Коррекция мутации F508del в гене CFTR в клеточных линиях от пациентов с муковисцидозом для разработки этиотропного лечения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Кондратьева Екатерина Владимировна

• Кондратьева Екатерина Владимировна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Кондратьева Екатерина Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Степень разработанности темы

Цель

Задачи исследования

Научная новизна исследования

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности результатов

Апробация результатов

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Личный вклад автора в проведение исследования

Публикации

Структура и объем диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Муковисцидоз

1.1.1 Этиология и патогенез

1.1.2 Современное состояние диагностики и лечения

1.2 Основы генной терапии и редактирования генома

1.2.1 Краткий обзор подхода редактирования генома

1.2.2 Система CRISPR-Cas9

1.2.3 Природные и усовершенствованные нуклеазы Cas9

1.2.4 Репарация ДНК при редактировании генома с помощью CRISPR-Cas9

1.3 Генная терапия и геномное редактирование при муковисцидозе

1.3.1 Введение в генную терапию муковисцидоза

1.3.2 Генная терапия in vivo

1.3.3 Генная терапия ex vivo (генно-клеточная терапия)

1.3.4 Вирусные методы доставки

1.3.5 Невирусные методы доставки

1.3.6 CRISPR-Cas9 в геномном редактировании при муковисцидозе

1.3.7 Нуклеазы цинковых пальцев в геномном редактировании при муковисцидозе

1.3.8 Нуклеазы TALEN в геномном редактировании при муковисцидозе

1.3.9 Пептидонуклеиновые кислоты в геномном редактировании при муковисцидозе

1.3.10 Антисмысловые олигонуклеотиды в генной терапии муковисцидоза .. 58 ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Объекты исследования

2.1.1 CFTE29o-

2.1.2 Линии фибробластов кожи

2.1.3 Линии ИПСК

2.1.4 Линии БКЛ

2.2 Разработка редактирующих систем на основе CRISPR-Cas9

2.2.1 Выбор нуклеазы Cas9

2.2.2 Дизайн и синтез спейсера нРНК

2.2.3 Клонирование спейсеров нРНК

2.2.4 Приготовление химически компетентных клеток

2.2.5 Химическая трансформация

2.2.6 Выделение плазмидной ДНК

2.2.7 Секвенирование плазмид по Сэнгеру

2.2.8 Дизайн одноцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов

2.3 Получение и характеристика ИПСК

2.3.1 Получение и ведение культуры фибробластов

2.3.2 Получение ИПСК методом репрограммирования фибробластов

2.3.3 Анализ цитотоксичности

2.3.4 Выделение нуклеиновых кислот

2.3.5 Дизайн и синтез ПЦР-праймеров

2.3.6 ПЦР и секвенирование ПЦР-продуктов по Сэнгеру для подтверждения генотипа клеток

2.3.7 Обратная транскрипция и ПЦР для анализа элиминации вируса Сендай

2.3.8 Формирование и культивирование эмбриоидных телец (спонтанная дифференцировка ИПСК)

2.3.9 Иммуноцитохимический анализ

2.3.10 Анализ на контаминацию микоплазмой культур клеток

2.3.11 ДНК-электрофорез в агарозном геле

2.3.12 Кариотипирование

2.3.13 Анализ коротких тандемных повторов (анализ STR)

2.4 Геномное редактирование линий CFTE29o-, ИПСК и БКЛ

2.4.1 Ведение клеточной линии CFTE29o-

2.4.2 Трансфекция клеточной линии CFTE29o-

2.4.3 Ведение линий ИПСК

2.4.4 Трансфекция линий ИПСК

2.4.5 Получение и ведение культур БКЛ

2.4.6 Трансфекция линий БКЛ

2.4.7 Проточная цитофлуориметрия

2.4.8 Амплификация участка гена CFTR в области варианта F508del и его глубокое таргетное секвенирование

2.4.9 Анализ результатов глубокого таргетного секвенирования

2.4.10 Статистический анализ для оценки эффективности редактирования

2.5 Анализ нецелевого (off-target) эффекта редактирования на БКЛ

2.5.1 Амплификация участков генома, содержащих предсказанные мишени off-target-эффекта редактирования, и их глубокое таргетное секвенирование

2.5.2 Анализ результатов глубокого таргетного секвенирования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Разработка системы на основе CRISPR-Cas9 для редактирования локуса в области варианта F508del в гене CFTR

3.1.1 Создание редактирующих плазмид, содержащих Cas9 и нРНК

3.1.2 Дизайн одноцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов

3.2 Получение ИПСК из фибробластов кожи больных муковисцидозом с вариантом F508del

3.2.1 Характеристика линии P1L1

3.2.2 Характеристика линии P2L2

3.2.3 Характеристика линии P5L1

3.2.4 Характеристика линии P6L8

3.2.5 Характеристика линии P7L2

3.2.6 Характеристика линии P8L2

3.2.7 Характеристика линии P9L1

3.2.8 Результаты получения ИПСК из фибробластов

3.3 Редактирование гена CFTR в области варианта F508del в клеточной культуре CFTE29o- с использованием различных комбинаций Cas9, спейсеров нРНК и оцОДР

