Особенности диминуции хроматина у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus (Crustacea, Copepoda) тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Гришанин, Андрей Константинович

• Гришанин, Андрей Константинович
• кандидат биологических наук
• 1996

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гришанин, Андрей Константинович

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.Диминуция хроматина у простейших (Protozoa).

2.Диминуция хроматина у нематод (Nematodes).

3.Диминуция хроматина у копепод (Copepoda)

4. Диминуция хроматина у двукрылых насекомых (Diptera),. „.

5. Диминуция хроматина у позвоночных (Vertebrata).

6. Диминуция хроматина у растений (Plantae),.;.

7.Биологическая роль диминуции хроматина

МАТЕРИАЛЫ I МЕТОДЫ,. .ЗА

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1,Феноменологические особенности процесса диминуции хроматина у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus.

2,Содержание ДНК в клетках Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus

3,Структура интерфазных ядер,гранул элиминируемого хроматина и хромосом в процессе диминуции хроматина у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus ,.,,.,,.,.,,.=.,,,,.,,,

ПРРУЖТТСЩТР v'P q д kr 7|intipuT/fjr q q

RUpnTTU 1ПП

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности диминуции хроматина у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus (Crustacea, Copepoda)»

К настоящему времени ДХ известна у немногих видов зу-кариот (Райков,1992; Веепшпп, 1977; Airoermann,1985; Tobier,1986; PimpineIIi,Soday,1989; Tobler et al-,1992)поэтому особую актуальность приобретают исследования тех ооъекtoe,в частности представителей рода Cyclops,-/ которых ДХ затрагивает значительную,в • идеале максимальную долю генома, соматических клеток. Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы было изучение процесса ДХ у двух представителей рода Cyclops - Cyclops kolensis Lili и подвида Cyclops strenuus strenuus Fischer, отличного по картине ДХ от того,который описала Верман (Beermann,1977). Были поставлены следующие задачи:

1.Провести с помощью цитофотометрии фелыеновокой реакции сравнение содержания ДНК в клетках обоих видов циклопов до и после ДХ,

2.Исследовать цитологически с помощью светового и электронного микроскопа процесс ДХ у С,kolensis,обращая особое внимание на изменение структуры хромосом,

3.Изучить с помощью электронной микроскопии структуру гранул элиминируемого хроматина у С.kolensis,

Научная новизна.

Впервые обнаружен вид эукариот - С,kolensis,у которого после рекордной потери генетического материала - более 90% -в соматических клетках полностью сохраняется число и типичная структура митотических хромосом, Этот факт указывает на то,что у С,kolensis более 90% хромосомной ДНК не связана как с кодирующими,так и с регуляторными функциями необходимыми для дифференцировки соматических клеток.

Обнаружен подвид С,strenuus strenuus диплоидное количество хромосом у которого,а также картина и график диминуционных процессов отличаются от описанных ранее для вида Cyclops strenuus Верман (Beemann, 1977),

Показано,что репликация ДНК у С.kolensis завершается до диминуции хроматина.

Установлено,что хромосомы С,kolensis в преддиминуцион-ном митозе без какой-либо предобработки проявляют сегментацию ?типичную для G-дисков млекопитающих.

Впервые описана мембрана,окружающая гранулы элиминируемого хроматина у многоклеточного эукариотического организма, которая в отличие от ядерной мембраны зукариотических клеток однослойная и в ней отсутствуют поры,

Впервые у представителей копепод в тканях взрослых циклопов С, kolensis и С. strenuus strenuus,обнаружены высокополиплоидные клетки,возникшие на основе поотдиминуционного генома,

Впервые у многоклеточного эукариотического организма изучена структура хромосом и интерфазных ядер зародышевых клеток до и после ДХ при помощи электронной микроскопии,

На основе полученных данных высказано предположение: процесс, подобный ДХ у С,kolensis и С,strenuus strenuus должен предшествовать смене типов интерсперсик последовательностей различной степени повторяемости в некодирующей части генома,многократно происходившей в ходе эволюции эукариот. Практическая значимость, 1,Специфика картины ДХ - количественная и качественная - может быть использована в качестве критерия при определении видов рода Cyclops. Известно,что идентификация видов .этого рода по стандартным морфологическим признакам представляет большие трудности даже для зоологов- систематиков.

2.Можно полагать5что в результате ДХ у С,ко1епз1з в генетических локусах хромосом соматических клеток сохраняется минимальное число функционально значимых последовательностей ДНК ,В таком случае дальнейшие исследования молекулярной структуры таких минилокусов окажутся полезными для оптимизации методов конструирования фрагментов донорной ДНК,используемых в генной инженерии,и, в частности,при генотерапии наследственных болезней человека, Положения выносимые на защиту:

1)Открытие у С.ко1епз1з рекордной для многоклеточных организмов доли генома,элиминируемой при ДХ из ядер соматических клеток;

2) Обнаружение подвида С.^гепшш о отличными от известных ранее для этого вида онтогенетическими характеристиками,такими как: диплоидное число хромосом,общая картина и график диминуционных процессов;

3)Описание процесса ДХ у С,ко1епз1з;

4)Обнаружение спонтанной О-подобной поперечной сегментации хромосом С,ко1епз1з в преддиминуционном митозе;

5)Обнаружение специфической структуры мембран, окружающих гранулы элиминируемого хроматина;

6)Сравнение ультраструктуры митотичеоких хромосом и интерфазных ядер клеток зародыша и,ко1епз1з до и после ДХ. Публикации, Основные результаты исследований,представленные в диссертационной работе,изложены в семи журнальных статьях.

Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы были доложены на научных семинарах и на заседании Ученого совета Института биологии внутренних вод им,И,Д.Папанина РАН (1991-1995) , на научных семинарах Института химической физики им.Н.Н.Семенова РАН (1991-1993) .Института общей генетики им.Н.И.Вавилова РАН (1994)., Института молекулярной генетики РАН (1995) 5 Института цитологии РАН (1994). на заседании Санкт-Петербургского отделения ВОРиС,посвященном 90-ле-тню со дня рождения А.А.Прокофьевой-Вельговокой (30 марта 1993 г.),на международной конференции по "Эволюционной генетике и адаптации", посвященной памяти Жака Моно (Оооуа, Франция, 25-29 сент, 1995).

Считаю своим приятным долгом выразить искреннюю признательность моему научному руководителю проф.А.П.Акифьеву, без помощи и участия которого эта работа не была бы выполнена, также проф.В,Я,Бродскому., при помощи которого были получены основные результаты этой работы. Я очень благодарен д.б.н. В,Ф.Семешину и проф, В,Ю,Полякову за помощь в работе и обсуждение результатов, а также проф, В.Р.Алексееву, к.б.н.

B.И.Лазаревой и к.б.н. Н.В,Карташевой за определение видов

C.kolensis и C.strenuus strenuus.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1, Диминуция хроматина у простейших (Рго1о2оа)

Процесс диминуции хроматина среди простейших организмов наблюдается у ряда видов ,относящихся к отрядам Hirrseri03t.emat.ida и НуроЬг1сЫс1а, во время ядерной дифференциров-ки. Ядерная дифференцировка ведет к появлению двух (или более) разных ядер в одной клетке: мелкого, метаболически менее активного генеративного ядра (микронуклеуса),и соматического ядра (макронуклеуса),более крупного,обеспечивающего вегетативные функции организма простейшего, Микронукдеуо (Ми) в отличие от макронуклеуса (Ма) проходит мейоз во время спаривания клеток, копулирующие клетки при этом обмениваются гаплоидными Ми,последние сливаются со стационарными Ми,образуя новый диплоидный Ми в каждой клетке, Клетки разделяются и новый Ми делится митотически без деления клетки, Один дочерний Ми становится ядром зародышевой линии,а другой развивается в новый соматический Ма (0г1аз,Н1£азЬ1- пакац;ша,1990}, Таким образом Ми сохраняет генетическую непрерывность в клеточном цикле и формирует после каждой конъюгации новое соматическое ядро, Обычно Ми рассматривался как транскрипционно инертное ядро,но полученные данные о роли генеративного ядра в развитии ротового аппарата у Рагагпесхигп (М^, 1988),свидетельствует,что некоторые гены Ми в ходе морфогенеза становятся активными. Геном Ми значительно отличается от генома Ма, Мнкронуклеарная ДНК хромосом имеет очень высокий молекулярный вес (более 1000 т.п.о.)*типичный для зукариотичеоких хромосом (PrescottД992). Гены встречаются группами вдоль молекулы,с короткими последовательностями между генами внутри группы,и перемежаются с намного более длинными повторяющимися и уникальными некодирующими последовательностями, которые находятся между групп генов (Boswell ei al,,1983; Klobutcher et al,,1986),Одна ив характерных отличительных особенностей микронукдеарного генома состоит в том,что все "нефункциональные " последовательности (интроны) ,которые прерывают гены в геноме Ми,вырезаются из него в процессе развития Ма из Ми (Klobutcher,Prescott,1986). Гены в ДНК Ми не зкопреооируются в растущих вегетативных клетках; например синтез ДНК не обнаружен при помощи авторадйографии (Prescott,1992), Поэтому обычно Уи рассматривался как транс-крипционно инертное ядро, Но полученные данные о роли генеративного ядра в развитии ротового аппарата у Paramecium (Mg,1988),свидетельствует,что некоторые гены Ми в ходе морфогенеза становятся активными.

Ма определяет фенотип организма,и содержит активно транскрибируемые гены, Развитие Ма проходит по двум основным схемам: первая объединяет в основном представителей отряда Нуpotгichida, вторая инфузорий из отряда Hymenostomatida (Райков, 1989; Kraut et al,,1986; Brunk,1986; Karrer,1986; Preer, 1989;Ammermann,1990; Steinbruck,1990), В самом начале развития Ма у некоторых гипотрихид из рода Stylonyohia проходит первый этап диминуции хроматина, во время которого элиминируется около 60% хромосом (Агшеггпаш, 1985). У представителей рода Oxytricha подобной редукции числа хромосом не наблюдали (Spear,Lauth,1976), Оставшиеся хромосомы политенизируютоя,В ' это время содержание ДНК в Ма увеличивается по сравнению о количеством ДНК в диплоидном Ми в 15 раз у Stylonychia mytilus (Аштешапп, 1971), в 30 раз у Oxytricha f ai lax (Fresoott,Murti, 1973),и почти в 53 раза у Euplotes aediculatus (Ашпетапп, 1971), По мере развития политении, в хромосомах ги-потрихид появляются поперечные полосы (Агшегаапп, 1964, 1965,1971,1974; . Alonso, Perez-SiIva,1965; Murti,1976; Rao,Ажпегаапп, 1970;Ruthman,1972;Spear, Lauth,1976). Степень репликации различных локусов хромосом неодинакова,так например отмечается "оверхрепликация*' отдельных гетерохроматиновых полос во время политенизации хромосом зачатка Ма Euplotes aediculatus (Aimermann,1971),и Chilodonella cuoullulus(Radzi-kowski,1979), Сформированные политенные хромосомы фрагментиру-ются на отдельные сегменты,окруженные мембраной толщиной 100 А (Kloetzel,1970; Murti,1973), образуя в зачатке Ма большое количество пузырьков, У Stylonichia число пузырьков равно числу полос (Ашегшаш, 1971; Ашеппапп et al,, 1974), у Oxytricha часть полос сливается перед фрагментацией,в результате чего количество полос в политенных хромосомах уменьшается в 4 pasaba в одном пузырьке заключается по несколько полос (Spear,Lauth, 1976'), Затем происходит второй этап ДХ,во время которого из фрагментов ДНК,заключенных в пузырьках,по-видимому, вырезаются опейоерные участки ДНК и интроны,называемые иначе внутренние элиминируемые последовательности (internal eliminated sequences, IES):,при этом оставшиеся участки генов (зкзоны) иногда меняют взаимное расположение., что необходимо для активизации генов, Завершается процессинг минихромосом путем наращивания на их концах теломерных повторов 0чкц/ длина которых видоопецифична (Roth,Presentt, 1985; Klobutcher,1987; Greslin et al-,1989). Все двадцать генов,охарактеризованных до сих пор в микронуклеарном геноме у Oxytricha nova и Euplotes crassus, содержат IES,некоторые часто в большом количестве,Геном Ми может содержать около 50000 IES,при этом все они удаляются и разрушаются во время развития макронуклеуса (Ribas-Aparacio,et. al,, 1987), IES представляют собой отдельные копии AT-богатых последовательностей,размером от 14 до 548 п.о.,более или менее рассеяных по генам (Prescott.,1992). Все IES- элементы имеют 2-19 п.о. прямых повторов, возможно определяющих сайты ,по которым происходит разрезание ДНК и сплайсинг участков генов (Presoott,1992). Часть IES,по крайней мере длинные единицы,удаляются в кольцевой форме на стадии политевных хромосом (Prescott.,1992). Кроме них на стадии полнтенных хромосом из ДНК Ми Е,crassus вырезаются два родственных семейства транопозонподобных элементов,называемых ТЕС-1 (Baird et al-,1989;Jahn et al,,1989) и TEC-2 (Jahn et al,, 1988),каждый около 5,3 т.п.о, длиной и представленных тридцатью тысячами копий, Oxytricha f al lax содержит около 1900 копий транопозонподобных элементов длиной около 4000 п,о,,на1

JL£. зываемък TBE-1 (Herricket al,,1985), Внутренние элиминируемые последовательности разделяют в микронуклеарном геноме сегменты генов , называемые MDS-элементами (macronuoIear destIned sequences или сохраняемые сегменты макронуклеуса),которые после экоцизии IES-злементов соединяются и образуют функционально активный ген Ма, Последовательность чередования сегментов MDS в макронуклеарном геноме может отличаться от таковой в геноме Ми, Характер распределения элементов MDS и IES может быть неодинаковым в разных генах. Так к примеру ген актина-1 имеет инвертированные MDS-элементы,а у гена -ТВР элементы MDS распределены кластерами: группа нечетных элементов и группа четных элементов MDS,которые после экоцизии IES сшиваются в порядке нумерации (Prescott, 1992),

После ДХ видоизмененные гены многократно реплицируются (1000 и более копий), но не обязательно в одинаковой степени (Steinbruck Л983,1990).Таким образом ДНК Ма у инфузорий отряда Hypotrichida и некоторых других таксонов представлена фрагментами содержащими один ген без интронов,экипированный регуля-торными пооледовательнноотями ,что соответствует 0,4-20,0 т,п,о,или 0,1-0,8 мкм (Kraut et al,, 1989; Aiwnemann, 1990; Steinbruck., 1990), Каждая такая молекула, минихромосома или ген в кусочке ДНК (genes in pieces), относительно автономна,способна к репликации (равна одному решшкону), и к транскрипции, имеет типичные теломеоные повторы,но не имеет центромер. Поэтому при делении Ма минихромосомы перераспределяются в дочерние макронуклеусы случайным образом, Однако поскольку таких последовательностей много,то высока вероятность того,что даже при амитозе оба дочерних Ма получат хотя бы несколько копий каждого гена. Кодирующему району гена предшествует лидерная последовательность размером от 50 до 500 п.о.,а за геном следуют трайлер-последовательность из пяти сотен пар оснований (Prescott,1992). Лидерная и трайлерная последовательности,вероятно. необходимы для инициации и термннации транскрипции.

Другая модель макронуклеуса встречается у инфузорий из отряда Hymenostomatida, родов Tetrahymena и Paramecium (Brimk, 1986;Каггег, 1986;Ргеег,1989;Steinbruck,1990). В самом начале развития Ма у Tetrahymena элиминируется 15% последовательностей хромосомной ДНК Ми,но в отличие от Hypotrichidae ДХ у представителей этого рода цитологическими методами не определяется (Gorovsky,1980;Yokoyama,Yao, 1982). Длина молекул ДНК макронуклеусов Tetrahymena, Paramecium и других инфузорий этой группы лежит в пределах от 24 до 2000 т.п.о. (Altschuler,Yao, 1985; Conover,Brunk,1986; Phan et al.,1989). ¥ Tetrahymena в Ма находится 200-300 типов подобных молекул ДНК (Райков,1992), Пять хромосом Ми Tetrahymena фрагментируетоя на 40-60 субхромосом в Ма.Каждая субхромосома Ма представителей отряда Hymenostomatida в отличие от минихромосом Ма инфузорий отряда Hypotrichida содержит по несколько генов. У субхромосом также имеются на концах теломерные повторы O^A^/G^T^,которые присоединяются в ходе фрагментации de novo, отсутствуют центромеры (Blackburn, 1986). Каждый тип оубхроыооом присутствует в Ма в нескольких десятках или сотнях копий.

Итак, во время диминуции хроматина у некоторых представителей простейших (Hypot.riohiohidae) удаляется из генома микронуклеуса до 98%, ДНК . Последняя представлена в основном повторяющимися последовательностями и интронамн ,а в Ма сохраняются лишь уникальные ' последовательности и рибоооомные гены (Prescott et al., 1973; Airanermann et al.,1974). Необходимо отметить, что ДХ среди простейших наблюдается у видов с высоким содержанием ДНК в микронуклеусе,а у видов с малым содержанием ДНК в микронуклеусе ДХ не была обнаружена (Ашегшагш, 1985).

