Особенности формирования патогенных вариантов в митохондриальной ДНК человека и подходы к их генетической коррекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Мазунин Илья Олегович

• Мазунин Илья Олегович
• доктор наук
• 2025

Оглавление диссертации доктор наук Мазунин Илья Олегович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы

Цель исследования

Задачи, решаемые в ходе исследования:

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы диссертационного исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности результатов

Апробация работы

Личный вклад автора в проведение исследований

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Публикации по теме диссертации

Объем и структура работы

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Особенности митохондриальной генетики

1.2 Роль митохондриальных мутаций и их сигнатур в биологии и медицине

1.3 Накопление делеций в мтДНК и их связь с заболеваниями и старением

1.4 Подходы и достижения в коррекции мутаций мтДНК

1.4.1 Редактирование варианта m.3243A>G

1.4.2 Редактирование варианта m.8993T>G

1.4.3 Редактирование варианта m.8344A>G

1.4.4 Редактирование варианта m.13513G>A

1.4.5 Редактирование варианта m.14459G>A

1.4.6 Редактирование варианта m.8483-13459del

1.5 Модельные системы, включающие делеции и точковые мутации в мтДНК

1.6 Модификации компонентов CRISPR-Cas для редактирования мтДНК

1.7 Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Биоинформатический анализ: особенности формирования нуклеотидных вариантов в мтДНК

2.1.1 Подготовка набора данных мутационных спектров для митохондриальных генов Хордовых

2.1.2 Реконструкция 192-компонентного мутационного спектра для митохондриальных генов Хордовых

2.1.3 Изучение вторичной структуры мтДНК человека в контексте формирования делеций

2.2 Молекулярная диагностика: особенности распространения патогенных вариантов мтДНК на примере наследственной оптической нейропатии Лебера50

2.3 Разработка методов генной терапии на примере систем CRISPR-Cas

2.3.1 Оптимизация системы CRISPR-Cas9 для нацеливания на мтДНК

2.3.2 Оптимизация системы CRISPR-Cas12a для нацеливания на мтДНК

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Особенности формирования точковых мутаций и делеций в мтДНК

3.1.1 Особенности формирования точковых мутаций в мтДНК

3.1.2 Особенности формирования делеций в мтДНК

3.1.3 Роль мутаций в прямых повторах мтДНК на формирование делеций в мтДНК и продолжительность жизни человека

3.2 Распространение патогенных вариантов мтДНК на примере наследственной оптической нейропатии Лебера

3.3 Разработка методов манипуляций геномом митохондрий человека

3.3.1 Модификация системы CRISPR/Cas9 для сдвига уровня гетероплазмии m.8993T>G

3.3.2 Модификация системы CRISPR/AsCas12а на нацеливания на митохондриальную ДНК клеток человека

ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ

4.1 Особенности формирования точковых мутаций в мтДНК

4.2 Особенности формирования делеций в мтДНК

4.3 Особенности распространение патогенных вариантов мтДНК на примере НОНЛ

4.4 Использование CRISPR-Cas9 для сдвига уровня гетероплазмии

4.5 Использование CRISPR-Cas12a для внесение сайт-направленных делеций в мтДНК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШЕЙ РАЗРАБОТКИ ТЕМЫ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список статей в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России, по тематике диссертации

Список публикаций в других изданиях по тематике диссертации

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности формирования патогенных вариантов в митохондриальной ДНК человека и подходы к их генетической коррекции»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Митохондриальная ДНК (мтДНК) представляет собой уникальный генетический материал, локализованный в митохондриях, специализированных органеллах клетки, отвечающих за производство энергии и множество других важнейших функций, включая регуляцию апоптоза, гомеостаз кальция и синтез некоторых биологически активных молекул [1]. В отличие от ядерного генома, митохондриальный геном характеризуется высоким уровнем полиплоидии, варьирующим от сотен до тысяч копий на клетку, а также преимущественно материнским типом наследования [2]. Локализация митохондриального генома вблизи дыхательной цепи митохондрий делают его особенно уязвимым к повреждениям активными формами кислорода (АФК), в связи с чем, мутации могут накапливаться с возрастом и приводить к развитию целого спектра митохондриальных патологий [3]. Таким образом, изучение возникновения мутаций в мтДНК и их распространение в популяциях человека занимает особое место в современной биологии и медицине.

Согласно современным представлениям, заболевания, обусловленные мутациями мтДНК, составляют значительную часть генетических патологий человека и характеризуются широким разнообразием клинических проявлений, варьирующих от сравнительно легких нарушений до тяжелых нейродегенеративных состояний, таких как синдромы MELAS (OMIM, 540000), MERRF (OMIM, 545000), синдром Лея (OMIM, 256000) и наследственная оптическая нейропатия Лебера (НОНЛ, OMIM, 535000). Такие заболевания часто протекают тяжело и сложно поддаются лечению, что объясняется уникальными свойствами мтДНК. Поскольку в каждой клетке сотни копий мтДНК и все они мутируют независимо, наблюдается смесь мутантной мтДНК и мтДНК дикого типа. Такое состояние носит название гетероплазмия. На степень тяжести заболевания влияют как количество мутантной мтДНК в общем пуле мтДНК в

клетке (пороговый эффект мутации), так и локус, где мутация появилась и закрепилась. Таким образом, изучение основ гетероплазмии помогает понять, как мутации мтДНК передаются по наследству, почему симптомы митохондриальных заболеваний столь вариабельны и какова их потенциальная опасность для будущих поколений.

Подходы к лечению митохондриальных заболеваний в основном направлены на симптоматическое облегчение состояния пациента и редко оказываются эффективными в долгосрочной перспективе. Это обусловлено тем, что большинство терапевтических методов не устраняет первопричину патологии — дефекты мтДНК. В связи с этим необходимы глубокие фундаментальные исследования, направленные на понимание механизмов возникновения и распространения патогенных мутаций, а также разработку новых методов их генетической коррекции [4].

С практической точки зрения разработка методов редактирования мтДНК имеет стратегическое значение. Технологии, позволяющие целенаправленно менять последовательность митохондриального генома, уже используются в качестве исследовательского инструмента для создания модельных организмов. Такие модели помогают глубже понять механизмы действия конкретных мутаций, протестировать гипотезы о влиянии этих изменений на функции клеток и оценить эффективность новых лекарственных соединений. Более того, если научное сообщество научится безопасно и точно «исправлять» патологические варианты мтДНК, это откроет путь к принципиально новым методам генной терапии митохондриальных болезней, в том числе тех, против которых пока нет удовлетворительного лечения.

Особое внимание исследователей привлекают системы редактирования генома, среди которых технологии CRISPR/Cas занимают лидирующие позиции благодаря высокой специфичности и относительной простоте применения [5]. Однако митохондриальный геном человека имеет ряд структурных и функциональных особенностей, усложняющих применение традиционных методов редактирования ДНК. В частности, трудности импорта белковых и РНК-

компонентов CRISPR-систем в митохондриальный матрикс ограничивают использование этих перспективных подходов [6]. Несмотря на достигнутые успехи, многие вопросы о механизмах импорта, эффективности и специфичности действия редакторов в митохондриях остаются недостаточно изученными, что делает эту область крайне перспективной для дальнейших исследований.

Таким образом, фундаментальные исследования мутаций в мтДНК закладывают основу для широкого спектра прикладных разработок - от более точной диагностики и прогнозирования наследственных заболеваний до создания инновационных методов лечения. Уже сегодня эта область активно развивается во многих странах, а результаты таких исследований могут кардинально изменить подход к борьбе со многими тяжелыми патологиями. По этой причине интерес к митохондриальному геному и методам его редактирования продолжает расти, привлекая к себе специалистов из самых разных областей — от генетики и биоинформатики до биомедицины и фармакологии.

Степень разработанности темы

В мировой научной практике накоплен обширный массив данных по митохондриальным заболеваниям, возникающим вследствие точечных мутаций и перестроек в мтДНК [3]. Исследователи установили ключевую роль митохондрий в энергетическом обмене, регуляции апоптоза и множестве других жизненно важных процессов, что и объясняет активное развитие методов генной коррекции патологических изменений мтДНК [4]. Появились доказанные на клеточных моделях подходы, основанные на специфических эндонуклеазах, «цинковых пальцах», технологиях TALEN и модифицированных CRISPR/Cas-системах, способных элиминировать мутантные копии мтДНК и повышать долю мтДНК дикого типа.

Вместе с тем остаются серьезные ограничения, связанные с доставкой РНК-компонентов и белковых комплексов в митохондриальный матрикс, неоднозначностью данных о долгосрочном эффекте редактирования, а также

высокими требованиями к специфичности и безопасности методов. Не до конца ясны молекулярные механизмы, отвечающие за возникновение делеций и точечных замен в мтДНК, а также факторы, определяющие разнообразие их распространения в различных популяциях и гаплогруппах. Кроме того, многие фундаментальные аспекты, касающиеся стабильности уровня гетероплазмии и влияния ядерных генов-модификаторов, требуют дальнейшего изучения.

В связи с этим необходимы дополнительные исследования, которые позволят уточнить природу и эволюцию мутаций в мтДНК, выявить основные «горячие точки» перестроек и разработать эффективные методы точечного редактирования, способные максимально безопасно и результативно восстанавливать функции митохондрий. Именно восполнение этих пробелов в понимании формирования и коррекции патогенных вариантов мтДНК определяет актуальность и научную значимость данной работы.

Цель исследования

Изучить особенности формирования патогенных вариантов в мтДНК человека и возможность разработки эффективных методов их генетической коррекции.

Задачи, решаемые в ходе исследования:

1. Оценить возраст-зависимую динамику асимметричных А^ замен на тяжелой цепи мтДНК и ее связь с уровнем окислительного стресса.

2. Реконструировать спектр точковых замен мтДНК и детально проанализировать его, выделив вклад ошибок митохондриальной полимеразы POLG, повреждений оцДНК и окислительных процессов.

3. Смоделировать трехмерную архитектуру мтДНК и картировать «горячие точки» делеций в областях, обогащенных крупными шпильками и повторами.

4. Проверить, как точечные варианты, изменяющие последовательность прямых повторов, влияют на частоту формирования основной делеции в мтДНК человека.