3.3.1 Эффективность НГСК в культуре CFTE29o-

3.3.2 Эффективность НГР в культуре CFTE29o-

3.3.3 Нормализация значений НГСК и НГР на эффективность трансфекции в культуре CFTE29o-

3.3.4 Доля совершенной НГР в культуре CFTE29o-

3.3.5 Результаты редактирования гена CFTR в области варианта F508del в клеточной культуре CFTE29o-

3.4 Редактирование гена CFTR в области варианта F508del в трех культурах ИПСК от больных муковисцидозом с использованием различных комбинаций Cas9, спейсеров нРНК и оцОДР

3.4.1 Эффективность НГСК в ИПСК

3.4.2 Эффективность НГР в ИПСК

3.4.3 Нормализация значений НГСК и НГР в ИПСК на эффективность трансфекции

3.4.4 Доля совершенной НГР в ИПСК

3.4.5 Соотношение НГСК и НГР в ИПСК

3.4.6 Результаты редактирования гена CFTR в области мутации F508del в трех культурах ИПСК

3.5 Редактирование варианта F508del в гене СРТЯ в трех культурах БКЛ от больных муковисцидозом с использованием различных комбинаций Cas9,

спейсеров нРНК и оцОДР

3.5.1 Эффективность НГСК в БКЛ

3.5.2 Эффективность НГР в БКЛ

3.5.3 Нормализация значений НГСК и НГР в БКЛ на эффективность

трансфекции

3.5.4 Доля совершенной НГР в БКЛ

3.5.5 Соотношение НГСК и НГР в БКЛ

3.5.6 Результаты редактирования гена CFTR в области варианта F508del в трех

культурах БКЛ

3.6. Оценка эффекта off-target при редактировании гена CFTR в трех культурах БКЛ

3.6.1 Подходы к оценке off-target-эффекта редактирования генома

3.6.2. Поиск потенциальных off-target-сайтов редактирования генома

3.6.3 Оценка эффекта off-target в предсказанных локусах

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России

Публикации в других изданиях

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Коррекция мутации F508del в гене CFTR в клеточных линиях от пациентов с муковисцидозом для разработки этиотропного лечения»

Актуальность темы исследования

Муковисцидоз (МВ) является одним из самых распространённых наследственных заболеваний: по данным ВОЗ частота заболевания в разных популяциях и этнических группах существенно варьирует, составляя в среднем 1 случай на 2000-2500 новорожденных среди европейцев. Данная патология обусловлена вариантами нуклеотидной последовательности в гене CFTR (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator, муковисцидозный трансмембранный регулятор проводимости) с аутосомно-рецессивным наследованием, частота их носительства достигает 1 на 25 человек [Nazareth, Walshaw, 2013]. Самым частым вариантом является F508del, частота его носительства в России достигает 52% среди больных МВ, в Европе — 60%, в США — 86% [Кондратьева Е.И. и др., 2023]. В результате патогенного варианта в гене CFTR нарушается структура и, соответственно, функция белка CFTR, что приводит к нарушению транспорта ионов хлора и натрия через клеточную мембрану. Это вызывает у пациента нарушения функционирования желёз внешней секреции, а наиболее распространенной формой МВ является лёгочная форма, при которой возникает секреторная недостаточность бронхиального дерева. В результате развивается мукостаз, нарушение вентиляции лёгких, что приводит к ослаблению неспецифического механизма защиты, присоединению респираторной инфекции и формированию множественных бронхоэктазов. Именно дыхательная недостаточность является причиной смерти подавляющего большинства детей и взрослых с МВ [Burney, Davies, 2012].

На сегодняшний день МВ, как и большинство других наследственных заболеваний, не имеет этиотропной терапии. В последние годы медицинские и технологические усовершенствования, такие как ранняя диагностика, специализированная помощь, патогенетические методы лечения и трансплантация легких, привели к увеличению среднего возраста выживания до 37,5 лет (в США)

по сравнению с 1980-ми годами, когда средний возраст выживания составлял около 20 лет. Тем не менее, пациенты вынуждены на протяжении всей жизни принимать муколитики, антибиотики, следить за должным удалением мокроты и бороться с тяжелыми обострениями болезни.

Проблема разработки этиотропной терапии муковисцидоза остается актуальной и по сей день, даже несмотря на совершенствование патогенетической и симптоматической терапии. Применение классической генозаместительной терапии (доставки в клетки функциональной копии гена СЕТЯ) ограничено нефизиологической экспрессией СЕТЯ и кратковременностью эффекта из-за эписомной природы векторов и обновления эпителия дыхательных путей. Между тем, в последние годы широко распространились и продолжают развиваться методы геномного редактирования, позволяющие корректировать конкретные варианты, что потенциально может быть использовано для создания препаратов с длительным терапевтическим эффектом. Эти методы являются технологически не очень сложными, в ряде случаев демонстрируют довольно высокую эффективность и позволяют получить стабильный результат.

В разработке этиотропной терапии муковисцидоза очень важной является проблема поиска подходящих клеток-мишеней для геномного редактирования. Перспективным является применение стволовых клеток, при редактировании генома в которых можно ожидать длительного, если не пожизненного терапевтического эффекта. В этой связи в ряде исследований предпринимались попытки коррекции гена СЕТЯ в индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (ИПСК) и в первичных базальных клетках легкого (БКЛ). Еще более удобной мишенью представляются индуцированные базальные клетки легкого, которые, в отличие от первичных БКЛ, могут быть получены в достаточном количестве из ИПСК и использованы для дальнейшей разработки лечения.

