич, 2010 год

1. Аветисов, Э.С., Близорукость. 1999, М.: Медицина. 289 с.

2. Аветисов, Э.С., Винецкая М.И., Савицкая Н.Ф. , Некоторые показатели обмена кислых мукополисахаридов при миопии. Вестн. офтальмол., 1975(4): с. 22-26.

3. Андреева, Л. Д., Морфологические особенности приживления склерального трансплантата после склеропластики в эксперименте Вестн. офтальмол., 1990(6): с. 14-17.

4. Бабаева, А.Г., Иммунологические механизмы регуляции восстановительных процессов. 1972, М.: Медицина. 157 с.

5. Бабаева, А.Г., Регенерация и система иммуногенеза. 1985, М.: Медицина. 255 с.

6. Бабаева, А.Г., Зотиков Е.А. , Иммунология процессов адаптивного роста, пролиферации и их нарушений. 1987, М.: Наука. 206 с.

7. Багров, С.Н., Ронкина Т.И., Балашов Н.Х. и др., Экспериментально-клиническое обоснование коллагенопластики Офтальмохирургия, 1991(4): с. 48-55.

8. Баранов, П.Ю. Мышцы мышей линии MDX в качестве модели миодистрофии экстраокулярных мышц человека // Материалы конференции молодых исследователей «Клиническая и экспериментальная офтальмология». 2007. М.

9. Беляев, B.C., Операции на роговице и склере 1988, Медицина: М. с. 84184.

10. Беляев, B.C., Ильина Т.С, Склеропластика в лечении прогрессирующей миопии Вестн. офтальмол., 1972. 3: с. 60-63.

11. Беляев, B.C., ed. Операции на роговой оболочке и склере. 1984, Медицина: М. 144 с.

12. Болтаева, З.К., Прогрессирование миопии и некоторые показатели метаболизма соединительной ткани. 1988, Медицина М. с. 1-30

13. Булач, Э.Х., О некоторых физических и гистохимических свойствах склеры при эмметропии и миопии. 1971, Медицина, М. с. 15-50

14. Бунин, А.Я., Канцельсон П. А., Яковлев А. А. , Микроциркуляция глаза. 1984, М.: Медицина. 176 с.

15. Бушуева, H.H., Отдаленые результаты различных методов склероукрепляющих операций у детей и подростков, страдающих прогрессирующей близорукостью Офтальмол. журн., 1989. 4: с. 194-198.

16. Бушуева, H.H., Эксплантат для укрепления склеры при хирургическом лечении прогрессирующей близорукости. Офтальмол. журн., 1992. 2: с. 70-73.

17. Ватченко, A.A., Строгаль А.С, Хомич СТ. и др, Склеропластика роговично склеральным трансплантатом у детей школьного возраста с прогрессирующей близорукостью Офтальмол. журн, 1988. 4: с. 228-229.

18. Винецкая, М.И., Болтаева З.К., Иомдина E.H., Андреева Л.Д., Биохимические аспекты прогрессирующей миопии. Офтальмол. журн, 1988. 3: с. 155-158.

19. Виноградов, В.В., Гистохимия мукополисахаридов при заживлении кожных ран. Архив патологии 1966. 28(1): с. 49-53.

20. Волков, В.В., Бржеский В.В., Ушаков H.A., Офталъмохирургия с применением полимеров. 2003, СПб. 309 с.

21. Волкова, О.В., Елецкий Ю. К., Основы гистологии с гистологической техникой. 1982, М.: Медицина. 304 с.

22. Воронцова, М.А., Регенерация органов у животных. 1949, М.: Медицина. 270 с.

23. Воронцова, М.А., Лиознер Л. Д. , Физиологическая регенерация. 1955, М. 408 с.

24. Вургафт, М.Б., К вопросу о склеропластических операциях при патологической миопии. Вестн. офтальмол., 1988. 6: с. 32-33.

25. Вургафт, М.Б., О роли наследственности в миопии Офтальмол. журн., 1990. №4: с. 231-235.

26. Высоцкий, A.M., Некоторые физические свойства связок коленного сустава млекопитающихся в связи с особенностями их структуры Механика полимеров, 1975. №4: с. 603 607.

27. Горбань, А.И., Баталова Т.В. , Введение фибринообразующих компонентов крови в теноново пространство с целью стабилизации прогрессирующей близорукости Офталъмохирургия, 1989. 1(2): с. 31 33.

28. Груша Я.О., Федоров .A.A., Бакаева Т.В., Способ маркировки биологических тканей для последующей идентификации зоны экспериментального воздействия. 2006: Патент RU № 2281758.

29. Епишева, С.Н., Венгер Г.Е., Эффективность склеропластики с применением текспланта при прогрессирующей миопии. Офтальмол. журн., 1998.1: с. 8-11.

30. Жаров, В.В., Первичная брефопластика в комплексном лечении про бодныхранений и субконъюнктивальныхразрывов склеры. 1987: JI. р. 25.

31. Зайкова, М.В., Пластическая офтальмохирургия. 1980, М: Медицина. 208 с.

32. Зайкова, М.В., Предупреждение прогрессирования близорукости путем пересадки умбиликальной ткани у детей Офтальмол. журн., 1993. 3: 157158 с.

33. Зайкова, М.В., Жаров В.В., Кошевой В.П. и др. , Первичная комбинированная брефопластика при проникающих ранениях склеры. Вестн. офтальмологии, 1983(4): с. 35-38

34. Зайкова, М.В., Лялин А.Н., Пересадка твердой мозговой оболочки плода человека при прогрессирующей близорукости. Вестн. офтальмол., 1984. 6: с. 33-34

35. Зайкова, М.В., Молокова Н. Ф., Турина О. Ю. и др. Морфологическое исследование умбиликовазоаллотрансплантатов в эксперименте, in Актуальные проблемы офтальмологии: Тезисы докладов научно-практической конференции. 1995.

