Определение концентрации натамицина в мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Корниенко Ирина Игоревна

• Корниенко Ирина Игоревна
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Корниенко Ирина Игоревна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Анализ состояния российского рынка мясной продукции и колбасных изделий

1.2. Критерии оценки качества и виды порчи колбасных изделий

1.3. Ветеринарно-санитарный контроль производства колбасных изделий

1.4. Физико-химическая и микробиологическая характеристика натамицина

1.5. Натамицин в пищевой промышленности, особенности применения и эффективность

1.6. Методы контроля качества и безопасности пищевых продуктов

1.7. Некоторые аспекты применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в пищевой промышленности

1.8. Проведение хроматографического анализа

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Организация исследования

2.2. Аппаратура и реагенты

2.3. Подготовка к проведению измерений

2.3.1. Определение условий хроматографического разделения и детектирования для ВЭЖХ метода с диодноматричным детектором

2.3.2. Подбор условий хроматографического разделения и детектирования для ВЭЖХ метода с масс-спектрометрическим детектором

2.4. Подбор оптимального метода пробоподготовки

2.5. Проведение валидационных испытаний методики определения концентрации натамицина в мясных продуктах методом ВЭЖХ

2.5.1. Программа проведения валидационных испытаний методики определения концентрации натамицина методом ВЭЖХ

2.5.2. Оценка метрологических характеристик

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Результаты эксперимента по расчету степени извлечения натамицина при

различных вариантах пробоподготовки

3.2. Результаты валидационного эксперимента

3.3. Результаты расчета параметров валидации

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРТУРЫ

Приложение А

Приложение Б

Приложение В

Приложение Г

Приложение Д

Приложение Е

Приложение Ж

Приложение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Определение концентрации натамицина в мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Мясоперерабатывающая промышленность является одной из важнейших отраслей экономики Российской Федерации. Спрос на продукцию животноводства как на источник полноценного белка демонстрирует устойчивость даже в условиях экономической нестабильности.

Рынок колбасных изделий представляет собой один из самых масштабных и динамичных секторов пищевой промышленности. Колбасы сохраняют высокую долю в структуре потребления населения России, а объемы их производства являются одним из определяющих факторов в оценке деятельности отечественных мясоперерабатывающих предприятий.

Решающую роль в формировании потребительского доверия играет безопасность производимой продукции, имеющая первостепенное значение и для общественного здравоохранения.

Для увеличения сроков годности и сохранения качества изделий из мяса используют антибактериальные и противогрибковые препараты, контроль содержания остаточных количеств которых является критически важным аспектом обеспечения потребительской безопасности. В зависимости от кондиции используемого при производстве сырья, особенностей его получения и технологии переработки, готовая продукция может содержать остаточные количества ксенобиотиков, нередко в значениях, превышающих нормативные показатели. Это связано не только с широким применением лечебных, лечебно-профилактических и ростостимулирующих средств для сельскохозяйственных животных и птицы в условиях промышленного производства, но и с использованием антибиотиков для продления сроков хранения готовой продукции.

Использование антибиотиков в технологии консервирования способствует сокращению продолжительности термообработки и позволяет минимизировать

риск преждевременного ухудшения органолептических свойств продуктов, обусловленного микробной и грибковой контаминацией [57].

Полиеновые макролиды - класс антимикотиков, продуцируемых штаммами актинобактерий рода Streptomyces, широко применяются в пищевой промышленности. На данный момент около 10 видов антибиотиков этого класса используются для различных целей в медицине, лабораторной практике и ряде отраслей народного хозяйства.

По объемам использования в промышленности натамицин (код E235 в международной классификации) занимает одно из ведущих мест среди полиеновых макролидов. Его отличительной особенностью является статус единственного антимикотического агента микробного происхождения, получившего одобрение для применения в качестве пищевого консерванта [52, 110, 112].

Преимущество натамицина заключается в том, что он сохраняет исходные характеристики продукта: его питательную ценность, внешний вид, вкус и текстуру. Натамицин также не оказывает ингибирующего действия на активность заквасочных культур. Его функциональное применение включает обработку поверхности сухих созревающих колбас, мяса, жаренного на гриле, и сушеной рыбы. Он также используется для вымачивания оболочек колбасных изделий [81].

Соединение демонстрирует низкую токсичность для человека и животных при соблюдении установленных пределов концентрации. Однако превышение нормативных уровней может вызвать аномалии развития плода у беременных женщин или спровоцировать аллергические реакции [69]. Высказываются также опасения по поводу использования растворимых форм натамицина, поскольку воздействие высоких концентраций препарата на желудочно-кишечные штаммы Candida spp. может привести к селективному отбору резистентных колоний [129].

К тому же в последние годы наблюдается тенденция к постепенному снижению чувствительности грибков к полиеновым антибиотикам [124, 151].

Для реализации положений Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации, ориентированной на поддержание высокого качества продуктов питания, критически важным является создание и имплементация инновационных аналитических подходов. Их применение позволит существенно расширить как пределы обнаружения, так и номенклатуру контролируемых параметров безопасности продукции.

На данный момент в России регулирование содержания натамицина в продуктах питания распространяется исключительно на сыры, в соответствии с ГОСТ Р ИСО 9233-2-2011. В отношении мясных изделий такой контроль не предусмотрен из-за отсутствия необходимой нормативной базы и аттестованных методик.

Исследования в области контроля остаточных концентраций антибиотиков в пищевых продуктах отражены в работах отечественных и зарубежных ученых [Aparicio J. F., 2015; Шевченко Д. С., 2016; Yangilar F., 2016; Амелин В. Г., Большаков Д. С., Авдеева Н. М., 2017; Войтенко С. И., Маркова К. В., 2017; Куликовский А. В., Иванкин А. Н., Du Y. L., 2017; Сатюкова Л. П., Абдуллаева А. М., Шопинская М. И., Литвинова Э. В., Шилина А. С., Панькова В. А., 2019; Полянских Е. И., Полоневич А. Г., Белышева Л. Л., Рахманько Е. М., Лещев С. М., 2019; Клюева А. В., Зайцева И. А., Роева Н. Н., Воронич С. С., 2021; Добина Е. А., Баранова Д. Р., 2022; Лаврухина О. И., Амелин В. Г., Киш Л. К., Третьяков А. В., Ватутина И. В., Пеньков Т. Д., 2022; Мощева А. Г., Гальвидис И. А., Буркин М. А., 2022; Андриевская Е. В., Полянских Е. И., Белышева Л. Л., Федорова Т. А., 2023; Фабрикантова Е. А., Бачинская В. М., Гончар Д. В., Алексеенкова С. В., 2024; Жижин Н. А., 2025], которые поддерживают идею рационального применения ксенобиотиков и выступают за формирование нормативной базы для контроля их содержания в продуктах питания.