Степень разработанности темы

Разработка этиотропного лечения МВ является крайне актуальной проблемой, а поскольку основной причиной заболевания является патогенный вариант F508del, то на тему его коррекции проводятся исследования во всем мире. Методы геномного редактирования были применены для редактирования гена CFTR и коррекции варианта F508del в разных клеточных культурах, при этом почти во всех исследованиях количество успешно корректированных клеток составляло доли процента или единичные колонии [Crane и др., 2015; Firth и др., 2015; Lee и др., 2012; Palmer, Turner, Ng, 2020; Ramalingam и др., 2013; Schwank и др., 2013]. Тем не менее, в 2019 году наконец получена высокая эффективность исправления варианта F508del в ИПСК с помощью CRISPR-Cas9 в виде рибонуклеопротеиновых комплексов (RNP) с доставкой электропорацией — вариант был исправлен в 12,7% аллелей и в 22% клеток [Ruan и др., 2019]. В 2020 году также удалось высокоэффективно (10-40% клеток) исправить вариант в первичных базальных клетках верхних дыхательных путей и бронхиальных эпителиальных клетках, доставляя CRISPR-Cas9 в виде RNP методом электропорации и донорные молекулы методом вирусной доставки [Vaidyanathan и др., 2020]. Также предпринимаются попытки использовать модифицированные системы редактирования на основе CRISPR-Cas9, такие как праймированное редактирование [Geurts и др., 2020a; Geurts и др., 2020b], а также системы TALEN [Fleischer и др., 2020] и ZFN [Suzuki и др., 2020], но по-прежнему в основном с низкой эффективностью.

Таким образом, сохраняется актуальность применения технологий геномного редактирования, в частности на основе CRISPR-Cas9, которые постоянно развиваются и получают новые модификации, позволяющие увеличить эффективность и специфичность методики, для разработки этиотропной терапии МВ.

10 Цель

Коррекция патогенного варианта F508del в гене СЕТЯ в клетках пациентов с муковисцидозом с использованием технологии CRISPR-Cas9.

Задачи исследования

1. Разработать системы на основе CRISPR-Cas9 для редактирования патогенного варианта Б508ёе1 в гене СЕТЯ.

2. Получить и охарактеризовать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) из фибробластов кожи пациентов с муковисцидозом с патогенным вариантом Б508ёе1 в гене СЕТЯ.

3. Оценить эффективность коррекции патогенного варианта Б508ёе1 и частоту неспецифических изменений в локусе редактирования при использовании различных вариантов CRISPR-Cas9 в клеточной культуре СБТЕ29о-.

4. Оценить эффективность коррекции патогенного варианта Б508ёе1 и частоту неспецифических изменений в локусе редактирования при использовании различных вариантов CRISPR-Cas9 в культурах ИПСК от пациентов с МВ.

5. Оценить эффективность коррекции патогенного варианта Б508ёе1 и частоту неспецифических изменений в локусе редактирования при использовании различных вариантов CRISPR-Cas9 в культурах базальных клеток легкого (БКЛ) от пациентов с МВ.

6. Оценить нецелевую активность CRISPR-Cas9 при коррекции патогенного варианта Б508ёе1 в гене СЕТЯ в культурах БКЛ от пациентов с МВ.

Научная новизна исследования

В литературе описаны попытки коррекции патогенного варианта Б508ёе1 с использованием методов геномного редактирования на основе нуклеаз цинковых пальцев (ZFN) или нуклеаз эффекторов, подобных активатору транскрипции

(TALEN), однако эти инструменты являются трудоемкими и дорогостоящими, поэтому не получили широкого распространения. В последнее десятилетие исследования в области геномного редактирования чаще применяют систему CRISPR-Cas9, однако для данного патогенного варианта они не многочисленны и в большинстве своем демонстрируют низкую эффективность коррекции in vitro [Firth и др., 2015; Palmer, Turner, Ng, 2020; Peters-Hall и др., 2018; Schwank и др., 2013]. Тем не менее, в нескольких работах удалось получить значимые уровни скорректированных аллелей — 1,9% в клетках CFTE29о- [Hollywood и др., 2016], 12,7% в ИПСК [Ruan и др., 2019] и до 40% в первичных базальных клетках верхних дыхательных путей и бронхиальных эпителиальных клетках [Vaidyanathan и др., 2020].

В данной работе использовано три варианта нуклеазы Cas9, которые ранее еще не были протестированы для коррекции патогенного варианта F508del — это два модифицированных варианта SpCas9, которые обладают большей специфичностью по сравнению с SpCas9 дикого типа [Kleinstiver и др., 2016; Slaymaker и др., 2016], а также вариант SaCas9, который благодаря его небольшому размеру потенциально можно доставлять в составе аденоассоциированного вирусного вектора [Ran и др., 2015]. Кроме того, использовано несколько вариантов спейсеров направляющих РНК (нРНК), подобранных самостоятельно, в том числе непосредственно на делецию F508del, что является сравнительно новым подходом и было использовано только в одной работе [Ruan и др., 2019] (в других исследованиях спейсеры нРНК были подобраны не на саму делецию F508del, а на участок рядом с ней, что приводило к нежелательной коррекции аллелей, не несущих эту делецию). В качестве матриц для направленной гомологичной репарации также использовано несколько вариантов одноцепочечных олигодезоксирибонуклеотидов (оцОДР), которые подобраны самостоятельно, в том числе на основании недавно полученных данных [Володина О.В. и др., 2022]. В итоге в данной работе проведено сравнение эффективности девяти комбинаций Cas9, спейсеров нРНК и оцОДР на семи клеточных культурах.