2, Диминуция хроматина у нематод (Nematodes)

Диминуция хроматина обнаружена у 12 видов нематод (Goday, Pirnpinelli, 1993), Она заключается в фрагментации хромосом и элиминации, как полагают (ТоЫегД986; PiiDpinel 11, Goday, 19891 Goday, Pimpine111, 1993). гетерохроматина во всех клетках соматической линии зародышей на ранних стадиях развития, Наиболее подробно изучен процесс ДХ у видов Parascaris equorum (2n=4), Parascaris univalens (2n=2) и Asoaris lumbricoides var*suuiri( 2n=38A+10X у самок, и 2n=38A+5X у самцов) (Tobler,1986). Как показал еще Бовери (Boveri,1887), во время второго деления дробления в одной из клеток P.equorum происходит нормальный митоз ,тогда как хромосомы другой клетки фрагментируются в метафазе на несколько десятков мелких хрома-тиновых телец, В каждом из четырех последующих делений одна клетка подвергается процессу ДХ (клетки соматической линии),а вторая (клетки зародышевого пути) сохраняет исходное количество хроматина (Esteban et al.,1995), Цитологический анализ гомоцентрических хромосом Р,univalens и P,equorum при помощи современных методов окраски (Pirnpinelli, Boday, 1989) показал, что в анафазе диминуционного деления лишь зухроматические сегменты хромосом мигрируют к полюсам веретена деления ,а в экваториальной зоне остаются теломерные и интеркалярные блоки гетерохроматина,которые в дальнейшем элиминируются из клетки, При помощи электронной микроскопии показано ,что хромосомы зародышевых клеток Р. univalens обладают непрерывным кинетохо-ром,перекрывающим зухроматические и гетерохроматические участки хромосом,что характерно для голоцентрических хромосом,а у хромосом P.univalens во время преддиминуционных делений дробления непрерывная кинетохорная пластинка покрывает только зух-роматиновые сегменты хромосом,к которым крепятся микротрубочки веретена,в то время как гетерохроматические терминальные районы не формируют кинетохорной пластинки и кинетической активности не проявляют (Goday et al,,1985, 1992), Установлено также, что в мейотичеоких метках кинетическая активность хромосом осуществляется посредством прикрепления микротрубочек веретена к гетерохроматическим концам хромосом Р,univalens (Goday,Pirnpinelli, 1989), После фрагментации хромосом во время диминуционных делений микротрубочки веретена прикрепляются к голоцентрическим зухроматичеоким хромосомам,которые обладают кинетохором имеющим необычную структуру: собран из отдельных субъединиц,вследствие конденсации хроматина после ДХ (Goday et al.,1992). Таким образом кинетохор у Parasoaris имеет различную структуру,локализацию и размеры в зародышевых митотичео-ких,мейотичеоких и пресоматических клетках, Гетерохрома-тив,элиминируемый из пресоматических клеток Р.univalens и P.equorum,представляет собой АТ-богатую сателлитную ДНК, которая составляет более 80%. зародышевого генома (Morits,Roth,1976; Piroplnelli,Goday, 1989),

У вида Ascaris rurnbrlcoides var,suurn ДХ лучше изучена на молекулярном уровне ,хотя все еще отсутствуют цитологические данные о количестве хромосом в клетках соматической линии этого вида после ДХ (ТоЫег, 1986), У A.suum в ходе ДХ из клеток соматической линии элиминируется АТ-богатая от-ДНК, составляющая около 25% зародышевого генома (ТоЫег et al., 1972; Moritz,Roth,1976;Goldstein,Straus,1978). По другим данным в результате ДХ геном пресоматических клеток A.suum редуцируется на 34% (Pasternak,Barrel, 1976),или даже на 56% (Davies,Carter,1980).Цитированные выше авторы также расходятся в оценке абсолютных значений соматического генома A.suum после ДХ: от 0,15 до 0,46 пг, Большая часть зародышевой ДНК A.suum составлена из повторяющихся единиц от-ДНК по 120 оснований в количестве около 10 копий,тогда как ДНК соматических клеток содержит не более 5000 копий этого повтора (Moritz,Roth,1976),а по данным других авторов менее 1000 копий (Mueller et al.,1982;Streeok et al.1982), Таким образом ДХ удаляет из зародышевого генома пресоматических клеток A.suurn более 99,5 %, от-ДНК, локализованной преимущественно на концах хромосом (ТоЫег et al,1992), Сравнивая клонированные соматические теломеры с соответствующими районами хромосом зародышевой линии обнаружили,что после хромосомной фрагментации на местах разрыва и на концах хромосом происходит наращивание те-ломерных повторов TTAG8C,которые отсутствуют в хромосомах клеток зародышевой линии (ТоЫег et al.,1992), Участки по которым происходит разрушение хромосом и наращивание повторов,были названы CBR (chromosomal breakage region).и являются, по предположению Тоблера и соавт. (Tobler et ai,,1992), мишенью для специфических факторов элиминации,Элиминируемая фракция генома. Â.suum содержит кроме ст-ДНК также и ореднеповторяющиеоя и уникальные последовательности (Roth,1979; Etter et al,,1991), Анализ геномного распределения среднеповторяющегося ретрот-ранопозона TAS у Ascaris suum показывает,что приблизительно 50 копий этой повторяющейся единицы распределяются в 20 различных участках гаплоидного генома,и существуют в двух вариантах: TAS-1 и TAS-2,в пропорции 2:1 (Aeby et al, 1986), Четвертая часть всех последовательростей TAS-1, и все последовательности TAS-2 выбрасываются из генома преооматичеоких клеток во время ДК (Aeby et al,,1986), TAS-злемент имеет структуру сходную с проретровирусами и мобильными элементами (Baltimoré,1985; Aeby et al,,1986),Тот факт,что все TAS-2 элементы удаляются во время ДХ,указывает на их специфическую локализацию в элиминируемой части генома (ТоЫег et al,, 1992), Недавно был открыт кластер содержащий, по меньшей мере, две различные копии униo кального гена элиминируемые в ходе ДХ у A,suuiïi (Etter,et al,,1991), Одна ив них кодирует белок из 148 аминокислот (ÂLEP-1) со значительной гомологией к белку, найденному в малой рибосомальной субъединице дрожжей и крысы (Etter et al, ,1991),Таким образом во время ДХ у A.suum удаляются из зародышевого генома пресоматических клеток не только высоко повторяющиеся последовательности,видимо не несущие генетической информации,но и средние повторы,функция которых пока также неизвестна^ уникальные последовательности,важные для клеток зародышевой линии (ТоЫег et al, ,1972,1992; Moritz,Roth, 1978; Goldstein,Straus, 1978; Etter et al,,1991), Соотношение повторяющихся и уникальных последовательностей в элиминируемой ДНК у Ascaris lumbricoides var, suum составляет 1:1 (Tobler et al,,1972; Goldstein,Straus,1978),

К сожалению, ничего не известно о составе хромосом у других нематод,у которых происходит ДХ,Все еще остается непонятным, почему у некоторых видов нематод происходит ДХ,а у других видов она не наблюдается,как например,у Panagrellus redivivus,геном которого содержит два семейства от-ДНК,составляющие 17% от общего генома,и которые не элиминируются из пресоматических клеток во время развития этой нематоды (Tobler et al,,1992),

Механизм ДХ у нематод мало исследован. На основании своих экспериментов по центрифугированию еще Вовери (Boveri,1910) заключил,что специфический,хотя и неизвестный фактор,дифференциально распределенный в цитоплазме яйца аскариды,путем асоиметричных делений контролирует на ранних стадиях эмбриогенеза развитие зародыша,в том числе прохождение ДХ в клетках соматической линии (Boveri,1910). Однако до сих пор о регуляции диминуционного процесса известно очень мало. Некоторые успешные экспериментальные исследования регуляции ДХ лишь недавно проведены на Asoariciae (Iadano,1968; Esteban et al,, 1995), Показано, что экспозиция развивающихся эмбрионов Parascaris uníval ens в хлористом литии приводит к инициации диминуционных процессов во всех бластомерах у части зародышей, а также изменяет поведение блаотомеров зародышевой линии, вызывая у них сходство с соматическими Оластомерами в том, что касается схемы деления,ориентации митотического веретена деления и синхронизации клеточных делений (Tadano,1968; Esteban et al,,1995).,Высказано предположение,что экспозиция в хлористом литии зародышей Р. univalens инактивирует цитоплаз-матмческие факторы}которые предотвращают ДХ в бластомерах,дающих в конечном итоге линию клеток зародышевого пути (Esteban et al,,1995), Интересна Taime закономерность,которую наблюдали авторы эксперимента: хлористый литий индуцировал ДХ в клетках зародышевой линии с 1-го по 4-е деления дробления,но не после 4-го деления,так как в этом случае инициировать диминуционные процессы в клетках зародышевой линии не удается (Esteban et al,,1995), Эта особенность поведения клеток зародышевой линии после 4-го деления дробления строго детерменирована и показывает, что развитие клеток зародышевого пути, начиная с этого этапа, не может быть изменено на направление сходное с развитием соматических блаотомеров (Esteban et al, ,1995). Аналогичным действием на зародыши P.univalens (подобно хлористому литию) обладает цитохалазин-В. Эмбрионы,обработанные цмтохалази-ном-В,осуществляют только симметричные,похожие на соматические, деления,« все блаотомеры дробящегося яйца подвергаются ДХ (Esteban et al,,1995),К тому же данные по влиянию цнтохалазн-на-В на эмбриогенез Р,univalens указывают,что распределение цитоплазматических факторов,определяющих ход ДХ,зависит от целостности микрофиламентов (Esteban et al,,1995).Исследование ,необработанных какими-либо агентами, эмбрионов Р.univalens, при использовании антитела anti-iwosin II,обнаружило различное распределение миозина между пресоматическими блаотомерами и блаотомерами родоначальниками зародышевого пути (Esteban et al.,1995).Учитывая тот факт,что актин и миозин участвуют в переносе некоторого количества РНК (Sundell and Singer,1991),а также данные,согласно которым белки цитоокеле-та,особенно актин,отвечают за закрепление локализованной м-РНК (Yisraeli et al,,1990),высказывается довольно обоснованная гипотеза из которой следует,что микрофиламенты,связанные о мРНК, транспортируют и/или закрепляют определенные цитоплазматичес-кие факторы,вызывающие ДХ в течение раннего развития эмбрионов Parascaris (Esteban et al.,1995).

Противоположное действию хлористого лития и цитохалази-на-В оказывает NaSCN- (Tadano,1968; Esteban et al.,1995).У эмбрионов, выдержанных. некоторое время в растворе этой соли на стадии,предшествующей 1-му делению дробления,появляются многоядерные эмбрионы,в котором не проходят диминуцнонные деления,а Vм — к.- J. анализ веретена деления обнаруживает множественные полюса и очевидный недостаток микротрубочек (Esteban et al. ,1995).Высказывается предположение,что действие NaSCN состоит в процессе денатурации фибриллярных белков,но не в специфическом влиянии на ДХ (Esteban et al.,1995).

Диминуция хроматина у нематоды Strongyloides papillosum,ведущей как паразитический так и овободноживущий образ жизни,определяет механизм половой дифференциации (Albertson et al.,1979).У паразитической формы 5.papillosum развиваются два типа половых клеток,Ив одного типа половых клеток пзртеногенетйчеоким путем развиваются свободноживущие самцы,у которых в ходе митотичеоких делений осуществляется диминуция хроматина, и которые формируют два типа опермиев,в том-числе спермии с редуцированными в ходе ДХ хромосомами.Из второго типа половых клеток также путем партеногенеза развиваются самки,ведущие овободноживущий и паразитический образ жизни,геном клеток которых не преобразуется в ходе ДХ (Albertson et al.,1979).

3. Диминуция хроматина у копепод (Copepoda)

К настоящему времени ДХ обнаружена у всего лишь у 13 видов пресноводных копепод; Cyclops divulsus, C.íurcifer, С. strenuus, С. var 1 cans, Canthocamptus staphy 11 nus (Beemann, 1959) ; C.bohater,C.vicinus (Einsle,1964); Acantocyclops vernal is (Акифьев,1974); С.abyssorum,C.kolensis,С.insignis,C.kikuohi

Einsle,1993,1994) и у трех видов морских копепод : Mesocyclops edax (Chinnappa, 1980); Pseudooalanus sp. и Eurytemora herdmani (Robins,McLaren, 1982). Феномен ДХ у циклопов рассматривался первоначально как, патологическое явление (Amma, 1911) , или как проявление синтеза вкеядерной ДНК (Stich,1954, 1962), Изучение феномена ДХ у пресноводных циклопов с использованием цитоФотометрии фельгеновокой реакции показало, что в течение одного-двух ранних эмбриональных делений клеток зародыша часть их ,дающая начало клеткам сомы,теряет примерно половину генома,в то время как клетки зародышевого пути сохраняют его исходные размеры (Beermam, 1977).Подобным же образом проходит ДХ у морского вида Mesocyclops edax (Chinnappa,1980).У двух других представителей морских копепод Pseudooalanus sp, и Eurytemora herdmani ДХ имеет совершенно иную природу и заключается в элиминации хроматина в течение первых двух делений созревания зародыша;редукции генома клеток соматической линии при этом не происходит (Robins,McLaren,1982), Изучая клетки зародыша С,strenuus на ранних этапах развития Кикнадзе обнаружила "хромомерную организацию" хромосом зародыша и отметила,что хромосомы на стадии 32-64 иластомеров в 2,5-3 раза короче хромосом первого деления дробления,и в 3-4 раза тоньше их (Кикнадзе,1972).В интерфазных ядрах дробящихся яиц Cyclops sp, обнаруживаются ядрышкоподоб-ные образования ,которые состоят из фибрилл 60-100А° в диаметре, но они не имеют рибосом, Формирование истинного ядрышка начинается со стадии 8-16 бластомеров (Кикнадзе,Беляева,1965),По мнененю Берман (Beemann, 1977) во время значительно удлиненной интерфазы преддиминуционного деления (до 7-8 часов у С.strenuus) происходит процесс экоцизии гетерохроматиновых участков хромосом зародышевых преооматичеоких клеток С, strenuus, C.furcifer, С, aivulsus,геном которых уменьшается на 56,54 и 45% соответственно,при этом соотношение количества ДНК в гаплоидном геноме зародышевой клетки до ДХ и после ДХ составляет (в пкг) 2,2/0,9 у О,strenuus, 2,9/1,44 у С.furcifег, 3,1/1,8 у С-divulsus (Веегташ, 1977), Элиминируемые участки хромосом (Н-блоки) зародышевых преооматичеоких клеток локализованы терминально у С,divulsus,терминально и в прицентромерном районе у C.furcifer,и интеркадярно у С,strenuus и Acantocyclops vernalis (Акифьев,1974; Веепвапп,1977).Высказываются предположения,что элиминируемые в ходе ДХ Н-блоки представляют собой конденсированные,и следовательно гетерохроматиновые участки хромосом по причине сильной конденсации этих районов (5,Beemann, 1966; W.Beemann, 1966), Однако специальных исследований, доказывающих гетерохроматиновую природу элиминируемых участков хромосом у циклопов,не проводилось, Механизм удаления элиминируемого хроматина из хромосом клеток соматической линии у циклопов ,согласно гипотезе Берман (Beerroann,1977) ,схож с механизмом экоцизии бактериофага из хромосомы кишечной палочки и заключается в выпетливании элиминируемого участка хромосом,рекомбинации гомологичных сайтов в основании петли, и в соединении фрагментов хромосом,что подтверждается фактом неизменности диплоидного числа хромосом до и после ДХ у исследованных видов Cyclops ,и наличием большого числа хроматиновых колец диаметром 25-30 нм ,длиной от 0,6 до 100 микрон в клетках зародышей 0,divulsus и O.furoií'er сразу после начала диминуционных событий ,независимо от локализации элиминируемых участков хромосом (Веешалп,Meyer,1980; Beermann,1984).У С.furoifег и С.divulsus Вермав отмечала широкий полиморфизм по величине и количеству Н-блоков, а у С.strenuus полиморфизм, который приводит к половому диморфизму относительно общего содержания хроматина в гаплоидном наборе хромосом (самцы гомозиготны по набору больших хромосом; самки обычно обладают гаплоидными наборами больших и малых хромосом; после диминуции разница между величиной геномов самцов и самок исчезает (Beermann,1977).К сожалению,у других видов пресноводных циклопов ДХ не была изучена столь подробно как у С, divulsus,С.furclfer и С,strenuus,а у некоторых из них факт наличия или отсутствия ДХ использовался лишь как систематический признак при определений видов циклопов

Einsle,1964,1993,1994),

4,Диминуция хроматина у двукрылых насекомых (Diptera).

У некоторых видое, представителей отряда Díptera (Ceoidomyiidae,Soiaridae,Chironomidae) наблюдается элиминация отдельных хромосом или целых хромосомных наборов в процессе половой дифференциации,при этом элиминации хромосом предшествует их гетерохроматинизация (Huettner, 1933; Reiberger, i по л -i r¡ лг\ - í.í.-.4- .-.,-.1 -1 noc: - -: f .-. -л г> л е •■incs. ¡ ?„-.-.4- 1 -i тп. i »¿м:, i э4и, ivtetucii i¡ j. з-jj; wj ule, j. ti^u, i эи i ; леи l. i , cu uwi ■, i ai ü;

Fux,1974; Oliver,1977; Albertson et aL,1979; Thomas,Prasad, 1980;),Элиминируемые хромосомы ограниченны клетками полового пути и обозначается у представителей сем, Ceoidomyiidae -Е-хромооомы,у Chironoïïiidae - К-хромооомы,у Sciaridae - L-xpo-мооомы; хромосомы основного набора называется ь-хромооомами (White, 1954,1959)» У представителей urthooladiinae (оем,0Мго-nomidae) элиминация K-хромосом происходит во время 5-7 деления дробления,а также после вылупления личинок до половины их числа в зиготе,Затем на стадии дифференцировки ооцитов и оперма-тоцитов редушшцированные К-хромооомы без разделения хроматид собираются у одного полюса клетки,В дальнейшем в результате мейоза одна дочерняя клетка имеет полный набор К-хромосом и S-xpOMOOOM и дает начало яйцеклетке у самок или сперматозоиду у самцов, вторая дочерняя клетка имеет только набор S-хромо-оом,и формирует питающую клетку ооцита или дегенерирующий сперматоцит у самцов (W,Beeraann, 1956), У галлиц (Ceoidomyiidae) во время созревания половых клеток у самцов полностью элиминируются Е-хромосомы,а у самок только частично,! результате зрелый сперматозоид содержит только S-хромосо-мы, а ооцит S-хромосомы и часть Е-хромооом (White, 1950,1973; Geyer-Duszynska,1961; Stuart,Hatchett, 1988),Число элиминируемых хромосом может быть до 48 у Heteropeza pygmaea (Kunz,Eckhardt,1974), или 30-32 y Miastor sp,,в последнем случае удаляется в результате ДХ около 74% ДНК (Nicklas,1959; Bantock,1970),Элиминируемые хромосомы у Ceoidomyiidae обогащены гетерохроматином (1имулев,1993), В некоторых случаях у галлиц бывает сложно без специальных тестов определить по степени конденсации хроматина принадлежность его к гетерохроматину или зухроматину, так как например у Miastor и Trishorrnornyia helianthi соматические хромосомы находятся в гетеропикнотичном состоянии,в отличие от элиминируемых Е-хромосом (White, 1950,1973).Среди личинок Chironoims melanotiis обнаружены особи, период жизни которых длится 3 месяца вместо обычных 3 недель (Keyl,Hagele,1966). У этих необычных личинок на 4-й стадии развития в клетках еженных желез от хромосом в районе ш-нетохора происходит отделение гетерохроматинового материала, который в дальнейшем элиминируется, Выбрасываемый гетерохрома-тин всегда подвергается характерной дифференциации: плотная гетерохроматиновая масса образует радиальные нити ,связанные с / внешним концентрическим кругом из плотного матриала. Цитофото- v метрическое исследование нормальных личинок Oh.melanotiis показало, что доля гетерохроматина в ядрах слюнных желез на 4-й стадии развития варьирует от 7 до 13% (Keyl,Hagele, 1966),

Элиминация хромосом наблюдается при развитии клеща Metaseiulus occidentalis (Acariña,Phytoseiidae),которая определяет процесс парагаплоидии,свойственный этому виду (Nelson-Rees et al., 1980).Приблизительно у однодневного зародыша самца из всех клеток,или по крайней мере из клеток зародышевого пути, элиминируется гаплоидный набор «хромосом,В дальнейшем у взрослых самцов Формируются путем митотических делений спермин с гаплоидным количеством хромосом,В клетках зародыша,из которых развиваются самки,элиминации хромосом не е происходитjи яйцеклетки созревают в ходе обычного мейоза,претерпевая редукционное деление.

Элиминируемый "хроматин",выделяющийся в первом делении созревания из хромосом половых клеток Lepidoptera,по-видимому, не содержит ДНК,так как при окрашивании по Фельгену (специфический краситель для ДНК) на месте этого "хроматина" наблюдался четкий просвет (Фролова,1935;Верейская,1975; Bauer, 1933), Цитохимическое изучение ДХ у Solenobia triquetrella (Lepidoptera) позволило Рису и Кляйнфельду сделать заключение о рибонуклеиновой природе элиминируемого "хроматина" у этой группы животных (Ris,Kleinfeld, 1952).Исследование подобного элиминируемого материала у Cidaria variata (Lepidoptera) в электронном микроскопе позволило установить,что он состоит из фибрилл толщиной около 100 А°(Sorsa,Suomalainen,1975).