Натамицин демонстрирует потенциал в качестве консерванта для мясной и молочной промышленности, однако его применение сопряжено с возможными

рисками для здоровья человека. Разработка и внедрение методики определения концентрации натамицина в мясной продукции поможет развитию мясоперерабатывающей промышленности России, а также позволит защитить рынок страны от продукции, не соответствующей регламентам Таможенного союза.

Степень разработанности темы исследования. Изучению проблем контроля натамицина в пищевых продуктах и оценке его влияния на организм человека посвящены работы таких отечественных и зарубежных ученых, как Rasgele P., Kaymak F., 2013; Абакумова A. A., Гугучкина Т. И., Антоненко М. В., 2015; Dalhoff A. A. Levy S. B., 2015; Ombarak R. A., Shelaby H. H., 2017; Сатюкова Л. П., Абдуллаева А. М., Шопинская М. И., Литвинова Э. В., Шилина А. С., Панькова В. А., 2019; Триандофилиди Ю. С., Ольховатов Е. А., Сокол Н. В., 2025; Жижин Н. А., 2025.

До настоящего времени комплексных исследований, посвященных разработке метода хроматографического определения натамицина в мясных продуктах, не проводилось, что стало детерминирующим фактором при определении цели и задач исследования.

Цель и задачи исследований. Цель работы - исследование параметров и подбор оптимальных условий хроматографического определения натамицина в сырокопченых и полукопченых колбасах, и разработка методики обнаружения натамицина в мясной продукции методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В соответствии с поставленной целью сформулированы следующие задачи:

1. Провести систематический обзор научной литературы с целью оценки существующих методик количественного определения натамицина в пищевых продуктах и выявления оптимальных аналитических процедур;

2. Осуществить выбор оптимальной хроматографической системы и условий определения натамицина в мясной продукции, в частности в сырокопченых и полукопченых колбасах, методами высокоэффективной

жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектором и высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектором;

3. Провести сравнительный анализ и определить методы пробоподготовки и характеристики используемых градуировочных растворов, обеспечивающие наиболее полное извлечение натамицина из проб сырокопченых и полукопченых колбас;

4. Разработать унифицированный метод определения остаточных количеств натамицина в мясных продуктах на основе высокоэффективной жидкостной хроматографии, позволяющий оперативно отслеживать и контролировать соответствие пищевой продукции требованиям ветеринарного надзора, как непосредственно на производственных площадках, так и в аккредитованных лабораторных условиях;

5. Оценить правильность получаемых при анализе проб результатов (провести валидацию разработанной методики, оценить прецизионность, повторяемость, специфичность метода, установить пределы обнаружения, количественного определения, линейности, аналитической области определения);

6. Осуществить метрологическую аттестацию методики определения концентрации натамицина в мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Научная новизна. При выполнении данной работы автором:

- разработана методика определения концентрации натамицина в мясных продуктах, в частности в сырокопченых и полукопченых колбасах, методами высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным и масс-спектрометрическим детектором;

- проведена аттестация и валидация оптимизированной методики контроля натамицина в продукции животного происхождения, подтверждена ее эффективность;

- дана оценка преимуществ разработанной методики контроля остаточного количества натамицина в мясной продукции с метрологическим обоснованием.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты исследований позволяют проводить объективную оценку содержания остаточных концентраций натамицина в мясных продуктах посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детективированием и высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детективированием.

Разработана, апробирована и аттестована методика качественного и количественного определения концентрации полиенового макролида в продуктах переработки мяса, на основе которой утверждена и опубликована «Методика определения концентрации натамицина в мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии МИ 12-2022» (№ 10.18720/8РБРи/2/723-22, 30 стр.).

Методология и методы исследования. Теоретические основы работы базируются на данных, представленных в современных отечественных и зарубежных публикациях. В работе использованы хроматографические методы анализа, включающие спектрофотометрию, жидкостную хроматографию в сочетании с масс-спектрометрией и статистическую обработку данных.

Положения, выносимые на защиту:

1. Комплексный анализ разработанных, унифицированных и оптимизированных протоколов пробоподготовки матриц животного происхождения для количественного определения остаточных концентраций полиеновых антибиотиков с помощью ВЭЖХ-МС/МС;

2. Сопоставление используемых хроматографических систем и условий определения концентрации натамицина для выявления оптимальных параметров определения его остаточных количеств в сырокопченых и полукопченых колбасах;

3. Особенности пробоподготовки для извлечения натамицина из проб сырокопченых и полукопченых колбас;

4. Результаты валидации методики определения концентрации натамицина в мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии;

5. Метрологическая аттестация методики определения концентрации натамицина в мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Степень достоверности и апробация результатов исследования.

Диссертационная работа основывается на анализе и интерпретации результатов комплексных исследований.

Высокая достоверность результатов достигается благодаря применению современных научных методов сбора и обработки информации, а также использованию для проведения экспериментального этапа сертифицированного в аккредитованных лицензированных учреждениях оборудования.

Современные подходы к обработке информации легли в основу статистического анализа и последующей интерпретации данных.

Выводы, сформулированные на основе результатов исследования, были представлены и рассмотрены на:

1. Международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, посвященной 155-летию РГАУ - МСХА имени К. А. Тимирязева, г. Москва, 2020 г.;

2. Научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии, биотехнологии и экспертизы сырья и продуктов животного происхождения», г. Москва, 2022 г.;

3. Х Научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, товароведения и экспертизы сырья и продуктов животного и растительного происхождения, зоотехнии и биотехнологии», проводимой в рамках XII Всероссийского фестиваля науки, г. Москва, 2022 г.;

4. Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Неделя молодежной науки», приуроченной к 105-летию Московской ветеринарной академии, г. Москва, 2024 г.;

5. IV Научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии, биотехнологии и экспертизы сырья и продуктов животного происхождения», г. Москва, 2025 г.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Анализ научных положений диссертации показал их полное соответствие паспорту специальности 4.2.2. - Санитария, гигиена, экология, ветеринарно-санитарная экспертиза и биобезопасность, пункты 2, 3, 4, что согласуется с действующей Номенклатурой научных специальностей, регламентирующей присуждение ученых степеней (утверждена Приказом Минобрнауки России от 24.02.2021 № 118).

Направления исследований:

п. 2. Организация и проведение исследований по влиянию природных и антропогенных загрязнителей на состояние здоровья животных, качество и безопасность продуктов питания животного происхождения.

п. 3. Разработка методов индикации и идентификации патогенных микроорганизмов в объектах ветеринарного надзора и их нормирование.

п. 4. Разработка методов определения остатков пестицидов, токсичных элементов, микотоксинов и фитотоксинов в объектах окружающей среды, кормах и продуктах животноводства и определение их безопасных уровней.

Личный вклад соискателя. В ходе диссертационного исследования автором был самостоятельно определен вектор научной работы, сформулированы её цель и задачи, а также осуществлен подбор методов испытаний и анализ соответствующей отечественной и зарубежной научной литературы.