До сих пор были опубликованы данные только о редактировании генома на первичных базальных клетках верхних дыхательных путей. В данной работе впервые показана возможность высокоэффективной коррекции варианта F508del в индуцированных базальных клетках легкого, которые являются одной из наиболее перспективных мишеней для разработки лечения МВ [Palfi и др., 2014].

Теоретическая и практическая значимость

Муковисцидоз является одним из самых распространённых наследственных заболеваний. При этом в настоящий момент средняя продолжительность жизни людей с МВ в России составляет 23,7 года [Кондратьева Е.И. и др., 2023], в США — 37,5 лет, хотя благодаря развитию патогенетической терапии средняя прогнозируемая продолжительность жизни в США для детей, рожденных в 20162020 годах, составляет 59 лет [Annual Data Report 2020 Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry]. Однако патогенетические методы лечения подходят не всем пациентам, так как разработаны для лечения больных с определённым перечнем вариантов в гене CFTR. Препараты являются дорогостоящими и имеют значительные побочные эффекты, а также требуют регулярного применения на протяжении всей жизни. Кроме того, применение препаратов ограничено возрастом. Таким образом, необходимы новые этиотропные методы лечения, а именно генная терапия заболевания.

Полученные данные помогут оценить возможность разработки этиотропного лечения МВ, вызванного самым частым вариантом F508del в гене CFTR, с помощью технологии CRISPR-Cas9, и могут быть использованы при планировании доклинических исследований этого терапевтического подхода.

Плазмиды с четырьмя комбинациями Cas9 и спейсеров нРНК позволяют отрабатывать подходы к редактированию патогенного варианта F508del в различных клеточных культурах для выявления наиболее эффективных систем CRISPR-Cas9 и комбинаций их компонентов.

Показана возможность высокоэффективной коррекции патогенного варианта в индуцированных базальных клетках легкого, которые, в отличие от первичных базальных клеток верхних дыхательных путей, могут быть получены в достаточном количестве из ИПСК и использованы для дальнейшей разработки лечения.

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертационного исследования явилось применение современных знаний и разработок в области редактирования генома человека, методов работы с клеточными культурами, молекулярно-биологических методов, методов анализа данных NGS и статистических методов. При создании редактирующих систем в основу работы легли научные разработки зарубежных исследователей в области усовершенствования CRISPR-Cas9 для редактирования генома. При создании линий ИПСК использованы критерии Международного реестра плюрипотентных клеток человека hPSCreg. При обработке данных глубокого таргетного секвенирования использован алгоритм на основании программы CRISPResso2.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработано девять систем на основе CRISPR-Cas9 для редактирования патогенного варианта F508del в гене СЕТЯ.

2. Получено и полностью охарактеризовано семь линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) от пациентов с муковисцидозом с патогенным вариантом F508del в гене СЕТЯ.

3. Наиболее эффективным вариантом CRISPR-Cas9 в клеточной культуре CFTE29o- является комбинация, включающая нуклеазу SpCas9(HF4), спейсер направляющей РНК sgCFTR#1 и одноцепочечный олигодезоксирибонуклеотид (оцОДР) ssODN#1, эффективность коррекции патогенного варианта составляет

2,8% аллелей. Все варианты редактирования продемонстрировали низкую частоту неспецифических изменений, не отличающуюся от нетрансфицированного контроля.

4. Наиболее эффективным вариантом CRISPR-Cas9 в линиях ИПСК и базальных клеток легкого (БКЛ) является комбинация, включающая нуклеазу eSpCas9(1.1), спейсер направляющей РНК sgCFTR#1 и оцОДР ssODN#3, эффективность коррекции патогенного варианта составляет 1,3-5,9% аллелей для ИПСК и 13,9-19,8% аллелей — для БКЛ. Ожидается, что эффективность коррекции мутации в 10% аллелей может приводить к клиническому эффекту при лечении муковисцидоза.

5. Комбинация, включающая нуклеазу eSpCas9(1.1), спейсер направляющей РНК sgCFTR#1 и оцОДР ssODN#3, вызвала неспецифические изменения в локусе редактирования в 6,9-30,6% аллелей в ИПСК и в 18,4-19,5% аллелей в БКЛ.

6. Наиболее эффективные варианты CRISPR-Cas9, используемые в данной работе, не демонстрируют неспецифической активности в геноме при редактировании F508del в гене СЕТЯ в линиях БКЛ от пациентов с муковисцидозом.

