Новая аспартатная протеиназа ретротранспозона Ulysses: Drosophila Virilis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат химических наук Волков, Денис Александрович

• Волков, Денис Александрович
• кандидат химических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат химических наук Волков, Денис Александрович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Общая характеристика аспартатных протеиназ. 3 1.1. Основные принципы структурной организации аспартатных протеиназ.

1.1.1. Трехмерная структура пепсина.

1.1.2.Трехмерная структура протеиназы HIV-1.

1.3. Общая характеристика ретровирусных аспартатных протеиназ на примере протеиназы вируса иммунодефицита человека.

1.3.1. Субстраты и субстратная специфичность.

1.3.2. Механизм катализа и факторы, влияющие на каталитическую активность.

1.4. Протеиназы эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов.

2. Общая характеристика мобильных генетических элементов.

2.1. Транспозоны.

2.2. Ретропозоны.

2.3. Ретротранспозоны.

2.3.1. Строение ретротранспозонов на примере copia Drosophila melanogaster и

Ulysses Drosophila virilis.

2.3.2. Жизненный цикл ретровирусов и ретротранспозонов.

2.3.3. Влияниеретротранспозиций на геном хозяина.

2.3.3.1. Негативное влияние.

2.3.3.2. Залечивание двухцепочечныхразрывов ДНК.

2.3.3.3. Удлинение теломер.

3. Теоритически-рассчетные методы исследования аспартатных протеиназ.

ГЛАВА II. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Определение локализации протеиназы Ulysses Drosophila virilis в составе полибелка-предшественника.

2. Клонирование гена протеиназы Ulysses Drosophila virilis в плазмидном векторерЕТ-23а(+).

З.Экспрессия рекомбинантного гена. Очистка белка.

4.Исследование свойств протеиназы Ulysses.

4.1. Определение молекулярной массы и изоэлектрической точки (pi).

4.2. Гидролиз мелиттина.

4.3.Гидролиз В-цепи инсулина

4.4. Определение рН-оптимума.

4.5. Ингибирование гидролиза В-цепи инсулина протеиназой Ulysses пепстатином

4.6.Автолиз

5. Построение трехмерной модели протеиназы Ulysses.

5.1. Моделирование трехмерной структуры.

5.2. Молекулярно-динамическое моделирование пространственной структуры молекулы протеиназы Ulysses.

5.3. Анализ третичной структуры.

5.4.Междоменный слой.

5.5. Анализ карманов связывания протеиназы Ulysses.

5.6.Спектр флуоресценции.

5.7. Круговой оптический дихроизм (КД)

ГЛАВА III. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы.

2. Методы исследования. 73 ВЫВОДЫ 80 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 81 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новая аспартатная протеиназа ретротранспозона Ulysses: Drosophila Virilis»

Функции аспартатных протеиназ в живом организме чрезвычайно разнообразны. Они участвуют в процессах пищеварения, в процессинге различных гормонов и нейропептидов, в утилизации белкового материала. К аспартатным протеиназам так же относятся протеиназы большинства ретровирусов, включая вирус иммунного дефицита человека (HIV) и аналогичные вирусы животных. Трехмерные структуры аспартатных протеиназ в значительной степени сходны, хотя ретровирусные протеиназы имеют ряд принципиальных особенностей.

Недавно обнаружено, что ретротранспозоны (мобильные генетические элементы, широко распространенные в геномах бактерий, растений, животных) содержат нуклеотидные последовательности, продуктами трансляции которых являются белки, гомологичные ретровирусным аспартатным протеиназам.

В последнее время обнаружено множество эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Полученные недавно данные о возможности активации эндогенных ретровирусов животных при пересадке органов человеку, а так же активации эндогенных ретровирусов человека при заражении HIV, делают изучение ретротранспозонов актуальной проблемой. Аспартатные протеиназы являются ключевыми ферментами жизненного цикла ретровирусов и ретротранспозонов и поэтому представляют собой основную мишень лекарственной терапии.