4=Диминуция хроматина у позвоночных животных

Диминуция хроматина обнаружена у четырех видов рыб отряда Myxinidae (Eptatretus okinoseanus5E,burgeri5Paramyxine atami и Myxyne garaani), в соматических клетках которых в результате ДХ редуцируется значительная доля зародышевого генома за счет элиминации части хромосом и почти всего С-положительного хроматина (Nakai et al., 1991), В ходе диминуционных процессов количество хромосом уменьшается с 54,52,48 и 16 в опер-матогониях у E,okinoseanus,E,burg:eri,P,atami и W.garrnani до 34, 36, 34 и 14 хромосом в клетках сомы (печени,крови, жаберного эпителия и селезенки) соответственно,при зтш зародышевый геном уменьшается до 54,6% у Е.okinoseanus, на 79,1% у E.burgeri, на 60% у P.atami и на 70,2% у M.garmani (Nakai et al,,1991), У представителя цельноголовых рыб Hydrolagus collei ДX происходит во время сперматогенеза, Доля элиминируемой ДНК, которая амплифицируетоя предположительно во время мейотической профазы,в этом случае составляет 10% от диплоидного генома (Stanley et al,,1984).Происходит ли подобное явление во время оогенеза у H.collei - неизвестно, Функциональное значение этого феномена пока непонятно,однако авторы статьи полагают,что потеря хроматина может служить скорее для ограничения структурных функций,чем основных генетических.

Отмечены случаи ДХ у млекопитающих, В цитоплазме 35% клеток всех исследованных зародышей мышей обнаружены Фель-ген-положительные гранулы (Доронин, 1986),Предполагается,что частичная деградация генома в клетках зародышей млекопитающих представляет собой нормальное явление и определяет начальные этапы дифференцировки зародышевых структур (Доронин,1986),В соматических тканях полевки Miorotus oregoni элиминируется Х-хромооома -, а также элиминируется У-хромосома у самцов и Х-хромосома у самок в соматических тканях некоторых видов сумчатых животных (Hayman,Martin,1969),

5, Диминуция хроматина у растений

Тканеспецифичная элиминация хроматина наблюдается у гибридных форм ячменя в тканях эмбриона и эндосперма,при этом обычно происходит селективная элиминация хромосом одного из

- ?.Q скрещиваемых видов (Subrahmanyam,Kasha, 1973; Fedak,1977;Finch, 1983). В ходе последовательных митотичеоких делений клеток зародыша и эндосперма гибридов Hordeum в них снижается число хромосом до тех пор,пока пока не станет гаплоидным в клетках эмбриона,и диплоидным в клетках эндосперма. Как правило элиминируются все хромосомы,принадлежащие одному из родительских видов, Существует генетический контроль над процессом элиминации хроматина у гибридов ячменя,но механизм его неизвестен (Но and Kasha, 1975;Simpson et al.,1980).

Генетический процесс,в ходе которого в полиплоидных рядах клетки шелковицы и розы теряют часть своего генома,по-видимому, широко распространен среди растений, У этих видов растений увеличение плоидности сопровождается уменьшением размеров хромосом за счет потери определенных фракций ДНК,причем не только часто повторяющихся последовательностей,но и средних повторов (Ахундова, 1983),

Как видно из изложенного,ДХ представляет собой несколько процессов,сходных между собой лишь по конечному результату - неравнозначности геномов половых и соматических клеток, Каждый из этих феноменов интересен по-своему, Исследования феномена ДХ мы решили проводить у представителей uTp.Copepoda,поскольку,как нам представлялось,этот тип ДХ имеет наибольшее значение для понимания организации хромосом и эволюции генома эукариот, В действительности,события при ДХ происходят в онтогенезе буквально на глазах исследователя! За несколько,как правило 1-й деления дробления могут коренным образом измениться как размеры генома,так и его молекулярная структура,то есть соотношение и взаимное расположение последовательностей разной степени повторяемости. Другими словами,ДХ у циклопа может служить моделью крупных преобразований генома в эволюции, Доля элиминируемого хроматина дает возможность судить прямо и с наибольшей точностью о том ,какая часть генома эукариот необходима и достаточна для осуществления функций всех тканевых клеток циклопа,поскольку ДК является по сути первым событием дифференцировки,разделяющем линию соматических клеток от клеток зародышевого пути у циклопа.

Исходя из сказанного главной целью настоящей работы был поиск видов Cyclops (на который пришлось затратить около половины имевшегося в нашем распоряжении рабочего времени), у которых во время ДХ элиминировалась бы максимальная часть генома, Именно эти виды наиболее перспективны для анализа как чисто фундаментальных задач,связанных с биологической ролью избыточной ДНК (Doolittie Sapienza,1980),так и для прикладных, поскольку в ходе ДК -природной генной инженерии (Shapiro,1992)-конструируются по программе,содержащейся в генотипе циклопов, локусы,имеющие минимальное число последовательностей, необходимых для полноценного осуществления всех генетических функций (как общеклеточных,так и тканеопецифических) во всех тканевых клетках циклопа.

Уы также постоянно обращали внимание на значение специфики картины ДХ, как цитотаксономического признака, важного для систематики,поскольку определение видов по обычным морфологическим критериям у Cyclops представляет большие трудности.

6,Биологическая роль диминуции хроматина.

Уже более ста лет биологи пытаются ответить на вопросы: каковы функции элиминируемого хроматина, в чем состоит биологическое значение ДХ, Вовери (Boveri,188?) предполагал,что элиминируемый хроматин обладает важными функциями для клеток зародышевой линии,так как центрифугирование зародышей Parascaris на ранних стадиях развития инициирует диминуцию во всех клетках эмбриона,включая клетки зародышевой линии. Поэтому согласно гипотезе Вовери элиминация хроматина необходима для определения направления развития (Boveri, 1887), Недавние доказательства того,что ДХ у A,sunn и Р.univalens включает потерю уникальной копии генов специфических для линии клеток зародышевого пути,что представляет по сути первые молекулярные подтверждения гипотезы Вовери (Eiter et al,,1991; Spicher et al,,1994), Верман предлагала рассматривать процесс ДХ либо,как крайний случай инактивации хроматина,либо как редкий вариант хромосомного полиморфизма,который достигается путем "прыгающей .репликации" различных интеркалярных повторов,что приводит к развитию гетерохроматиновых блоков у Cyclops (Beemann, 1977),Известно спонтанное образование у гибридных видов Nikotiniana многочисленных гетерохроматиновых сегментов (Gerstel,Burns,1967}, У Drosophila nasitoides,y которой очень маленькие,точечные хромосомы преобразуются во вторичное тигантокое плечо одной из хромосом,которое полностью гетерохро-матинизировано (Cordeiro et al.,1975).Функция элиминируемой во время ДХ ДНК в принципе может состоять в контроле транскрипции в клетках зародышевого пути,в регуляции мейоза,а также в регуляции процессов репликации и транскрипции (Ампегтапп,1985).Обнаружение в элиминируемой Фракции генома Ascaris limnbriooides гена,кодирующего рибосомный белок ALEP-1, по мнению Тоблера и соавт. (Tobler et al.,1992).дает достаточное основание чтобы рассматривать ДХ, как альтернативную форму регуляции генной активности. Рассматривается также возможность регуляции генной активности в ходе ДХ в зависимости от наличия или отсутствия в хромосомах блоков гетерохршатина,которые удаляются из генома пресоматических клеток в результате ДХ ( Tobler et al.,1992; Goday,Pimpinelli, 1993), Еще одна гипотеза ( Goday,Pimpinelli, 1993) относительно биологической роли ДХ у нематод связывает элиминацию хроматина в пресоматических клетках с увеличением плоидности отдельных соматических клеток взрослого организма,и рассматривает ДХ как механизм для регуляции экспрессии генов и регуляции количества хроматина (дозы генов) в ходе онтогенеза (Goday,Pimpinelli, 1993), Дело в том,что размер клеток нематод коррелирует со степенью эндополиплоидии,а количество клеток во взрослом организме строго детерминировано,поэтому рост нематод в большей степени зависит от увеличения размера клеток,чем от их пролиферативной активности (Hyman, 1951; Goday,Pimpinelli, 1993),Поэтому несмотря на небольшую разницу в числе клеток, величина тела аскарид,в онтогенезе которых наблюдается феномен

ДХ и полиплоидии, в несколько сот раз больше величины тела Caenorhabditis ssp,, ДХ у которой не обнаружена (Sulstons,Brenner, 1974; Goday,Pirnpinelli,1993).

Эволюционное значение такой формы реорганизации генома, как диминуция хроматина,Годзй и Пимпинелли (Boday, Pirnpinelli ,1993) рассматривают как отражение работы общего механизма,регулирующего количественные изменения генного продукта в онтогенезе,

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Циклопов вида Cyclops kolensis (Lili) отлавливали во время репродуктивного периода весной в Марьинском пруду на Воробьевых горах в ■ г,Москве,a Cyclops strenuus strenuus (Fischer) в пруду около д.Заломы Некоувского р-на,Ярославской обл. Стадию дробления развивающегося зародыша С,kolensis и С, strenuus определяли с помощью светового микроокопа in vivo,Было установлено,что количество бластомеров в дробящемся центро-лецитальном яйце вышеуказанных видов циклопов соответствует числу сферических образований,представляющих собой участки цитоплазмы с ядром и имеющих,по-видимому,оптическую плотность , отличную от таковой окружающего их желтка,Подобным образом можно'достаточно надежно определять стадию деления зародыша вплоть до окончания 6-го деления дробления. Необходимо заметить, что дробление зародышей в парных яйцевых мешках С,kolensis и С,strenuus происходит с высокой степенью синхронности, Эта особенность развития зародышей С,kolensis и С,strenuus была использована при приготовлении препаратов для изучения их методами электронной микроскопии. Парные яйцевые мешки циклопов использовали с целью получения контрольного препарата для световой микроскопии.

Была измерена длительность промежутка времени между i ( следующими друг за другом эмбриональными делениями С,kolensis V и С,strenuus путем определения стадии дробления in vivo с последующей фиксацией зародышей и окраской ацетоороеином ,

Для световой микроскопии яйцевые мешки самок циклопов с развивающимися эмбрионами фиксировали смесью этанола и уксусной кислоты (3:1) в течение 3 часов при 4°С с 3-кратной сменой фиксатора, Затем часть фиксированного материала окрашивали 0,2% ацетоороеином ,раздавливали в 45%-ной уксусной кислоте и исследовали в световом микроокопе,Другую часть материала фиксировали в смеси этанола и уксусной киолоты(3;1), вместе о семенниками Drosophila melanogaster(линия Меллер-5), Далее фиксированный материал промывали в 70% этаноле 15 мин,и столько же в 35% этаноле,затем 3 раза по 10 мин в дистиллированной воде,Проводили гидролиз в IN HCl при 1=80^0 в течение 12,5 мин, Наличие в одном объеме яйцевых циклопов с яйцевыми мешками и семенников дрозофилы гарантировало одинаковые условия гидролиза для обоих объектов,что исключительно важно при цито-фотометрических исследованиях, По окончании гидролиза пробы промывали в 5 сменах дистиллированной воды в течене 30 мин,и окрашивали реактивом Шиффа на протяжении 2 часов,После этого промывали исследуемый материал свежеприготовленной сернистой водой 3 раза по 10 мин,отмывали дистиллированной водой 3 раза по 10 мин,и помещали последовательно в 35%,70%,98% этанол по 15 мин в каждом,и раздавливали покровным стеклом на предметном, затем снова помещали в 96% этанол на 20 мин,Далее исследуемый материал проводили через бу'танол,бутанол-ксилол, ксилол по 20 мин в каждом,и заключали в бальзам, модифицированная нами методика подготовки препаратов для цитофотометрии не требует замораживания их сухим льдом или жидким азотом, и позволяет получать большое количество препаратов,прошедших процедуру окраски по Фельгену строго в одних и тех же условиях. Количество ДНК измеряли на сканирующем микроденситометре,используя объектив 100Х в области поглощения ДНК-фукоина(Фельген)-580нм,

Для исследования структуры хромосом и интерфазных ядер Cyclops kolensis до и после ДХ в трансмиссионном электронном микроскопе (ТЗМ) у С,kolensis отделяли парные яйцевые мешки,один из которых фиксировали для световой микроскопии в смеси этанол/уксусная кислота(3:1),второй для электронной в 2,51 глутаровом альдегиде на 0,07М фосфатном буфере при рН=6,9,в течение 1,5 часов.Часть препаратов, предназначенную для изучения в световом микроскопе, окрашивали по Фельгену или ацетоороеином, Препараты,которые готовились для изучения в трансмиссионном электронном микросшэпе(ТЭМ),после фиксации в глутаровом альдегиде промывали в 0,07М фосфатном буфере с рН=6,9,помещали в 1% раствор четырехокиои осмия на таком же буфере на £ часа при 4°С,и снова промывали в фосфатном буфере. Далее препараты обезвоживали в серии этиловых спиртов возрастающей концентрации (5; 10; 15;20;30;40-, 50;60;70%) по 30 мин в каждом и помещали в 70% этанол,насыщенный уранилацета-том,на 12 часов,Завершали обезвоживание в 80% ;9б% и 100% этаноле; двух сменах бутанола,бутаноле-ксилоле(1:1), двух сменах ксилолаГпо 30 мин в каждом), После этого препараты помещали в смеси ксилола и аралдита в пропорции 3:1, 1:1, 1:3, на 8-12 часов в каждом виде смеси,а затем в чистый аралдит.Выдерживали препараты в термостате при t-37°C IS часов,а далее при 60° С двое суток,Полученные срезы контрастировали уранил-ацетатом и окрашивали по Рейнольдоу. Срезы многих десятков клеток зародышей C.kolensis были исследованы в ТШ Hitachi при ускоряющем напряжении 60 kv.

Для изучения гранул элиминируемого хроматина в клетках зародыша C.kolensis при помощи ТШ применялся также модифицированный метод Миллера (Ш11еглВаккеп, 1972),согласно которому проводили обработку дробящихся яиц C.kolensis на этапах 2-7 деления дробления.Для этого яйцевые мешки циклопа замораживали сухим льдом или жидким азотом.раздавливали на предметном стекле, и ресуопендировали содержимое яйцевых мешков в МаОН- боратном буфере с рН=9 ;сетки с углеродной пленкой опускали в ячейки микрокамеры для центрифугирования,наполненные 4% формальдегидом о сахарозой,и сразу же удаляли из ячейки 3/4 этой смеси.Микропипеткой набирали диспергированный материал и переносили в ячейки микрокамеры,осторожно наслаивая ее на поверхность формальдегида о сахарозой. Микрокамеры закрывали пленкой Parafilm и центрифугировали при 3500-4000 об/мин в течение 20 мин.Избыток жидкости удаляли фильтровальной бумагой, после этого округляли мениск микрокамеры переворачивали ее, снимали сетки пинцетом, промывали их в воде при рН=9 ,убирали воду фильтровальной бумагой и подсушивали сетки на воздухе; полученные препараты окрашивали 1%, уранилацетатом в течение 15 секунд,ополаскивали в 70% этаноле и в воде с рН=9,снова убирали избыток жидкости фильтровальной бумагой и высушивали сетки на воздухе.

Гранулы С,коlensis изучались также и при помощи сканирующей электронной микроскопии. Для этого парные яйцевые мешки самок О,kolensis с развивающимися в них зародышами фиксировали смесью этанол-уксусная кислота (3:1) в течение 4-х часов при комнатной температуре,дважды меняя фиксатор,Один из двух фиксированных яйцевых мешков от каждой особи окрашивали ацетоорсеином,раздавливали в капле 50%. уксусной кислоты,изучали полученные препараты в световом микроскопе,затем замораживали их на сухом льду,и снимали пинцетом покровное отекло,При раздавливании препарата важно было разрушить оболочку яйцевого мешка и клеточную мембрану,и добиться того,чтобы хромосомы оказались распластанными на предметном стекле,и доступны для электронного сканирования,Подготовленные таким образом препараты промывали 3 раза в фосфатном буфере(рН=6,9),дегидратировали в серии ацетонов(20-100%),высушивали в критической точке из абсолютного ацетона,и помещали в установку Eiko для напыления золотом,В дальнейшем препараты были изучены в 09М J5M-25S,Jeol под углом 45°,

Работа с циклопами представляет большие трудности во многих отношениях, Во-первых,определение циклопов крайне сложно даже для специалистов зоологов, Во-вторых, циклопы чрезвычайно трудно поддаются лабораторному культивированию,впервые это отметила Верман в 1977г, В-третьих,репродуктивный период у видов,с которыми мы работали чрезвычайно короток; 2-3 недели весной и иногда осенью у относительно небольшой части популящи. В четвертых,из-за плохой проницаемости оболочки яйцевых мешков пока не разработаны методики получения колхицинирован-ных препаратов хромосом для циклопов в раннем эмбриогенезе,В пятых,в литературе отсутствуют данные о дифференциальной окраске хромосом у указанных видов циклопов. Кроме этого,нам не известны работы,в которых бы биохимическими методами изучались нуклеиновые кислоты и белки циклопов, В целом можно констатировать ,что до настоящего времени не выполнена ни одна экспериментальная работа по изучению ДХ на циклопах. Тем не менее мы надеемся,что те результаты,которые будут изложены нами ниже окажут стимулирующее воздействие для преодоления указанных трудностей работы с циклопами,

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.Феноменологические особенности процесса диминуции хроматина у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus

Первые три деления дробления зародыша Cyclops kolensis проходят с высокой степенью синхронности о промежутками между делениями равными 70-90 мин. Интервал между 3-м и 4-м делениями резко увеличивается по сравнению с первыми тремя делениями, и равен 8-9 часам.Промежуток времени между последующими по крайней мере тремя делениями значительно уменьшается (Табл.1), Диминуция хроматина у Cyclops kolensis проходит во время 4-го деления дробления в 6 клетках зародыша из 8 и характеризуется тем,что в конце значительно удлиненной интерфазы появляются мелкие Фельген-положительные гранулы (РисЛ),В седьмой клетке ДХ проходит о некоторым опозданием,когда вышеуказанные шесть клеток входят уже в 5-е деление, В восьмой клетке дими-нуционные процессы не происходят вовсе, Описанная асинхрон-нооть делений дробления у зародышей С,kolensis после 3-го деления имеет закономерный характер и наблюдалась у всех зародышей (более 200),изученных на этой стадии. Когда в шести клетках зародыша С, kolensis из восьми проходит 4-е деление,то в оставшихся 2-х клетках зародыша в зто время еще наблюдаются полупрозрачные интерфазные ядра, По окончании диминуционного деления в шести клетках зародыша в интерфазном ядре 7-й клетки

OC(N & s • ГОСУ-Д«" . * цтбяй 1

Таблица 1.Длительность интервалов времени между делениями дробления зародыша Cyclops kolensis при 18-20°С

Интервал между j Длительность 1 Примечание (делениями 1 интервала j

I 70-У0 мин

I 70-Уи мин

4-5 !■ 50-60 мин [соматических

У зародышевых клеток dU~6U МИН

1 50-ьи мин i 50-60 мин

Мнтерфазные ядра в клетках зародыша С.kolensis до 4-го деления дробления отличаются слабой равномерной окраской, отсутствием хромоцентра и гетерохроматинизированных структур,что проявляется на препаратах,окрашенных как по методу Фельгена,так и ацетоороекном (Рис.2). Мы провели подсчет числа плотных гранул,появляющихся в конце преддиминуционной интерфа-зьк По мере прохождения цикла деления число Фельген-положительных гранул уменьшается с 500-600 в интерфазе до 150 в мё-тафазе,и до 15-40 в телофаве,в то же время эти гранулы увеличиваются в размерах о 0,5 до 3-4 мкм. Описываемые гранулы также четко окрашиваются и ацетоорсеином.