Степень достоверности результатов

Для достижения высокого уровня достоверности эксперименты были проведены в нескольких технических и биологических репликах с последующим анализом полученных данных с применением современных статистических методов. Цели и задачи работы сформулированы на основе актуальных данных в области молекулярной биологии и генетики. Для теоретического обоснования и сравнительного анализа использован широкий спектр отечественных и зарубежных литературных источников. В работе применялись современные методы исследования и сертифицированное оборудование. Результаты, полученные автором, свидетельствуют о выполнении поставленных задач, и их интерпретация подробно отражена в выводах.

Апробация результатов

Основные результаты диссертационной работы представлены на конференции молодых ученых при ФГБНУ «МГНЦ» (Москва, 2019 г.), конференции ESHG (Гетеборг, 2019 г.), конференции FEBS (Краков, 2019 г.), XV Национальном конгрессе «Инновационные методы диагностики и терапии муковисцидоза. Прорыв в будущее» (Суздаль, 2021 г.), Всероссийской мультимедийной конференции «Генная терапия» (Москва, 2022 г.) и на Международном Конгрессе «VIII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров» (Саратов, 2024 г). Диссертация апробирована и рекомендована к защите на совместном межлабораторном заседании Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует паспорту специальности 1.5.7. Генетика (медицинские науки). 13. Генетика соматических клеток. Репрограммирование стволовых/соматических клеток. 14. Генетические основы биотехнологии. Генетическая и клеточная инженерия. Генетически модифицированные организмы. 19. Генетика человека. Медицинская генетика. Наследственные болезни. Генетическая терапия. Работа включает в себя обсуждение проблем генетики человека, медицинской генетики, наследственных болезней, принципов генной терапии, генетической инженерии, репрограммирование соматических клеток.

Личный вклад автора в проведение исследования

Автор работы участвовала во всех стадиях исследовательской работы: в формулировании цели и задач, разработке схемы и порядка проведенных

исследований, выборе методик работы, статистическом анализе полученных данных. Автором исследования получена часть плазмидных конструкций методами генной инженерии (ПЦР, клонирование). Автор принимала непосредственное участие в культивировании линий фибробластов и СБТЕ29о-, создании всех культур ИПСК и получении полной характеристики ИПСК молекулярно-биологическими методами (ПЦР, ОТ-ПЦР, ИЦХ). Автор провела трансфекцию всех культур, подготовила биологический материал для глубокого таргетного секвенирования и проанализировала все полученные результаты глубокого таргетного секвенирования.

Автором изучена и обработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Автор опубликовала результаты исследования в рецензируемых журналах, а также представила их на научных конференциях.

Публикации

Материалы диссертационной работы представлены в 16 печатных работах, в том числе в 10 статьях (все Web of Science и/или Scopus, К1 — 1, К2 — 1), опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук. В опубликованных научных работах полностью отражены основные результаты диссертации, положения и выводы.

Структура и объем диссертации

Диссертация имеет следующую структуру: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации, список сокращений и условных обозначений, список публикаций по теме диссертации, список литературы, приложение. Работа представлена на 225 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, 23

рисунка и 1 приложение. Библиографический указатель включает 312 наименований, из них 7 отечественных и 305 иностранных источников.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Муковисцидоз

1.1.1 Этиология и патогенез

Муковисцидоз (МВ) — тяжелое системное моногенное аутосомно-рецессивное заболевание. К его развитию приводят патогенные варианты в гене CFTR, кодирующем трансмембранный регулятор проводимости, который расположен в локусе 7q31.2. Белок CFTR относится к суперсемейству ABC-транспортеров (АТФ-связывающих кассетных транспортеров) и функционирует как активируемый протеинкиназой А ионный канал, обеспечивающий пассивную диффузию ионов хлора (Cl-) [Anderson и др., 1991] и бикарбонат-ионов (HCO3-) [Choi и др., 2001; Ishiguro и др., 2009]. Этот канал вовлечен в транспорт солей и жидкости в различных органах, в частности, функционирует на апикальной мембране эпителиальных клеток [Berger и др., 1991; Choi и др., 2001]. Белок состоит из пяти доменов: двух трансмембранных (TMD1 и TMD2), двух нуклеотидсвязывающих (NBD1 и NBD2) и регуляторного (R) домена [Corradi, Vergani, Tieleman, 2015]. Патогенные варианты гена CFTR, приводящие к нарушениям строения или отсутствию молекулы канала, обусловливают развитие МВ [Derichs, 2013]. Основная гипотеза, объясняющая связь между дефектным CFTR и процессами, развивающимися в легких при МВ, заключается в том, что потеря CFTR-опосредованной секреции Cl- вызывает дегидратацию поверхности дыхательных путей как из-за снижения CFTR-опосредованного Cl-, так и из-за секреции жидкости и вторичного увеличения ENaC (эпителиальный №+-канал)-опосредованной абсорбции Na+ и жидкости [Boucher, 2007; Nam и др., 2006]. В результате дегидратация становится ключевым фактором, вызывающим неправильное сворачивание муцина и формирование вязкого секрета [Abdullah и др., 2017]. Кроме того, дефектная секреция Cl-/HCO3- через CFTR изменяет вязкость слизи и способствует ее прикреплению к эпителию дыхательных путей

[Hoegger и др., 2014]. Недостаточное подщелачивание внеклеточной среды может также аномально снижать рН сурфактанта, что уменьшает активность эндогенных противомикробных факторов и дефензинов [Pezzulo и др., 2012; Stoltz и др., 2010].