Аспартатные протеиназы играют важную роль в жизненном цикле ретровирусов, эндогенных ретровирусов и ретротранспозонов. Мутации аспартатов активного центра, приводят к неспособности образования функционально-активных белков ретроэлемента и как следствие неспособности к дальнейшему функционированию.

Наше внимание привлек Ulysses - мобильный генетический элемент, обнаруженный в Drosophila virilis. Он имеет структурную организацию, характерную для LTR-содержащих ретротранспозонов: первая свободная рамка считывания кодирует белки матрикса и капсида, вторая - протеиназу, обратную транскриптазу, РНКазу Н и интегразу.

Предмет наших исследований - протеиназа ретротранспозона Ulysses, предполагаемая последовательность которой содержит консервативные для аспартатных протеиназ структурные области, в том числе триаду DTG в области активного центра.

В связи с этим, целью данной работы является проведение клонирования, выделения и исследование свойств полученного белка из мобильного элемента Ulysses Drosophila virilis. В целом данная работа является первой попыткой получения аспартатной протеиназы из мобильного элемента.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Волков, Денис Александрович

выводы

1. На основе сравнительного анализа продукта трансляции гена ретротранспозона Ulysses (Drosophila virilis) и первичных структур известных ретровирусных аспартатных протеиназ определены фланкирующие последовательности протеиназы Ulysses.

2. Клонированием и экспрессией гена протеиназы ретротранспозона Ulysses в E.coli впервые получен кодируемый им белок, обладающий протеолитической активностью

3. Исследованы физико-химические свойства протеиназы Ulysses, в том числе ее устойчивость при автолизе, а также специфичность при гидролизе пептидных субстратов и проведено сравнение с протеиназой HIV-1. Показано, что протеиназа ретротранспозона Ulysses обладает широкой специфичностью (гидролизует связи, образованные карбоксильными группами гидрофобных и заряженных аминокислот). Оптимум рН действия равен 5.5.

4. Методом молекулярного моделирования построена пространственная модель протеиназы Ulysses, согласующаяся с экспериментальными данными по спектрам флуоресценции и КД и результатам автолиза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Волков, Денис Александрович, 2005 год

1. Szecsi. Р.В. The aspartic proteases. // Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1992, v. 52, pp. 22-25.

2. Bennett K., Levine Т., Ellis J.S., Peanasky R.J., Samloff I.M., Kay J. Chain B.M. Antigen processing for presentation by class II major histocompatibility complex requires cleavage by cathepsin E. // Eur. J. Immunol., 1992, v. 22, pp. 1519-1524.

3. Lees W.E., Kalinka S., Meech J., Capper S.J., Cook N.D., Kay J. Generation of human endothelin by cathepsin E.// FEBS Lett., 1990, v. 273, pp. 99-102.

4. Pungercar J., Strukelj В., Gubensek F., Turk V., Kregar I. Amino acid sequence of lamb prechymosin and its comparison to other chymosins. //Adv. Exp. Med. Biol., 1991, v. 306, pp. 127-131.

5. Kay J., Dunn B.M. Viral proteinases: weakness in strength. // Biochim. Biophys. Acta, 1990, v. 1048, pp. 1-18.

6. Антонов B.K. // Химия протеолиза. / M.: Наука, 1991, 363 с.

7. Rajagopalan T.G., Stein W.H., Moore S. The inactivation of pepsin by diazoacetylnorleucinemethyl ester. // J. Biol. Chem., 1966, v. 241, pp. 4295-4297.

8. Tang J. Specific and irreversible inactivation of pepsin by substrate-like epoxides. // J. Biol. Chem., 1971, v. 246, pp. 4510-4517.

9. Marciniszyn J. Jr., Hartsuck J.A., Tang J. Mode of inhibition of acid proteases by pepstatin. // J. Biol. Chem., 1976, v. 251, pp. 7088-7094.

10. Toogood H.S., Prescott M., Daniel R.M. A pepstatin-insensitive aspartic proteinase from a thermophilic Bacillus sp. // Biochem. J., 1995, v. 307, pp. 783-789.