Рис.2. Клетки С.ко1еп513 стадии ранней профазы 4-го деления дробления. а-окраска по Фельгену,б-окраска ацетдароеином. Увел.X £000.Стрелками указаны гранулы элиминируемого хроматина

В метафазе и особенно в анафазе 4-го деления видно,что большая часть Фельген-положительних гранул перемещается к полюсам клетки раньше ,чем хромосомы, при этом выткнутая форма гранул,не дошедших до полюса.,позволяет предположить участие в этом процессе нитей веретена (Рис.За,б,в). Материал гранул не подвергается декомпактивации во время телофазы 4-го деления дробления. По окончании 4-го деления практически все Фель-ген-положительные гранулы гранулы перемещаются в цитоплазму. В течение £-3 последующих делений все гранулы исчезают в пресо-матических клетях,по-видимому,за счет их разрушения.

Диминуция хроматина у исследованной нами популяции Cyclops strenuus strenuus проходит в два этапа: на 5-м и 6-м делениях дробления зародыша (Рис.4). V лг ч п

Ч, V

Рис.З.Пресоматические клетки зародыша С.ко1епз1з во время 4-го деления дробления: а- на стадии метафаеы, б,в - на стадии анафазы, а,б - окраска ацетоорсеином, в - окраска по Фельгену, Стрелкой у казаны: ^ -хромосомы,'/}- гранулы элиминируемого хроматина, Увел.Х

Рис.4,Клетки соматической линии С.51гепцуБ на стадии анафазы: а) 5-го деления дробления; б) 6-го деления дробления. Стрелками обозначены:^ хромосомы,{ггранулы элиминируемого хроматина.Увел.Х5600. родыша С,й.гегшиз зЬгепииз: &-клетка не прошедшие ДХ;-фа-клетка во время ДХ;о-клетка после ДХ; КОЛ- клетки соматической линии; КЗЛ - клетки зародышевой линии.

До 4-го деления клетки зародыша С.зЬгепииз з1гепииз делятся синхронно через каждые 45-50мин. После 4-го деления дробления клетки зародыша С.з1:.геп1шз з1гепциз начинают делиться асинхронно. Перед 5-м и б-м делениями зародышевых соматических клеток С.эЬгепиив зЬгепииз продолжительность интерфазы значительно возрастает,что приводит к увеличению интервалов между 4-м и 5-м,и между 5-м и 6-м делениями зародышевых соматических клеток С.з1гепииз з1гепииз(Табл.2). Таблица 2.Длительность интервалов времени между делениями дробления зародыша С.з1гепииз зЬгепииз при 18-20°С г ¡Интервал между [делениями Длительность интервала t S j Примечание | 1 1 1 I 1-2 40-50 мин t 1 1 1 2-3 40-50 мин I ! 3-4 40-50 мин i i 4-5 170-130 мин j У зародышевых [ соматических | j 5-6 80-90 мин I клеток | j 6-7 35-40 мин | .//„//„„ } j 7-8 j 35-40 мин j —//—//— | f i

В интерфазных ядрах зародышевых соматических клеток С, з1.гепииз з1гепииз, как и у С. ко1епз1з перед диминуционными делениями появляются мелкие гранулы в количестве 50-80.,которые хорошо окрашиваются как по Фельгену}так и ацетоорсеином .В анафазе 5-го и 6-го деления подобные гранулы сосредоточены намзкваторе" клетки (Рис.4)однако из-за ассоциации части гранул трудно определить их количество-В телофазных ядрах этих же клеток гранулы легко подсчитать,их число колеблется от 15 до 20. В то время как 14 клеток соматической линии,вступающие в 5-е деление (диминуционное), находятся на стадии преддиминуционной интерфазы а две клетки делятся путем обычного митоза,не сопровождающегося потерей хроматиноЕого материала,одна из них - это клетка зародышевого пути,ДХ в которой не наблюдается. Вторая клетка после деления дает клетку зародышевого пути и клетку соматической линии,которая в дальнейшем претерпевает два последовательных диминуционных деления, Таким образом ДХ у С,з^гепииз проходит последовательно во время 5-го и 6-го делений дробления,в результате которых в зародыше С,51гепииз оказывается 58 клеток соматической линии и 6 клеток зародышевого пути (Рис.5 ).

2,Содержание ДНК в клетках Cyclops коlensis и Cyclops strenuus strenuus.

Цитофотометрическое исследование ДХ в клетках соматической линии зародыша C.kolensis позволило обнаружить большое количество элиминируемой ДНК,которое удаляется из хромосом зародышевых клеток во время 4-го д ими нуцион н ог о деления(Табл.3). Для измерения количества ДНК,составляющей додиминуционный геном C.kolensis,использовали отдельно лежащие группы анзфазных и хелофазных хромосом £-3 деления зародышевых клеток.Величина гаплоидного генома зародышевых клеток C.kolensis до 4-го деления составляет 2,3+0.05пг,Перерасчет из условных единиц в пикограммы проводили,исходя из измеренных величин содержания ДНК в сперматидах D.melanogaster и литературных данных (Rasch et ab ,1971). Количество ДНК после ДХ определяли у особей C.kolensis и у С.strenuus strenuus в соматических интерфазных клетках взрослого циклопа,так как только в этом случае можно было проводить измерения, исключив наложение клеток в толще препарата.Это еще удобно и потому,что тканевые клетки взрослых организмов представляют собой постмитотическую популяцию,то есть большинство из них,видимо остановилось в движении по циклу S, Содержание ДНК в гаплоидном соматическом геноме C.kolensis оказалось равным 0,14+0,02 пг,что составляет примерно 5-7%, от додиминуционногО генома зародышевых клеток данного вида .Количество ДНК,измеренное в ядрах интерфазных клеток зародыша C.kolensis перед 4-м делением было равно примерно 4С,и в то же время в этих ядрах еще отсутствовали гранулы зли

40, и в то же время в этих ядрах еще отсутствовали гранулы элиминируемого хроматина,

Таблица 3,Содержание ДНК в эмбриональных и соматических метках С.ко1епз1з и С.з1гепииз з!г, в условных единицах. М + м.

Вид

В эмбриональных клетках на стадии ана- и телофаеы

1-т--

До ДХ ! 5-го деления

В соматических |Злиминируклетках |емая ДНК взрослой особи | %

20 I 40 ко!епз1з12 г> 5360+1201

321+45!620+50

94 N 3;

42 | сю

С.зЬгепшз | 20=1630+140 ( 2С=980+80 N 1 2.8 1 26

II

442+40|876+95 30 1 38

Содержание ДНК в сперматидах С.гле1апо£аз1ег (Мел л ер-5): 20=420+50=0,36±0,,04пг поСРазсЬ е! а! .1971). М-количество исследованных клеток.

Этот факт доказывает,что процесс формирования гранул элиминируемого хроматина б зародышевых клетках соматической линии С, ко1епш8 происходит после репликации ДНК между 3 и 4-м делением дробления,Содержание ДНК б гранулах элиминируемого хроматина клеток соматической линии зародыша С.ко1епз1з на стадии тело-фазы 4-го деления варьирует от 0,05 до 0,5 пг,при этом е отдельных телофазных ядрах содержится в среднем 25 гранул,что позволяет сделать вывод о продолжающемся слиянии гранул,которое начинается в интерфазе 4-го деления. Гранулы находящиеся в каждом таком ядре можно условно разделить на 3 группы; от 0,15 до 0,5 пг (3-5 шт), от 0,09 до 0,14 пг (4-7 шт) и от 0,05 до 0,08 пг (4-12 шт ). Содержание ДНК в гранулах десяти телофазных клеток,не накладывающихся на другие клетки, оказалось равным после деления на два (ив клеток удаляется реилицйррванный материал) 2,0-2,2 пг, что соответствует разнице между количествами ДНК в клетках соматической линии С.ко1епз1з до и после дх.

Среди клеток взрослых особей С,ко1епз1з,формирур:1щих покровы циклопа,встречаются полиплоидные клетки в количестве около 80 с содержанием ДНК в каждой из них в среднем 102С?что равно примерно 1680 пооледиминуционным гаплоидным геномам.

Количество ДНК в геноме клеток соматической линии С.з1.гепииз уменьшается б результате ДХ о 0,72пг до 0г18пг.В 5-м делении из клеток сомы элиминируется 40% хроматина,а в 6-м делении еще 35% от первоначального зародышевого генома (Табл.3),

В теле взрослых особей С,з1гепииз насчитывается около 50 полиплоидных клеток о содержанием ДНК в каждой ие них около 850,что соответствует 240 последиминуционным гаплоидным геномам.

3= Структура интерфазных ядер,гранул элиминируемого хроматина и хромосом в ходе ДХ у Cyclops kolensis и Cyclops strenuus strenuus

В данном исследовании было проведено сравнительное изучение клеток зародышей Cyclops kolensis в парных яйцевых мешках методами световой и электронной микроскопии. Было установлено, что во время ранней интерфазы 4-го деления дробления клеток зародышей С.kolensis ,когда их ядра, окрашенные по Фельгену или ацетоорсеином,имеют вид полупрозрачных пузырьков,лишенных каких-либо гетерохромантизированных структур (Рис.6а),то в электронном микроскопе видно,что в интерфазных ядрах клеток зародышей,находящихся в парном яйцевом мешке той же особи циклопа , хроматин диспергирован по всему объему ядра в виде тонких фибрилл толщиной Юнм, 25-ЗОнм и ЭО-ЮОнм (Рис, 66). Хромо-центры и периферический конденсированный хроматин,примыкающий к ядерной мембране,отсутствуют. Сходной структурой обладают интерфазные ядра клеток зародышевого пути С.kolensis после 4-го деления дробления (Рис.7а). Изучение в ТЗМ интерфазных ядер клеток соматической линии зародышей С.kolensis,фиксированных глутароЕЫМ альдегидом и четырехокисью осмия после ДХ показало.,что они имеют структуру,свойственную большинству эу-кариотических клеток:диспергированный во всем объеме хроматин перемежается с участками вьюокошнденсированного хроматина, часть хромоцентров тесно привыкает к ядерной мембране (Рис,76).

Рис,5.Клетки зародыша С,ко!епз1з на стадии ранней интерфазы 4-го деления дробления:а -окраска по Фелъгёну; б -в электронном микроскопе. Стрелкой обозначена ядерная мембрана (ям).

Рис.7.Интерфазные ядра клеток зародыша С,ко1еп513 во время 8-го деления дробления: а)клеток зародышевого пути в ТЭУ; б,в)клеток соматической линии, Стрелками обозначены; ядрышко (я), хромоцентр(хц).

Подобная картина наблюдалась как на препарата:-:, фиксированных глутаровым альдегидом и четырехокисью осмия,.так и на препаратах ,изученных в световом микроскопе,а затем переведенных в форму удобную для исследования в электронном микроскопе (Рис.8в), Такая структура достаточно типична для интерфазных ядер дифференцированных зукарштичесшш клеток (Ченцов, Ноляков,1974; Восток,Оэмнер, 1981).

При изучении в ТШ срезов клеток зародыша С.ко1епз1з,на стадии поздней интерфазы,а также ранней профазы (Рис.80,в) 4-го деления дробления,обнаружены округлые и слегка вытянутые образования,окруженные двухслойной мембраной,с электроныоплот-ньш внутренние содержимым и диаметром 0,2- 0,5 мкм.Эти образования появляются в поздней интерфазе,когда целостность ядерной мембраны еще не нарушена.В мембране,окружающей эти образования на стадии ранней профазы 4-го деления дробления,хорошо видны поры с дииаметром 500-600 Д°, В парном яйцевом мешке этим образованиям ,по-видимому; соответствуют Фельген-положительные гранулы появляющиеся также перед 4-м делением(Рис.8а).

После 4-го деления в цитоплазме клеток соматической линии обнаруживаются злектронноплотные округлые образования, с диаметром 0,5-3,5 мкм ,окруженные плотной однослойной лишенной пор мембраной толщиной 50 нм,которые перемещаются в цитоплазму ( Рис.9а), По-видимому в профазе,когда еще идут процессы "созревания" гранул,наличие пор необходимо для транспорта молекул участвующих в завершении этих процессов,далее,к концу 4-го деления происходит "консервация" элиминируемого хроматина,пора в мембране исчезают,по нашему предположению о целью исключения доступа ферментов участвующих в декомпактивации хроматина.

Рис,8,Клетки зародыша на стадии поздней интерфазы(б, ),а также ранней профазы(б, ) 4-го деления дробления:а) окраска по Фелъ-гену; б.в)в электронном микроскопе. Обозначения: гранулы элиминируемого хроматина(гр), ядерная мембрана(ям)ядрышко(я),

После 4-го деления в цитоплазме клеток соматической линии обнаруживаются электронноплотные округлые образования, с диаметром 0,5-3,5 мкм ,окруженные плотной однослойной лишенной пор мембраной толщиной 50 нм, которые перемещаются в цитоплазму ( Рис.9а). По-видимому в профазе,когда еще идут процессы "созревания" гранул,наличие пор необходимо для транспорта молекул участвующих в завершении этих процессов,далее,к конДу 4-го деления происходит "консервация1' элиминируемого хроматина, поры в мембране исчезают, по нашему предположению о целью исключения доступа ферментов участвующих в д екомпактиэацпя хроматина.

Подобные гранулы обнаруживаются ка препаратах подготовленных по методу Миллера,когда происходит механическое разрушение яиц О.ко1епзаз на стадии 4-5 деления,при этом разрушаются только клеточные оболочки,а ядра остаются неповрежденными, что подтверждает предположение о переходе гранул элиминируемого хроматина из ядра в цитоплазму. Наблюдаемые на этих препаратах гранулы также имеют плотную лишенную пор мембрану толщиной 50 ям (Рис.96) как и азектронноплотные образования наблюдаемые в цитоплазме клеток зародыша С.ко1епз1з во время 5-6-го деления дробления,видимые на срезах в ТЭМ.Зти мембраны не имеют двухслойного строения и не содержат пор,что резко отличает их от ядерной мембраны.Округлые электронноплотные образования размерами 0,5-2,5 мкм наблюдаются на препаратах зародышей С. ko3.er.isis на стадии анафазы 5-го деления дробления, при при изучении их в СЭМ (Рис.Эв).

- 58

Сходство структур,наблюдаемых в ТЭМ и в СЭМ, ,а также наличие в парных яйцевых мешках С.ко1еп51з Фель ген-положит ель -ных гранул, позволяют сделать заключение об идентичности этих структур , и с большой долей вероятности утверждать,что злект-ронноплотные образования,окруженные мембраной и появляющиеся в конце интерфазы 4-го деления дробления,представляют собой гранулы элиминируемого хроматина.

Рис.9.Гранулы элиминируемого хроматина на стадии интерфазы б-го деления (а,в) и 4-5-го деления(б) зародыша С,ко1епз!з в ТЭМ(а,б) и в СЭМ (в) - указаны стрелкой.

Анализ срезов соматической линии зародыша С. кс>1епя1 = до и после ДХ показал,что после диминуционного деления значительно уменьшается диаметр клеток и интерфазных ядер,а также уменьшается количество ядрышек с £ до 1,но при этом отношение общего диаметра ядрышек к диаметру клетки ,а также диаметра ядра к диаметру клетки остается практически постоянным(Табл,4; Рисв75,в: 8а,б).

Таблица 4

Размерные характеристики клеток соматической линии С,ко19лз1з до и после ДХ(в мкм)

Средний диаметр

До ДХ

После ДХ

Клетки{ск ) Ядра(с1я ) Ядрышка (с! а к)

14 ±

10,6 ± 0,8

1) 1,3 ± О,Е

2) 0,5 ± ОД 0,13 ^ о / с!к= 0,76

I 4,6 ± 0,5 [ 3,4 ± 0,4 | 0,54 + 0,06

1 (1ЯК/ с!к= 0,12 ! с!я / ок= 0,74

Исследование проведенное при помощи светового микроскопа позволило установить,что количество хромосом в диплоидном наборе С. kolensis 2п=22. Оно не изменяется в ходе онтогенеза,хотя после 4-го деления дробления длина хромосом в 7 клетках зародыша из 8 уменьшается в 3-4 раза с 11-20 до 2,6 -7 мш,а диаметр с 1 до 0,5 мкм (Рис.10). Хромосомный набор зародышевых клеток C.kolensis до 4-го деления дробления состоит в основном из метацентричеоких хромосом(Рис. 11а).Лишь одна пара хромосом может быть по классификации Левана (Levari et al.,1964) с уверенностью отнесена к субметацентрическим ,с соотношением длин плеч 2,2 ,другая пара хромосом может быть отнесена,в зависимости от степени компактизации,как к метацентричеокш,так и к субметацентрическим,так как соотношение длин плеч у них равно l,f±D,l. Диплоидный хромосомный набор клеток соматической линии C.kolensis после ДХ содержит 6 пар метацентричеоких, 4 пары субметацентрических,и 1 пару акроцентрических хромосом (Рис. 116).Таким образом в кариотше клетки соматической линии C.kolensis вследствие ДХ вместо двух пар метацентрических хромосом появились: 1 пара акроцентрических хромосом и,по меньшей мере,2 пары субметацентрических хромосом. Клетка направительного тельца C.kolensis содержит гаплоидное число хромосом и совершает митотичеокое деление в то время,когда клетки зародыша вступают в 4-е деление дробления (Рис.12).

РисЛО, Клетки зародыша С,ко1епз!э во время 5-го деления дробления . Стрелками обозначены г ^хромосомы клетки зародышевого пути; ^хромосомы клетки соматической линии; $ гранулы элиминируемого хроматина. Увел.2800, о 2 " hl) / л Г» «j К<\ M »А* 5 t\b AfV fî Ii П

Рис,il.Диплоидный набор анафазнын хромосом С.kolensis а) до ДХ; б) после ДХ. 2п=22. пё

12. Метафазные хромосомы клетки направительного тельца С.ко1епз1з, N=11.