Патогенные варианты гена CFTR разделяют на 7 функциональных классов (Таблица 1), которые можно сгруппировать в три основные категории. К первой относятся формы, не способные накапливаться на поверхности клетки из-за нарушенного биосинтеза (класс I и класс V) или из-за дефектного сворачивания белка в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) (класс II). Ко второй категории относятся формы, которые экспрессируются на поверхности клетки, но не способны переносить ионы Cl- из-за дефекта активации (класс IV) или проводимости канала (класс III). В третью категорию можно выделить некоторые усеченные формы CFTR, при которых биосинтез и функция хлоридного канала, по-видимому, сохранены, но стабильность их зрелой, комплексно-гликозилированной, формы резко снижена. Варианты классов I и II наиболее распространены (22% и 88% пациентов с МВ, соответственно, являются носителями по меньшей мере одного из них); варианты классов III и IV встречаются редко (1-5% вариантов у пациентов с МВ), а варианты классов V и VI — очень редки (< 1% вариантов у пациентов с МВ) [Hull, 2012]. Класс I делят на 2 подгруппы: IA включает варианты, препятствующие синтезу матричной РНК (мРНК), например, варианты в промоторе гена; IB включает варианты, нарушающие трансляцию белка, например, варианты со сдвигом рамки считывания, варианты сплайсинга или нонсенс-варианты, которые вводят преждевременные стоп-кодоны, что приводит к серьезному снижению или полному отсутствию экспрессии CFTR. Варианты класса II приводят к изменениям, влияющим на созревание белка CFTR и его процессинг в ЭР и системах Гольджи, в результате чего почти весь белок подвергается деградации и рециркулирует, и лишь небольшое количество может попасть на поверхность клетки. При этом аминокислотные замены также могут влиять на функцию (то есть добавляются эффекты классов III, IV или VI) белка, который попадет на поверхность клетки. Варианты класса III нарушают регуляцию канала CFTR, вызывая аномальное

гейтирование (открытие и закрытие) канала с уменьшенной вероятностью его открытия. Варианты класса IV изменяют ионную проводимость канала, снижая унитарную проводимость [Hämmerle, Aleksandrov, Riordan, 2001; Sheppard и др., 1993]. Варианты класса V не изменяют конформацию белка, но уменьшают его количество за счет нарушения работы промотора или аномалий сплайсинга [Highsmith и др., 1994; Zielenski, Tsui, 1995]. Наиболее распространенными в этой группе являются варианты, которые снижают эффективность сплайсинга мРНК CFTR, но все же разрешают нормальный сплайсинг некоторой части белка. Варианты класса VI дестабилизируют канал в компартментах после ЭР и/или в плазматической мембране (ПМ), уменьшая его конформационную стабильность [Haardt и др., 1999] и/или создавая дополнительные сигналы интернализации [Silvis и др., 2003], что приводит к ускоренному обороту белка в ПМ и уменьшению его экспрессии в апикальной ПМ.

Таблица 1 — Классификация патогенных вариантов в гене CFTR

Класс мутаций Дефект Примеры вариантов

IA Нарушение формирования мРНК Dele2,3, 1717-1G>A

IB Нарушение формирования функционального белка G542X, W1282X

II Нарушение транспорта белка F508del, N1303K, I507del

III Нарушение открытия канала G551D, S549N, R560T

IV Уменьшение проводимости канала D1152H, R347P, R117H

V Недостаточное количество белка 3849+10kb C>T, 2789+5G>A, A455E

VI Нестабильность белка N287Y, Q1412X

В дополнение к приведенной выше классификации, некоторые пациенты с МВ могут иметь компаунд-гетерозиготные патогенные варианты; однако их можно классифицировать в соответствии с тем, какой вариант обладает доминирующим

эффектом. Например, пациент с вариантами G542X (класс I) и F508del (класс II) попадает в класс I, так как вариант G542X имеет доминирующий функциональный эффект [Ahmed и др., 2003]. Варианты класса IV и V являются функционально доминирующими, когда сочетаются с вариантами классов I, II или III [Rogan, Stoltz, Hornick, 2011].

Наиболее распространенным вариантом среди больных МВ является вариант F508del. В США 85,5% всех пациентов с МВ являются носителями данного варианта [Cystic Fibrosis Foundation], в России согласно Регистру больных муковисцидозом Российской Федерации — 52% [Кондратьева Е.И. и др., 2023]. Этот вариант вызывает нарушение посттрансляционной модификации и транспорта белка, что ведет к его деградации ещё до достижения ПМ [Lukacs и др., 1994], а достигшие мембраны молекулы функционально неполноценны и нестабильны [Goor Van и др., 2006].

Отсутствие или дефекты белка CFTR приводят к развитию эпителиальной дисфункции. Нарушение работы каналов ионов хлора приводит к повышенной вязкости секретов желез внешней секреции, при этом почти все экзокринные железы вовлекаются в патологический процесс в той или иной степени. Железы могут подвергаться обтурации вязким или твердым материалом в просвете, что характерно для поджелудочной железы, кишечных желез, внутрипеченочных желчных протоков, желчного пузыря и подчелюстных желез.