Все этапы исследования, включая разработку плана, подготовку анализируемых образцов, выполнение хроматографического анализа, а также аттестацию и валидацию примененной методики, наряду с обобщением и

статистической обработкой полученных результатов, были осуществлены под непосредственным руководством и при участии автора диссертации. Личный вклад автора в данную работу превышает 80 %.

Публикации. По материалам исследования опубликовано 2 статьи и 3 тезиса в изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки РФ. Изданы методические рекомендации «Методика определения концентрации натамицина в мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии МИ 12-2022» (№ 10.18720/SPBPU/2/z23-22, 30 стр.).

Структура и объем диссертации. Диссертационное исследование представлено на 141 странице компьютерного текста и охватывает все необходимые разделы: введение, обзор литературы, экспериментальную часть, заключение, выводы, список литературы и сокращений, а также приложения. Визуализация данных и иллюстративный материал включает 18 таблиц, 9 рисунков и 13 формул. Библиографический список состоит из 168 наименований, при этом 50 из них представляют собой зарубежные публикации.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Анализ состояния российского рынка мясной продукции и колбасных

изделий

Мясная промышленность - одна из самых значимых отраслей народного хозяйства. Несмотря на экономические колебания рынков сбыта, спрос на мясо и продукты его переработки остается стабильным благодаря их высокой питательной ценности [2, 68, 90].

Согласно Доктрине продовольственной безопасности Российской Федерации, одной из приоритетных стратегических задач страны является увеличение емкости рынка продуктов питания животноводческого происхождения. Особое внимание уделяется достижению самообеспеченности в сфере производства мяса и мясопродуктов (в пересчете на мясо) на уровне не менее 85 % [76].

Удовлетворение потребностей различных групп населения в высококачественной мясной продукции является ключевой задачей мясоперерабатывающей отрасли, обусловливающей необходимость ежегодного увеличения производственных мощностей при одновременном поддержании уровня качества продукции и сопутствующем расширении ассортимента. Реализация соответствующей долгосрочной стратегии развития требует не только постоянного анализа динамики рынка, или вложений в сырье и оборудование, но и непрерывного совершенствования технологии производства продукции [47].

На сегодняшний день производство колбасных изделий считается одним из основных направлений в экономике народного хозяйства [54].

За последние 10-15 лет структура потребления мясных продуктов в России претерпела значительные изменения, однако колбасы по-прежнему занимают большой удельный вес в питании населения и относятся к числу наиболее распространенных видов мясопродуктов. Это обусловлено их вкусовыми качествами, высокой пищевой ценностью и способностью к сравнительно

продолжительному хранению. Возможность длительной транспортировки без потери качества делает колбасы незаменимым продуктом в логистике и снабжении, особенно в условиях современных реалий, когда доставка продуктов питания может происходить на большие расстояния [92].

С точки зрения потребительской привлекательности, существенным является и тот факт, что колбасы не нуждаются в предварительной кулинарной обработке перед употреблением [37].

Рынок колбасных изделий - один из самых быстрооборачиваемых в российской пищевой промышленности [79].

На протяжении последних лет объем промышленного производства колбасных изделий в Российской Федерации стабильно превышает 23002500 тысяч тонн в год [90].

Ассортимент продуктов переработки мяса за последние 10 лет существенно расширился: наряду с традиционными видами колбас выпускается большое количество изделий по новым оригинальным технологиям с использованием нетрадиционного сырья.

Для поддержания конкурентоспособности производители колбасных изделий прибегают к расширению линейки выпускаемой продукции, что проявляется в расширении ассортимента сетевых магазинов за счет таких позиций, как колбасные нарезки и различные мясные деликатесы [78].

Мясоперерабатывающая промышленность выпускает свыше тысячи торговых наименований колбасных изделий, относящихся к категории эмульгированных продуктов, к которой относят гомогенные, гетерогенные, грубоизмельченные и крупноизмельченные изделия [65].

Анализ распределения объемов производства копченых колбас по ассортиментным группам указывает на то, что преобладающую долю занимает производство полукопченых колбас, составляющее 55,8 % от общего объема. В то же время производство сырокопченых колбас занимает 9,42 % от общего объема продукции [92].

В последние годы наблюдается значительное увеличение числа предприятий, как отечественных, так и иностранных, стремящихся занять определенные позиции на рынке производства мясных деликатесов. Данная тенденция приобретает все более выраженные черты [107].

Согласно статистическим данным, в секторе экономики, связанном с производством колбасных изделий, зарегистрировано свыше пяти тысяч предприятий различного масштаба. При этом треть из зарегистрированных организаций функционирует в данной сфере менее пяти лет, что обусловлено устойчивым ростом спроса и свидетельствует о привлекательности рынка для новых производителей [48]. Это также говорит о постоянном росте объемов производства, вызванном стабильно повышающимся спросом на колбасные изделия [110].

По данным на 2024 г., российский рынок колбасных изделий практически полностью обеспечивается продукцией отечественного производства [34].

Таким образом, повышение качества и конкурентоспособности продукции мясоперерабатывающего подкомплекса АПК необходимо не только для достижения определенных экономических целей и укрепления позиций на внутреннем и международном рынках, но и для социальной стабильности и обеспечения здоровья населения страны [11, 98].

Качество продукции, включающее безопасность и вкусовые характеристики, является одним из основных критериев оценки конкурентоспособности продуктов питания, определяемых исходя из потребительских предпочтений [50].

В рамках государственной политики Российской Федерации в области питания, первостепенное значение уделяется обеспечению гигиенической безопасности пищевых продуктов, являющейся основным условием санитарно-эпидемиологического благополучия населения [84].

1.2. Критерии оценки качества и виды порчи колбасных изделий

Несмотря на значимость мясной продукции для пищевой индустрии, ее изготовление представляет собой сложный и ресурсоемкий процесс [60].

Колбасные изделия характеризуются высокой стоимостью в сравнении с другими категориями продовольственных товаров, что обусловлено как длительным процессом выращивания и откорма животных, так и сложностью последующих этапов производства [21, 30].

Ассортимент колбасных изделий отличается разнообразием, которое является следствием вариаций в сырьевой базе, рецептурных решениях, технологических режимах и методах обработки и проявляется в разнообразии органолептических и структурных характеристик готовой продукции. При этом в большинстве случаев основное значение имеют свойства сырья [88, 112].

Колбасные изделия представляют собой пищевые продукты, получаемые путем измельчения мясного сырья до состояния фарша, последующего формования в оболочку различного типа (натуральную, искусственную или без оболочки) и термической обработки до достижения потребительской готовности [35].