Сравнительное изучение в ТЭМ додиминуционных хромосом (Рис.136) Апоследиминуционных хромосом (Рис.14в) и хромосом клеток зародышевого пути(Рис,15в) С.ко!епзхз,фиксированных в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия,показало,что плотность хроматина в додиминуционных хромосомах значительно меньше, чем в хромосомах клеток зародышевого пути и е последимину-ционных хромосомах.Этим фактом можно объяснить разницу в диаметре хромосом клеток зародышевого пути (0,5-0,7 мкм) и додиминуционных хромосом(0,8-1,Омкм). Диаметр последиминуционных хромосом клеток соматической линии при измерении в ТЭМ, оказался равен 0,2-0,Зыкм.Так как фиксация в глутаровом альдегиде и четырехокиси осмия позволяет лучше сохранить структуры клетки, чем фиксация в уксусной кислоте и спирте (Бронштейн и др.,1965;Свифт,1969),то эти измерения можно считать более точными, чем проведенные при помощи светового микроскопа. Структура метафазных хромосом клеток зародышевого пути не имеет видимых отличий от структуры метафазных хромосом клеток соматической линии при их фиксации глутаровым альдегидом и четырехо-кисью осмия. На поперечном срезе тех и других в электронном микроскопе видны плотные тела,лишенные субструктуризации. Вдоль внешнего края метафазных хромосом клеток соматической линии и зародышевого пути наблюдаются выросты. Подобная характеристика метафаэных хромосом является общей для клеток растений и животных,а выросты,по-видимому,является следствием спиральной укладки хромонемы (Ченцов,Поляков, 1974),

Исследование в ТЭМ хромосом клеток зародышевого пути С,ко1епз!з, предварительно изученных в световом микроскопе, после перевода препарата в пригодную для этого форму,обнаружило наличие чередующихся по длине хромосомы участков с различной степенью упаковки хроматина: участки, сформированные из глобулярных структур диаметром 100-150нм, перемежаются с участками диффузного хроматина(Рис,206). Участки с различной плотностью упаковки хроматина по длине хромосомы видны и на препаратах анафазных минихромосом С.ко!епз1з,также первоначально окрашенных ацетоорсеином,а затем изученных в ТЭМ(Рис,196).Таким образом исследование в электронном микроскопе хромосом клеток соматической линии зародыша С, ко1егтз ,преобразованных в ходе ДХ,и хромосом клеток зародышевого пути с неизменным геномом не обнаружило каких-либо принципиальных отличий б их структуре.

РисЛ3.Хромосомы на стадии анафазы 3-го деления дробления: а)световой микроскоп,окраска ацетоорсеином; б)ТЗМ, Штрелками указаны хромосомы(х).центриольГц),а) Увел.Х £000.

Рис.14,Хромосомы меток соматической линии зародыша С,ко1епз1з во время 5-го деления дробления: а)анафаза,световой микроскоп, окраска ацетоорсеином;б)те же хромосомы в ТЕМ;в)метафа-за, ТШ, фиксация глутаровьш альдегидом и четырехокисью осмия. Стрелками указаны более плотные участки хромосом.

Рис,15.Хромосомы клеток зародышевого пути на стадии метафазы 5-го деления дробления; а)световая микроскопия (окраска адето-орсеином); б)те же хромосомы в ТЭМ; в) ТЭМ.,фиксация глугаревым альдегидом и четырехокисью осмия. На Рис.156 стрелками обозначены: участки хромосом сформированные из диффузного хроматина, и из глобулярных структур.

В митотичеоких хромосомах С.ко1епз1з на стадии 3-го деления дробления при окраске ацетоороеином без какой-либо предобработки четко и постоянно выявляется чередование темных и светлых полос (Рис.16;Рис.1?а),весьма сходное о G или R, но не С- окраской в хромосомах млекопитающих, Количество таких полос В отдельных хромосомах колеблется от 20 до 40. Необходимо заметить ,что в митотических хромосомах клеток зародыша O.kolensis на стадии 1-го и 2-го деления дробления (Рис.18) ,а тем более у последиминуционных хромосомах клеток соматической линии (Рис.176) такой четкой исчерченности не наблюдалось. Интересно отметить;что в хромосомах клеток зародышевого пути O.kolensis после 4-го деления,окрашенных ацетоороеином,также не было обнаружено в световом микроскопе отчетливой G-подобной сегментаций (Рис.10),

Длина хромосом зародышевых соматических клеток С.strenuus strenuus вследствие ДХ уменьшается в 2-2,5 раза, с 4,5-1£,5мкм до 2,8-5,4мкм (Рис.19). Диплоидное число хромосом у C.strenuus strenuus вследствие ДХ не изменяется,и остается равным 24.Число бивалентов во время 1-го мейотического деления у C.strenuus strenuus равно 12 (Рис.21).К сожалению нам не удалось получить метафазные пластинки с хорошим разбросом до-диминуционных хромосом,поэтому в данной работе не представлен диплоидный набор хромосом C.strenuus strenuus до ДХ . В диплоидном наборе последиммнуционных хромосом С.strenuus strenuus можно выделить 6 пар метацентрических хромосом ,3 пары субме-тацентриков и 3 пары акроцентрических хромосом (Рис.'ЙО).

Рис.16. Прометзфэзвые хромосомы С,ко1епз1з во время 3-го деления дробления,Увел- ХЗООО. : л.

Чк

Рис.17. Клетки зародыша С,ко1епз1з на стадии анафазы: а-3-го деления дробления,б - 5-го деления дробления. Увел.Х2000. Стрелками отмечены гранулы элиминируемого хроматина. к' % '

Рис.18,Клетка зародыша С.коХепзхз на стадии анафазы 2-го деления дробления, N

Рш»19.Клетки зародыша С.зЬэг.зЬгепииз во время 7-го деления дробления, Стрелками обозначены^хромосомы клетки зародышевого пути; из? Хромосомы клетки соматической линии; гранулы элиминируемого хроматина. Увел, £800. 4

Рт л

Рис, ЕО,Диилиидныи набор анафазных хромоссш клетки соматической линии зародыша С,з!гегшиз зЪгелииз после 7-го деления дробления (2М=24),

ЛАааг,/ч

1 Г* л л

ПСИ*

ЛЛллп

Рис. 10

Рис,£1. Биваленты С.з1гепииз з1гепииз на стадии днакине-эа,п=1Е. г--.

0В0УВДЕН1Е

Главным результатом настоящей работы является обнаружение у С,ко1епз1з рекордной среди многоклеточных доли генома, элиминируемой в процессе ДХ, Трудно согласиться с мнением Верман (Вееташ,1977), согласно которому во время ДХ у циклопов удаляется только лишь гетерохроматин,В таком случае доля гетерохроматина в геноме 0,ко1епз1з должна быть 94%, что по сравнению с таковой у других видов (Прокофь ева-Бель говс-кая,1988) крайне маловероятно. Ранее А.П.Акифьевым (Акифь-ев,1993),было предложено рассматривать совокупность генов,ре-гуляторных участков,последовательностей ДНК,связанных с ядерным матриксом,в том числе ориджинов репликации и Р-повторов,на основе которых протекает мейотический кроссинговер у высших эукариот (БсЫегп, НоНа, 1984), в качестве базигенома по аналогии с базигеном Серебровского (Серебровский,Дубинин, 1929). Вазигеном обеспечивает структурно-функциональную организацию ядра эукариотической клетки и не может быть потерян ни при каких условииях,Очевидно,что те 5-7%, генома,которые остаются после ДХ в соматических клетках С,ко1епз1з,в наибольшей степени соответствуют представлению о базигеноме.В то же время процесс ДХ у С,ко1епз1з прямо указывает на то,что 94-96 % генома этого вида не несут кодирующих и регуляторных функций необходимых для дифференцировки и гистогенеза,

Сейчас неясно какими базигеномными последовательностями г О экипированы генетические локуоы минихромооом соматических клеток C.kolensis. Однако не исключено,что щж ДК в генах соматических клеток C.kolensis отсутствуют и интроны. Известно, что размеры гена,состоящего из экзонов и интронов,могут варьировать в необычайно широких пределах от нескольких сот до более, чем 1 млн.п.н., а число интронов может колебаться от О до нескольких десятков (Георгиев,Корочкин, 1992), Итак, додимину-ционный геном C.kolensis - это 2/3 пг ДНК. Он равен примерно 2/3 генома человека, и намного превосходит геном D.iiielanogBster , который близок к постдиминуционному геному циклопа. Возможно,что число генов у циклопа и дрозофилы,как и у других беспозвоночных не слишком отличается от такового у нематоды ( Ohotia, 1994 ) и составляет примерно 20000, Эти сопоставления могут указывать на два направления ДХ у C.kolensis. Во-первых, гены, остающиеся в соматических тканях, полностью сохраняют экзон-интронную структуру, Постдиминуцион-ный геном C.kolensis - это около 200 млн.п.н, Если средний размер структурной части эукариотичеокого гена (суммы экзонов) составляет около 2 тыо.п,н.,а число генов 20 тыс,,то на их долю приходится 40 млн.п.н, или 20% постдиминуционного генома, Если же интроны в генах после ДХ сохраняются, то даже если средний ген (сумма экзонов и интронов) увеличивается в 10 раз ,то оставшейся ДНК для такого генома просто не хватит,тем более если в поотдиминуционных хромосомах сохраняется какое-то количество структурного гетерохроматина,что не исключено, Поэ тому либо поотдимннуцйонные хромосомы практически не содержат межгенной не принадлежащей к интронной некодирующей или молчащей ДНК,либо по крайней мере в части генов в процессе ДХ подвергаются зкоцизии и интроны, Решение этого вопроса методами молекулярной биологии вполне возможно,и любой ответ на поставленный вопрос будет весьма важен для понимания биологической роли избыточной ДНК ,в частности и интронов,

По уровню элиминации ДНК в ходе ДХ С,ко1епз1з приближается к макронуклеусам некоторых инфузорий (РгеБсоН е1 а1., 1973; Ажпегаапп е! а1,, 1974 ), но в отличие от простейших у С,ко1епз1з не уничтожается сама хромосомная структура и хромосомы остаются видимыми в световом микроскопе. Следовательно структурное обеспечение элементарных генетических процессов после ДХ у С,ко1епз1з и С,з1.гегшиз в отличие от макронуклеусов скорее всего остается таким же, как и у всех остальных многоклеточных, С другой стороны,по крайней мере,некоторые тканевые клетки циклопа,подобно макронуклеусам инфузорий,имеют выоокопо-липлоидный геном,Возможно,одна из причин появления этого феномена у циклопов заключается в следующем; функциональная потребность в умножении ряда последовательностей,наталкивается на необходимость многократного умножения генетического материала, который никогда не будет востребован в дифференцированных соматических клетках,Поэтому для организма выгодно удалить избыточную ДНК генома в ходе ДХ и многократно воспроизвести нба-зигеном" клеток С,ко1епз1з и С, зЬ^егшиз з!.геп1шз подобно тому как это происходит у некоторых видов нематод (May,Pimpinelli, 1993). Это простое объяснение в духе синтетической теории эволюции,отводящей решающую роль в адаптацио-генезе естественному отбору,игнорирует,однако главный парадокс ДХ у C.kolensis: зачем так много ДНК необходимо для клеток germ line ? Кроме того,ДХ не столь простое (вероятно,на первый взгляд) явление,как индустриальный меланизм; для того,чтобы включить механизм ДХ,требуется координированная во времени работа многих генов (Веешапп, 1977), Это по сути дела означает, что ДХ - неимоверно дорогая плата за то,чтобы иметь несколько десятков клеток из £0 тыс, у целого организма с высокополиплоидными ядрами, Почему механизм полиплоидного сброса (Ахундова, 1983) мог бы сработать только для этих клеток во время их последних делений перед конечной дифференцировкой? С другой стороны своего рода сброс некодирующей ДНК во время ДХ происходит у некоторых видов простейших (Prescott et,al,,1973; 0rias,Higashinakag:ava,1990). К сожалению, пока феномен димину-ции хроматина изучен крайне недостаточно,чтобы уверенно отстаивать преимущество той или иной гипотезы,Лишь дальнейшее накопление фактов позволит с большей убедительностью говорить о биологической роли ДХ и о его механизмах,

Один из общебиологических аспектов диминуции хроматина связан с длительной дискуссией (Дулиттл,1986) о так называемом С-парадоксе,Суть которого состоит в том,что практически у всех эукариот размеры генома превышают суммарную длину структурных генов и регуляторных последовательностей в десятки,а иногда в сотни и тысячи раз,Таким образом , гены существуют как бы в виде "островов" в океане негенной ДНК (термин Руоева, Zuckerkandl,1992)«На протяжении 25 лет с тех пор ,как было всеми осознано это явление (Callan,1967);казалось не раз,что функции избыточной ДНК и ее биологическое значение вот-вот будут определены.Однако каждый раз исследователей ожидало разочарование .

Количественное изучение ДХ у циклопов ставят перед исследователями вопрос; соответствует ли часть генома удаляемая при ДХ той части генома эукариот,которую принято называть "избыточной" ,Для объяснения роли "избыточной" ДНК был высказан ряд гипотез,из которых две,по крайней мере,могут быть проверены на основе результатов исследования ДХ,Первая из них - это гипотеза Бриттена и Дэвидсона (Britten,Davidson, 1971),согласно которой избыточная ДНК представляет собой регуляторные последовательности, Полученные нами данные по диминуции хроматина у С.kolensís и С, strenuus strenuus свидетельствуют против этой гипотезы,так как весь морфогенез,для осуществления которого необходима целостность и полнота структурно-фуннкциональ-ных областей генома, начинается уже после того,как завершилась диминуция хроматина, Поэтому элиминация около 94% генома клеток соматической линии C.kolensis и 75% генома клеток сомы С,strenuus strenuus ставит под сомнение гипотезы приписывающие "избыточной" ДНК какие-либо известные функции и позволяет оде f лать вывод о том,что элиминируемая ДНК не несет никаких значительных кодирующих и регуляторных функций, Вполне возможно,что некоторые элиминируемые последовательности необходимы для нормального хода мейоза (Р-повторы) и созревания половых клеток. Тем не менее маловероятно,что 94% генома C,kolensis и 75% генома C,strenuus st.r, кодируют только функции специфичные для половых клеток,а 6% и 25% соответственно - все остальные функции организма.

Больший интерес явление ДХ представляет для оценки гипотезы "эгоистичной" ДНК (Doolittle,Sapienza,1980;Orgel,0riok, 1980)„авторы которой рассматривают накопление избыточной ДНК в геноме эукариот как самоумножение селективно нейтральных последовательностей ,и допускают,что отдельные нуклеотидные последовательности, в особенности те,которые имеют структуру,характерную для мобильных генетических элементов,могут существовать в ядре как самостоятельные члены семейств гомологичных последовательностей, Они не несут каких-либо важных генетических функций и существуют лишь потому,что решшкационная машина эукариотической клетки без излишних трудностей обеспечивает их воспроизведение в каждом .клеточном цикле, Семейства таких поо-ледоовательностей должны быть распределены в виде определенных кластеров довольно равномерно по хромосомам C.kolensis и могут характеризоваться рядом особенностей,касающихся графика репликации или обогащеннооти определенными нуклеотидамн,а также формирования "хроматинового кода",концепция которого разработана Фогтом (Vogt,1990).He исключено,что именно такие кластеры проявляются на определенных этапах онтогенеза в форме дисков, придающих хромосомам C.kolensis СЗ-подобнную окраску, Можно предположить, что у C-kolensIs и у С. strenuus strenuus в процессе ДХ удаляются в первую очередь как раз те последовательности, которые и составляют так называемую "избыточную" или "эгоистичную" ДНК, ДХ у Copepoda может казаться уникальным явлением не только по механизму преобразования хромосомной структуры,но и по результатам - физическому исключению участков генома,не являющихся необходимыми для развития животного, Такая постановка вопроса допускает,что у видов,у которых отсутствует ДХ,некодипующие последовательности все же играют какую-то роль в генетической регуляции. Однако надо принять во внимание следующие факты. Во-первых.большая доля генома например у млекопитающих - около 50% в течение онтогенеза не участвует в транскрипции (Lewin, 1983 ); во-вторых,внутриядерному распаду подвергаются РНК-овые копии с интронов,а также и та РНК,которая считывается РНК-полимеразой за пределами цист-рона; ее размеры могут достигать нескольких сот пар нуклеоти-дов (Георгиев,Корочкин, 1992)- Эти факты указывает на то,что у видов,не имеющих ДХ, избыточная ДНК инактивируется не физически, но функционально, причем различными способами, Жесткая генетическая запрограммированность ДХ ,специфическая картина и график ее у разных видов циклопов,в том числе и те четкие различия , которые выявлены в настоящей работе,свидетельствуют о том,что проявление так называемого "эгоизма" у элиминируемой ДНК едва ли возможно в значительной степени,поскольку она интернирована в хромосомные структуры. Очевидно,что в процессе ДХ,в особенности таком масштабном , как у С,kolensis,должен работать внутриклеточный механизм,надежно дискриминирующий элиминируемую ДНК,от той которая должна быть сохранена для реализации фенотипа организма. Таким образом,ДХ представляет собой яркий пример контролирования генотипом самой структуры генетического материала клетки,

Основными характеристиками генома эукариот являются размеры и особенности чередования последовательностей разной степени повторности. По обоим этим показателям наблюдается исключительное разнообразие (Газарян,Тарантул, 1983),Оно может свидетельствовать о том,что как количественные,так и качественные особенности генетического материала эукариот в ходе эволюции не раз претерпевали самую коренную перестройку. Иначе нельзя объяснить, почему по типу чередования уникальных и повторяющихся последовательностей геном Musca domestica больше похож на геном человека,чем на геном D,melanogaster,Более того,даже виды-двойники D.melanogaster и D,simulaos имеют существенные различия по указанной особенности молекулярной организации генома (Газарян,Тарантул, 1983), Это означает,что за геномными реорганизациями не всегда следуют сравнимые по масштабу изменения фенотипа,Наиболее ярко независимость эволюции генома и Фенотипа подтверждается явлением ДХ.В действительности морфологические отличия между некоторыми видами циклопов,имеющих в онтогенезе ДХ разного масштаба и со своеобразной феноменологией ,настолько малы,что установить их может лишь опытный специалист по систематике копепод. Это означает,что развитие циклопов происходит практически одинаково как на основе постоянного, так и реорганизованного во время диминуции генома, Мы имеем дело с тем же эффектом,что и преобразования генома в ходе эволюции,

Диминуция хроматина у многоклеточных открывает один из механизмов преобразований генома,который мог сработать практически мгновенно, На основании полученных в данной работе результатов представляется возможным сделать следующее предположение: процесс,подобный ДХ у и,коlensis,должен предшествовать смене типов интерсперсии последовательностей различной степени повторяемости в некодирующей части генома,многократно происходившей в ходе эволюции зукариот,

Диплоидное число хромосом у C.kolensis,KaK и у других видов циклопов,где это изучалось (Вееггпапп, 1977) ,не изменяется в ходе ДХ, Интересно однако отметить, что у CLkolensis (2п=22; 2о=4,8пг) нет таких маленьких хромосом как,скажем 21 хромосома человека или 4 хромосома D, inelanogaster,3To согласуется с концепцией критической массы хромосом,недавно предложеной Акифьевым (Акифьев,1993), Критическая масса,иначе говоря содержание ДНК в хромосомах высших эукариот,позволяет видеть хромосомы в световом микроскопе в митозе или в мейозе, учитывая разрешающую способность светового микроскопа, У высших зу-кариот,в частности у всех многоклеточных,нет в норме хромосом, которые имели бы количество ДНК ниже критической - массы. Согласно этой концепции та ДНК,что остается в хромосомах соматических клеток С.kolensis,наиболее приближается к понятию базигеном,а та которая удаляется в процессе ДХ может рассматриваться ршк "наполнитель",то есть функционально малозначимая часть генома,

Нами описан еще один вид Copepoda: Cyclops strenuus strenuus Fischer (отличный по картине ДХ от того,с которым работала Берман (Веегаапп, 1977), У этого вида 2п=24; 2с=1,44пг.В процессе ДХ у С,strenuus,sir.элиминируется 75%, ДНК,,причем во время 5-го деления хромосомы пресоматических клеток .теряют 40% ДНК,а остальную часть элиминируемой ДНК в 6-м делении дробления. Геном germ line С,kolensis в три раза превосходит геном С,strenuus strenuus,тогда как постдиминуци-онные геномы этих видов различаются всего лишь немногим болевшем на 20%, Таким образом,в обоих случаях ДХ протекает так,что сохраняется критическая масса всех хромосом и ни одна из них не переходит за пределы разрешения светового микроскопа, Вопрос о том,для чего нужна сама критическая масса остается открытым, Окончательная проверка его в аспекте проблемы ДХ будет заключаться в установлении связи между исходными размерами генома и количеством элиминируемой ДНК при ДХ у разных видов, Согласно идее критической массы тут должна существовать прямая зависимость,и у видов с очень маленькими геномами ДХ вообще не должна иметь места.