11. Ito M., Dunn B.M., Oda K. Substrate specificities of pepstatin-insensitive carboxyl proteinases from gram-negative bacteria. // J. Biochem. (Tokyo), 1996, v. 120, pp. 845-850.

12. Андреева H.C. Структура пепсина. I. Собственная симметрия молекулы фермента и возможные пути эволюции аспартатных протеиназ. // Мол. биол., 1985, т. 19, стр. 218-224.

13. Davies D.R. The structure and function of the aspartic proteinases. //Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem., 1990, v. 19, pp. 189-215.

14. Tang J., Wong R.N. Evolution in the structure and function of aspartic proteases. // J. Cell. Biochem., 1987, v. 33, pp. 53-63.

15. Hartsuck J. A., Koelsch G., Remington S.J. The high-resolution crystal structure of porcine pepsinogen.//Proteins, 1992, v. 13, pp. 1-25.

16. James M., Moore S., Sielecki A., Chernaia M., Tarasova N. The molecular structure of human progastricsin and its comparison with that of porcine pepsinogen. // Adv. Exp. Med. Biol., 1995, v. 362, pp. 11-18.

17. Moore S.A., Sielecki A.R., Chernaia M.M., Tarasova N.I., James M.N. Crystal and molecular structures of human progastricsin at 1.62 A resolution. // J. Mol. Biol., 1995, v.247, pp. 466-485.

18. Gardner,M.J., Hall,N., Fung,E., White,O., Berriman,M., Hyman,R.W. Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. // Nature, 2002, v.419 (6906), pp. 498-511.

19. Sielecki A.R., Fedorov A.A., Boodhoo A., Andreeva N.S., James N.G. Molecular and crystal structures of monoclinic porcine pepsin refined at 1.8 A resolution.// J. Mol. Biol. -1990 v.214 - pp.143-170.

20. Andreeva N.S. Consensus template for the aspartic proteinase fold.// Adv. Exp. Med. Biol. 1992 - v.306 - pp.559-572.

21. Андреева H.C., Гущина A.E., Жданов A.C., Печик И.В., Сафро М.Г., Федоров А.А. Некоторые аспекты структурных исследований аспартатных протеиназ.// Молек. биол. 1989 - т.23 - стр.1523-1534.

22. Lapatto R., Blundell Т., Hemmings A., Overington J., Wilderspin A., Wood S., Merson

23. J.R., Whittle P.J., Danley D.E., Geoghegan K.F., Hawrylic S.J., Lee S.E., Scheld K.G., Hobart P.M. X-ray analysis of HIV-1 proteinase at 2.7 A resolution confirms structural homology among retroviral enzymes. // Nature, 1989, v. 342 , pp. 299-302.

24. Stebbins J., Towler E.M., Tennant M.G., Deckman I.C., Debouck C. The 80's loop (residues 78 to 85) is important for the differential activity of retroviral proteases. // J. Mol. Biol., 1997, v. 267, pp. 467-475.

25. Katz R.A. & Skalka A.M. The retroviral enzymes. // Annu. Rev. Biochem., 1994, v. 63, pp.133-173.

26. Levy J.A. Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection. // Microbiol. Rev., 1993, v. 57, pp. 183-289.

27. Overton H.A., McMillan D.J., Gridley S.J., Brenner J., Red-Shaw S., Mills J.S. Effect of two inhibitors of the human immunodeficiency virus protease on the maturation of the HIV gag and gag-pol polyproteins. // Virology, 1990, v. 179, pp. 508-511.

28. Jhonson M.I. & Hoth D.E. Present status and future prospects for HIV therapies. // Science, 1993, v. 260, pp. 1286-1292.

29. Daube H., Billich A., Mann K., Schramm H.J. Cleavage of phosphorylase kinase and calcium-free calmodulin by HIV-1 protease. // Biochem. Biophys. Res. Communs., 1991, v. 178, pp. 892-896.

30. Krafft G.A. & Wang G.T. Sinthetic approacher to continuous of retroviral proteases. // Meth. Enzymol., 1994, v. 241, pp. 70-86.