5. Модифицировать нуклеазу и гидовые РНК системы CRISPR/Cas9 для снижения уровня гетероплазмии т.8993Т^, ассоциированной с синдромом НАРП.

6. Исследовать функциональную активность расщепленной гидовой РНК системы CRISPR/Cas12a при распознавании и гидролизе ДНК мишени.

7. Выяснить, способны ли гидовые РНК для Cas12a, расщепленные и полноразмерные, импортироваться в митохондрии клеток человека без дополнительных сигналов импорта.

8. Разработать подход к внесению сайт-направленных делеций в геном митохондрий человека, используя систему CRISPR/Cas12a.

Научная новизна

Впервые был изучен мутационный спектр мтДНК почти 12 тыс. видов хордовых животных, включая человека, что позволило понять механизмы формирования симметричных и асимметричных нуклеотидных замен, их связь с репликацией и повреждениями мтДНК, а также их роль в метаболизме и физиологических процессах.

Впервые изучено влияние роли вторичной структуры мтДНК на процесс формирования в ней делеций, а также предложена модель этого процесса. Показано, что ряд нуклеотидных замен может существенно менять вероятность возникновения делеций мтДНК.

Впервые показано, что модифицированная для импорта в митохондрии клеток человека система CRISPR/Cas9 может гидролизовать мутантный гаплотип мтДНК (т.8993Т^), приводя к сдвигу уровня гетероплазмии в сторону дикого типа.

Впервые показано, что гидовые РНК, нацеливающие нуклеазу Cas12a на определенный локус в ДНК, могут быть разделены на две части - скаффолдную и спейсерную - без потери функциональной активности системы CRISPR/Cas12a.

Впервые показано, что модифицированная для импорта в митохондрии клеток человека система CRISPR/Cas12a может быть использована для внесения сайт-направленных делеций в мтДНК.

Теоретическая и практическая значимость работы

Рассмотренные механизмы формирования точечных замен, а также предложенная модель формирования делеций в мтДНК позволили значительно расширить представления о природе митохондриальных патологий. В частности, во-первых, мутационный спектр мтДНК разложен на основные компоненты, каждая из которых характеризуется специфичностью нуклеотидных замен в мтДНК. Во-вторых, продемонстрирована роль прямых повторов и шпилечных структур в формировании делеций: оказалось, что именно эти участки наиболее уязвимы к перестройкам. Как следствие, распространенность мутаций мтДНК в человеческой популяции может значительно варьировать в зависимости от этнических и географических факторов, что особо важно при оценке риска развития тех или иных митохондриальных заболеваний.

Прикладное значение работы состоит в том, что полученные результаты прокладывают путь к новым методам лечения митохондриальных болезней. Используя систему CRISPR/Cas9, удалось снизить уровень гетероплазмии точковой мутации m.8993T>G, ассоциированной с синдромом NARP (OMIM, 551500) в цитоплазматической гибридной линии человека. Предложенные модификации нуклеазы SpCas9 и гидовых РНК для ее нацеливания на мтДНК человека зарегистрированы как изобретения с номерами патентов 2634395 и 2717977, соответственно. Модификация системы CRISPR/Cas12a позволила внести в мтДНК клеток человека сайт-направленные делеции, что, с одной стороны, может служить инструментом для создания модельных систем для изучения заболеваний,

обусловленных делециями в мтДНК, а с другой - является доказательством функционирования системы CRISPR/Cas12a в митохондриях. Модификация нуклеазы AsCas12a была зарегистрирована как изобретение с номером патента 2662994.

Методология и методы диссертационного исследования

Методологическую основу работы составили современные подходы к изучению структуры и функций мтДНК, а также механизмов ее мутагенеза и коррекции мутаций, отраженные в зарубежных и отечественных исследованиях. Для обоснования выбранных методов был проведен анализ публикаций, посвященных возникновению и распространению точечных замен и крупных перестроек в мтДНК, а также работ, демонстрирующих возможности доставки нуклеаз и РНК-компонентов в митохондрии. При этом учитывались достижения в области биоинформатики и клеточной инженерии.

Объектами исследования служили клеточные линии человека с патогенным вариантом m.8993T>G мтДНК (NARP, OMIM, 551500), и биоматериал пациентов, страдающих наследственными митохондриальными патологиями различного профиля (НОНЛ). В некоторых экспериментах использовались цитоплазматические гибриды (цибриды), что позволило глубоко изучать эффекты конкретных мутаций и тестировать различные стратегии генного редактирования. Кроме того, для оценки распространенности мутаций у жителей России проводился сбор образцов ДНК у пациентов НОЛН и анализ уровня гетероплазмии мтДНК. Каждый пациент подписал-информированное согласие на обработку генетических данных.

При выполнении исследования применялся широкий спектр молекулярно-генетических, биохимических и клеточных методов. В частности, ПЦР и капельная цифровая ПЦР использовались для детекции и количественной оценки мутаций, а секвенирование по Сенгеру — для точной валидации вариантов, выявленных высокопроизводительным секвенированием (NGS). Технология NGS с целевыми

панелями или экзомным подходом позволяла выявлять как точечные, так и крупные перестройки мтДНК, а параллельный биоинформатический анализ охватывал выявление делеций, оценку частоты гетероплазмии и прогноз функциональных последствий найденных изменений. В исследовании путей генной коррекции особое внимание уделялось модификации систем CRISPR/Cas9 и CRISPR/Cas12a, путем добавления к белковой и РНК компонентам сигналов митохондриальной локализации. Экспериментальная часть включала анализ уровня сдвига гетероплазмии до и после воздействия нуклеаз, оценку функциональных показателей и выявление долгосрочной стабильности редактированных клеточных линий. Статистическая обработка полученных результатов (выполняемая средствами R и Python) базировалась на методах описательной статистики, дисперсионном анализе и подходах коррекции множественных сравнений.

Применение комплексного набора методов, включающих молекулярно-генетические, функциональные и биоинформатические подходы, позволило всесторонне рассмотреть проблему формирования патогенных мутаций мтДНК, оценить их распространенность у жителей России и разработать экспериментальные подходы к точной генетической коррекции, которые могут стать основой для дальнейшей трансляции в клиническую практику.

Положения, выносимые на защиту

1. Мутационный спектр точечных замен в мтДНК подразделяется на три основные группы: симметричные ошибки репликации POLG (C>T, A>G), асимметричные C>T замены, возникающие вследствие повреждений одноцепочечной ДНК, и асимметричные A>G замены, обусловленные дезаминированием аденозина.

2. Формирование делеций в мтДНК определяется не только наличием прямых повторов, но и пространственной структурой ДНК, формирующей

крупномасштабные шпилечные образования, в зонах которых делеции встречаются значительно чаще.

3. Модификация системы CRISPR/Cas9 за счёт присоединения митохондриальной сигнальной последовательности к нуклеазе Cas9 и интеграции в гидовые РНК детерминант митохондриального импорта обеспечивает направленную доставку компонентов в митохондрии, что приводит к достоверному снижению уровня гетероплазмии мутации т.8993С>Т в цитоплазматической гибридной клеточной линии.

4. Модификация системы CRISPR/Cas12 лишь за счёт присоединения митохондриальной сигнальной последовательности к нуклеазе Cas12, но без дополнительных модификаций гидовых РНК обеспечивает направленную доставку компонентов в митохондрии, что приводит к формированию сайт-направленных делеций в мтДНК человека.

Степень достоверности результатов

Достоверность полученных данных обеспечивается репрезентативностью исследуемых объектов (клеточные линии и образцы ДНК, отражающие широкий спектр мутаций мтДНК, в том числе различный уровень гетероплазмии патогенных вариантов) и многократной верификацией ключевых наблюдений. Для исключения случайных эффектов все эксперименты проводились в несколько этапов с контролем качества, а применявшиеся молекулярно-генетические и биохимические методы (ПЦР, секвенирование по Сенгеру, NGS, системы CRISPR/Cas) соответствуют общепринятым протоколам и международным стандартам.

Сопоставление полученных результатов с данными других отечественных и зарубежных групп подтвердило согласованность полученных сведений о патогенных вариантах мтДНК и подходах к их коррекции. Наличие общих тенденций (например, закономерности формирования делеций, распространения точечных замен) говорит в пользу правильности методологических подходов и

корректности статистического анализа, выполненного с учетом критериев множественных сравнений.

Дополнительную надежность придает участие результатов исследования в экспертном рецензировании и их апробация в виде докладов на профильных научных конференциях и публикаций в отечественных и зарубежных изданиях. Это свидетельствует о том, что представленные выводы прошли независимую научную оценку и могут рассматриваться в контексте дальнейших работ по изучению механизмов формирования точечных мутаций в мтДНК, делеций в мтДНК, их распространение и разработке методов их генетической коррекции.

Апробация работы

Материалы исследования были представлены на конференции "Гибридные технологии и биомедицинские приложения" в Калининграде в 2016 году, на конференции "Механизмы регуляции функций органелл эукариотической клетки" в Иркутске в 2018 году, на Международной конференции "Хромосома" в Новосибирске в 2018 году, на XXVIII Ежегодной международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» в Уфе в 2018 году, на III Международной конференции «Наука будущего» и IV Всероссийский молодёжный научный форум «Наука будущего - наука молодых» в Сочи в 2018 году, на Международной конференции «Краеугольные аспекты репродуктивной медицины VII» в Москве в 2019, 2020, 2022, 2023 и 2024 годах, на конференции «Геномное редактирование в медицинской генетике» в 2021 году, на конференции CRISPR-2023 в Новосибирске в 2023, на Всероссийской мультимедийной конференции "Генная терапия: настоящее и будущее" в Москве в 2023 и 2025 годах.

Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета 24.1.168.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова».

Личный вклад автора в проведение исследований

Автором работы сформулирована цель исследования, а также поставлены задачи для ее достижения. Проанализирован колоссальный объем отечественной и иностранной научной литературы по теме диссертационного исследования.