Тяжесть клинической картины обусловлена в первую очередь поражением дыхательной системы — качество и продолжительность жизни определяются нарушением функции легких и постоянными легочными инфекциями. Хотя гистологически легкие при рождении чаще нормальны, у большинства пациентов патология дыхательной системы развивается в младенчестве или раннем детстве. Тампонада слизью и хроническая бактериальная инфекция сопровождаются выраженным воспалительным ответом и повреждением дыхательных путей, что в конечном счете приводит к бронхоэктазам и дыхательной недостаточности. Течение заболевания характеризуется эпизодическими обострениями бронхолегочного процесса и прогрессирующим снижением функции легких.

Постепенно формируются бронхиолиты, хроническое воспаление, повышенная реактивность бронхов, хроническая гипоксия, приводящая в свою очередь к мышечной гипертрофии легочных артерий, легочной гипертензии и гипертрофии правого желудочка [Elborn, 2016].

Как уже упоминалось, при муковисцидозе в патологический процесс часто вовлекаются поджелудочная железа, кишечник, гепатобилиарная система. Экзокринная функция поджелудочной железы нарушена у 85-95% больных, что приводит к нарушению всасывания белков и жиров и развитию кахексии [Goodman, Percy, 2005]; эндокринная функция страдает реже, однако нарушение толерантности к глюкозе или сахарный диабет выявляются примерно у 2% детей, 20% подростков и до 40% взрослых. Вовлечение желчных протоков с застоем желчи и желчной тампонадой приводит к бессимптомному фиброзу печени у 30% пациентов [Colombo, 2007]. Однако, несмотря на то что симптомы поражения желудочно-кишечного тракта наблюдаются практически у всех пациентов, они хорошо поддаются коррекции существующими лекарственными препаратами, в частности заместительной ферментной терапией, вследствие чего фенотип пациентов МВ обусловлен преимущественно поражением легких.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Кондратьева Екатерина Владимировна, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Володина О.В. и др. Рациональный дизайн одноцепочечного олигодезоксирибонуклеотида, используемого для коррекции мутаций при геномном редактировании // Биохимия. 2022. Т. 87. № 5. C. 617-626.

2. Демченко А.Г. Получение и характеристика 2D- и BD-культур клеток респираторного эпителия из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека для моделирования и разработки терапии муковисцидоза: дисс. ... канд. биол. наук: 1.5.7 - Москва, 2024. - 144 с.

3. Каширская Н.Ю. Капранов Н. И. Современные фармакотерапевтические подходы к лечению муковисцидоза // Фарматека. 2014. №2 3. С. 38-43.

4. Кондратьева Е.И. и др. Российский регистр пациентов с муковисцидозом: уроки и перспективы // Пульмонология. 2023. Т. 33. № 2. C. 171181.

5. Рыжкова О. П. и др. Руководство по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS) (редакция 2018, версия 2). // Медицинская генетика. 2019. Т. 18. № 2. C. 3-23.

6. Смирнихина С. А. и др. Моделирование муковисцидоза в клеточной культуре HEK293T и разработка способа коррекции мутации F508del // Медицинский вестник Северного Кавказа. 2020. Т. 15. № 2. С. 158-162.

7. Честков В.В., Табаков В.Ю., Щепкина Ю.В. Амниокар -пролиферативная среда для мезенхимальных клеток // Успехи молекулярной онкологии. 2014. Т. 1 № 2. C. 74-78.

8. Abdullah L. H. и др. Defective postsecretory maturation of MUC5B mucin in cystic fibrosis airways // JCI insight. 2017. Т. 2. № 6. C. e89752.

9. Accurso F. J. и др. Sweat chloride as a biomarker of CFTR activity: Proof of concept and ivacaftor clinical trial data // Journal of Cystic Fibrosis. 2014. Т. 13. № 2. C. 139-147.

10. Adikusuma F. h gp. Large deletions induced by Cas9 cleavage // Nature 2018 560:7717. 2018. T. 560. № 7717. C. E8-E9.

11. Ahmed N. h gp. Molecular consequences of cystic fibrosis transmembrane regulator (CFTR) gene mutations in the exocrine pancreas // Gut. 2003. T. 52. № 8. C. 1159-1164.

12. Alapati D. h gp. In utero gene editing for monogenic lung disease // Science translational medicine. 2019. T. 11. № 488.

13. Allen F. h gp. Predicting the mutations generated by repair of Cas9-induced double-strand breaks // Nature Biotechnology. 2019. T. 37. № 1. C. 64-82.

14. Alton E. W. h gp. A randomised, double-blind, placebo-controlled trial of repeated nebulisation of non-viral cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene therapy in patients with cystic fibrosis // Efficacy and Mechanism Evaluation. 2016. T. 3. № 5. C. 1-210.

15. Alton E. W. F. W. h gp. Cationic lipid-mediated CFTR gene transfer to the lungs and nose of patients with cystic fibrosis: A double-blind placebo-controlled trial // Lancet. 1999. T. 353. № 9157. C. 947-954.

16. Alton E. W. F. W. h gp. Repeated nebulisation of non-viral CFTR gene therapy in patients with cystic fibrosis: A randomised, double-blind, placebo-controlled, phase 2b trial // The Lancet Respiratory Medicine. 2015. T. 3. № 9. C. 684-691.