31. Kay K. & Dunn B.M. Substrate specifity and inhibitors of aspartic proteinases. // Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1992, v. 52, pp. 23-30.

32. MeekTh.D., Rodriguez E.J., Angeles Th.S. Use of steady state kinetic methods to elucidate the kinetic and chemical mechanisms of retroviral proteases. // Meth. Enzymol., 1994, v. 241, pp. 127-156.

33. Darke P.L., Jordan S.P., Hall D.L., Zugay J.A., Shater J.A., Kuo L.C. Dissociation and association of the HIV-1 protease dimmer subunits: equilibria and rates. // Biochemistry, 1994, v.33, pp. 98-105.

34. Darke P.L. Stability of the dimeric retroviral proteases. // Meth. Enzymol., 1994, v. 241, pp. 104-127.

35. Rose J.R., Salto R., Craik C.S. Regulation of autoproteolysis of the HIV-1 and HIV-2 proteases with engineered amino acid substitutions. // J. Biol. Chem., 1993, v. 286, pp. 1193911945.

36. Jordan S.P., Zugay J.A., Darke P.L., Kuo L.C. Activity and dimerization of human immunodeficiency virus protease as a function of solvent composition and enzyme concentration. // J. Biol. Chem., 1992, v. 267, pp. 20028-20032.

37. Davis DA, Dorsey K, Wingfield PT, Stahl S J, Kaufman J, Fales HM, Levine RL. Regulation of HIV-1 protease activity through cysteine modification. I I Biochemistry, 1996, v. 35(7), pp. 2482-8.

38. Dunn B.M., Goodenow M.M., Gustchina A. and Wlodawer A. Retroviral proteases. // Genome Biology, 2002, v. 3(4), pp. 30061-30067.

39. Jurgen H.B., Seelmeir S., von der Helm K. Molecular and enzymatic characterization of porcine endogenous retrovirus protease. // Journal of Virology, 2002, v.76, pp. 7913-7917.

40. Zabransky A., Andreansky M., Hruskova-Heidingsfeldova O., Havlicek V., Hunter E., Ruml Т., Pichova I. Three active forms of aspartic proteinase from Mason-Pfizer monkey virus. // Virology, 1998, v. 245(2), pp. 250-256.

41. Merkulov G.V., Lawler J.F., Eby Y., Boeke J.D. Ту 1 proteolytic cleavage are required fortransposition: all sites are not equal. // Journal of Virology, 2001, v.75, pp. 638-644.

42. Irwin P. A., VoytasD.F. Expression and processing ofproteins encoded by the Saccharomy ces retrotransposon Ty5. // Journal of Virology, 2001, v.75, pp. 1790-1797.

43. BergD.E., and Howe M. // Mobile DNA. / American Society for Microbiology, Washington D.C., 1989, p. 347.

44. Engel W., and Preston C. Formation of chromosome rearrangements by P factors in Drosophila. // Genetics, 1984, v. 107, pp. 657-678.

45. Langley C., Montgomery E., Hudson R., Kaplan N. and Charlesworth B. On the role of unequal exchange in the containment of transposable element copy number. // Genet. Res., 1988, v. 52, pp. 223-236.

46. Strand D., and McDonald J. Insertion of a copia element 5' to the Drosophila melanogaster alcohol dehydrogenase gene (adh) is associated with altered developmental and tissue-specific patterns of expression. // Genetics, 1989, v. 121, pp. 787-794.

47. Cai H., and Levine M. The gypsy insulator can function as a promoter-specific silencer in the Drosophila embryo. // EMBO J., 1997, v. 16, pp. 1732-1741.

48. Georgiev P., and Corces V. The su(Hw) protein bound to gypsy sequences in one chromosome can repress enhancer-promoter interactions in the paired gene located in the other homolog. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, v. 92, pp. 5184-5188.

49. Moore J.K. & Haber J.E. Capture of retrotransposon DNA at the sites of chromosomal double-strand breaks. // Nature (London), 1996, v. 383, pp. 644-646.