Автор настоящей диссертации непосредственно участвовал в обсуждении и экспериментальном осуществлении анализа модификаций системы CRISPR/Cas9 для направленного импорта её компонентов в митохондрии человека, собственноручно провел эксперименты по модификации нуклеазы Cas9 и впервые открыл и экспериментально подтвердил возможность функционирования расщепленной гидовой РНК, а также принимал непосредственное участие в адаптации и изучении системы CRISPR/Cas12a и показал ее способность эффективно работать в митохондриях с гидовыми РНК без дополнительных модификаций. В исследованиях, посвященных генетической эпидемиологии НОНЛ, автор принимал активное участие в сборе биологического материала, выделении ДНК, проведении секвенирования, интерпретации полученных данных и написании публикаций. Автор участвовал в обсуждении биоинформатического анализа структуры митохондриального генома и патогенных делеций.

Автор выполнял подготовку заявок и отчетов по грантам, обеспечивающим непрерывное финансирование представленных в диссертации исследований.

На основании полученных результатов автором были сформулированы выводы и подготовлена рукопись диссертационного исследования.

Результаты представленной работы опубликованы в рецензируемых российских и иностранных журналах, а также представлены автором лично на российских и международных научных мероприятиях.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует паспорту специальности 1.5.7. — Генетика (биологические науки) — «Молекулярные и цитологические основы

наследственности. Геномы, их структура и функция. Структурная и функциональная геномика. Эволюционная геномика. Методы генетического анализа у прокариот и эукариот. Генетика человека. Медицинская генетика. Наследственные болезни. Генетическая/молекулярно-генетическая

биоинформатика и методы многомерного анализа. Популяционная генетика. Медико-генетическое консультирование. Молекулярно-генетическая диагностика заболеваний человека. Генотерапия». Работа включает в себя обсуждение проблем молекулярной генетики, генетики человека, молекулярно-генетической диагностики и генной терапии.

Публикации по теме диссертации

Материалы диссертационной работы представлены в 32 печатных работах, в том числе в 24 статьях (все Web of Science и/или Scopus, К1 - 3), опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для соискателей ученой степени доктора биологических наук. В опубликованных научных работах и автореферате полностью отражены основные результаты диссертации, положения и выводы. По результатам исследования получено пять патентов на изобретение.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 243 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц, 48 рисунков, а также приложение. Работа состоит из введения, обзора литературы, глав с изложением материалов и методов, результатов исследования, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и библиографического указания, включающего 209 источников, из которых 206 являются зарубежными.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Особенности митохондриальной генетики

Митохондриальная ДНК (мтДНК) представляет собой одну из генетических программ эукариотической клетки и локализуется в специализированных клеточных компартментах — митохондриях, находящихся вне ядра. Принято считать, что мтДНК кодирует 22 транспортные РНК и 2 рибосомальные РНК, необходимые для работы трансляционного аппарата органелл, а также 11 матричных РНК, которые внутри митохондрий транслируются в 13 субъединиц комплексов окислительного фосфорилирования (ОФ). Размер митохондриального генома человека составляет 16,5 тысяч пар нуклеотидов, из которых более тысячи пар участвуют в регуляции транскрипции и репликации [7]. Детальный разбор механизмов транскрипции и трансляции можно найти у других авторов (например, [8]). В последние годы научное сообщество все чаще рассматривает возможность расширения кодирующей способности мтДНК, и новые исследования свидетельствуют о том, что митохондриальный геном может кодировать не только белки, но и некодирующие РНК различной длины [9,10]. Предполагается, что эти молекулы могут функционировать не только внутри митохондрий, но и экспортироваться за пределы органелл, участвуя в регуляции метаболизма на клеточном уровне.

Эти органеллы нередко называют «энергетическими станциями» клетки, однако синтез АТФ в дыхательной цепи — лишь одна из их многочисленных функций (Рисунок 1.1). Митохондрии играют ключевую роль в гомеостазе кальция, синтезе гема и ряда аминокислот, а также в регуляции апоптоза, что делает их критически важными элементами клеточного метаболизма [11]. В связи с этим мутации, затрагивающие гены, связанные с митохондриальной функцией, могут вызывать мультисистемные и полиорганные патологии, объединяемые под общим термином «митохондриальные заболевания». Эти состояния варьируют от хорошо дифференцированных синдромов до симптомокомплексов, которые на первый

взгляд не имеют единой этиологии. По крайней мере в 20% случаев такие заболевания обусловлены мутациями в мтДНК, которые могут возникать спонтанно (de novo) в 25% случаев или передаваться по материнской линии [3,12]. Остальные 80% митохондриальных заболеваний связаны с мутациями в ядерной ДНК и подчиняются Менделевскому типу наследования, что делает их потенциальными кандидатами для стандартных методов генной терапии.

Рисунок 1.1 - Синтез АТФ в дыхательной цепи митохондрий. А. Карта митохондриального генома человека. Указаны гены: субъединицы НАДН-дегидрогеназы (ND1-ND6 и ND4L), цитохром Ь (CYTB), субъединицы цитохром с оксидазы (С01-Ш), субъединицы АТФ-синтазы (АТР6, АТР8), рРНК Ш и ^ и тРНК (обозначены однобуквенным кодом соответствующих аминокислот). ЖР и ЬБР — промоторы тяжёлой и лёгкой цепи; ОН и OL — начала репликации тяжёлой и лёгкой цепи. D-петля — некодирующий участок. В. Схематическое представление окислительного фосфорилирования. Система окислительного фосфорилирования

состоит из пяти комплексов и двух специфических переносчиков электронов: кофермента Q (CoQ) и цитохрома с (cytC). По мере прохождения электронов через дыхательную цепь протоны переносятся из матрикса в межмембранное пространство комплексами I, III и IV, а затем возвращаются обратно в матрикс через комплекс V. Этот процесс позволяет комплексу V синтезировать АТФ из АДФ и неорганического

фосфата (из [4])

Мутации в мтДНК могут быть как точечными заменами нуклеотидов, так и перестройками, включающими делеции, дупликации и инверсии. Точечные замены составляют основную часть патогенных вариантов и демонстрируют значительную клиническую гетерогенность. С одном стороны, мутация m.3243A>G в гене MT-TL1 ассоциирована с различными митохондриальными синдромами, включая MELAS (OMIM, 540000), который характеризуется энцефалопатией, лактат-ацидозом и инсультоподобными эпизодами; CPEO, связанный с прогрессирующей внешней офтальмоплегией (OMIM, 157650); и MIDD, сопровождающийся диабетом и глухотой (OMIM, 520000). C другой стороны, сходные клинические проявления могут вызывать десятки различных точечных замен в мтДНК [13]. Перестройки митохондриального генома, в частности делеции, представляют собой еще один важный класс патогенных изменений мтДНК. По современным данным, примерно половина ооцитов, рекомендованных к переносу, содержит определенный уровень мтДНК с делециями, причем этот показатель возрастает с увеличением возраста матери. Если такие делеции широко распространяются в эмбрионе, у ребенка могут развиться тяжелые митохондриальные заболевания, такие как синдромы Лея, Пирсона, Кернса—Сейра или прогрессирующая внешняя офтальмоплегия. Делеции в клетках дофаминергических нейронов черной субстанции (Substantia nigra) ассоциированы с болезнью Паркинсона. Кроме того, в постмитотических клетках, таких как нервные и мышечные, у всех людей старше 40-50 лет наблюдается накопление делеций мтДНК, что является естественным процессом старения этих тканей [14,15].

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Мазунин Илья Олегович, 2025 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Suomalainen A., Nunnari J. Mitochondria at the crossroads of health and disease // Cell. 2024. Vol. 187, № 11. P. 2601-2627.

2. van den Ameele J. et al. Mitochondrial heteroplasmy beyond the oocyte bottleneck // Seminars in Cell & Developmental Biology. 2020. Vol. 97, P. 156-166.

3. Gorman G.S. et al. Mitochondrial diseases // Nature Reviews Disease Primers. 2016. Vol. 2, 16080.

4. Rimskaya B. et al. Enzymatic tools for mitochondrial genome manipulation // Biochimie. 2025. Vol. 229, P. 114-128.

5. Villiger L. et al. CRISPR technologies for genome, epigenome and transcriptome editing // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2024. Vol. 25, P. 464-487.

6. Jeandard D. et al. Import of Non-Coding RNAs into Human Mitochondria: A Critical Review and Emerging Approaches // Cells. Vol. 8, № 3. 286.

7. Anderson S. et al. Sequence and organization of the human mitochondrial genome // Nature. 1981. Vol. 290, P. 457-465.

8. Gustafsson C.M., Falkenberg M., Larsson N-G. Maintenance and Expression of Mammalian Mitochondrial DNA // Annual Review of Biochemistry. 2016. Vol. 85, P. 133-160.

9. Ren B. et al. Emerging functions of mitochondria-encoded noncoding RNAs // Trends in Genetics. 2023. Vol. 39, № 2. P. 125-139.

10. Wan W. et al. Mitochondria-derived peptide MOTS-c: effects and mechanisms related to stress, metabolism and aging // Journal of Translational Medicine. 2023. Vol. 21, 36.

11. Monzel A.S., Enriquez J.A., Picard M. Multifaceted mitochondria: moving mitochondrial science beyond function and dysfunction // Nature Metabolism. 2023. Vol. 5, P. 546-562.

12. Schon K. et al. Mitochondrial Diseases: A Diagnostic Revolution // Trends in Genetics. 2020. Vol. 36, № 9. P. 702-717.

13. Li D. et al. Pathogenic mitochondrial DNA 3243A>G mutation: From genetics to

phenotype // Frontiers in Genetics. 2022. Vol. 13.

14. Kraytsberg Y. et al. Mitochondrial DNA deletions are abundant and cause functional impairment in aged human substantia nigra neurons // Nature Genetics. 2006. Vol. 38, P. 518-520.

15. Herbst A. et al. Mitochondrial DNA deletion mutations increase exponentially with age in human skeletal muscle // Aging Clinical and Experimental Research. 2020. Vol. 33, P. 1811-1820.

16. Gupta R. et al. Nuclear genetic control of mtDNA copy number and heteroplasmy in humans // Nature. 2023. Vol. 620, P. 839-848.

17. Shoop W.K. et al. Mitochondrial gene editing // Nature Reviews Methods Primers. 2023. Vol. 3, 19.

18. Rausser S. et al. Mitochondrial phenotypes in purified human immune cell subtypes and cell mixtures // eLife. 2021. 10:e70899.

19. D'Erchia A.M. et al. Tissue-specific mtDNA abundance from exome data and its correlation with mitochondrial transcription, mass and respiratory activity // Mitochondrion. 2015. Vol. 20, P. 13-21.