Важным признаком в строении ядер преооматичеоких клеток, характеризующей начало процесса ДХ у С.kolensis .служит появление первоначально мелких Фельген-положительных гранул во время 4 -го деления дробления (Рис,), Количество гранул ,появ- V ляюпщхся в конце интерфазы диминуционного деления, видоопеци-фично и колеблется у С,kolensis от 500 до 600,в то время как у 0,strenuus streniiiis оно равно примерно 80, По всей вероятности, уменьшение числа гранул в клетках зародыша с 500-600 до 150 в метафазе и до 15-40 в телофазе происходит за счет слияния гранул. Специфичность окраски Фельгена в настоящее время надежно доказана (Robins et а1,,1980),и это позволяет утверждать, что Фельген-положительные гранулы соответствуют участкам элиминируемого хроматина, Так как в интерфазных ядрах зародышевых соматических клеток С, strenuus strenuus перед диминуци-онными делениями появляются мелкие гранулы элиминируемого хроматина в количестве 60-80,а в телофазных ядрах этих же клеток количество гранул колеблется от 15 до 20,то по-видимому,также как и у 0,kolensis,у 0,strenuus strenuus происходит слияние гранул элиминируемого хроматина при продвижении клеток соматической линии от интерфазы диминуционного деления к телофазе.

Длительность интерфазы 4-го деления дробления зародышевых преооматичеоких клеток С,kolensis в 6 раз превышает длительность интерфазы додимннуционных делений и в 9-10 раз длительность интерфазы пооледиминуционных делений клеток соматической линии (Табл.1).Подобное удлинение интерфазы во время ранних эмбриональных делений,насколько нам известно, среди эукариот наблюдается только у видов-рода Cyclops,у которых имеется ДХ (Веегшапп,1977; Табл.1,2).Тот факт,что интервалы между додиминуционными и последиминуционными делениями отличаются ненамного может быть объяснен следующим образом.Известно,что скорость движения репликадионной вилки в самых различных клетках эукариот достаточно постоянна и составляет 0,5-1 мкм в минуту, поэтому для того чтобы отреплицнровать додиминуционный геном,размер которого на порядок превышает размер генома клеток после ДХ,необходимо чтобы в додиминуционных хромосомах работало на порядок больше участков инициации репликации, чем после ДХ.В свою очередь это означает,что элиминируемая ДНК насыщена потенциальными ориджинами репликации,Последние представляют собой последовательности связанные о ядерным матрик-оом,

Наблюдаемая,при изучении в световом микроскопе,равномерная окраска интерфазных ядер C.kolensis до 4-го деления дробления,характерная для многих видов животных (Прокофь-ева-Вельговская,1986).отсутствие в них хромоцентра и гетерох-роматннизйрованных структур,объясняется,по-видимому, не отсутствием гетерохроматина как такового,а включением его в процесс репликации ДНК ,который в это время инициируется во многих ориджинах,Вполне вероятно,что типичный для соматических клеток календарь репликации,когда время репликации гетерохроматина четко сдвинуто на конец фазы S, в начале развития у за родышей С,ко1епз1з еще не установился, Клеточные циклы в раннем эмбриогенезе изучены достаточно подробно (ВгаЬат,1973; Ротт, 1980), Главная особенность клеточного цикла в этот период заключается в отсутствии периода и относительно небольшой продолжительности периодов 3 и б^у Еоех видов животных независимо от типа яиц и способа дробления (Епифанова и др.,1983). Маловероятно предположение,что особенности структуры ядер клеток зародышей 0,ко1епз1з связаны о транскрипционной активностью гетерохроматина.Скорее всего они обусловлены коротким временем фазы синтеза ДНК,в ходе которой гетерохроматин неизбежно должен подвергаться декомпактизации,и особенностью процессов связанных с эксцизией элиминируемого хроматина из доди-минуционных хромосом пресоматических клеток, Именно сложность и неординарность процесса эксцизии элиминируемой фракции генома из хромосом пресоматических клеток С,ко1епз1з, по-видимому, также является причиной резкого увеличения длительности преддиминуционной интерфазы,

Аоинхроннооть делений дробления,наблюдаемая при развитии всех изученных нами зародышей С,ко1епз1з и состоящая в феномене четко фиксированного во времени сдвига начала диминуци-онного деления одной из пресоматических клеток и задержки деления клетки зародышевого пути,а также двухэтапнооть днминуци-онного процесса у С,з1гепииз з1гепииз,вероятно жестко запрограммирована в онтогенезе указанных видов и,по-видимому,связана со спецификой механизма регуляции прохождения ДХ у определенной части клеток развивающихся зародышей. Можно предположить, что механизм ДХ запускается детерминантами, находящимися еще в неоплодотворенном яйце циклопа,но также опосредован спецификой некоторых участков генома,граничащих с элиминируемыми последовательностями. Основой для такого предположения является эксперимент Бовери с центрифугированием яиц аскариды,после которого ДХ наблюдалась во всех клетках зародыша,а также данные полученные при изучении участков ДНК,по которым происходит переотройка генома во время ДХ у аскарид (ТоЫег е1. а1,,199£),и у гипотрих (РгезооН, 1992).

Отсутствие гранул элиминируемого хроматина в интерфазных ядрах клеток 0,ко1епз1з перед 4-м делением в то время, когда количество ДНК в них было примерно равно 4С,свидетельствует в пользу того ,что процесс формирования гранул элиминируемого хроматина в зародышевых клетках соматической линии С,ко1епз1з происходит после репликации в интерфазе 4-го деления дробления,во время которой реплицируются как последовательности элиминируемой ДНК,так и последовательности генома клеток соматической линии.

Разница в структуре интерфазных ядер пресоматических клеток до и после ДХ,а также зародышевых клеток С,ко1епз!з,отмеченная при изучении их в ТЭМ ,обычна при сравнении клеток животных в раннем эмбриогенезе с клетками взрослого организма^ повышение структурированности интерфазных ядер и оформление в них гетерохроматинизированных структур связывается с появлением в хроматине дополнительного количества негиотоновых белков(Прокофьева-Вельговокая,1986),Причиной изменения структурированности интерфазных ядер в раннем эмбриогенезе у С.kolensis может быть переход с цитоплазматической регуляции экспрессии генов во время первых делений дробления,определяемую детерминантами находящимися еще в цитоплазме неошюдотво-ренного яйца,на ядерную, когда генная экспрессия регулируется посредством конденсации и деконденоации хроматина,Подобное предположение основывается на известных представлениях относительно механизмов дифференциальной активности генов эукариот во время эмбриогенеза (Нейфах,Тимофеева, 1978; Raff,Kaufman, 1983).

Редукция ядрышка вследствии диминуционных процессов в пресоматических клетках С,kolensis позволяет предположить,что в данном случае вследствие ДХ происходит удаление из хромосом зародышевых соматических клеток части рибосомных цистро-нов,функциональная потребность в которых теряется вместе с элиминируемым хроматином. В то же время остается постоянной относительная функциональная активность рибосомных генов,о чем можно судить по величинам отношения общего диаметра ядрышек к диаметру клетки,и диаметра ядра к диаметру клетки,которые не изменились после ДХ(Табл).Данный факт представляет особый ин- I/ терес в связи с недавно полученными сведениями об элиминации гена ÂLEP-1 в клетках соматической линии Ascaris suum ,кодирующего белок со значительной гомологией к малой рибооомальной субъединице дрошей и крысы (ТоЫег еЬ а1. Д992).

Известно,что выоококонденоированный хроматин интерфазного ядра содержит инактивированные гены (Ченцов,Поляков ,1974;Восток,СамнерЛ981), Следовательно,сохранение после ДХ ядерно-цитоплазматического отношения у зародыша С,ко1егтз таким же,каким оно было до ДХ, при наличии значительного числа участков высококонденсированного,а значит инактивированного хроматина,позволяет предположить,что величина ядерно-цитоплазматического отношения скорее определяется функциями ядерной мембраны,чем величиной генома или числом функционирующих генов, учитывая тот факт,что у особей С,ко1епз1з в результате ДХ элиминируется более 90% генома.

Наличие четко выраженной 6-подобной поперечной иочерчен-ности хромосом в клетках зародыша С,ко1епз1з вовремя 3-го деления дробления,непосредственно предшествующего ДХ является исключительно интересным признаком хромосомного фенотипа данного вида, особенно,принимая во внимание ту роль,которая придается В- и й-дискам как молекулярно-генетическим экологическим нишам ( Но1п5аи1з1, 1989),

Отсутствие у хромосом клеток зародышевого пути и хромосом клеток соматической линии после ДХ зародыша С,ко1епз1з отчетливой 0-подобной сегментации,которая хорошо видна у хромосом того же циклопа на стадии анафазы 3-го деления дробления в световом микроскопе,и б то же время наличие чередующихся по длине хромосом клеток зародышевого пути и последиминуционных хромосом клеток соматической линии участков с различной степенью упаковки хроматина, первоначально окрашенных ацетоорсеи-ном,а затем изученных в ТЭМ,возможно объясняется предобработкой вышеуказанных хромосом смесью спирта и уксусной кислоты,в результате которой из их материала экстрагируются хромосомные белки,и становятся заметны отличия в упаковке материала хромосом, невидимые в ТЭМ на препаратах,фиксированных глутаровым альдегидом и четырехокиоью осмия(Рис,5В; 6В).Чередование плотных, составленных из глобулярных структур участков хромосомой участков диффузного хроматина,соответствующих В- и к-оегмен-там,наблюдали в ТЭМ при гипотонической обработке культивируемых клеток хомячка,что объясняется избирательной экстракцией материала хромосом в процессе фиксации препаратов смесью спирта и уксусной кислоты,а также специфической упаковкой хромосомного материала в ¡3 и К-сегментах (Зацепина и др., 1988). Возможно, что отличия в упаковке материала митотических хромосом С,ко1епз1з в 3-м делении дробления могут быть связаны с какими-либо их структурно-функциональными особенностями,например: поздняя репликация,генетическая активность,обогащенность определенными нукяеотидами. Следовательно появление В-сегментации у хромосом С„ко1епз1з можно рассматривать как маркировку элиминируемых участков хромосом во время преддиминуционного деления,

Так как у С,ко1епз1з и С.зт:.гепщ13 з1гепииз диплоидное число хромосом в результате ДХ не изменяется,то число сайтов яу эксцизии,по которым идет вырезание элиминируемого хроматина при ДХ согласно гипотезе Берман[31,должно быть равно или кратно 500-800 у О.ко1епз15 или 160 у п,з1гепциз з1гетшз,Распределение сайтов эксцизии элиминируемого хроматина в хромосомах 0,ко1епз1з происходит,вероятно,довольно равномерно по воем хромосомам набора,так как осуществляется более или менее пропорциональное уменьшение размеров хромосом вследствие ДХ,После удаления из хромосом клеток соматической линии участков элиминируемого хроматина во время интерфазы димннуционного деления, и восстановления целостности хромосом может изменяться и механизм регуляции генов,например в результате ДХ может исчезать ''эффект положения генов5',Подобную гипотезу относительно ДХ у аскариды высказывали К,Годэй и 0,Пимпинелли Шоаау, Ршр1пе111,1993),

Элиминируемым хроматином во время ДХ у зародышей С„ко1епз1з, возможно являются те участки плотноконденсирован-ного хроматина,которые придают В-подобную сегментацию хромосомам зародышевых соматических клеток 0,ко1епз1з во время 3-го деления дробления,и число которых во всех хромосомах диплоидного набора (в среднем 30 X 22} примерно равно числу первоначально появляющихся Фельген-положительных гранул в интерфазе 4-го деления дробления (500-600), Таким образом ДХ,по-видимому, является важным фактором регуляции генной активности на хромосомном уровне в онтогенезе 0,ко1епз1з,

Гранулы элиминируемого хроматина ,появляющиеся вследствие процесса ДХ у циклопов,по крайне мере у изученных нами С,ко1епз1з и С.зйгепииз зт:.гепццз, являются совершенно особенными внутриклеточными структурами существующими относительно непродолжительный отрезок времени. Функциональная потребность в создании подобных структур очевидна, ибо если элиминируемая ДНК не будет заключена в гранулу с плотной лишенной пор мембраной и по этой причине,по-видимому,непроницаемой,то на конденсированный элиминируемый хроматин должны действовать факторы декомпактизации наверняка присутствующие в клетке во время телофазы 4-го деления дробления и тогда компартментализованная элиминируемая ДНК превратилась бы,по-видимому, в микроядра,что привело бы к хаосу в клетке,так как ДНК находящаяся в микроядрах способна к репликации (Огедхпге еЬ а1,, 1983 ). Причина, по которой компартменты элиминируемого хроматина не превращаются в микроядра,по-видимому, состоит в том,что в элиминируемых фрагментах ДНК отсутствуют те участки генома,которые обеспечивают связь хромосомной ДНК с ядерным матрикоом и,в частности, с внутренней поверхностью ядерной мембраны, По-видимому, именно поэтому гранула элиминируемого хроматина не превращается в активно функционирующую ядерную структуру. Характерная особенность гранул элиминируемого хроматина - плотная лишенная пор мембрана - резко отличает ее и от микроядер,которые частично окружены ядерной мембраной обладающей порами (Огелтге еЬ а,1,, 1982), и от таких клеточных органелл как ядро или митохондрии,имеющие двухслойную мембрану о порами

Бродский,1965; Вил,Hoyл3,1981) ,что позволяет им активно осуществлять обменные процессы,в то время как гранулы,благодаря особенностям своей плотной мембраны,вероятно,лишены такой возможности, Поэтому мембрану гранул элиминируемого хроматина следует рассматривать как плотную оболочку, функция шторой, по-видимому, состоит только лишь в изоляции заключенного в ней элиминируемого хроматина от окружающей ее внутриклеточной среды,

Основными характеристиками генома эукариот являются размеры и особенности чередования последовательностей разной степени повторности. Известно, что разные виды эукариот имеют различные типы чередования последовательностей ДНК (Газа-рян,Тарантул, 1983),Этот факт может означать,что как количественные, так и качественные особенности генетического материала эукариот в ходе эволюции не раз претерпевали самую коренную перестройку. Иначе нельзя объяснить, почему по типу чередования уникальных и повторяющихся последовательностей геном Musca domestica больше похож на геном человека,чем на геном D.melanogaster, Более того,даже виды-двойники D,melanog:aster и D,simulans имеют существенные различия по указанной особенности молекулярной организации генома (Газарян,Тарантул,1983). Это означает, что за геномными реорганизациями не всегда следуют сравнимые по масштабу изменения фенотипа. Наиболее ярко независимость эволюции генома и фенотипа подтверждается явлением ДХ,В действительности морфологические отличия между неко торыми видами циклопов5имеющих в онтогенезе ДХ разного масштаба и со своеобразной феноменологией ,настолько малы,что установить их может лишь опытный специалист по систематике копе-под, Шапиро отмечает (Schapiro,1992) ,что три вида Cyclops (C,furoifer,C,uivulsus,C, strenuus),описанные Берман трудноразличимы для морфолога,Мы также столкнулись с трудностями при идентификации видов,у которых изучали ДХ,Кроме очевидных изменений хромосомных структур ,можно полагать,что такие особенности организации генома, как молекулярно-генетические ниши Холмквиота (Ноlinguist, 1989),иными словами С,6 и R -банды, основанные на хроматиновом коде(Yogi,1990),домены Боднера (Bodnar,1988) и другие реальные или гипотетические черты хромосомного фенотипа претерпевают существенное изменение при ДХ,особенно такого маоштаба,как у C,kolensis,

Следовательно,огромные преобразования генома могут никак не оказываться на фенотипе организма. Это означает,что развитие циклопов происходит практически одинаково как на основе постоянного,так и реорганизованного во время диминуции генома. Мы имеем дело с тем же эффектом,что и преобразования генома в ходе эволюции, Поэтому ДХ можно рассматривать еще и как макромутацию по отношению к хромосомному фенотипу, В то же время можно полагать,что если ДХ - подобные события произойдут в germ line,то и они могут,не отражаясь на фенотипе,немедленно стать жестким фактором генетической изоляции,Изменения молекулярной структуры генома при ДХ - подобных процессах неизбежно приведут к нарушению конъюгации хромосом в мейозе со всеми вытекающими последствиями,

ДХ,в особенности того типа,что описана Верман (Beermann,1977) и нами,, у С. kolensis и С. strenuus strenuus позволяет понять,как может произойти первое событие,с которого начинается смена типов интерсперсии. Новым последовательностям должно быть освобождено место в геноме,в противном случае размеры геномов будут безгранично расти,Если же процесс,подобный ДХ,хотя бы изредка может произойти в половых клетках,а результаты недавней работы лаборатории Годзй (Esteban et al,,1995) свидетельствуют о том »что это возможного потерявший более или менее значительную долю некодирующих последовательностей геном может быть заселен другими последовательностями,

Несмотря на то,что методы цитогенетики давно применяются при изучении видов семейства Cyclopidae (Braun,1909;Matsohek, 1910; ChambersД912;BeermannД959,1986Д977;Rusch,1960;Einsle, 1962,1963,1964,1975,1977,1993,1994a,b; Ohinnappa,Victor, 1977; Chinnappa,1980; Purasjoki,Vilamaa,1984; Кикнадзе,Беляева,!965; Кикнадзе,1972;Монченко,Таволжанова,1976; Кочина,Монченко,1986; Кочина, 1987',) 5 тем не менее далеко не у всех этих видов обнаружена и описана ДХ,

В нашем исследовании установлено,что ДX у С,kolensis происходит во время 4-го деления дробления,а ДХ у С,strenuus strenuus в 5 и 6-м делении дробления, А согласно данным Зйн-сле,который использовал факт наличия феномена ДХ в онтогенезе некоторых видов циклопов для целей систематики (Einsle, 1993), ДХ у C.kolensis проходит во время 5-го деления дробления, тогда как ДХ у С,strenuus происходит в 4-м делении дробления (Веегшаш, 1977; Einsle, 1993). Начиная свою работу по изучению диминуции хроматина,мы определили вид,с которым работали как Cyclops sirenuiis strenuus ,и уже потом после консультации с В.Р.Алексеевым (ЗИН,РАН, г.С.Петербург) и В,И.Лазаревой (ИБВВ,РАН, п.Борок) исправили результаты определения на Cyclops kolensis Lili. Как видно из приведенных выше данных изученная нами популяция С.strenuus sir. значительно отличается от популяции 0.strenuus,о которой работала Верман (Beermann,1977), Диплоидное число хромосом у С.strenuus strenuus равно 24,а не 22 по Берман;отсутствует половой диморфизм по величине хромосом,свойственный популяции,описанной Берман; элиминируется в ходе диминуции 75% ДНК,а не 56%; ДХ проходит в два этапа на 5-м и 6-м делении дробления,а не на 4-м;элиминируемый хроматин в анафазе диминуционного деления локализуется не на полюсах веретена,а на его экваторе, По-видимому, вое вышеперечисленные различия связаны с высокой поли-морфноотью вида С, strenuus Лак например у Cyclops heberti (strenuus subgroup) диминуция хроматина проходит во время 5-го деления дробления,а гранулы элиминируемого хроматина концентрируются на стадии анафазы диминуционного деления в области экваториальной пластинки (Einsle,1994b),что сходится по ряду параметров с картиной диминуции у популяции С,strenuus strenuus,исследованной нами,и отличается от данных Верман (Beermann,1977). Поэтому,как, нам представляется,есть все основания полагать,что изученная популяция С.strenuus strenuus представляет собой самостоятельный вид,морфологически сходный с популяцией,с шторой работала Верман,Можно с . высокой долей вероятности предположить.что реципрокное скрещивание данных популяций докажет их видовую самостоятельность. Основой такого предположения могут служить эксперименты по гибридизации различных хромосомных форм Äoanthooyolops amerioanus,которые показали наличие репродуктивной изоляции между всеми этими формами, и позволили авторам эксперимента рассматривать каждую из популяций,со свойственным ей диплоидным набором хромосом, как самостоятельный вид (Монченко,Таволжанова,1976;Кочина,1987),

Анализируя особенности диминуционного процесса у C.kolensis, первоначально мы наталкиваемся на сходство картины ДХ этого вида с картиной ДХ у О, strenuus по Верман (Beermann,1977), но тем не менее она имеет и существенные отличия; наличие спонтанной дифференциальной сегментации хромосом во время 3-го деления дробления, 94% элиминируемой при ДХ ДНК,а не 56% ,отсутствие полового диморфизма по величине хромосом,что имеет место у С,strenuus по Верман (Веermann,1977), Кроме того осуществление диминуционных процессов в онтогенезе популяции C.kolensis,с которой работали мы,в 4-м делении дробления, а также характер распределения элиминируемого хроматина в анафазе диминуционного деления,позволяет говорить о значительных цитогенетичеоких отличиях от популяции С.kolensis,описанной Айнвле (Einsle, 1993), А так как вышеуказанные различия генетически детерминированы,то не исключено,что и в данном случае мы имеем дело с видами двойниками, Согласно мнению ряда систематиков группа видов Cyclops strenuus чрезвычайно полиморфна и включает в себя скорее всего несколько видов,Именно поэтому в пределах рода Cyclops и вида С,strenuus неоднократно проводились ревизии Шонченко,1974 ), в таком случае каждый из таких видов может обладать своей,присущей только этому виду, картиной ДХ.