В состав мясной продукции, кроме животных белка и жира, входят и другие компоненты животного и растительного происхождения. Некоторые из них, такие как яйца (или меланж), молоко цельное и обезжиренное, казеин и казеинаты, добавляют в фарш для повышения эмульгирующей (жиро- и влагосвязывающей) способности. Белки, дополнительно внесенные в мясную систему, оказывают положительное стабилизирующее воздействие. Лактоза, пряности и ряд других компонентов придают продукту его уникальные вкусовые качества, но и создают идеальные условия для размножения патогенной микрофлоры [62, 66].

Сложные и многокомпонентные составы мясной продукции создают благоприятные условия для развития широкого спектра патогенных организмов.

Выявление, а также определение количества и качественного состава которых является задачей служб государственного и санитарного надзора [100].

По характеру механической обработки колбасные изделия подразделяют на фаршевые и крупнокусковые.

Классификация продукции охватывает несколько ключевых категорий, в числе которых: вареные колбасы, полукопченые и копченые изделия, фаршированные колбасы, наполненные разнообразными начинками, кровяные колбасы, изготовленные на основе животной крови, сосиски, сардельки, мясные хлебы, зельцы, студни, ливерные колбасы и паштеты. Важное место занимают диетические и лечебные колбасы, производимые с учетом специфических требований к питанию и содержащие обогащенные витамины или минералы, и отличающиеся сниженным количеством жира или соли [40].

К категории полукопченых колбасных изделий относят те, что прошли стадии обжарки/подсушки, варки и копчения, а также, если это предусмотрено рецептурой, сушки.

Производство сырокопченой колбасы включает в себя осадку и/или ферментацию (с применением или без применения стартовых культур), последующее холодное копчение и длительную сушку.

Технологический процесс производства полукопчёных и сырокопчёных колбас регламентирует сроки хранения, начиная с замороженного мясного сырья. В частности, срок хранения замороженной свинины не должен превышать 3 месяцев для сырокопчёных и 6 месяцев для полукопчёных колбас.

Это связано с тем, что при более продолжительном хранении начинаются окислительные изменения в жирах. Для производства многих колбас не разрешается использовать повторно замороженное мясо [41, 86].

Даже при условии использования доброкачественного по всем кондициям сырья, производство каждого из видов колбасных изделий - сложный и многоэтапный процесс, включающий в себя целый ряд различных технологических операций, которые базируются на применении разнообразных

физических, химических и биотехнологических методов, а также на использовании тепловых и других видов воздействия на исходное сырье.

Многократная обработка сырья и соблюдение всех санитарно-гигиенических норм и требований к производственному процессу не гарантирует снижения микробиологической активности и уменьшения скорости окисления, оказывающих значительное влияние на качество мясных продуктов в период их производства и при последующем хранении. Эти процессы могут стать решающими в вопросе определения сроков годности колбасных изделий, поскольку они напрямую влияют на безопасность и качество конечного продукта [59, 61].

Срок хранения полукопчёных колбас в подвешенном виде составляет максимум 7 суток с даты производства при температуре не выше 12 °С и относительной влажности воздуха 75-78 %.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Корниенко Ирина Игоревна, 2026 год

Щ(вО ят| -

!

В

CJ <с к

*

->--- мм

0.25 0.5 075 1 1.25 1.5 1. 5 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25 3.5 3.75 4 4.25 4.5 4.75 5.25 5.6 5.75 6 6.25 6.5 6.75 7 7.25 7.5 7.75 1 1.25 1.5 1.75 9 9.25 9.5 9.75 10 10.25 10.5 10.75 11 1125 11J 11.75 12 Вреия у^ержы за>н1лл [мин]

Рисунок 2.1. - Хроматограмма раствора натамицина, подвижная фаза: ацетатный буфер ^^2), метанол 60:40

Указанный эффект не наблюдался при использовании подвижных фаз с более высоким значением pH.

В ходе эксперимента установлена целесообразность применения бинарной системы фаз, включающей деионизированную воду (фаза А) и ацетонитрил (фаза В). Такой подход позволяет упростить методику анализа, сохраняя приемлемые характеристики разделения и стабильное время удерживания.

Оптимальный градиент элюирования подбирался таким образом, чтобы пик анализируемого вещества был полностью изолирован от других пиков на хроматограмме.

На начальном этапе методики использовался градиент, указанный в Таблице 2.3.

Другие хроматографические параметры: скорость потока - 1,0 мл/мин; оптимальная температура колонки - 30 °С; объем вводимой пробы - 20 мкл.

Таблица 2.3. - Градиент, подобранный для анализа чистых растворов натамицина

Время, мин Концентрация А, % Концентрация В, %

0 95 5

7,0 5 95

10,0 5 95

10,1 95 5

15,0 95 5

При использовании установленных параметров на хроматограмме (Рисунок 2.2) пик натамицина наблюдался при времени удерживания 6,29 минутам.

■ |>300|1МВЩ51д=304.4 1^=360.1 О|1002021-12-21 10-51-43403-00Л

5 3 5

□

н

1

5 0 I V

У

--—л-

0.25 0.5 0.75 1 1.25 1 5 1.76 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25 3.5 3.75 4 4.25 4.5 4.75 5 5.25 5.5 5.75 5 6.25 6.5 6.75 7 7.25 7.5 7.75 Время удерживания [мин] 8.25 8.5 8.75 9.25 9.5 9.75 10 10.25 10.5 10.75 1 11.25 11.5 11.75 12

Рисунок 2.2. - Хроматограмма раствора стандартного образца натамицина с градиентом, указанным в таблице 2.2.

В процессе пробоподготовки сырокопченой колбасы отмечено, что матричный пик (Рисунок 2.3) элюирует близко ко времени выхода целевого компонента.

V

и (0

N □

Ф ГО £ ° Я N N 10 4 А ю

V в V т 2 Й К о> ^ М о о

J _— —С_____~ ~ I л . Л? V и V У? __^

0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1./5 2 2.25 2.5 2.Т5 3 3.25 3.5 3.75 4 4.25 4.5 4.75 5 5.25 5.5 5.75 6 6.25 5.5 5.75 7 7.25 7.5 7.75 1 1.25 1.5 1.75 9 9.25 9.5 9.75 10 10.25 1 0.5 10.75 11 11.25 1« 11.75 12

Бремя * дерм ант [мин

Рисунок 2.3. - Хроматограмма экстракта пробы сырокопченой колбасы

После серии экспериментов градиент был изменен на представленный в Таблице 2.4.

При данном градиенте матричные и другие посторонние пики не накладываются на пик натамицина.

Таблица 2.4. - Скорректированный градиент для методики определения натамицина в мясных продуктах методом ВЭЖХ

Время, мин Концентрация A, % Концентрация B, %

0 95 5

10 50 50

12 95 5

15 95 5

На Рисунке 2.4 представлена хроматограмма экстракта сырокопченой колбасы с добавлением натамицина, на Рисунке 2.5 - хроматограмма экстракта пробы без добавления натамицина при градиенте, указанном в Таблице 2.4.