20. Lee W. et al. Molecular basis for maternal inheritance of human mitochondrial DNA // Nature Genetics. 2023. Vol. 55, P. 1632-1639.

21. Kirillova A. et al. The Role of Mitochondria in Oocyte Maturation // Cells. 2021. Vol. 10, № 9. P. 2484.

22. Giacomello M. et al. The cell biology of mitochondrial membrane dynamics // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2020. Vol. 21, P. 204-224.

23. Bogenhagen D.F. Does mtDNA nucleoid organization impact aging? // Experimental Gerontology. 2010. Vol. 45, P. 473-477.

24. Nissanka N., Moraes C.T. Mitochondrial DNA damage and reactive oxygen species in neurodegenerative disease // FEBS Letter. 2018. Vol. 592, № 5. P. 728-742.

25. Mikhailova A. et al. A mitochondria-specific mutational signature of aging: increased rate of A > G substitutions on the heavy strand // Nucleic Acids Research. 2022. Vol. 50, № 18. P. 10264-10277.

26. Gomes T.B. et al. Mechanisms and pathologies of human mitochondrial DNA

replication and deletion formation // Biochemical Journal. 2024. Vol. 481, № 11. P. 683715.

27. Galtier N. et al. Mitochondrial DNA as a marker of molecular diversity: a reappraisal // Molecular Ecology. 2009. Vol. 18, № 22. P. 4541-4550.

28. Ballard J.W., Whirlock M.C. The incomplete natural history of mitochondria // Molecular Ecology. 2004. Vol. 13, № 4. P. 729-744.

29. Ludwig L.S. et al. Lineage Tracing in Humans Enabled by Mitochondrial Mutations and Single-Cell Genomics // Cell. 2019. Vol. 176, № 6. P. 1325-1339.

30. Lareau C.A. et al. Massively parallel single-cell mitochondrial DNA genotyping and chromatin profiling // Nature Biotechnology. 2020. Vol. 39, P. 451-461.

31. Lehmann G. et al. Mitochondrial Genome Anatomy and Species-Specific Lifespan // Rejuvenation Research. 2006. Vol. 9, № 2.

32. Belle E.M.S. et al. An investigation of the variation in the transition bias among various animal mitochondrial DNA // Gene. 2005. Vol. 355, P. 58-66.

33. Montooth K.L., Rand D.M. The Spectrum of Mitochondrial Mutation Differs across Species // PLOS Biology. 2008. Vol. 6, № 8. P. 1634-1637.

34. Ju Y.S. et al. Origins and functional consequences of somatic mitochondrial DNA mutations in human cancer // eLife. 2014. Vol. 3, e02935

35. Muller F.L. et al. Trends in oxidative aging theories // Free Radical Biology and Medicine. 2007. Vol. 43, № 5. P. 477-503.

36. Alexeyev M.F. Is there more to aging than mitochondrial DNA and reactive oxygen species? // FEBS Journal. 2009. Vol. 276, № 20. P. 5768-5787.

37. Pakendorf B., Stoneking M. Mitochondrial DNA and human evolution // Annual Review of Genomics and Human Genetics. 2005. Vol. 6, P. 165-183.

38. Sonal R.S., Weindruch R. Oxidative Stress, Caloric Restriction, and Aging // Science. 1996. Vol. 273, № 5271. P. 59-563.

39. Beckman K.B., Ames B.N. The free radical theory of aging matures // Physiological Reviews. 1998. Vol. 78 P. 547-581.

40. Richter C., Park J.W., Ames B.N. Normal oxidative damage to mitochondrial and nuclear DNA is extensive // PNAS. 1988.Vol. 85, № 17. P. 6465-6467.

41. Houten B.V., Woshner V., Santos J.H. Role of mitochondrial DNA in toxic responses to oxidative stress // DNA Repair. 2006. Vol. 5, № 2. P. 145-152.

42. Yuan Y. et al. Comprehensive molecular characterization of mitochondrial genomes in human cancers // Nature Genetics. 2020. Vol. 52, P. 342-352.

43. Kennedy S.R. et al. Ultra-Sensitive Sequencing Reveals an Age-Related Increase in Somatic Mitochondrial Mutations That Are Inconsistent with Oxidative Damage // PLOS Genetics. 2013. Vol. 9, № 9. e1003794.

44. Calman C. et al. Effect of long-term cold exposure on antioxidant enzyme activities in a small mammal // Free Radical Biology and Medicine. 2000. Vol. 28, № 8. P. 12791285.

45. Ku H-H., Sohal R.S. Comparison of mitochondrial pro-oxidant generation and anti-oxidant defenses between rat and pigeon: possible basis of variation in longevity and metabolic potential // Mechanisms of Ageing and Development. 1993. Vol. 72, № 1. P. 67-76.

46. Rong Z. et al. The Mitochondrial Response to DNA Damage // Frontiers in Cell and Developmental Biology. Vol. 9.

47. Larsen N.B. et al. Nuclear and mitochondrial DNA repair: similar pathways? // Mitochondrion. 2005. Vol. 5, № 2. P. 89-108.

48. Alexeyev M. et al. The Maintenance of Mitochondrial DNA Integrity—Critical Analysis and Update // Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 2013. Vol. 5:a012641.

49. Bohr V.A. et al. Mitochondrial DNA repair of oxidative damage in mammalian cells // Gene. 2002. Vol. 286, № 1. P. 127-134.

50. Zsurka G. et al. Is There Still Any Role for Oxidative Stress in Mitochondrial DNA-Dependent Aging? // Genes. 2018. Vol. 9, № 4. P. 175.

51. Sanchez-Contreras M. et al. A replication-linked mutational gradient drives somatic mutation accumulation and influences germline polymorphisms and genome composition in mitochondrial DNA // Nucleic Acids Research. 2021. Vol. 49, № 19. P. 11103-11118.

52. Sanchez-Contreras M. et al. The multi-tissue landscape of somatic mtDNA

mutations indicates tissue-specific accumulation and removal in aging // eLife. 2023. Vol.12, P. e83395.

53. Iliushchenko D. et al. Deciphering the Foundations of Mitochondrial Mutational Spectra: Replication-Driven and Damage-Induced Signatures Across Chordate Classes // Molecular Biology and Evolution. 2025. Vol. 42, № 2. P. msae261.

54. Koh G. et al. Mutational signatures: emerging concepts, caveats and clinical applications // Nature Reviews Cancer. 2021. Vol. 21, P. 619-637.

55. Kucab J.E. et al. A Compendium of Mutational Signatures of Environmental Agents // Cell. 2019. Vol. 177, № 4. P. 821-836.

56. Moorjani P. et al. Variation in the molecular clock of primates // PNAS. 2016. Vol. 113, № 38. P. 10607-10612.

57. Bender A. et al. High levels of mitochondrial DNA deletions in substantia nigra neurons in aging and Parkinson disease // Nature Genetics. 2006. Vol. 38, P. 515-517.

58. Herbst A. et al. Accumulation of Mitochondrial DNA Deletion Mutations in Aged Muscle Fibers: Evidence for a Causal Role in Muscle Fiber Loss // The Journals of Gerontology: Series A. 2007. Vol. 62, № 3. P. 235-245.

59. Herbst A. et al. Latent mitochondrial DNA deletion mutations drive muscle fiber loss at old age // Aging Cell. 2016. Vol. 15, № 6. P. 1132-1139.

60. Yu-Wai-Man P. et al. Somatic Mitochondrial DNA Deletions Accumulate to High Levels in Aging Human Extraocular Muscles // Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2010. Vol. 51, P. 3347-3353.

61. Blakely E.L. et al. Mitochondrial DNA deletion in "identical" twin brothers // Journal of Medical Genetics. 2004. Vol. 41, № 2. P. e19.

62. Barritt J.A. et al. Mitochondrial DNA rearrangements in human oocytes and embryos // Molecular Human Reproduction. 1999. Vol. 5, № 10. P. 927-933.

63. Chan C.C.W. et al. Mitochondrial DNA content and 4977 bp deletion in unfertilized oocytes // Molecular Human Reproduction. 2005. Vol. 11, № 12. P. 843-846.

64. Vermulst M. et al. DNA deletions and clonal mutations drive premature aging in mitochondrial mutator mice // Nature Genetics. 2008. Vol. 40, P. 392-394.

65. Trifunovic A. et al. Premature ageing in mice expressing defective mitochondrial

DNA polymerase // Nature. 2004. Vol. 429, P. 417-423.

66. Khrapko K., Vijg J. Mitochondrial DNA mutations and aging: a case closed? // Nature Genetics. 2007. Vol. 39, P. 445-446.

67. Vermulst M. et al. Mitochondrial point mutations do not limit the natural lifespan of mice // Nature Genetics. 2007. Vol. 39, P. 540-543

68. Hiona A. et al. Mitochondrial DNA Mutations Induce Mitochondrial Dysfunction, Apoptosis and Sarcopenia in Skeletal Muscle of Mitochondrial DNA Mutator Mice // PLOS One. 2010. Vol. 5, № 7. P. e11468.

69. Nicholas A. et al. On the timing and the extent of clonal expansion of mtDNA deletions: Evidence from single-molecule PCR // Experimental Neurology. 2009. Vol. 218, № 2., P. 316-319.

70. Popadin K. et al. When man got his mtDNA deletions? // Aging Cell. 2014. Vol.13, № 4. P. 579-582.

71. Samuels D.C., Schon E.A., Chinnery P.F. Two direct repeats cause most human mtDNA deletions // Trends in Genetics. 2004. Vol. 20, № 9. P. 393-398.

72. Guo X. et al. Repeats, longevity and the sources of mtDNA deletions: evidence from 'deletional spectra' // Trends in Genetics. 2010. Vol. 26, № 8. P. 340-343.

73. Cortopassi G.A. A neutral theory predicts multigenic aging and increased concentrations of deleterious mutations on the mitochondrial and Y chromosomes // Free Radical Biology and Medicine. 2002. Vol. 33, № 5. P. 605-610.

74. Samuels D.C. Mitochondrial DNA repeats constrain the life span of mammals // Trends in Genetics. 2004. Vol. 20, № 5. P. 226-229.

75. Khaidakov M. et al. Direct repeats in mitochondrial DNA and mammalian lifespan // Mechanisms of Ageing and Development. 2006. Vol. 127, № 10. P. 808-812.