50. Biessmann H., Valgeirsdottir K., Lofsky A., Chin C., Ginther В., et al. HeT-A, a transposable element specifically involved in "healing" broken chromosome ends in Drosophilamelanogaster. // Mol. Cell. Biol., 1992b, v. 12, pp. 3910-3918.

51. Levis R., Ganesan R., Houtchens K., Tolar L. and Sheen F. Transposons in place of telomeric repeats at a Drosophila telomere. // Cell, 1993, v. 75, pp. 1083-1093.

52. Rio D. Regulation of Drosophila P-element transposition. // Trends Genet. 1991, v. 7, pp. 282-287.

53. Kaufman P. and Rio D. P-element transposition in vitro by a cut-and-paste mechanism and uses GTP as a cofactor. // Cell, 1992, v. 69, pp. 27-39.

54. Beall E.,and Rio D. Drosophila IRBP/Ku p70 corresponds to the mutagen-sensitive mus309 gene and is involved in P-element excision in vivo. // Genes. Dev., 1996, v. 10, pp. 921-933.

55. Siebel C., Admon A. and Rio D. Soma-specific expression and cloning of PSI, a negative regulator of P-element pre-mRNA splicing. // Genes. Dev., 1995, v. 9, pp. 269-283.

56. Rebatchouk D., and Narita J. Foldback transposable elements in plants. // Plant Mol. Biol., 1997, v. 34, pp. 831-835.

57. Dawson A., Hartswood E., Paterson T. and Finnegan D. A LINE-like transposable element in Drosophila, the I factor, encodes a protein with properties similar to those of retroviral nucleocapsids. // EMBO J., 1997, v. 16, pp. 4448-4455.

58. Xiong Y., and Eikbush T. Origin and evolution of retroelements based upon their reverse transcriptase sequences. // EMBO J., 1990, v. 9, pp. 3353-3362.

59. Luan D., Korman M., Jakubczak J. and Eickbush T. Reverse transcription of R2Bm RNA is primed by a nick at the chromosomal target site: a mechanism for non-LTR retrotransposition. // Cell, 1993, v. 72, pp. 595-605.a

60. Kim A., Terzian C., Santamaria P., Pelisson A., Purdqhomme N., et al. Retroviruses ininvertebrates: the gypsy retrotransposon is apparently an infectious retrovirus of Drosophila melanogaster. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1994, v. 91, pp. 1285-1289.

61. Tanda S., Mullor J. and Corces V. The Drosophila Tom retrotransposon encodes an envelope protein. // Mol. Cell. Biol., 1994, v. 14, pp. 5392-5401.

62. Nuzhdin S., Pasyukova E. and Mackay T. Positive association between copia transposition rate and copy number in Drosophila melanogaster. // Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci., 1996, v. 263, pp. 823-831.

63. Zelentsova H., Poluectova H., Mnjoian L., Lyozin G., Veleikodvorskaja V., Zhivotovsky L., Kidwell M.G., Evgen'ev M.B. Distribution and evolution of mobile elements in the virilis species of Drosophila. // Chromosoma, 1999, v. 108, pp. 443-456.

64. Evgen'ev M.B., Corces V.G., Lankenau D.-H. Ulysses transposable element of Drosophila shows high structural similarities to functional domains of retroviruses. // J. Mol. Biol., 1992, v. 225 (3), pp. 917-924.

65. Lower R., Lower J., Kurth R. The viruses in all of us: characteristics and biologicalsignificance of human endogenous retrovirus sequences. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, v. 93, pp. 5177-5184.

66. Yoshioka K., Kanda H., Akiba H., Enoki M. and Shiba T. Identification of an unusual structure in the Drosophila melanogaster transposable element copia: evidence for copia transposition through an RNA intermediate. // Gene, 1991, v. 103, pp. 179-184.

67. Eichinger D. and Boeke J. A specific terminal structure is required for Ту 1 transposition.//

68. Genes. Dev., 1990, v. 4, pp. 324-330.

69. Lower R. The pathogenic potential of endogenous retroviruses: facts and fantasies. // Trends in microbiology, 1999, v. 7 (9), pp. 350-355.