0ко1Ьа5110А01 В,Эд=304,4 [№3601001 ко1Ьа5 1 2021-12-2114-02-19+03-(М

ак@8.546мп|

в ш

гт О « й й 3 ¡5.

А Ь. V 1 со V V V

0.25 0.5 0.75 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25 3.5 3.75 4 4.25 4.5 4.75 5 5.25 5.5 5.75 6 6.25 6.5 6.75 7.25 7.5 7.75 8 8.25 8.5 8.75 9 9.25 9.5 9.75 10 10.25 10.5 10.75 1 11 25 11.5 11.75 12

Рисунок 2.4. - Хроматограмма экстракта пробы колбасы с добавлением натамицина

V реак@8.546т|

□

V

1

п ---

7 :

ш 1 и 1 «5 Ю ® тг 1 : й

ь V л 1 1 пг ; 7

) А К-

0.25 0.5 0.75 1 1.25 1.5 1.75 2 2.25 2.5 2.75 3 3.25 3.5 3.75 4.25 4.5 4.75 5 5.25 5.5 5.75 6 6.25 6.5 6.75 7.25 7.5 7.75 8.25 8.5 8.75 9 9.25 9.5 9.75 10 10.25 10.5 10.75 1 11.25 11.5 11.75 12

Рисунок 2.5. - Хроматограмма экстракта пробы колбасы без добавления натамицина

Проект методики в части анализа содержания натамицина в мясных продуктах методом ВЭЖХ-ДМД, содержит результаты проведенного исследования, в частности, параметры хроматографического определения.

2.3.2. Подбор условий хроматографического разделения и детектирования для ВЭЖХ метода с масс-спектрометрическим детектором

Для методики определения натамицина хромато-масс-спектрометрическим методом были подобраны параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования.

Настройки масс-спектрометрического детектирования устанавливали в соответствии с получением наиболее интенсивных сигналов характеристических ионов.

Идентификация и количественное определение пиков осуществлялись посредством многократной регистрации реакций (MRM) с использованием положительного режима ионизации.

В спектре дочерних ионов натамицина выделяются три иона с самой высокой интенсивностью. Их характеристики и параметры автоматической оптимизации для соответствующих переходов указаны в Таблице 2.5.

Таблица 2.5. - Оптимальные параметры масс-спектрометрического определения натамицина

Аналит Молекулярный ион, т/г Дочерние ионы, т/г Ите 01 Рге ЫаБ* СОШБЮП Бпег§у* 03 Рге ЫаБ*

Натамицин 666,4 485,3 10,0 -32,0 -16,0 -16,0

467,1 10,0 -20,0 -17,0 -16,0

503,2 10,0 -20,0 -14,0 -36,0

* знак «-» обусловлен особенностями масс-спектрометра.

В дополнение к параметрам, указанным в Таблице 2.5, были заданы следующие настройки масс-спектрометра: расход газа небулайзера - 3 л/мин; расход газа-осушителя - 10 л/мин; расход нагревающего газа - 10 л/мин; температура интерфейса - 350 °С; температура DL - 150 °С; температура нагревателя - 300 °С; давление газа в ячейке соударений CID - 210 кПа; режим ионизации - ESI.

В качестве неподвижной фазы для хроматографического выделения натамицина была использована колонка Thermo Scientific Acclaim 120 C18 длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм и диаметром зерна сорбента 3,0 мкм.

Для метода ВЭЖХ-МС/МС были использованы следующие подвижные фазы: фаза А - 0,5 %-ный раствор муравьиной кислоты в воде; фаза B - смесь метанола, ацетонитрила и муравьиной кислоты в соотношении 49,75/49,75/0,5. При этом муравьиная кислота была добавлена в фазу для усиления положительной ионизации. Для установленной хроматографической системы был подобран градиент, представленный в Таблице 2.6.

Таблица 2.6. - Градиент для определения натамицина в мясных продуктах методом ВЭЖХ-МС/МС

Время, мин Концентрация A, % Концентрация B, %

0 95 5

3,0 5 95

4,0 5 95

4,1 95 5

5,0 95 5

Кроме того, были заданы и другие параметры хроматографирования:

-5

температура колонки - 40 °С; скорость потока подвижной фазы - 400 мм /мин;

-5

объем вводимой пробы - 2 мм .

При анализе проб сырокопченых и полукопченых колбас мешающих влияний матричных пиков не установлено. Хроматограмма экстракта пробы колбасы с добавкой натамицина представлена на Рисунке 2.6.

Рисунок 2.6. - Хроматограмма экстракта пробы колбасы с добавкой натамицина

2.4. Подбор оптимального метода пробоподготовки

Подготовка проб поверхности колбас

При помощи ломтерезки со всех колбас слоями толщиной не более 5 мм снимают внешнюю часть, из которой вырезают прямоугольные образцы

л

площадью около 1 дм . Определяют площадь поверхности проб в квадратных дециметрах и массу в граммах. Взвешенные и измеренные куски проб измельчают до однородности, полученную массу тщательно перемешивают.

После проведения пробоподготовки инструменты, вступавшие в контакт с образцами для испытания, очищают горячей водой, обрабатывают метанолом и тщательно высушивают.

Подготовка проб внутренней части колбас

Внутреннее содержимое колбасы, освобожденное от оболочки, подвергается гомогенизации аналогично образцам из внешней части.

По завершении подготовки каждой анализируемой пробы все инструменты, контактировавшие с образцами, последовательно очищаются горячей водой, обрабатываются метанолом, после чего тщательно просушиваются струей сжатого воздуха.

Определение способа пробоподготовки

На основании анализа научной литературы, характеристик натамицина и особенностей исследуемых образцов были подобраны методики подготовки проб, включающие экстракцию и последующую очистку полученных экстрактов, проводимую с целью удаления из образцов жира и других компонентов, способных исказить результаты хроматографического анализа или повредить оборудование.

Способ 1:

Пробу массой 1,0 г смешивают с 7,5 см метанола. Полученную смесь подвергают встряхиванию на шейкере в течение 5 минут. Затем добавляют 2,5 см воды и продолжают перемешивание на шейкере в течение 10 минут. Образцы помещают в морозильную камеру на 1 час при минус 18 °С ± 2 °С.

По завершении этапа замораживания, смесь подвергается центрифугированию в течение десяти минут при скорости 4000 оборотов в минуту и температуре 4 °С. Данная процедура направлена на эффективное разделение компонентов смеси, в результате чего образуется твердая фаза. После центрифугирования, полученная жидкая фаза аккуратно переносится в чистую пробирку. Затем она подвергается фильтрации с использованием нейлонового фильтра с размером пор 0,22 микрометра, что обеспечивает удаление мельчайших частиц. Отфильтрованная жидкость собирается в виалу и далее подается в хроматографическую систему для анализа.