36. Золотарева, М.М., К показаниям, технике и результатам послойной ауто- и гомосклеропластики. Офтальмол. журн., 1969(2): с. 96-100

37. Ивашина, А.И., Балашова Н.Х., Федченко О.Т. и др. , Применение коллагенопластики в лечении прогрессирующей близорукости у детей. Офт. хирургия., 1991. 3: с. 28-31

38. Иомдина, E.H., Биомеханика склеральной оболочки глаза при миопии: диагностика нарушений и их экспериментальная коррекция. 2000: М. 316 с.

39. Казначеев, В.П., Маянский Д.Н. , Современные представления о системе мононуклеарных моноцитов Успехи совр. биол., 1978. 3: с. 415-431

40. Kapp, Я., Макрофаги. Обзор ультраструктуры и функции. 1978, М: Медицина. 188 с.

41. Киселева, O.A., Зиангирова Г.Г., Иомдина Е.Н, Алиев Т.И., Результаты морфологического исследования экспериментального применения эксплантатов из полигликолидного волокна в хирургии отслойки сетчатки Вестн. офтальмол., 2005. 3: с. 12-14

42. Киселева, O.A., Петрова Т.Х., Морозова И.В, Применение новых склеропластических материалов в хирургии травматической отслойки сетчатки Вестн. офтальмол., 1992. 4: с. 18-19

43. Клименко, H.A., Татарко С. В., Механизмы стимулирующего влияния тканевых базофилов на репаративные процессы при воспалении. Морфология, 1976(2): с. 69-72

44. Ковальчук, Л.В., Локальная иммунокоррекция цитокинами, in Аллергология и клиническая иммунология, Л.В. Ковальчук, Ганковская Л.В., Editor. 1999. с. 64-71

45. Ковальчук, Л.В., Ганковская Л .В., Рубакова Э .И. , Система цитокинов. 1999, М.: Медицина. 77 с.

46. Ковальчук, Л.В., Ганковская Л.В. , Природная композиция цитокинов (суперлимф) в топической иммунокоррекции. Аллергия, астма и клин, иммунол., 2000(7): 25-27 с.

47. Корниловский, И.М., Патогенетические аспекты стабилизаг^ии миопии после склеропластических операций Офтальмол. журн., 1987(6): 343-347 с.

48. Кривошеина, О.И., Запускалов И.В., Елегчева О.Н. , Клинический опыт лечения гнойных язв роговицы с помощью аутологичных мононуклеаров крови. Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры М., 2007: 201-206 с.

49. Куприянов, В.В., Миронов В.А., Миронов А.А., Турина О.Ю. , Ангиогенез. Образование, рост и развитие кровеносных сосудов. 1993, М: НИО «Квартет», 170 с.

50. Лангер, Ц.И1, Склеропластика при зияющих ранениях белочной оболочки Вестн. офтальмологии, 1945. 5(6): 46-49 с.

51. Маркосян, Г.А., Укрепление склеры при прогрессирующей близорукости новыми видами синтетических материалов. 1999: М. 160 с.

52. Маянский, Д.Н., Роль клеток соединительной ткани в процессах регенерации. 1980, Йошкар-Ола. 143 с.

53. Маянский, Д.Н., Секреция макрофагов Успехи совр. биол 1982. 93(1): 7388 с.

54. Маянский, Д.Н., Уровни регуляции фибропластических процессов. Пат. физ., 1982(4): 27-34 с.

55. Мусаелян, З.В., Оценка стабилизирующего действия инъекции склероукрепляющей на клиническую рефракцию глаза при прогрессирующей близорукости. Вестник офтальмологии, 1988. 6: 26-28с.

56. Нестеров, А.П., Либенсон Н.Б. , Укрепление склеры широкой фасцией бедра при прогрессирующей близорукости. Вестн. офтальмол., 1967. 1: с. 15-19

57. Новохатский, A.C., Новак В.А. , Экспериментальные исследования метода укрепления склеры при введении в теноново пространство. Офтальмол. журн., 1988. 8: с. 481-484

58. Обрубов, С.А., Е.И. Сидоренко, В.Н. Федорова, Т.К.Дубовая, А.А.Древаль, Акустическая биомеханика глаза и её значение для клиники. 2001, М. 128 с.

59. Павлюк, A.C., A.A. Каспаров, Евг.А. Каспарова, A.M. Суббот, П.Ю.Баранов Репрограммирование иммуноцитокиновой доминанты Thl/Th2 с использованием лиганда TLR-3 полиА:полиУ. Российский Иммунологический Журнал, 2008. 2(11): с. 123-124

60. Поляк, Б.Л., Повреждения органа зрения. 1972, Л.: Медицина. 415 с.

61. Свирин, A.B., Применение склероукрепляющей коллагенопластики с трофическим компонентом в лечении прогрессирующей миопии высокой степени. Вестн. офтальмол., 1994.1: с.11-13

62. Свирин, A.B., Антипова O.A., Отдаленные результаты введения аллоткани в теноново пространство при прогрессирующей близорукости. Офтальмол. журн., 1984. 8: с. 471-472

63. Серов, В.П., Пауков B.C., ed. Воспаление. Руководство для врачей. 1995, Медицина: М. 640 с.

64. Сомов, Е.Е., Гомопластика склеры. 1972, Л.: Изд. Воен.-мед. акад. 26 с.70.71,72,73,74