70. Kazazian H.H.J. Mobile elements and disease. // Current opinion in genetics & Development, 1998, v. 8, pp. 343-350.

71. Challem J.J. and Taylor E.W. Retroviruses, ascorbate, and mutations, in the evolution of Homo Sapiens. // Free radical biology & Medicine, 1998, v. 25 (1), pp. 130-132.

72. Kazazian H.H.J., Wong C., Scot A.F., Philips D.G. Haemophilia A resulting from de novo insertion of LI sequences represent a novel mechanism for mutation in man. // Nature, 1998, v. 332, pp. 164-166.

73. Kazazian H.H.J & Moran J.V. The impact of LI retrotransposons on the human genome. // Nat Genet., 1998, v. 19, pp. 19-24.

74. Kidwell M.G. and Lisch D.R. Transposable elements and host genome evolution. // Tree, 2000, v. 15 (3), pp. 95-99.

75. Teng S.-C., Bohue K. & Gabriel A. Retrotransposon reverse-transcriptase-mediated repair of chromosomal breaks. // Nature (London), 1996, v. 383, pp. 641-644.

76. Биологический энциклопедический словарь. / M.: Сов. Энциклопедия, 1989, 864с.

77. Greider CW, Blackburn EH. A telomeric sequence in the RNA ofTetrahymena telomerase required for telomere repeat synthesis. Nature, 1989, v. 337(6205), pp. 331-7.

78. Cooke HJ, Smith В A. Variability at the telomeres of the human X/Y pseudoautosomal region. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 1986;51 Pt 1, pp. 213-9.

79. Allshire RC, Gosden JR, Cross SH, Cranston G, Rout D, Sugawara N, Szostak JW,

80. Fantes PA, Hastie ND. Telomeric repeat from T. thermophila cross hybridizes with human telomeres, Nature, 1988, v. 332(6165):656-9.

81. Lundblad V, Szostak JW. A mutant with a defect in telomere elongation leads to senescence in yeast. Cell, 1989, v.57(4), pp. 633-43.

82. Allsopp RC, Vaziri H, Patterson C, Goldstein S, Younglai EV, Futcher AB, Greider CW, Harley CB. Telomere length predicts replicative capacity of human fibroblasts. Proc Natl AcadSciUSA, 1992, v. 89(21), pp. 10114-8.

83. Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, Harley CB, West MD, Ho PL, Coviello GM, Wright WE, Weinrich SL, Shay JW. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science, 1994, v. 266(5193), pp. 2011-5.

84. Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, Holt SE, Chiu CP, Morin GB, Harley CB, Shay JW, Lichtsteiner S, Wright WE. Extension of life-span by introduction of telomerase into normal human cells. Science, 1998, v. 279(5349), pp. 349-52.

85. Pardue M.-L. & DeBaryshe P.G. Drosophila telomeres: two transposable elements with important roles in chromosomes. // Genetica, 1999, v. 107, pp. 189-196.

86. Kidwell M.G. and Lisch D. Transposable elements as sources of variation in animals and plants. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, v. 94, pp. 7704-7711.

87. Eickbush Т.Н. Telomerase and retrotransposons: which came first? // Science, 1997, v. 277, pp. 911-912.

88. Nakamura T.M., Gregg B.M., Chapman K.B. Telomerase catalytic subunit homologs from fission yeast and human. // Science, 1997, v. 277, pp. 995-997.

89. Попов E.M. // Проблема белка. Том 3 / М.: Наука, 1997, с. 75-77.

90. Huang Xiao-Qin, Jiang Hua-Liang, Luo Xiao-Min. A 3D-structural model of memapsin 2protease generated from theoretical study. // Acta Pharmacol Sin, 2001, v. 22(1), pp. 50-56,,

91. Andreeva N., Bogdanovich P., Kashparov I., Popov M., Stengach M. Is histoaspartic protease a serine protease with a pepsin-like fold? // Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, 2004, v. 55, pp. 705-710.