76. Shamanskiy V. et al. Mitochondrial Deletions and Healthspan: Lessons from the Common Repeat // biorXiv. https://doi.org/10.1101/2024.09.02.610808.

77. Albertini A.M. et al. On the formation of spontaneous deletions: The importance of short sequence homologies in the generation of large deletions // Cell. 1982. Vol. 29, № 2. P. 319-328.

78. Persson O. et al. Copy-choice recombination during mitochondrial L-strand

synthesis causes DNA deletions // Nature Communications. 2019. Vol. 10, P. 759.

79. Canela A. et al. Genome Organization Drives Chromosome Fragility // Cell. 2017. Vol. 170, № 3. P. 507-521.

80. Tanaka M. et al. Gene Therapy for Mitochondrial Disease by Delivering Restriction Endonuclease Sma I into Mitochondria // Journal of Biomedical Science. 2002. Vol. 9, № 6. P. 534-541.

81. Gammage P.A. et al. Mitochondrially targeted ZFNs for selective degradation of pathogenic mitochondrial genomes bearing large-scale deletions or point mutations // EMBO Molecular Medicine. 2014. Vol. 6, P. 458-466.

82. Bacman S.R. et al. Specific elimination of mutant mitochondrial genomes in patient-derived cells by mitoTALENs // Nature Medicine. 2013. Vol. 19, P. 1111-1113.

83. Pereira C.V. et al. mitoTev-TALE: a monomeric DNA editing enzyme to reduce mutant mitochondrial DNA levels // EMBO Molecular Medicine. 2018. Vol. 10, P. e8084.

84. Zekonyte U. et al. Mitochondrial targeted meganuclease as a platform to eliminate mutant mtDNA in vivo // Nature Communications. 2021. Vol. 12, P. 3210.

85. Peeva V. et al. Linear mitochondrial DNA is rapidly degraded by components of the replication machinery // Nature Communications. 2018. Vol. 9, P. 1727.

86. Gammage P.A. et al. Near-complete elimination of mutant mtDNA by iterative or dynamic dose-controlled treatment with mtZFNs // Nucleic Acids Research. 2016. Vol. 44, № 16. P. 7804-7816.

87. Schmiderer L. et al. Site-specific CRISPR-based mitochondrial DNA manipulation is limited by gRNA import // Scientific Reports. 2022. Vol. 12, P. 18687.

88. Shoop W.K. et al. Efficient elimination of MELAS-associated m.3243G mutant mitochondrial DNA by an engineered mitoARCUS nuclease // Nature Metabolism. 2023. Vol. 5, P. 2169-2183.

89. Yang Y. et al. Targeted elimination of mutant mitochondrial DNA in MELAS-iPSCs by mitoTALENs // Protein Cell. 2018. Vol. 9, № 3. P. 283-297.

90. Hashimoto M. et al. MitoTALEN: A General Approach to Reduce Mutant mtDNA Loads and Restore Oxidative Phosphorylation Function in Mitochondrial Diseases //

Molecular Therapy. 2015. Vol. 23, № 10. P. 1592-1599.

91. Gaude E. et al. NADH Shuttling Couples Cytosolic Reductive Carboxylation of Glutamine with Glycolysis in Cells with Mitochondrial Dysfunction // Molecular Cell. 2018. Vol. 69, № 4. P. 581-593.

92. Mikczuk M. et al. Development of a single-chain, quasi-dimeric zinc-finger nuclease for the selective degradation of mutated human mitochondrial DNA // Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36, № 12. P. 3926-3938.

93. Mikczuk M. et al. Sequence-specific modification of mitochondrial DNA using a chimeric zinc finger methylase // PNAS. 2006. Vol. 103, № 52. P. 19689-19694.

94. Bacman S.R. et al. mitoTALEN reduces the mutant mtDNA load in neurons // Molecular Therapy Nucleic Acids. 2024. Vol. 35, № 1. P.102132.

95. Bacman S.R. et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation // Nature Medicine. 2018. Vol. 24, P. 1696-1700.

96. Suzuki T., Nagao A., Suzuki T. Human Mitochondrial tRNAs: Biogenesis, Function, Structural Aspects, and Diseases // Annual Review of Genetics. 2011. Vol. 45. P. 299-329.

97. Alexeyev M. et al. Selective elimination of mutant mitochondrial genomes as therapeutic strategy for the treatment of NARP and MILS syndromes // Gene Therapy. 2008. Vol. 15. P. 516-523.

98. Richter U. et al. The molecular pathology of pathogenic mitochondrial tRNA variants // FEBS Letter. 2021. Vol. 595, № 8. P. 1003-1024.

99. Kidere D. et al. Impact of the m.13513G>A Variant on the Functions of the OXPHOS System and Cell Retrograde Signaling // Current Issues Molecular Biology. 2023. Vol. 45, № 3. P. 1794-1809.

100. Santorelli V.M. et al. Identification of a Novel Mutation in the mtDNA ND5 Gene Associated with MELAS // Biochemical and Biophysical Research Communications. 1997. Vol. 238, № 2. P. 326-328.

101. Yahata N., Boda H., Hata R. Elimination of Mutant mtDNA by an Optimized mpTALEN Restores Differentiation Capacities of Heteroplasmic MELAS-iPSCs //

Molecular Therapy. 2021. Vol. 20, P. 54-68.

102. Jun A.S. et al. Use of Transmitochondrial Cybrids To Assign a Complex I Defect to the Mitochondrial DNA-Encoded NADH Dehydrogenase Subunit 6 Gene Mutation at Nucleotide Pair 14459 That Causes Leber Hereditary Optic Neuropathy and Dystonia // Molecular and Cellular Biology. 1996. Vol. 16, № 2. P. 771-777.

103. Lujian S.A. et al. Ultrasensitive deletion detection links mitochondrial DNA replication, disease, and aging // Genome Biology. 2020. Vol. 21, P. 248.

104. Srivastava S., Moraes C.T. Double-strand breaks of mouse muscle mtDNA promote large deletions similar to multiple mtDNA deletions in humans // Human Molecular Genetics. 2005. Vol. 14, № 7. P. 893-902.

105. Fukui H., Moraes C.T. Mechanisms of formation and accumulation of mitochondrial DNA deletions in aging neurons // Human Molecular Genetics. 2008. Vol. 18, № 6. P. 1028-1036.

106. Pickrell A.M. et al. Striatal Dysfunctions Associated with Mitochondrial DNA Damage in Dopaminergic Neurons in a Mouse Model of Parkinson's Disease // Journal of Neuroscience. 2011. Vol. 31, № 48. P. 17649-17658.

107. Pinto M. et al. Mitochondrial DNA damage in a mouse model of Alzheimer's disease decreases amyloid beta plaque formation // Neurobiology of Aging. 2013. Vol. 34, № 10. P. 2399-2407.

108. Kauppila J.H.K. et al. A Phenotype-Driven Approach to Generate Mouse Models with Pathogenic mtDNA Mutations Causing Mitochondrial Disease // Cell Reports. 2016. Vol. 16, № 11. P. 2980-2990.

109. Gammage P.A. et al. Genome editing in mitochondria corrects a pathogenic mtDNA mutation in vivo // Nature Medicine. 2018. Vol. 24, P. 1691-1695.

110. Bacman S.R. et al. MitoTALEN reduces mutant mtDNA load and restores tRNAAla levels in a mouse model of heteroplasmic mtDNA mutation // Nature Medicine. 2018. Vol. 24, P. 1696-1700.

111. Lee H. et al. Mitochondrial DNA editing in mice with DddA-TALE fusion deaminases // Nature Communications. Vol. 12, P. 1190.

112. Guo J. et al. DdCBE mediates efficient and inheritable modifications in mouse

mitochondrial genome // Molecular Therapy Nucleic Acids. 2021. Vol. 27, P. 73-80.

113. Qi X. et al. Expanding DdCBE-mediated targeting scope to aC motif preference in rat // Molecular Therapy Nucleic Acids. 2021. Vol. 32, P. 1-12.

114. Kaminski M.M. et al. CRISPR-based diagnostics // Nature Biomedical Engineering. 2021. Vol, 5. P. 643-656.

115. Wang J.Y., Doudna J.A. CRISPR technology: A decade of genome editing is only the beginning // Science. 2021. Vol. 379, № 6629. P. eadd8643.

116. Jo A. et al. Efficient Mitochondrial Genome Editing by CRISPR/Cas9 // BioMed Research International. 2015. Vol. 2015, P. 305716.

117. Орищенко К.Е. и др. Импорт нуклеазы CAS9 в митохондрии // Гены и Клетки. 2016. Т. 11, № 2. С. 100-105.

118. Anton Z. et al. Mitochondrial import, health and mtDNA copy number variability seen when using type II and type V CRISPR effectors // Journal of Cell Science. 2020. Vol. 133, № 18. P. jcs248468.

119. Nikitchina N. et al. Targeted deletions in human mitochondrial DNA engineered by Type V CRISPR-Cas12a system // NAR Molecular Medicine. 2025. Vol. 2, № 2. P. ugaf021.

120. Loutre R. et al. Anti-replicative recombinant 5S rRNA molecules can modulate the mtDNA heteroplasmy in a glucose-dependent manner // PLOS One. 2018. Vol. 13, № 6. P. e0199258.

121. Dovydenko I. et al. Mitochondrial targeting of recombinant RNA // Methods Molecular Biology. 2015. Vol. 1265, P. 209-225.

122. Wang G. et al. Mitochondria-targeted RNA import // Methods Molecular Biology. 2015. Vol. 1264, P. 107-116.

123. Закирова Э.Г. и др. Изучение влияния детерминант митохондриального импорта в структуре нРНК на активность комплекса нРНК/SpCas9 in vitro // Вавиловский журнал генетики и селекции. 2020. Т. 24. № 5. С. 512-518.

124. Bi et al. Direct evidence of CRISPR-Cas9-mediated mitochondrial genome editing // Innovation. 2022. Vol. 3, № 6. P. 100329.

125. Loutre R. et al. Can Mitochondrial DNA be CRISPRized: Pro and Contra //

IUBMB Life. 2018. Vol. 70, № 12. P. 1233-1239.