Имеет ли эволюционное значение диминуция хроматина у циклопов ? Возможно предположение,что элиминируемый хроматин может накапливаться в геноме для создания поотзиготических барьеров,которые непреодолимы в случае реципрокных скрещиваний с близкородственными видами. Такой вывод следует из отрицательного результата экспериментов по гибридизации различных хромосомных форм Acanthooyclops amerioanus (МонченкоДаволжа-нова, 1986; Кочина, 1987), а также из факта отличия хромосомного фенотипа популяции С,strenuus в нашем исследовании от хромосомного фенотипа популяции С,strenuus, исследованной Берман (Вееплапп, 1977),

В таком случае диминуция хроматина - инструмент кладоге-неза, и в тоже время неизбежное следствие процесса накопления' избыточной информации необходимой для изоляции вида в условиях симпатрии,Следствие,основная функция которого состоит в удале

С? / нии части генома,ставшей ненужной после прохождения мейотичео-ких процессов,а потому удаляемой ив клеток соматической линии, Правомерены еще два вопроса,ответить на которые пока мы не можем : насколько универсален механизм диминуции хроматина и как часто он использовался в эволюции зукариот для регуляции величины генома клеток сомы? Нетрудно предположить, что сам процесс ДХ детерменирован в онтогенезе многими генами, работа которых строго координирована - это вырезание элиминируемых участков по вполне определенным сайтам,которые к этому времени должны быть должным образом подготовлены,сшивание участков хромосом,консервация элиминируемого хроматина посредством окружения его высококонденоированных конгломератов лишенной пор мембраной ,вполне определенный способ поведения элиминируемого хроматина во время диминуционного деления,по-видимому, обязательное наращивание теломеров, после эксцизии учаоков элиминируемого хроматина, компактизация элиминируемой ДНК, К тому же очевидно,что некоторые из вышеперечисленных этапов,например формирование гранул,должны быть определены не одним,а многими генами, В этой связи мы считаем возможным высказать предположение, что процесс ДХ у циклопов возникает под влиянием единичной мутации, Действие этой мутации заключается в активации фермента диминуции. Все остальные этапы ДХ существуют в норме. Если механизм диминуции хроматина достаточно универсален,то процесс появления по крайней мере части "избыточной" информации может быть связан с созданием на ранних этапах эволюции эукариот барьеров неокрещиваемооти между видами за счет накопления избыточной ДНК,которая препятствовала бы прохождению ме-йотических процессов. Таким образом диминуцию хроматина можно рассматривать как инструмент и как следствие эволюции циклопов, а может и эукариот.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Явление ДХ у циклопов находится в самом начале молеку-лярно-генетических исследований,Если не считать принципиально важной,но пока не подтвержденной другими авторами работы Бер-ман (Beermann and Meyer, 1980; Beermann,1984), в которой были обнаружены циклические ДНК-овые структуры во время ДХ' у C.divulsus и C.furcifer,TO других молекулярно-биологических исследований на циклопах не было проведено,Недавно группой сотрудников во главе с A,ILАкифьевым было показано с помощью поли-меразной цепной реакции со случайным праймером RAPD-PCR, что после ДХ у С.kolensis некоторая часть последовательностей сохраняется ,тогда как другие исчезают и возникают новые.

Многие вопросы,относящиеся к молекулярным механизмам ДХ будут выяснены,когда будет создан банк последовательностей из до- и последиминуционной ДНК С,kolensis,Тогда прояснятся такие интригующие аспекты генетической организации эукариот,как наличие интронов и их необходимость для функционирования генов в половых и соматических клетках,механизмы позиционного эффекта, и другие,

ДХ у С,kolensis, когда она будет в достаточной мере изучена, откроет новые перспективы для генной инженерии,в частности, поможет найти пути создания эффективно работающих локусов минимальных размеров. выводы

1.В настоящей работе с помощью цитофотометрии фельгеновокой реакции впервые установлено,что в результате диминуции хроматина клетки соматической линии C.kolensis и С-strenuus strenu-us теряют около 94% и 75% ДНК соответственно;при этом величина гаплоидного генома изменяется у C.kolensis о 2,3 до 0,14 пг,а у С,strenuus strenuus с 0,72 до 0,18 nr.

2.Показано,что процесс формирования гранул элиминируемого хроматина в зародышевых клетках соматической линии C.kolensis начинается после репликации ДНК в конце интерфазы 4-го деления дробления,

3. У взрослых особей C.kolensis и С,strenuus strenuus обнаружены высокополиплоидные клетки с содержанием ДНК в каждой из них равным примерно 1700 и 180 пооледиминуционным геномам соответственно.

4.Установлено, что диплоидное число хромосом ( 2п ) у Cyclops kolensis равно 22,а у С,strenuus strenuus 24.

5.У обоих видов циклопов имеет место резкое удлинение продолжительности преддиминуционной интерфазы (у C.kolensis в 6 раз,у С,strenuus strenuus в 4 раза перед 5-м делением и в 2 раза перед 6-м делением дробления),

6,Обнаружена спонтанная дифференциальная иочерченнооть (S-подобные полосы) хромосом С.kolensis,четко выраженная во время 3-го преддиминуционного деления дробления.

7.Обнаружено закономерное снижение числа гранул элиминируемого хроматина в клетках зародыша C.kolensis на стадии интерфазы Г'-.-i

- лих телофазы 4-го деления дробления,при одновременном увеличении размеров зтих гранул,

8, Исследование гранул элиминируемого хроматина у CLkolensis в электронном микроскопе обнаружило наличие у них плотной,лишенной пор мембраны толщиной 50 нм, окружающей элиминируемый хроматин,

9,При исследовании клеток соматической линии CLkolensis до и после 4-го деления дробления в ТЭМ показано,что в результате ДХ происходит изменение структуры интерфазных ядер,связанное с появлением конденсированного хроматина, но не обнаружено принципиальных различий в структуре хромосом клеток соматической и зародышевой линии,

10,На основании полученных результатов высказано следующее предположение: процесс,подобный ДХ у С,коlensis,должен предшествовать смене типов интерсперсии последовательностей различной степени повторяемости в некодирующей части генома,многократно происходившей в ходе эволюции эукариот,

Полученные цитогенетические характеристики видов С.kolen-sis и С, strenuus strenuus предлагается использовать для таксономии циклопов,

ОПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1,Акифьев А.П. Молчащая ДНК и ее роль в эволюции // Природа, 1974.N.9. С,4954,

2,Акифьев А,П, Концепция базигенома и критической массы хромосом зукариот/./Докл,РАН,1993,Т,332,N, 1, С,96-98,

3,Ахундова 3,М, Полиплоидия и ДНК, Баку:3лм,1983,0,107,

4,Бил Дж,,Ноулз Дж, Внеядерная наследственность, М,:Мир,1981, С.168,

5,Восток К.,Самнер 3,Хромосома эукариотической клетки,М,:Мир, 1981,С,598,

6,Бродский В,Я, Неделящееоя ядро,В кн.Руководство по цитологии, Т.1 ,М-Л;Наука,1965,С,269-332,

7,Бронштейн А,А,,Винников Я,А,,Титова Л,К,Цитохимические реакции, В кн,Руководство по цитологии,Т.1.М-Л:Наука,1965,0,71-84,

8,Верейская В,Н, Цитохимическое исследование хроматина в ме-йозе тутового шелкопряда // Цитология,1975,ТЛ7,N.С,603-606,

9,Газарян К,Г,,Тарантул В,3,Геном зукариот.М,:Изд-во МГУ, 1983,С,272,

Ю.Дулиттл У,Ф,Четырнадцать месяцев концепции эгоистичной ДНК, Сб,работ/ Под ред,Доувера Г,.Флейвелла P.M.:Мир,1986,С,13-39, 11,Георгиев Г,П,,Корочкин Л,И, Современные представления о структуре гена высших организмов // Генетика.1992.Т.28.N.1. 'С.20-27.

12,Доронин Ю,К, Диминуция хроматина,аномалии митозов и гибель клеток в ранних зародышах мыши // Цитология.1986. Т. 28. N. 5. С,495-500,

13.Епифанова О.И.}Терских В.В.,Полуновский В,А, Покоящиеся клетки,Свойства и функции в организме,М,: Наука.1983.С.176. 14,Жимулев И-.Ф. Гетерохроматин и эффект положения гена // Новосибирск, : Наука,1993,С,490,

15,Зацепина О.В.,Поляков В.Ю.}Ченцов Ю,С,Дифференциальная де-конденсация митотичеоких хромосом при гипотонической обработке клеток как возможная причина 6-сегментации // Цитология,1988, N.10.0,1172-1179,

16.Зацепина и,В,,Челидзе П.В.,Ченцов Ю.С.Количественные изменения фибриллярных центров в процессе инактивации ядрышек в дифференцирующихся зритроблаотах мыши // Онтогенез,1989,Т,2, N.1.C.40.

17,Кикнадзе И,И, Функциональная организация хромосом // Л.:Наука.1972. С,212.

18,Кикнадзе И.И.,Беляева Е.С. Структура ядрышка в раннем эмбриогенезе // Генетика.1965.Т.3.N. 1.С.11-14.

19,Кочина Е.М. Цитотаксономичеокое изучение циклопов группы Aoanthocyolops "americanus - vernalis" (Crustacea,Copepoda)// Вестн,зоол, 1987.N. 3.P,7-11,

20,Кочина E.M,,Монченко В,И, и видовой самостоятельности Cyclops kikuohii (Crustacea,Cyclopidae) // Вестн,зоол,1986,N. 1, P.15-18,

21,Лукашенко Н.П,,Рыбакова 3,1, Структура и функция геномов простейших // М,:Наука.1991.0,127,

22.Монченш В. И.,Таволжанова Т.И, ,1976, Концепция биологического вида применительно к систематике циклопид (Crustacea,Cyclopidae) // Журн. общ.биол.Т.37.N.4.Р.563- 573.

23.Нейфах А,А,,Тимофеева М.Я. Проблемы регуляции в молекулярс ной биологии развития, М,:Наука, 1978,С,337.

24,0ленов Ю.М. Некоторые проблемы эволюционной генетики и дарвинизма, Л.: Изд-во АН СССР,1961.С.186,

25,Прокофьева-Вельговокая А,А,Гетерохроматические районы хромосом. М.: Наука,1986.С.431,

26,Райков И.Б, Ядерная дифференцировка и гетероморфизм ядер у простейших /7 Цитология,1992,Т,34,N,7,С,3-16,

27,Райков И.Б. Ядерный геном простейших // В кн. Организация генома, М.; Наука,1989,С,110-154.

28,РОТТ Н.Н.Клеточные деления в прегаструляционный период развития// Онтогенез.1980,N,11.С.3-23,

29,Серебровский А.С,,Дубинин Н.П, Искусственное получение мутаций и проблема гена //Успехи эксп.биол.1929.Вып.4.0.235-247.

30,Свифт К,Количественная цитохимия рибонуклеиновых кислот,В кн,Введение в количественную цитохимию,М,: Мир,1969,С,288-313, 31,Ченцов Ю.С.,Поляков В.Ю.Уль траотруктура клеточного ядрам , I Наука, 1974.С.160,

32,Aebi Р,,A,Spicher,I de Chastonay,F.Muller,Tohler H,Structure and genomic organization of proretrovirus-1ike elements partially eliminated from the somatic genome of Ascaris lumbri-coides // The EMBO Journal.1986.V.5.P.3353-3360.

33,Albertson D.,Nwaorgu O.C.,Sulstons J.E.Chromatin diminution and chromosomal mechanism of sexual differentiation in Strongy-loides papillosus // Chromosome.1979. V.75.P.75-8?.

34,Alonso P.5Perez-Si Iva J, Giant chromosomes in Protozoa // Nature. 1965.V,205,P,313-314.

35,Altschuler M,I.5Yao M,C, Macronuclear DNA of Tetrahymena thermophila exists as defined subchromosomal-sized molecules// Nucl, Acids Res,1985,V.13.P,5817-5831,

36,Amma К, Uber die dif.ferenzeirung der Keimbahnzellen bei den Oopepoden // Arch,Zellforsch,1911,¥.6,P.497-576,

37,Ammermann D, Reisenchromosomen in der Maoronuoleusange des Oiliaten Stylonychia spec,//Naturwissenschaften,1964,Bd,51,S, 249,

38,Ammermann D, Cytologisohe und genetische Untersuchungen an dem Ciliaten Stiloniohia mytilus Ehrenberg //Arch,Protistenk, 1965,Bd.108. S,109-152,

39,Ammermann D, Morphology and development of the macronuclei of the oiliat.es Stylonychia mytilus and Euplotes aediculatus// Chromosoma,1971.V.33,P.209-238,

40,Ammermann D, Chromatin diminution and chromosome eliminationiMechanisms and adaptive significance.In;Cavalier-Smith T. The evolution and genome size.J.Wiley Sons Ltd.New-York,1985,

41,Ammermann D, The contribution of hypotriohous oiliates to our understanding of molecular biology and evolution of oiliates /V Zool, Sei,1990,V.7,P,13-20,

42, Ammermann D,,Steinbruck (3, ,von Berger L,,Hennig W, The

-T i iUL) development of the rnaoronuoieus in the ciliated protozoan Stylonyohia mytilus // Chromosoma.1974,V,45,P,401-429,

43.Baltimore D. Retrovirus and retrotransposon:the role of reverse transcription in shaping the eukaryotio genome // Cell.1985.V.40. P.481-482.

44.Bantock C. Experiments on chromosome elimination in the gall midg,Mayetiola destructor //J.Embryol.Exptl.Morphol. 1970. ¥.24.P.257- 286.

45.Bauer H. Die wachsenden Oocytenkerne einiger Insecten in ihrem verhalten zur Nuklealfarbung // Zs.Zellforsch.1933.V,18, P.286-288.

46.Beermann S, Chromatin diminution bei Copepoden // Chromosoma, 1959, N,10,P.504-514,

47.Beermann S, A quantitative study of chromatin diminution in embryonic mitosis of Cyclops furoifer // Genetics.1968.N. 54. P.567-576.

48.Beermann S, The diminution of heterochromatio chromosomal segments in Cyclops(Crustacea,Copepoda)// Chromosoma,1977,N,60, P.297-344,

49.Beeriiiann S. Circular and linear structures in chromatin diminution of Cyclops // Chromosoma.1984.V.89.N.5.P,321-328.

50.Beermann S. and Meyer G.F. Chromatin rings as products of ohromatn diminution in Cyclops furoifer // Chromosoma.1980.V. tyyy >.| Q p OTfty — OQA f ! , yi . tJ , r , / t £-041 .

51.Beermann W. Differentiation at. the level of the chromosomes// Cell Differentiation and Morphogenesis,- Amsterdam: North

Holland,1966, P.£4-54.

52,Blackburn E,H,Telomeres // The molecular- biology of ciliated Protozoa // Orlando etc, Acad.Press.1986a.P.155-178.

53,Blackburn E.H. Structure and formation of telomeres in Holotrichous ciliates /./ Int,Rev,Cytol, 1986b,¥,99,P,29-47,

54,Bodnar J.W. A doman model for eucariotic DM organisation, a molecular basis for cell differentiation and chromosome evolution // J,Teor.biol.1988,V,132,P,479-507,

55,Boswell R,E,,Jahn C.L. ,Greslin Ä.F. ,Prescot.t D,M,// Nucleic Acids Res.N.11.P.3651-3663.

56,Braun M.1909,Die speyifischen Chromosomenyahlen der einheimischen Arten der Gattung Cyclops //Arch.Yellforsch.1909. N.3.P. 449-482,

57,Britten R,J.,Davidson E.H. Repetetive and non-repetetive DNA sequences and a speciation of the origin of evolutionary novelty // Quart,Rev,Biol,1971,V.49,P,111-138,

58,Brunk C,F, Genome reorganization in Tetrahymena // Int,Rev.Cytol,1986,V,99,P.49-83,

59,Callan H.S. The organisation of genetic units in chromosomes // J.Cell Sei,1967,¥,2,P,1-7.

60,Cullis O.A. Phenotipic consequences of environmentally induced changes in plant DNA // Trends in Genetics.1986,V,2,N,

J. tC.- a a OlJ /" il^i U

61,Chambers R, Egg maturation,chromosomes and spermatogenesis in Cyclops // Univ.Toronto Stud.Biol.Ser.1912.N. 14.P.1-37.

62,Chinnappa G.G. Bivalent forming race of Mesooyclops Edax

Copepoda,Crustacea)//Can.J.Genet.Cytol.1980. V.22.P.427-431.