92. Kulkarni S.S., Kulkarni V.M. Structure based prediction of binding affinity of human immunodeficiency virus-1 protease inhibitors. // Journal Chem. Inf. Comput. Sci., 1999, v. 39, pp. 1128-1140.

93. Ersmark K., Feierberg I., Bjelic S., Hulten J., Samuelsson В., Aqvist J, Hallberg A. C2-symmetric inhibitors of Plasmodium falciparum plasmepsin II: synthesis and theoretical predictions. // Bioorg Med Chem., 2003, v. 11(17), pp. 3723-33.

94. Андреева H.C., Печик И.В. Сравнение трехмерных структур гибких молекул белков. // Мол. биол., 1995, т. 29, стр. 1102-1113.

95. Scheinker V.S., Lozovskaja E.R., Bishop J.G., Corces V.G., Evgen'ev M.B. A Long Terminal Repeat-Containing Retrotransposon is Mobilized During Hybrid Dysgenesis in Drosophila virilis . // Proc. Natl. Acad.Sci.USA, 1990, v. 87, pp. 9615-9619.

96. Andreeva N.S. A consensus template for the aspartic proteinase fold. // Adv. in Exp. Med. Biol., 1991, v. 306, pp. 559-572.

97. Stebbins J. & Debouk Ch. Expression system for retroviral proteases. // Meth. Enzymol:.,1994, v. 241, pp. 3-16.

98. Rizzo C.J. & Korant B.D. Genetic approachesdisigned to minimize cytotoxicity of retroviral protease. // Meth. Enzymol., 1994, v. 241, pp. 16-24.

99. Wondrak E.M., Louis J.M., MoraP.T., Orozlan S. Purification of HIV-1 wild-type protease and characterization of proteolytically inactive HIV-1 protease mutants by pepstatin A affinity chromatography. // FEBS Lett., 1991, v.280, pp. 347-350.

100. Mirgorodskaya O., Kazanina G., Mirgorodskaya E., Vorotynseva Т., Zamolodchikova Т., Alexandrov S. A comparative study of the specificity of melittin hydrolysis by dupdenase, trypsin and plasmin. // Prot. Pept. Lett., 1996, v. 3, pp. 315-320.

101. Дергоусова Н.И. // Исследование структурных основ функционирования аспартатных протеиназ. Мутагенез протеиназы ВИЧ-1. Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук. / Москва, 1998.

102. Симанкова А.Н., Миргородская О.А., Савельева Н.В., Кернер Р., Ройпсторфф П., Александров СЛ. Грибная аспартатная npoTeHHa3aH3Trichodermaviride. Специфичность при гидролизе олигопептидов. // Биоорганическая Химия, 1997, т. 25, с. 611-614.

103. Marti-Renom M.A, Stuart A., Fiser A., Sanchez R., Melo F., Sali A. Comparative protein structure modeling of genes and genomes. // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., 2000, v. 29, pp. 291-325.

104. Brooks B.R., Bruccoleri R.E., Olafson B.D., StatesD.J., Swaminathan S., and Karplus M. CHARMM: A Program for Macromolecular Energy, Minimization, and Dynamics Calculations. //J. Сотр. Chem., 1983, v. 4, pp.187-217.

105. Fidy J., LabergeM., Ullrich В., Polgar L., Szeltner Z., Gallay J., and Vincent M. Tryptophan rotamers that report the conformational dynamics of proteins // Pure Appl. Chem., 2001, v. 73(3), pp. 415-419.

106. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 1989.

107. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.//Anal. Biochem., 1976, v.72 pp.248254.

108. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage Т47/Nature (London), 1970, v.227 pp.680-685.

109. Lin КН., Cheng S.Y. An efficient method to purify active eukaryotic proteins from the inclusion bodies in Escherichia coli.// Biotechniques , 1991, v. 11 p.748

110. Provencher,S.W.,Glockner J., Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. // Biochemistry, 1981,v.20, pp. 33-37.

111. Laskowski R A, MacArthur M W, Moss D S & Thornton J M. PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. //J. Appl. Cryst., 1993, v.26, pp.283291.