126. Bian W. et al. Knock-In Strategy for Editing Human and Zebrafish Mitochondrial DNA Using Mito-CRISPR/Cas9 System // ACS Synthetic Biology. 2019. Vol. 8, № 4. P. 621-632.

127. Hussain S.A. et al. Adapting CRISPR/Cas9 System for Targeting Mitochondrial Genome // Frontiers of Genetics. 2021. Vol. 12, P. 627050.

128. Wang B. et al. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis at microhomologous regions of human mitochondrial genome // Science China Life Sciences. 2021. Vol. 64, P. 14631472.

129. Nikitchina N. et al. Targeting of CRISPR-Cas12a crRNAs into human mitochondria // Biochimie. 2024. Vol. 217, P. 74-85.

130. Gao K. et al. Active RNA interference in mitochondria // Cell Research. 2020. Vol. 31, P. 219-228.

131. Shebanova R. et al. Efficient target cleavage by Type V Cas12a effectors programmed with split CRISPR RNA // Nucleic Acids Research. 2022. Vol. 50, № 2, P. 1162-1173.

132. Lareau C.A. et al. Codon affinity in mitochondrial DNA shapes evolutionary and somatic fitness // bioRxiv. 2023. https://doi.org/10.1101/2023.04.23.537997

133. Efimenko B., Popadin K., Gunbin K. NeMu: a comprehensive pipeline for accurate reconstruction of neutral mutation spectra from evolutionary data // Nucleic Acids Research. 2024. Vol. 52, № W1. P. W108-W115.

134. Leray M., Knowlton N., Machida R.J. MIDORI2: A collection of quality controlled, preformatted, and regularly updated reference databases for taxonomic assignment of eukaryotic mitochondrial sequences // Environmental DNA. 2022. Vol. 4, № 4. P. 894-907.

135. Islam A. et al. Uncovering novel mutational signatures by de novo extraction with SigProfilerExtractor // Cell Genomics. 2022. Vol. 2, № 11. P. 100179.

136. Ng A. et al. Aristolochic acids and their derivatives are widely implicated in liver cancers in Taiwan and throughout Asia // Science Translational Medicine. 2017. Vol. 9, P. eaan6446.

137. Degasperi A. et al. Substitution mutational signatures in whole-genome-sequenced cancers in the UK population // Science. 2022. Vol. 376, P. abl9283.

138. Cai Y. et al. Complex genomic patterns of abasic sites in mammalian DNA revealed by a high-resolution SSiNGLe-AP method // Nature Communications. 2022. Vol. 13, P. 5868.

139. Robinson J.T. et al. Juicebox.js Provides a Cloud-Based Visualization System for Hi-C Data // Cell Systems. 2018. Vol. 6, № 2. P. 256-258.

140. Rao S. et al. A 3D Map of the Human Genome at Kilobase Resolution Reveals Principles of Chromatin Looping // Cell. 2014. Vol. 159, № 7. P. 1665-1680.

141. Zazhytska M. et al. Non-cell-autonomous disruption of nuclear architecture as a potential cause of COVID-19-induced anosmia // Cell. 2022. Vol. 185, № 6. P. 10521064.

142. Zuker M. Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction // Nucleic Acids Research. 2003. Vol. 31, № 13. P. 3406-3415.

143. Lorenz R. et al. ViennaRNA Package 2.0 // Algorithms for Molecular Biology. 2011. Vol. 6, P. 26.

144. Shamanskiy V. et al. ImtRDB: a database and software for mitochondrial imperfect interspersed repeats annotation // BMC Genomics. 2019. Vol. 20, P. 295.

145. Frey B., Dueck D. Clustering by Passing Messages Between Data Points // Science. 2007. Vol, 315. № 5814. P. 972-976.

146. Needleman S.B., Wunsch C.D. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins // Journal of Molecular Biology. 1970. Vol. 48, № 3. P. 443-453.

147. Shamanskiy V. et al. Secondary structure of the human mitochondrial genome affects formation of deletions // BMC Biology. 2023. Vol. 21, P. 103.

148. Sukernik R. et al. Mitochondrial Genome Diversity in the Tubalar, Even and Ulchi: Contribution to Prehistory of Native Siberians and Their Affinities to Arctic Native Americans // American Journal of Physical Anthropology. 2012. Vol. 148, № 1. P. 123138.

149. Behar D.M. et al. A "Copernican" Reassessment of the Human Mitochondrial

DNA Tree from its Root // The American Journal of Human Genetics. 2012. Vol. 90, № 4. P. 675 - 684.

150. van Oven M., Kayser M. Updated comprehensive phylogenetic tree of global human mitochondrial DNA variation // Human Mutation. 2008. Vol. 1039, № 30. P. 386394.

151. Brandon M.C. et al. MITOMAP: a human mitochondrial genome database—2004 update // Nucleic Acids Research. 2005. Vol. 33, № 1. P. 611-613.

152. Ingman M., Gyllensten U. mtDB: Human Mitochondrial Genome Database, a resource for population genetics and medical sciences // Nucleic Acids Research. 2006. Vol. 34. № 1. P. 749-751.

153. Attimonelli M. et al. HmtDB, a Human Mitochondrial Genomic Resource Based on Variability Studies Supporting Population Genetics and Biomedical Research // BMC Bioinformatics. 2005. Vol. 6, P. S4.

154. Li B. et al. Automated inference of molecular mechanisms of disease from amino acid substitutions // Bioinformatics. 2009. Vol. 25, № 21. P. 2744-2750.

155. Pejaver V. et al. Inferring the molecular and phenotypic impact of amino acid variants with MutPred2 // Nature Communications. 2020. Vol. 11, P. 5918.

156. Adzhubei A. et al. A method and server for predicting damaging missense mutations // Nature Methods. 2010. Vol. 7, P. 248-249.

157. Choi Y. et al. Predicting the Functional Effect of Amino Acid Substitutions and Indels // PLOS One. 2012. Vol. 7, № 10. P. e46688.

158. Kumar P., Henikoff S., Ng P.C. Predicting the effects of coding non-synonymous variants on protein function using the SIFT algorithm // Nature Protocols. 2009. Vol. 4, P. 1073-1081.

159. Dussurget O., Roulland-Dussoix D. Rapid, sensitive PCR-based detection of mycoplasmas in simulated samples of animal sera // Applied and Environmental Microbiology. 1994. Vol. 60, № 3. P. 1.

160. Summer S. et al. YBEY is an essential biogenesis factor for mitochondrial ribosomes // Nucleic Acids Research. 2020. Vol. 48, № 17. P. 9762-9786.

161. Whelan D.., Bell T.D. Super-Resolution Single-Molecule Localization

Microscopy: Tricks of the Trade // The Journal of Physical Chemistry Letters. 2015. Vol. 6, № 3. P. 374-382.

162. Bae S., Park J., Kim J. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases // Bioinformatics. Vol. 30, № 10. P. 1473-1475.

163. Gao L. et al. Engineered Cpf1 variants with altered PAM specificities // Nature Biotechnology. 2017. Vol. 35, P. 789-792.

164. Yamano T. et al. Crystal Structure of Cpf1 in Complex with Guide RNA and Target DNA // Cell. 2016. Vol. 165, № 4. P. 949-962.

165. McMahon M.A. et al. Chemically Modified Cpf1-CRISPR RNAs Mediate Efficient Genome Editing in Mammalian Cells // Molecular Therapy. 2018. Vol. 26, № 5. P. 1228-1240.

166. Zetsche B. et al. Multiplex gene editing by CRISPR-Cpf1 using a single crRNA array // Nature Biotechnology. 2017. Vol. 35, P. 31-34.

167. Livak K.J., Schmittgen T.D. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-AACT Method // Methods. 2001. Vol. 25, № 4. P. 402-408.

168. Bolger A., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data // Bioinformatics. 2014. Vol. 30, № 15. P. 2114-2120.

169. Li H., Ruan J., Durbin R. Mapping short DNA sequencing reads and calling variants using mapping quality scores // Genome Research. 2008. Vol. 18, P. 1851-1858.

170. Danecek P. et al. Twelve years of SAMtools and BCFtools // GigaScience. 2021. Vol. 10, № 2. P. giab008.

171. Chintalapati M., Moorjani P. Evolution of the mutation rate across primates // Current Opinion in Genetics & Development. 2000. Vol. 62, P. 58-64.

172. Czernecki D. et al. Reclassification of family A DNA polymerases reveals novel functional subfamilies and distinctive structural features // Nucleic Acids Research. 2023. Vol. 51, № 9. P. 4488-4507.

173. Gavrilov V., Golubeva T., Bushuev A. Evolution of metabolic scaling among the tetrapod: effect of phylogeny, the geologic time of class formation, and uniformity of

species within a class // Integrative Zoology. 2022. Vol. 17, № 5. P. 904-917.

174. Mikhailova A.G. et al. A>G substitutions on a heavy chain of mitochondrial genome marks an increased level of aerobic metabolism in warm versus cold vertebrates // Biorxiv. 2023. https://doi.org/10.1101/2020.07.25.221184.

175. Almatarneh M.H. et al. Computational Study of the Deamination Reaction of Cytosine with H2O and OH- // The Journal of Physical Chemistry A. 2006. Vol. 110. № 26. P. 8227-8234.

176. Sugimura S. et al. Oxidative Phosphorylation-linked Respiration in Individual Bovine Oocytes // Journal of Reproduction and Development. 2012. Vol. 58, №2 6. P. 636641.

177. Degtyareva N.P. et al. Mutational signatures of redox stress in yeast single-strand DNA and of aging in human mitochondrial DNA share a common feature // PLOS Biology. 2019. Vol. 17, № 5. P. e3000263.

178. Koh C.V. et al. Single-nucleotide-resolution sequencing of human N6-methyldeoxyadenosine reveals strand-asymmetric clusters associated with SSBP1 on the mitochondrial genome // Nucleic Acids Research. 2018. Vol. 46, № 22. P. 11659-11670.

179. Harami G.M. et al. Phase separation by ssDNA binding protein controlled via protein-protein and protein-DNA interactions // PNAS. 2020. Vol. 117, № 42. P. 26206-26217.

180. Muñoz-Fuentes V., Di Rienzo A., Vilá C. Prdm9, a Major Determinant of Meiotic Recombination Hotspots, Is Not Functional in Dogs and Their Wild Relatives, Wolves and Coyotes // PLOS One. 2011. Vol. 6, № 11. P. e25498.