Способ 2:

Пробу массой 1,0 г смешивают с 7,5 мл ацетонитрила. Полученную смесь

-5

подвергают встряхиванию на шейкере в течение 5 минут. Затем добавляют 2,5 см воды и продолжают перемешивание на шейкере в течение 10 минут. Образцы помещают в морозильную камеру на 1 час при минус 18 °С ± 2 °С. По завершении этапа замораживания, смесь подвергается центрифугированию в течение десяти минут при скорости 4000 оборотов в минуту и температуре 4 °С. После центрифугирования, полученная жидкая фаза аккуратно переносится в чистую пробирку. Затем она подвергается фильтрации с использованием нейлонового фильтра с размером пор 0,22 микрометра. Отфильтрованная жидкость собирается в виалу и далее подается в хроматографическую систему для анализа.

Способ 3:

-5

В центрифужную пробирку вместимостью 50 см отбирают навеску

-5

измельченного образца 1,00 ± 0,05 г, добавляют 10 см деионизированной воды и перемешивают до однородной массы. К полученной смеси добавляют 10 мл ацетонитрила, герметично закрывают и подвергают образец интенсивному перемешиванию на вибрационном шейкере в течение 5 минут. Затем в пробирку вносят содержимое пакета набора для экстракции или аналогичную ему смесь солей (1,0 ± 0,5 % г хлорида натрия (х.ч.), 1,0 ± 0,5 % г натрия лимоннокислого тризамещенного двойного гидрата (ч.д.а.), 0,5 ± 1,5 % г натрия лимоннокислого двузамещенного полуторного гидрата (ч.д.а.)). Пробирку помещают в шейкер на 10 минут, после чего центрифугируют при 4 °С в течение 10 минут с частотой вращения 4000 об/мин. После завершения центрифугирования образец подвергается замораживанию при температуре минус 18 °С ± 2 °С в течение 1 часа.

По истечении заданного времени, 8 см3 верхнего слоя жидкости помещают в пробирку объемом 15 см3. В пробирке уже находятся 900 ± 0,5 % мг безводного сульфата магния (ч.д.а.) и 150 ± 0,8 % мг сорбента БопёевИ-РБЛ, которые служат для очистки экстракта. Пробирку помещают на шейкер на 10 минут, затем

центрифугируют при 4 °С в течение 10 минут с частотой вращения 4000 об/мин. После центрифугирования отбирают жидкость объемом 1 мл, упаривают до нескольких капель и доводят водой до 1 мл. Полученный экстракт фильтруют через шприцевой фильтр в виалу и используют для хроматографического анализа.

Для каждого способа пробоподготовки была рассчитана степень извлечения методами ВЭЖХ и ВЭЖХ-МС/МС по формуле 2.2:

КСЭ = (2.2)

Ьо

где ЯСЭ - степень извлечения; Бх - площадь пика аналита при добавлении в пробу до пробоподготовки; Б0 - площадь пика аналита при добавлении в пробу после пробоподготовки.

Для оценки степени извлечения натамицина каждый метод пробоподготовки был протестирован в 10 повторностях. Полученные экстракты были проанализированы с использованием двух методов жидкостной хроматографии: ВЭЖХ-ДМД и ВЭЖХ-МС/МС.

Работа по набору экспериментальных данных проводилась в Московской испытательной лаборатории ФГБУ ЦНМВЛ в условиях внутрилабораторной прецизионности.

В лаборатории имелись все необходимые средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, предусмотренные документом на методику измерений. Испытания проводились с соблюдением условий, предусмотренных методикой измерений.

Сроки проведения валидации: 18 октября 2021 г. - 22 октября 2021 г.

Валидационные испытания проводились согласно созданной методике определения концентрации натамицина в мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии для установления границ повторяемости, внутрилабораторной прецизионности и оценки неопределенности при количественном определении натамицина в мясных изделиях.

Разработка и аттестация методик измерений осуществлялась в несколько этапов:

1) Подготовка плана экспериментальных исследований по определению метрологических характеристик методики измерений;

2) Формализация результатов исследований;

3) Разработка проекта методики измерений «Методика определения концентрации натамицина в мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии»;

4) Рассмотрение проекта методики измерений с целью проверки её соответствия требованиям ГОСТ Р 8.563;

5) Аттестация методик измерений.

Валидация и расчет метрологических характеристик осуществлялись на основании следующих нормативных документов:

ГОСТ Р 8.563-2009. Государственная система обеспечения единства измерений. Методики (методы) измерений.

ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения.

ГОСТ Р ИСО 5725-3-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 3. Промежуточные показатели прецизионности стандартного метода измерений.

ГОСТ Р ИСО 5725-4-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 4. Основные методы определения правильности стандартного метода измерений.

ГОСТ Р ИСО 5725-5-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 5. Альтернативные методы определения прецизионности стандартного метода измерений.

ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002. Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике.

ГОСТ Р ИСО 21748-2012. Статистические методы. Руководство по использованию оценок повторяемости, воспроизводимости и правильности при оценке неопределенности измерений.

ГОСТ 12.1.005-88. Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны.

ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности.

ГОСТ 12.1.018-93. Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования.

ГОСТ Р 12.1.019-2009. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты.

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80). Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия.

ГОСТ 6995-77. Реактивы. Метанол-яд. Технические условия.

ГОСТ 9792-73. Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ OIML R 76-1-2011. Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания.

ПМГ 96-2009. Государственная система обеспечения единства измерений. Результаты и характеристики качества измерений. Формы представления.

РМГ 29-2013. Государственная система обеспечения единства измерений. Метрология. Основные термины и определения.

РМГ 61-2010. Государственная система обеспечения единства измерений. Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа. Методы оценки.

РМГ 76-2014. Государственная система обеспечения единства измерений. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа.

Для проведения валидационных испытаний был использован жидкостный хроматограф Agilent 1100 с диодно-матричным детектором с ОСКО выходного сигнала и времени удерживания не более 2 % и 0,3 % соответственно. Разделение методом ВЭЖХ проводили на хроматографических колонках Poroshell 120 EC-C18 (4,6x100 мм) и Agelent Hipersil AA-ODS 5,0 мкм (2,1x200 мм).

Для хроматографического анализа также был задействован высокочувствительный жидкостный хромато-масс-спектрометр Shimadzu Shimadzu LCMS 8060 ГРСИ 64401-16 с хроматографической колонкой Acclaim 120 C18 (2,1x150 мм).

Навески отбирали с помощью аналитических весов Sartorius BP 110S специального класса точности с пределом взвешивания 0,1 мг. Для получения воды реагентного качества была использована система высокой очистки воды I типа Millipore, обрабатывающая до 2 л/мин. Для центрифугирования образцов применяли центрифугу с охлаждением Thermo Fisher Scientific SL 40R. Экстракцию проб проводили с помощью шейкера для пробирок Multi Reax II.