63.Chinnappa C,C,, Victor R. Cytotaxonomio studies on some cyclopoid copepods (Copepoda,Crustacea) from Ontario,Canada //Canad, J,of ZooL1977.¥.57,N.8.P.1597-1604.

64,Chotia C, Protein families in the melazoan genome // Development, Suppl.1994, P,27-33,

64,Conover R.K.,Brunk C.F, Maoronuclear DNA molecules of Tetrahymena therxfiophila // Mol,Cell,Biol,1986,V,6,P,900-905,

65,Cordeiro M,,Wheeler i,,Lee 0,S,,Kastritsis C.D.,Richardson R.H. Heterochromatic chromosomes and satellite DNA of Drosophila nasutoides // Chromosoma,1975,V,51,P,65-73,

66,Davies A,H,.Carter C.E. Chromatin diminution in Ascaris suums // Exp,Cell Res,1980, V,128,P,59-62,

67,Doolittle W.F.,Sapienza S, Selfish genes,the phenotype paradigm and genome evolution // Nature,1980,V.284,P,601-603,

68,Einsle LL Die Bedeutung der Chromatin-Diminution fur die Systematik der Gattung Cyclops s.str.// Die naturwiss,1962,

V, 49, N. 4, P, 90,

69, Einsle U.Untersuchungen über die Variabilitat von Cyclops furcifer CLAUS //Crustaceana.1963.N.5.P.193-204.

70,Einsle LL Die Gattung Cyclops s.str.im Bodensee/ZArch,Hydro-biol,1964,V,60,P,133-139,

71, Einsle U. Revision der Gattung Cyclops s.str,Speyiell der Abyssorum - Grupp // Mem,1st,Ital.Idrobiol,1975,N,32,P.57-219,

72, Einsle U,,1977,Untersuchungen zum Auftreten von Acanthocyclops robust .us [Crust,Cod,) im Bodensee-ubersee // Arch,Hydrobiol,1977,V,79,N.3,P,382-396,

73,Einsle U.Crustacea:Copepoda:Calanoida und Cyclopoida.Subwasserfauna on Mitteleuropa Bd.8/Heft 4/Teil 1:1-209.Gustav

Fischer Verlag: Stutgart. 1993.

74. Einsle U. Cyclops kikuchii Smirnov,1932 (Oopepoda,

Cyclopoida),eine selbständige art aus suddeutshen gewassera // Crustaoeana.1994a.V.66,N. 2.P.240-246.

75. Einsle ü, Cyclops heberti n.sp.and Cyclops singularis n,sp,,two new species within the genus Cyclops ("strenuus-subgroup")(Crust,Copepoda) from ephemeral ponds in southern Germany// Hydrobiologia,1994b,

76. Esteban M,R,,Giovinazzo G,,Goday C, Chromatin diminution is strictly correlated to somatic cell behavior in early development of the nematode Parasoaris univalens // J,Cell Sei.1995,V,108,P,2393- 2404,

77.Etter A.Aboutanos M,,Tobler H,,Muller F, Eliminated chromatin of Ascaris contains a gene that encodes a putative ribosomal protein // Proc.Nathl.Acad.Sei.USA.1991.V.88.

P.1593-1596.

78.Decosse J.J.,Aiello N. Feulgen hydrolysis effect of acid and temperature // J.Histochem. Cytochem.1966.N. 14,P.601-604.

79.Fedak G. Haploids from barley,rye crosses // Can.J.Genet. Cytol.1977.V.19.N. 1.P.15-19.

80.Finch R.A. Tissue-specific elimination of alternative whole parental genomes in one barley hybrid // Chromosoma,1983.V.88. P,386-393.

Sl.Fux T. Chromosome elimination in Heteropeza pygmaea:2.Ultra-structure of the spindl apparatus // Chromosoma,1974.V,49,

P.99-112.

82,Gabriel M,L. Primitive genetic mechanisms and the origin of chromosomes // Amer.Naturalist.1960.V.54.P.257-269.

83,Gerstel D.U,,Burns J,A. Phenotypic and chromosomal abnormalities associated with the introduction of heterochromatin from Nicotiniana otophora into N.tabacum // Genetics,1967,V,56.

P.483-502,

84,Geyer-Duszynska I, Spinal disappearance and chromosome behavior after partial - embryo irradiation in Ceoidomyiidae (Diptera) // Chromosoma.1961,V,12,P,233-247,

85,Qoday C,,Ciofi-Luzzatto A,,Pimpinelli 3,Centromere ultrastructure in germ-line chromosomes of Parascaris // Chromosoma, 1985.¥.91.P.121-125.

86,Goday C., Gonzalez J,M,3Esteban M,R,,Giovinazzo G,}Pim-pinelli S, Kinetoohores and chromatin diminution in .early embryos of Parascaris univalens // J,Cell Biol.1992.¥.118.N. 1. P. 23-32,

87,Goday C,3Pimpinelli S, The Occurence,Role and Evolution of Chromatin Diminution in Nematodes // Parasitology Today,1993, ¥,9,N. 9.P.319-322,

88,Goldstein P. and Neil S, Molecu!are characterization of Ascaris suum DNÂ and of chromatin diminution // Exp,Cell Res,1976,V,116,N. 2.P,462-466,

89,Gorovsky M, A, Genome organization and reorganization in Tetrahymena // Ann,Rev,Genet,1980,V,14,P,203-239,

90,Graham C.F. The cell oyolle during mammalian development. In; Cell oyole in development and differentiation/ Ed.by M.Bolls,F.S.Fi 11et. Cambridge Univ.press.1973.P.293-310,

91,Bregoire M,,D,Hernandez-Verdum,C,Masson,et al, Interphasio chromosome segregation in micronuclei followed by electron and fluoroohrome H 33342 binding to DNA // Biol,Cell,1982,V,45.N.2. P.123-129,

92,Greslin A.F.,Prescott D.M.,Oka Y,,Loukin S.H.,Chappell J.C. Reording of nine exons is necessary to form a functional actin gene in Oxytricha nova // Proo.Nat,Acad,Sei,USA,1989,V.86. P,6264-6268,

93,Hart1 D,L,,Brown S.W. The origin of male haploid genetic systems and their expected sex ratio /7 Theor,Pop,Biol,1970, V.l.P.165-190.

94,Hayman D.L.and Martin P.G.Comparative Mammalian Cytogenetics (Bernischke,K,ed ).P.191-217.

95,Ho K.M.,Kasha K.J. Genetic control of chromosome elimination during haploid formation in barley // Genetics,1975,V,81,P,263-275,

96,Holrnquist G,P, Evolution of chromosome bands; molecular ecology of nonooding DNA // J,moLevol, 1989,V,28,P,469-486,

97,Huettner A.F. Continuity of the centrioles in Drosophila melanogaster // Z.Zellforsh.Mikrosk.Ariat. 1933a.V. 19.P. 119-134.

98,Huettner A,F,Octoploidy and diploidy in Miastor amerioana// Anat.Reo.1933,V.58.(suppl,).P.8.

99,Hyman L.H. The Invertebrates, Vol,3,Me Graw-Hill.1951.

100,Karrer K, The nuclear- DNA of holotriohous ciliat.es // The molecular biology of ciliated Protozoa .Orlando etc.:Acad.Press,1986,F,85-110,

101,Keyl H.G.,Hagele K, Heteroohromatin-proliferation an den Speicheldrüsen-Chromosomen von Chironomus melanotus // Ohromosoma,1966,V,19, P,223-230,

102,Klobuteher et sL, // Mol,Cell Biol.N.6.P,3606-3613,

103,Klobutcher L.A,,Presoott D.M. The Molecular Biology of Ciliated ProtozoaCGal1,J,G,,ed.).Academic Press,1986,P.111-154,

104,Klobutcher L.A,Mioronuolear organization of macronuolear genes in the hypotriohous oiliate Oxytricha nova // J.Protozool.1987.V.34.P.424-428.

105,Kloetzel I.A. Compartmentalization of the developing maoronuoleus following conjugation in Stylonyohia and Euplotes// J,Cell Biol, 1970.¥.47.P.395-407,

106,Kraut H.,Lips H.J,,Presoott D.M. The genome of hypotriohous oiliates // Int.Rev.Cytol. 1986.V.99.P. 1-28.

107,Levan A, ,-Fredga K, .Sanderson A,A, Nomenclature for oentromerio position on chromosomes // Hereditas,1964,Y,60,

P.269-271,

108,Lewin B, Genes // New Yore,Chichester,Brisbane,1983.P.544.

109,Matscheck H, Uber Eirefung und Eiablage bei Copepoden // Arch, Zellforsch,1910,N,5,P,37-119,

110,Met.calf M.E. • The germ-cell cycle of Phytophaga destructor// Quart. J.Micr.Sei.1935.V.77.P.585-606.

111, Miller O.L.,Bakken A.N. Morphological studies of Transcription // Acta Endocrinol,(Suppl.) 1972,N. 168,P,155-160.

112.Moritz К.В.,Roth 6.E. Complexity of germ line and somatic DNA in Asoaris // Nature.1976.V.259.P.55-57.

113.Mueller F.P.,P.Walker,P.Aeby,H.Neuhaus,E.Back,and Tobler H. Moleoulare cloning and seqeunce analysis of higly repetitive DNA sequenses contained in the eliminated genome of Asoaris lumbriooides // ISBN 0-8451-0163-3.1982.P.127-138.

114. Murti K.G. Organization of genetic material in the maoronuoleus of hypotrichous ciliat.es // Ed.R.C.King.N.Y. ;L.: Plenum press.1976.¥.5. P.113-137.

115. Nakai Y.,Kubota S.,Kohno S, Chromatine diminution and chromosome elimination of four Japanese hagfish species // uytogenet.Cell Genetics,1991.¥.56.P.196-198.

116.Nelson-Rees W.'A. ,Hoy M.A,,Roush R,T, Heterochromatinization, Chromatin elimination and haploidization,in the parahaploid mite Metaseiulus occidentalis, Nesbitt (Acarina:Phytoseiidae)// Chromosoma, V.77.N.3.P.263-276.

117.Ng S.F. Cortical positioning and the fate of oral structures during the sexual process in amicronucleate homopolar tandems of Paramecium // Development,1988,¥.102,

P.587-594,

HS.Nicklas R.B. An experimental and descriptive study of chromosome elimination in Miastor spec,(Cecydomiidae,Diptera)// Chromosoma,1959,¥.10.P.301-336,

119,Oliver J.H.Jr. Cytogenetics of mites and tics /./ Ann,Rev,Entomol. 1977, ¥.22, P,407-429,

119.0rgel L.E.,Crick F.H.C.Selfish DMA:the ultimate parasite//

Nature.1980.V.284.P,604-607,

120.0rias E.,Higashinakagava T.Genome organisation and reorganisation in Ciliated Protozoa//Zoo1. Science Suppl,1990,V,7,P,59-69,

122,Pasternak J.,Barrel R. Quantitation of nuclear DMA in Ascaris lumbricoides: DNA constancy and chromatin diminution // Genet. Res. 1976. V. 27. P. 339-348.

123,Phan H.L. «Forney J. ,Blaokbum E.H. Analysis of Paramecium maoronuclear DNA using pulsed field gel electrophoresis //

J.Protozoologie,1989, V.3B.P.402-408.

124,Pimpinelli S.,Goday C. Unusual kinetoohores and chromatin diminution in Parasoaris // Trends in Genetics.1989,V,5,N,5,

P,310-315.

125,Freer J.R.Update on the molecular genetics of Paramecium// J, ProtozooL 1989,V,36.P. 182-184.

126,Presoott D.M,,Bostook C.J.,Murti K.G, et al, DNA of ciliated protozoa, Electron microscopic and sedimentation analyses of maoronuclear and micronuclear DNA of Stylonyohia mytylus // Chromosoma.1971. V.34.P.355-366,

127,Prescott D,M,.Murti K.G. Chromosome structure in ciliated protozoans // Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.1973.V.38.

P,609-618,

128,Presoott D.M. The unusual organization and processing of genomic DNA in hypotriohous ciliat.es // Trends Genet, 1992,¥.8, N,2,P,439-445,

129,Purasjoki K,,viljamaa H, Acanthocyclops robustus (Copepoda,

-1 -1 p=u j. l

Cyclopoida) in plancton of the Helsinki sea area,and a morphological comparison between A.robustus and A,vernal is // Finn, Mar.Res.1984.V.250.P.33-44.

130,Radsikowski S, Asynchronous replication of polytene chromosome segments of the new maoronucleus aniage in Ohilodonella oucullulus O.F. Müller // Protistologica, 1979, V.15.P.521-526.

131,Raff R.A.,Kaufman 1,0, Embryos,genes,and evolution, Maomillan Publishing Co.,Inc.New York.1983.P.404.

132,Rao M.,Ammermann D, Polytene chromosomes and nucleic acid metabolism during macronuolear development in Euplotes // Chromosoma, 1970,V,29,P,246-254,

133,Rasch E,M,,Barr H,I,,Rasch R.W.The DNA content of sperm of Drosophiia melanogaster //Chromosoma,1971, V.33. P.1-18.

134,Reitberger A, Das verhalten der Chromosomen bei der pedogenetisehen Entwicklung der Cecidomyiidae uligarces paradoxus mit besonderer Berückisehtingung der Chromosomenelimination // Verh.Schweiz.Naturforsch.Ges.1934.V.115.P.359-360.

135,Reitberger A, Die Cytologie des padogenetisehen Entwiokiungszyklus der Gallmucke Oligaroes paradoxus Mein // Chromosoma, 1940,V.l.P.391- 473,

136,Rempel J.G.,Church N.S. The embryology of Lytta viridana Le Conte (Coleoptera,Meloidea).IY.Chromatin elimination.Can.I. Zool.V.47.P.351-353.

137,Rihas-Aparaoio R.M. et al.// Genet.Dev.1987.N. 1.P.323-336.

138,Ris H,5Kleinfeld R, Cytochemical studies on thechromatin elimination: Solenobia (Lepidoptera) // Uhromosoma.1yb2.V.5. p.363-371.

139, Robins I „FL, Abrains G, ,Pinoook I, The structure of Schiff reagent aldehyde adducts and the mechanism of the Schissreaction as determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy // Canad.J,Chem,1980.N.58.P.339.

140,Robins J,FL,McLaren I.A,Unusual variations in nuclear DNA contents in the marine copepod Pseudooalanus//Oan,J,Genet,Oytol. -iqp.9 v P wo-K./in

-i. SL'lv 4 i i ¡vi J 1 a X.t--a

141,Roth G.E. Satellite DNA properties of the germ line limited DNA and the organisation of the somatic genomes in the nematodes Ascaris suum and Parascaris equorum//Chromosoma.1979. V.74.N. 3.P.355-371.

142,Roth M,,Presoott D.M. DNA intermediates and telomere, addition during genome reorganization in Euplotes crassus // Cell,1985.V,41, P.411-417,

143,Rusoh M.E, Untersuchungen über Geschlechtsbestimmungmechanismen bei Oopepoden // Chromosoma,I960,N. 11,P,419-432,

144,Ruthmann A,Division and macronuclei of Keronopsis rubra// J,Protozool,1972.V.19.P.661-666,

145,Shapiro I.A. Natural ggenetic engineering in evolution // Genetica, 1992,¥,86,P,99-111,

146,Simpson E,,Snape J.W.,Finch R.A, Variation between Hordeum bulbosum genotypes in their ability to produce haploids of barley Hordeumvulgare // Z Pflanzenzucht.1980.V.85.P.205-211. 147,Sorsa M,, Suomaiainen E,Electron microscopy of chromatin

•i -i ~ IX f elimination in Cidaria (Lepidoptera) // Hereditas. 197*5.V.80.

N. 1.P.35-40,

148,Spear B,B,,Lauth M.R. Polytene ohromosomes of Oxytriohai biochemical changes during macronuclear development in a ciliated protooan // Chromosoma,1976.V.54.P.1-13. 149.Spicher A.,Etter A,,Bernard V.,Tobler H.5Wuller F. Extremely stable transcripts may compensate for the elimination of the gene Fert-1 from all Ascaris lumbricoides somatic cells // Dev.biol.1994.V.164.P.72-86, 150,Stanley H,P.

151,Steinbruck G, Overamplification of genes in macronuclei of hypotrichous oiliates // Chromosoma,1983,V,88,P,156-163. 152.Steinbruck G.Recent advanes in the study of ciliate genes// Eur. J. Prot ist ol, 1990, V. 26, P, 2-14,

153,Stern H.jHotta . Y. Regulatory mechanisms in meiotic crossingover// Chromosoma,1984,V.89,P,127-137,

154,Stich H. Stoff und Strömungen! der Spindel von Cyclops strenuus // Chromosoma.1954,V,6,P,199-236,

155,Stich H. Variations of the DNA content in embrional cells of Cyclops strenuus // Exp,Cell Res.¥.26,P,136-144,

156,Streeck R.E.5Moritz K.B.,Beer K. Chromatin diminution in sequence of the eliminated satellite DNA .// Nucleic Acids

Res,1982,V,10,N,11,P,3495-3502,

157.Stuart J.J.,Hatchett J.H.Cytogenetics of the Hessian fly:

I.Mitotic karyotype analysis and poiyten chromosome correlations // J.Hered.1988.V.79.P.184-189.

158.Stuart J.J.,Hatohett J.H.Cytogenetics of the Hessian fly:

II,Inheritance and behavior of somatic and germ-line limited chromosomes // J,Hered,1988,V.79,P.190-199.

159.Subrahmanyam N.C. and Kasha S. Selectiv chromosomal elimination during Haploid Formation in Bar-ley Following interspecific hybridization //Chromosoma.1973,¥.42,P,111-125, 160,Sulstons J.E.,Brennes S,Ihe DNA of Caenorhabditis elegans// Genet ics.1974.V.77.P.95-104.

161.Thomas C.Prasad R.S, Chromosome elimination in Ctenocepha-lides orientis (Siphonaptera) // Cytobios.1980.V.29.P.109-114.

162.Tobler H,.Muller F.,Back E.,Aeby P. Germ line soma differentiation in Ascaris: A moleculare approach // Experentia. 1985.V,41,P,1311-1319,

163.Tobler H. The differentiatin of germ and somatic line in nematodes. In book: Hennig W. (Ed.) Results and Problems in cell differetiation,N,Y,USA,1986,Y,13,P,1-70,

164.Tobler H.jEtter A.,Muller F, Chromatin dimdnution in nematode development // Trends in Genetics.1992.¥.8,N,12,

165.Vogt P. Potential genetic functions of tandemly repeated DNA sequence blocks in human genome are based on higly conserved "chromatin folding code" // Human Genetics,1990,¥,84. P,301-336,

166.White M,J,D,Cytological studies on gall midges, Univ.Texas

Publ. 1950- N. 500?. P. 1-80.

167,White M,J,D,Animal Cytology and Evolution,2nd ed,Cambridge: Cambridge Univ,Press,1959,

168,White M,J,D, Cytogenetics and systematic entomology // Ann,Rev, Entomol.1957.N. P.71-90.

169,White M.J.D. Animal cytology and evolution,3-d ed,Cambridge University Press,1973,P,751-758, l?0.Yokoyama R,W,,Yao M,0, Elimination of DNA sequences during maoronuolear differentiation in Tetrahymena thermophila3as detected by in situ hybridization // Ohromosoma,1982,V.85.P.

-1 1 J. -L

171,Zuckerkandl E, Revisiting junk DNA // J,mol,evolution,1992, V,34, P,259-271,