181. Finsterer J. Diagnosis of Kearns-Sayre syndrome requires genetic confirmation // Indian Journal of Ophthalmology. 2023. Vol. 71, № 3. P. 1056.

182. Alexe G. Enrichment of longevity phenotype in mtDNA haplogroups D4b2b, D4a, and D5 in the Japanese population // Human Genetics. 2007. Vol. 121, P. 347-356.

183. Wallace D.C. et al. Mitochondrial DNA Mutation Associated with Leber's Hereditary Optic Neuropathy // Science. 1988. Vol 242, № 4884. P. 1427-1430.

184. Мазунин И.О., Володько Н.В. Наследственная оптическая нейропатия Лебера // Вестник Офтальмологии. 2018. T. 134, № 2. C. 92-97.

185. McCormick E.M. et al. Specifications of the ACMG/AMP standards and guidelines for mitochondrial DNA variant interpretation // Human Mutation. 2020. Vol. 41, № 12. P. 2028-2057.

186. Abu-Amero K.K., Bosley T.M. Mitochondrial Abnormalities in Patients with LHON-like Optic Neuropathies // Investigative Ophthalmology & Visual Science. 2006. Vol. 47, P. 4211-4220.

187. Kaltimbacher V. et al. mRNA localization to the mitochondrial surface allows the efficient translocation inside the organelle of a nuclear recoded ATP6 protein // RNA. 2006. Vol. 12, P. 1408-1417.

188. O'Hara R. et al. Quantitative mitochondrial DNA copy number determination using droplet digital PCR with single-cell resolution // Genome Research. 2019. Vol. 29, P. 1878-1888.

189. Hashimasu H. et al. Crystal Structure of Cas9 in Complex with Guide RNA and Target DNA // Cell. 2014. Vol. 156, № 5. P. 935-949.

190. Jeandard D. et al. CoLoC-seq probes the global topology of organelle transcriptomes // Nucleic Acids Research. 2022. Vol. 51, № 3. P. e16.

191. Mekler V., Kuznedelov K., Severinov K. Quantification of the affinities of CRISPR-Cas9 nucleases for cognate protospacer adjacent motif (PAM) sequences // Journal of Biological Chemistry. 2020. Vol. 295, № 19. P. 6509-6517.

192. Chen J.S. CRISPR-Cas12a target binding unleashes indiscriminate single-stranded DNase activity // Science. 2018. Vol. 360, № 6387. P. 436-439.

193. Li S. et al. CRISPR-Cas12a has both cis- and trans-cleavage activities on single-stranded DNA // Cell Research. 2018. Vol. 28, P. 491-493.

194. Vasilev R. et al. Targeted modification of mammalian DNA by a novel Type V Cas12a endonuclease from Ruminococcus bromii // International Journal of Molecular Sciences. 2022. Vol. 23, № 16. P.9289.

195. Simone D. et al. The reference human nuclear mitochondrial sequences compilation validated and implemented on the UCSC genome browser // BMC Genomics. 2011. Vol. 12, P.517.

196. Lee H.R., Johnson K.A. Fidelity of the human mitochondrial DNA polymerase //

Journal of Biological Chemistry. 2006. Vol. 281, № 47. P. 36236-36240.

197. Zou X. et al. A systematic CRISPR screen defines mutational mechanisms underpinning signatures caused by replication errors and endogenous DNA damage // Nature Cancer. 2021. Vol. 2, P. 643-657.

198. Matkarimov B.T., Saparbaev M.K. DNA Repair and Mutagenesis in Vertebrate Mitochondria: Evidence for Asymmetric DNA Strand Inheritance // Mechanisms of Genome Protection and Repair. 2020. Vol. 1241, P. 77-100.

199. Coppede F., Stoccoro A. Mitochondrial DNA Methylation and Human Diseases // International Journal of Molecular Sciences. 2021. Vol. 22, № 9. P. 4594.

200. Karran P., Lindahl T. Hypoxanthine in deoxyribonucleic acid: generation by heat-induced hydrolysis of adenine residues and release in free form by a deoxyribonucleic acid glycosylase from calf thymus // Biochemistry. 1980. Vol. 19, № 26. P. 6005-6011.

201. Wang S., Hu A. Comparative study of spontaneous deamination of adenine and cytosine in unbuffered aqueous solution at room temperature // Chemical Physics Letters. 2016. Vol. 653, P. 207-211.

202. Ericson N.G. et al. Decreased Mitochondrial DNA Mutagenesis in Human Colorectal Cancer // PLOS Genetics. 2012. Vol. 8, № 6. P. e1002689.

203. Mikhailov K.V. et al. Coding palindromes in mitochondrial genes of Nematomorpha // Nucleic Acids Research. 2019. Vol. 47, № 13. P. 6858-6870.

204. Phillips A.F. et al. Single-Molecule Analysis of mtDNA Replication Uncovers the Basis of the Common Deletion // Molecular Cell. 2017. Vol. 65, № 3. P. 527-538.

205. Innan H., Nordborg M. Recombination or Mutational Hot Spots in Human mtDNA? // Molecular Biology and Evolution. 2002. Vol. 19, № 7. P. 1122-1127.

206. Yonova-Doing E. et al. An atlas of mitochondrial DNA genotype-phenotype associations in the UK Biobank // Nature Genetics. 2001. Vol. 53, P. 982-993.

207. Gorman G.S. et al. Mitochondrial donation: from test tube to clinic // Lancet. 2018. Vol. 392, № 10154. P. 1191-1192.

208. Romero P. et al. Pan-American mDNA haplogroups in Chilean patients with Leber's hereditary optic neuropathy. Molecular Vision.. 2014. Vol. 20, P. 334-340.

209. Wang G. et al. PNPASE and RNA trafficking into mitochondria // Biochimica et

Biophysica Acta (BBA) - Gene Regulatory Mechanisms. 2012. Vol. 1819, № 10. P. 9981007.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Таблица 1. Праймеры для наработки ампликона ДНК-матрицы для определения уровня гетероплазмии и сборки плазмиды рАЬ-ТА8993Т

Название Последовательность 5'^3'

Ь8080 TCTTGCACTCATGAGCTGTC

Ь8815 СТСАТТТАСАССААССАССС

Н9819 GCCAATAATGACGTGAAGTCC

Н10598 GTTGAGGGTTATGAGAGTAGC

Таблица 2. Праймеры для сборки плазмиды pAL-TA8993G

Название Последовательность 5'^3'

Я_8993_8БМ TTGAATGAGTAGGCTGATGGTTTC GA TAATAACTAGTATGGG

Б_8993_8ВМ CCAATAGCCCGGGCCGTACGC

Таблица 3. Праймеры для наработки ампликона ДНК-матрицы для подсчета количества копий мтДНК и трансгена mitoSpCas9

Название Последовательность 5'^3'

Б КСОА3 GAGTTTCCTGGACAAATGAG

Я КСОА3 CATTGTTTCATATCTCTGGCG

КСОА3 РгоЬе БАМ 6-БАМ- TCTGGAAGACATAAACGCCAGTCC

Т-БН01

КСОЛЭ РгоЬе НЕХ НЕХ- тстааллалслтлллсасслатсс Т-БН01

Б МТ-М04 ССлТТСТССТССТлТСССТСллС

Я МТ-М04 лсллтстолтоттттооттлллст лтлттт

МТ-М04 РгоЬе 6-БлМ- ссалслтслттлссаааттттсст СТТ[ БН01

Я_Сав9ёё сатлсласлалалататттлаа

Е_Сав9ёё сттсалааллатсатаалтлла

РгоЬе_Сав9ёё_Е 6-блм- тстассслатссттслтсалллаа БН01

РгоЬе_Сав9ёё_Н НЕХ- тстассслатссттслтсалллаа БН01

Таблица 4. Праймеры для наработки Т7 ампликонов

Название Последовательность

Б_Т7_8993 TAATACGACTCACTATAGGGTACT СА TTCAACCAATAGCC

Я_Т7_вЯКА_Сав9 AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC

Таблица 5. Праймеры для линкер-опосредованной ПЦР

Название Последовательность 5'^3'

ЬМР25 GCGGTGACCCGGGAGATCTGTATT С

ЬМР11 GAATACAGATC

ир GGATGAGTACGTGGATTAACC

LOW TCTTGCACTCATGAGCTGTC

Таблица 6. Праймеры для наработки ампликона плазмидной ДНК для последующего секвенирования

Название Последовательность 5'^3'

ибБ GAGGGCCTATTTCCCATGAT

Е_Ашр_§КЫА GCGACACGGAAATGTTGAATAC

М13Б GTTGTAAAACGACGGCCAGTG

М13Я AGCGGATAACAATTTCACACAGG А

Таблица 7. Праймеры и пробы для аллель-специфичной ПЦР для дискриминации мутаций т.8993Т^

Название

Последовательность 5'^3'

Б 8993 ёёРСЯ салллсслтсласстлстслттсл л

Я 8993 ёёРСЯ сстаслатллтаттласааттлаа

РгоЬе 8993 WT НЕХ-Ссллтлассс[т]аассат- БН02

РгоЬе 8993 МТ рлм-ллтлассс[а]аассат-БН01

* в квадратных скобках указан LNA-модифицированный нуклеотид

Таблица 8. Данные цифровой капельной ПЦР (ddPCR) в эксперименте сдвига уровня гетероплазмии в системе mitoCRISPR (СОХ8А-РЬлО-8рСа59/5§ДКл-НР-НБ)

варианты гидовых РНК для трансфекции

повторы по 8§ккл 8§ЯКл-НБ-НБ тоск

1 1950 1725 2077 1830

1886 1789 1917 2038

1965 1725 1944 1880

2 2052 1595 1803 1791

1877 1612 1886 1951

1877 1716 1949 1777

3 2058 1676 1829 1899

1977 1795 1974 1714

1853 1685 1881 1768

Рисунок 1. Сравнительный анализ методов доставки, систем CRISPR и мотивов импорта РНК. (A) Доставка гРНК в клетки путем прямой трансфекции РНК (нижняя часть) или экспрессии из плазмидной ДНК в ядре (верхняя часть). (B) Сравнение систем CRISPR-Cas9 и CRISPR-Cas12a. Примыкающий к протоспейсеру мотив (PAM) показан оранжевым цветом; создаваемые двухцепочечные разрывы обозначены красными треугольниками как в целевой (TS), так и в нецелевой (NTS) цепях ДНК. (C) Мотивы импорта РНК, обнаруженные в человеческой RNase MRP RNA (выделены жёлтым) и в D-шпильке (HD, показана

синим) и F-шпильке (HF, показана коралловым) TPHKALysCUU (tRK1) дрожжей S. cerevisiae.