Для ввода точного объема проб при проведении исследования в ручном режиме использовались механические одноканальные дозаторы BIOHIT Proline Plus с варьируемыми объемами 10-100 мкл, 20-200 мкл, 100-1000 мкл, 1000-10000 мкл.

Для проведения работ использовались: мембранные микрофильтры (0,200,45 мкм, спиртоустойчивые), стеклянные виалы (2 см3, с завинчивающимися крышками и тефлоновыми прокладками), мерные колбы (2-10-2 по ГОСТ 1770), полипропиленовые пробирки (50 см3, с завинчивающимися крышками) и одноразовые шприцы (2 см3).

Для хранения проб, реактивов и стандартных образцов применяли лабораторную морозильную камеру с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от минус 18 °С до минус 24 °С и бытовой холодильник с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0 °С до 8 °С.

Для проведения валидации были использованы деионизированная вода и реактивы квалификации «х.ч.»: метанол (ГОСТ 6995), ацетонитрил (ТУ 6-094326), муравьиная кислота (ГОСТ 5848).

Работа проводилась на стандартных образцах натамицина с чистотой 95 % (ВЭЖХ) производства компании Sigma-Aldrich PHR1703.

Матрицей послужили колбасы сырокопченые и полукопченые.

Валидация включала два этапа: предварительно проводилась оценка специфичности методики путем исследования 30 холостых проб колбасы, после чего устанавливали пределы количественного определения, повторяемости и внутрилабораторной прецизионности с помощью метода добавок.

Для этого было проведено исследование 30 проб колбасы с внесением на уровне ЬОО (0,5 мг/кг), 30 проб колбасы с внесением на уровне 2 ЬОО (1,0 мг/кг) и 30 проб с внесением на уровне верхней границы определения методики

Л

(150 мг/кг), а также 30 проб с внесением на уровне ПДК (1 мг/дм2), / ПДК

2 2 (0,5 мг/ дм ) и 2 ПДК (2 мг/ дм ) для кожуры колбасы.

Подготовка образцов с внесением. Образец колбасы, предварительно проверенный на отсутствие натамицина, был подготовлен в соответствии с установленной методикой. После гомогенизации были отобраны навески необходимой массы, в которые внесли рассчитанное количество стандартного раствора натамицина в метаноле.

Расчет объема внесения проводили по формуле 2.3:

= ^ (2.3)

где Уд - объем добавляемого стандарта; Сд - желаемая концентрация определяемого вещества в пробе; щ, - масса навески исследуемого образца; Сс -концентрация используемого стандарта.

Рассчитанные количества натамицина были добавлены в пробы, после чего они подверглись перемешиванию на шейкере в течение 15 минут. Дальнейшая пробоподготовка и анализ осуществлялись согласно утвержденной методике.

Оценка метрологических характеристик методик измерений осуществлялась в соответствии с требованиями ГОСТ Р ИСО 5725-2002 (часть 2) и РМГ 61-2010, с применением расчетных формул из Таблицы 2.7.

Таблица 2.7. - Расчет метрологических характеристик методики измерений

Характеристика Способ расчета Формула расчета Критерий оценки

Среднее арифметическое значение параллельных определений Сумму результатов пареллельных измерений делят на количество параллельных измерений —

Дисперсия параллельных определений Сумму квадратов отклонений результатов параллельных измерений от среднего значения делят на п - 1; п - число параллельных определений —

Критерий Кохрена Максимальное значение дисперсии делят на сумму дисперсий Значение не должно превышать Отабл для числа степеней свободы V = п - 1, соответствующего максимальной дисперсии, и f = Ь, соответствующего числу суммируемых дисперсий, и принятой доверительной вероятности Р = 0,95

Если От(тах) > 0Табл, то соответствующее таХ Из дальнейших расчетов исключают и процедуру повторяют для следующего по значению и т. д. до тех пор, пока От(таХ) не станет меньше либо равно Отабл

Стандартная неопределенно сть в условиях повторяемости Вычисляют корень из суммы дисперсий, деленной на количество измерений —

Стандартная неопределенность Вычисляют корень из суммы квадрата стандартной неопределенности по типу А и В в относительных величинах и° = л/ил + ии —

Расширенная неопределенность Умножают суммарную стандартную неопределенность на 2 ~ у/иСО "1" "дозаторов + "весов + —

Среднее арифметическое значение результатов анализа Сумму результатов измерений делят на количество измерений —

Показатель внутрилабора- торной прецизионности методики анализа в виде выборочного СКО - SR Вычисляют корень из суммы квадрата стандартного отклонения средних результатов в условиях прецизионности и квадрата стандартного отклонения единичных результатов в условиях повторяемости, умноженного на (1/П - Ш), где п - количество параллельных определений по методике, а N - число результатов единичного анализа (параллельных определений), полученных при проведении эксперимента -

Оцененное смещение Вычисляют разность общего среднего и аттестованного значения б = Хт _ С,п -

Критерий Граббса

Вычисляют разность максимального значения средних арифметических параллельных определений и общего среднего, деленных на стандартную неопределенность в условиях промежуточной прецизионно сти. Вычисляют разность общего среднего и минимального значения средних арифметических параллельных определений, деленных на стандартную неопределенность в условиях промежуточной прецизионности

Значение не должно превышать GRтабл для числа степеней свободы

f = и

соответствующего числу результатов анализа, и принятой доверительной вероятности Р = 0,95.

Если GR„

> GRT

или/и GRm,min > GRтабл, то соответствующие

результаты ^т>тах или/и

ляп из дальнейших расчетов исключают. Процедуру проверки на наличие выбросов продолжают до тех пор, пока не будут выполнены условия:

GRm,max < GRтабл

или/и

GRm,min < GRтабл.

Предел

промежуточной прецизионности

Отно сительную стандартную неопределенность в условиях промежуточной прецизионности умножают на коэффициент

0(Р, п),

зависящий от числа

параллельных измерений

п,= (КР.п)- « Яотн

Критерий Стьюдента

Рассчитывают частное от деления модуля смещения на корень из суммы квадрата стандартной неопределенности в условиях промежуточной прецизионности, деленного на число

результатов

анализа и

квадрата

погрешности

аттестованного

значения,

деленного на 3

^ сравнивают с ^эд при числе степеней свободы f = Ь - 1 для доверительной вероятности Р = 0,95. Если ^ < ^аблф, то оцененное смещение незначимо на фоне случайного разброса, в этом случае его принимают равной

нулю (6 = 0). Если ^ > 1табл(£), то оцененное смещение значимо на фоне случайного разброса, и может быть принято решение о введении в результаты анализа, получаемые при реализации данной методики в

лаборатории, поправки

назначение ^ ,

то есть значение & , соответствующее содержанию С, вычитают из любого результата анализа, полученного согласно проверяемой методике

Предел

повторяемости

Отно сительную стандартную неопределенность в условиях повторяемости умножают на коэффициент 0(Р,п), зависящий от числа параллельных измерений

гл = (}(Р,п)$

2

г отн

Стандартная неопределенность по типу А

Стандартная неопределенность по типу В

Корень из суммы

квадратов

неопределенност

ей влияющих

факторов с

учетом

выбранного

распределения

(прямоугольного

- неопределенность фактора делится на

или треугольного

- неопределенность фактора делится на

л/6

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В настоящем разделе диссертации изложены актуализированные и дополненные данные, полученные в ходе исследований, результаты которых ранее были опубликованы в научных изданиях, входящих в перечень Высшей аттестационной комиссии Российской Федерации:

1. Дельцов, А. А. Определение способа пробоподготовки для извлечения натамицина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / А. А. Дельцов, И. И. Корниенко, С. А. Альферович // Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии, биотехнологии и экспертизы сырья и продуктов животного происхождения: Сборник трудов 4-й Научно-практической конференции, Москва, 16 мая 2025 года. - Москва: Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА им. К. И. Скрябина, 2025. - С. 254-255.