Рисунок 2. Карта плазмиды pSQT1313 AsCas12a гРНК, кодирующей гРНК AsCas12a, содержащую детерминанты импорта РНК под контролем промотора U6. Плазмида использовалась в качестве матрицы для in vitro транскрипции (создано с помощью программы SnapGene, GSL Biotech). Положения каркаса AsCas12a crRNA-34 и кодирующей спейсер части на карте плазмиды обозначены чёрным и синим прямоугольниками соответственно. Дополнительные 3'-концевые мотивы импорта РНК tRK1 (HD и HF) и RNase MRP RNA (MRP) показаны малиновым цветом. Соответственно, гРНК AsCas12a без дополнительного мотива импорта РНК (crRNA-34-NM) этой части не содержит.

Рисунок 3. Синтетические гРНК AsCas12a с защитными концевыми модификациями. (А) Структуры химически модифицированных нуклеотидов, замененных в гРНК AsCas12a и содержащих 2'-0-метильные (2'-0-Ме) и фосфоротиоатные (PS) группы (адаптировано из МсМа^п, М. А. и др., 2018; DOI: 10.1016/].ymthe.2018.02.031). (В) Пример полной последовательности AsCas12a crRNA-45 с концевыми модификациями 2'-0-Ме и PS. Нуклеотиды с 2'-0-Ме-заменой выделены красным цветом, нуклеотиды с PS-заменой — синим.

Таблица 9. Последовательности нуклеотидов в исследованиях по импорту гРНК в митохондрии

Название Последовательность

F_T7_AsCas12a тллтлсалстслстлтлаатллтттстлстсттатлалт

R_T7_MRP тсттсаслтлааас

R_T7_HD сасаттласслтс

R_T7_HF стсааааалтатс

R_T7_NEG ллстлсслсстлсстсс

RNA5 лалаттталтсстаастслаал

RNA3 лсаласталсалсллсслтаслс

UNI - тллтсстатттастсссслс

L8080 тсттаслстслталастатс

H11381 AAGTGGAGTCCGTAAAGAGG

L3081 GTAATCCAGGTCGGTTTCT

H8361 CTGTAAAGAGGTGTTGGTTC

L7831 CATCCTTTACATAACAGACG

H13555 AGGCGTTTGTGTATGATATGTTTGC

F12981 CCTCCTCCTAGCAGCAGC

H1813 GGTTATAATTTTTCATCTTTCCC

L12640 TCGTTACATGGTCCATCATAG

H15912 TCTCCGGTTTACAAGACTGG

Таблица 10. Последовательности зондов для гибридизации гРНК в митохондриях Название Последовательность 5'^3'

Anti-crRNA-1 GTAGTATGGGAGTGGGAGGG

Anti-crRNA-6 TGTGATAAGGGTGGAGAGGT

Anti-crRNA-10 TTTGTTATGATGTCTGTGTG

Anti-crRNA-14 TTGGGTGCTAATGGTGGAGT

Anti-crRNA-30 ACTCCAAAGACCACATCATC

Anti-crRNA-31 AGCCTAGGGTGTTGTGAGTG

Anti-crRNA-34 GGAAAAGGTTGGGGAACAGC

Anti-crRNA-45 (crRNA-45-spacer) GGTGGGGATCAATAGAGGGG

Anti-crRNA-52 CCTTCTTATTATTTGATCTA

Probe against cytosolic 5.8S rRNA GGCCGCAAGTGCGTTCGAAG

Probe against the mitochondrial tRNAVal GGTCAGAGCGGTCAAG

Таблица 11. Последовательности гРНК

239

Название Последовательность

иллииисилсисииоилолисссиссслсиссслилсилс

crRNA-4 иллииисилсисииаилалиссссослисссссииссллл

crRNA-6 иллииисилсисииаилалилссисисслсссиилислсл

иллииисилсисииаилалисиссалсссссиллсллссс

crRNA-9 иллииисилсисииаилалилсласлсслллисисслсси

crRNA-10 иллииисилсисииаилалислслслалслислиллсллл

crRNA-11 иллииисилсисииаилалилсиисслсисслиллсасис

crRNA-14 иллииисилсисииаилалилсисслсслииласлссслл

crRNA-16 иллииисилсисииаилалилсиислисииасссиислии

crRNA-17 иллииисилсисииаилалиисслиллллиисиисиилаи

crRNA-19 иллииисилсисииаилалиллслилсллллссслссссл

crRNA-21 иллииисилсисииаилалилслаислссссссллсиллс

crRNA -22 иллииисилсисииаилалилсииилслисслллслислс

crRNA-28 иллииисилсисииаилалисилиисассилслсллииси

crRNA-31 иллииисилсисииаилалислсислсллслсссилааси

crRNA-34 иллииисилсисииаилалиасиаииссссллссиииисс

crRNA-39 иллииисилсисииаилалиислиилсиллсллслииисс

crRNA-41 иллииисилсисииаилалиассслсиллассллислсии

crRNA-46 иллииисилсисииаилалиилиаиислллсиаислииии

crRNA-49 иллииисилсисииаилалиисаслссилсаиисллилии

crRNA-51 иллииисилсисииаилалиссаилслиласлслиилсла

crRNA-52 иллииисилсисииаилалиилалислллиллиллаллаа

crRNA-53 иллииисилсисииаилалилисллисассслслислсис

crRNA-56 иллииисилсисииаилалилислсллсллиилисллили

crRNA-57 иллииисилсисииаилалилсилсслсллсисллсааси

crRNA-45 иллииисилсисииаилалиссссисилииалисссслсс

crRNA-30 иллииисилсисииаилалиалиалиаиааисиииаалаи

Таблица 12. Олигонуклеотиды, использованные в экспериментах по внесению сайт-направленной делеции в мтДНК

Название Последовательность 5'^3'

F_pY010 TGACGATGACAAGCTCATGACACAGTTC GAGGGC

R_ pY010 CCTGTCAGCCCTGCTGTTGCGCAGCTCCT GGAT

F_ pMito-Cas9 AGCAGGGCTGACAGGTCC

R_ pMito-Cas9 GAGCTTGTCATCGTCATCCTTG

F_FRT_As GCGCAACTAACCCGCTGATCAGCCTCG

R_FRT_As GGAGGCCATACTAAACGAGCTCGTCGAC GA

F_SuAsCas12ato FRT CGTTTAGTATGGCCTCCACTCGTGT

R_SuAsCas12ato FRT TCAGCGGGTTAGTTGCGCAGCTCCTGGA

F_(d5)CMV TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTG

R_(d5)CMV CGGAACTCCATATATGGGCTATG

F_As_SOD2 CTGGCTCCGGTTTTGGGGTATCTGGGCTC CAGGCAG GACTACAAAGACCATGACGG

R_As_SOD2 CTGCCTGCTGGTGCCGCACACTGCCCGG CTCAACAT GCTAGCGGATCTGACGGT

F_As_ATG4D AAGCCGGACCAGCTTTAGCAAGATCTCC AGCATCCA CCTCTGTGGCCGCCGCTACCGTTTCGACT ACAAAGA CCATGACGG

R_As_ATG4D TTAACCACCCAACCGTACTTGACGTTGTT CCAGGCTG TCAGGAACTTGGCCTTGAACTTCATGCTA GCGGATCT GACGGT

F_As_Su9 ATCCAGACTGGCTCCCCCCTCCAGACCCT CAAGCGC ACCCAGATGACCTCCATCGTCAACGCCA CCACCCGC

R_As_Su9 GGTGCGCTTGCTGACCTGAGCAACGCGG ACAGCAG GGCGGGCAACCTTGGCGGAAGCAGCCAT CCGGGAG

GCCAGGCGAGAGGC GAGGACACGAGTG GAGGCCAT GCTAGCGGATCTGAC

RNA5 AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGA

RNA3 ACGAGCTGACGACAACCATGCAC

UNI - TAATCCTGTTTGCTCCCCAC

L7831 CATCCTTTACATAACAGACG

H13555 AGGCGTTTGTGTATGATATGTTTG

F_12S GCACTTAAACACATCTCTGCC

R_12S TGAGATTAGTAGTATGGGAGTGG

F_TST GACTGGACTCGGGCCATATC

R_TST ACGTGGCAATGAGAGGC TG

L8542 TTCGCTTCATTCATTGCCCCC

H11024 GTGGTTCACTGGATAAGTGGCG

LMPCR1 GCGGTGACCCGGGAGATCTGTATTC

LMPCR2 GAATACAGATC

L7831 CATCCTTTACATAACAGACG

L8342 GAACCAACACCTCTTTACAGTG

H11870 GGGGTAAGGCGAGGTTAGC

H11381 AAGTGGAGTCCGTAAAGAGG

H16000 CTTAGCTTTGGGTGCTAATGG

H15929 TCCGGTTTACAAGACTGGTGTA

L8542 TTCGCTTCATTCATTGCCCCC

H11015 TGGATAAGTGGCGTTGGCTTG

L8542-adptr TCGTCGGCAGC GTCAGATGTGTATAAGA GACAGTTCGCTTCATTCATTGCCCCC

H11015-adptr GTC TCGTGGGC TCGGAGATGTGTATAAG AGACAGTGGATAAGTGGCGTTGGCTTG

L8581 CGCAGTACTGATCATTCTATTTCC

H15929 TCCGGTTTACAAGACTGGTGTA

L8581-adptr TCGTCGGCAGC GTCAGATGTGTATAAGA GACAGCGCAGTACTGATCATTCTATTTCC

H15929-adptr GTC TCGTGGGC TCGGAGATGTGTATAAG AGACAGTCCGGTTTACAAGACTGGTGTA

Таблица 13. Антитела, используемые в экспериментах

Название антитела Поставщик Каталожный номер

Primary antibodies