2. Дельцов, А. А. Контроль содержания натамицина в пищевых продуктах на территории России / А. А. Дельцов, И. И. Попова // Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии, биотехнологии и экспертизы сырья и продуктов животного происхождения : Сборник трудов научно-практической конференции (Москва, 2022) / Под общей редакцией С. В. Позябина, Л. А. Гнездиловой. - Москва : Сельскохозяйственные технологии, 2022. -С. 257-258.

3. Попова, И. И. Контроль содержания натамицина в пищевых продуктах : доклад, тезисы доклада / И. И. Попова, А. И. Грудев, Е. Г. Шубина, А. Л. Баиров ; Сборник статей по материалам докладов ученых РГАУ -МСХА имени К. А. Тимирязева, других вузов и научно-исследовательских учреждений на Международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, посвященной 155-летию РГАУ - МСХА имени К. А. Тимирязева. Выпуск 293, Ч. 1. - Москва : Издательство РГАУ-МСХА, 2021. - С. 616-619.

4. Попова, И. И. Методика определения концентрации натамицина в мясных продуктах методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-

пектрометрическим детектированием / И. И. Попова, А. А. Дельцов, Е. Г. Шубина, А. Л. Баиров, А. И. Груднев // Ветеринария, зоотехния и биотехнология, 2023. - № 3. - С. 95-102.

5. Попова, И. И. Методы определения антибактериальных препаратов в пищевых продуктах / И. И. Попова, А. А. Дельцов, А. И. Грудев, Е. Г. Шубина // Ветеринария, зоотехния и биотехнология, 2023. - № 6. - С. 56-62.

Результаты эксперимента по расчету степени извлечения натамицина при различных вариантах пробоподготовки представлены в Таблице 3.1.

Таблица 3.1. - Результаты эксперимента по расчету степени извлечения натамицина при различных вариантах пробоподготовки

№ способа пробоподготовки № эксперимента Степень извлечения метода ВЭЖХ Степень извлечения метода ВЭЖХ-МС/МС

1 90,1 92,0

2 93,6 90,9

3 90,3 92,3

4 94,2 93,2

1 5 91,5 91,0

6 94,4 91,7

7 90,4 92,6

8 92,4 92,0

9 92,7 93,7

10 92,0 91,4

1 46,6 50,3

2 48,1 47,4

3 47,4 48,7

2 4 46,7 49,3

5 47,1 48,3

6 48,6 50,2

7 47,1 50,0

8 47,4 48,6

9 48,9 49,4

10 48,6 47,2

1 77,2 80,4

2 77,5 78,4

3 77,9 79,2

4 79,2 77,5

3 5 77,1 77,3

6 77,9 78,5

7 78,4 79,6

8 78,7 79,7

9 78,9 78,2

10 79,8 78,0

Средние величины степеней извлечения наглядно представлены на Рисунке 3.1.

100, 75, 50, 25, 0,

Способ 1 Способ 2 Способ 3

Рисунок 3.1. - Степени извлечения натамицина из проб сырокопченых и полукопченых колбас, полученные при использовании различных способов пробоподготовки

Первый метод пробоподготовки обеспечивает наибольшую степень извлечения исследуемого соединения, что свидетельствует о том, что экстракция метанолом с последующей очисткой вымораживанием является оптимальным способом подготовки образца для извлечения натамицина.

Для повышения точности результатов и нивелирования влияния степени извлечения рекомендуется применение матричной градуировки в каждой аналитической серии.

Результаты работы, описанные в данном разделе, опубликованы в сборнике трудов 4-й Научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии, биотехнологии и экспертизы сырья и продуктов животного происхождения» Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА им. К. И. Скрябина:

Дельцов, А. А. Определение способа пробоподготовки для извлечения натамицина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии / А. А. Дельцов, И. И. Корниенко, С. А. Альферович // Москва : Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии - МВА им. К. И. Скрябина, 2025. - С. 254-255.

Ввиду использования матричной градуировки, программным обеспечением жидкостного хроматографа и жидкостного масс-спектрометра выдаются результаты с размерностью мг/кг.

Для анализа внутренних частей колбасы эта размерность и значения сохраняются как окончательный результат единичного измерения. Для поверхности колбасы результат пересчитывается для получения размерности мг/дм по формуле 3.1:

= , (3.1)

где тА,п -масса натамицина на единицу площади поверхности; W - массовая доля натамицина в пробе, мг/кг; т - масса взвешенного куска поверхности пробы, кг; А - площадь взвешенного куска пробы для испытания, дм2.

Результаты измерений представлены в Таблицах 3.2-3.4.

Таблица 3.2. - Результаты определения натамицина в пробах внутренней части колбас методом ВЭЖХ

Дата Исполнитель Матрица Массовая концентрация добавки, мг/кг Определенная концентрация, мг/дм2

1,005

1,000

1,0 1,024

18.10.2021 Исполнитель 1 Колбаса (внутренняя часть) 0,988

1,003

1,034

2,0 1,998

2,006

2,008

2,0 2,014

1,990

2,040

19,960

19,800

20,0 20,240

19,800

20,200

20,560

0,984

0,986

1,0 0,995

0,967

0,973

1,006

1,950

19.10.2021 Исполнитель 2 Колбаса (внутренняя часть) 1,964

2,0 1,966

1,974

1,944

1,944

19,780

20,0 19,540

19,840

19,460

20,0

19,180

19,800

20.10.2021

Исполнитель 3

Колбаса (внутренняя часть)

1,0

2,0

20,0

1,003

0,997

1,011

1,012

1,010

1,020

2,022

2,008

2,024

2,038

2,032

2,038

20,240

20,120

20,280

20,320

20,360

20,340

21.10.2021

Исполнитель 1

Колбаса (внутренняя часть)

1,0

0,974

0,977

0,984

0,998

0,966

1,004

1,992

2,002

2,0 2,038

2,026