17. Alton E. W. F. W. h gp. Preparation for a first-in-man lentivirus trial in patients with cystic fibrosis // Thorax. 2017. T. 72. № 2. C. 137-147.

18. Amato F. h gp. Gene Mutation in MicroRNA Target Sites of CFTR Gene: A Novel Pathogenetic Mechanism in Cystic Fibrosis? // PLoS ONE. 2013. T. 8. № 3. C. e60448.

19. Anderson M. P. h gp. Nucleoside triphosphates are required to open the CFTR chloride channel // Cell. 1991. T. 67. № 4. C. 775-784.

20. Anne E. h gp. Restoration of F508-del function by transcomplementation: The partners meet in the endoplasmic reticulum // Cellular Physiology and Biochemistry. 2019. T. 52. № 6. C. 1267-1279.

21. Ashmore-Harris C., Fruhwirth G. O. The clinical potential of gene editing as a tool to engineer cell-based therapeutics // Clinical and Translational Medicine. 2020. T. 9. № 1. C. e15.

22. Awatade N. T. h gp. R560S: A class II CFTR mutation that is not rescued by current modulators // Journal of Cystic Fibrosis. 2019. T. 18. № 2. C. 182-189.

23. Baghbaderani B. A. h gp. Detailed Characterization of Human Induced Pluripotent Stem Cells Manufactured for Therapeutic Applications // Stem Cell Reviews. 2016. T. 12. № 4. C. 394.

24. Bardin E. h gp. Modulators of CFTR. Updates on clinical development and future directions // European Journal of Medicinal Chemistry. 2021. T. 213. C. 113195.

25. Barrangou R. h gp. CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes // Science. 2007. T. 315. № 5819. C. 1709-1712.

26. Bednarski C. h gp. Targeted integration of a super-exon into the CFTR locus leads to functional correction of a cystic fibrosis cell line model // PLoS ONE. 2016. T. 11. № 8. C. e0161072.

27. Berger H. A. h gp. Identification and regulation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator-generated chloride channel // Journal of Clinical Investigation. 1991. T. 88. № 4. C. 1422-1431.

28. Beumer K. J. h gp. Donor DNA utilization during gene targeting with zinc-finger nucleases // G3: Genes, Genomes, Genetics. 2013. T. 3. № 4. C. 657-664.

29. Beumer W. h gp. WS01.2 QR-010, an RNA therapy, restores CFTR function using in vitro and in vivo models of AF508 CFTR // Journal of Cystic Fibrosis. 2015. T. 14.

30. Blattner G. h gp. Gene Editing and Genotoxicity: Targeting the Off-Targets // Frontiers in Genome Editing. 2020. T. 2. C. 613252.

31. Boucher R. C. h gp. Gene Therapy for Cystic Fibrosis Using E1-Deleted Adenovirus: A Phase I Trial in the Nasal Cavity University of North Carolina at Chapel Hill // Human Gene Therapy. 1994. T. 5. № 5. C. 615-639.

32. Boucher R. C. Cystic fibrosis: a disease of vulnerability to airway surface dehydration // Trends in Molecular Medicine. 2007. T. 13. № 6. C. 231-240.

33. Boyle M. P. h gp. A CFTR corrector (lumacaftor) and a CFTR potentiator (ivacaftor) for treatment of patients with cystic fibrosis who have a phe508del CFTR mutation: A phase 2 randomised controlled trial // The Lancet Respiratory Medicine. 2014. T. 2. № 7. C. 527-538.

34. Brouns S. J. J. h gp. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes // Science. 2008. T. 321. № 5891. C. 960-964.

35. Burnett L. C. h gp. Induced pluripotent stem cells (iPSC) created from skin fibroblasts of patients with Prader-Willi Syndrome (PWS) retain the molecular signature of PWS // Stem cell research. 2016. T. 17. № 3. C. 526.

36. Burney T. J., Davies J. C. Gene therapy for the treatment of cystic fibrosis // The application of clinical genetics. 2012. T 5. C. 29-36.

37. Camarasa M. V., Galvez V. M. Robust method for TALEN-edited correction of pF508del in patient-specific induced pluripotent stem cells // Stem Cell Research and Therapy. 2016. T. 7. № 1.

38. Cameron P. h gp. Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage // Nature methods. 2017. T. 14. № 6. C. 600-606.

39. Capes-Davis A. h gp. Match criteria for human cell line authentication: Where do we draw the line? // International Journal of Cancer. 2013. T. 132. № 11. C. 2510-2519.

40. Caplen N. J. h gp. Liposome-mediated CFTR gene transfer to the nasal epithelium of patients with cystic fibrosis // Nature Medicine. 1995. T. 1 № 1. C. 39-46.

41. Carbone A. h gp. Correction of defective CFTR/ENaC function and tightness of cystic fibrosis airway epithelium by amniotic mesenchymal stromal (stem) cells // Journal of Cellular and Molecular Medicine. 2014. T. 18. № 8. C. 1631-1643.

42. Carlile G. W. h gp. A novel triple combination of pharmacological chaperones improves F508del-CFTR correction // Scientific Reports. 2018. T. 8. № 1. C. 11404.

43. Carraro G. h gp. Transcriptional analysis of Cystic Fibrosis airways at single cell resolution reveals altered epithelial cell states and composition // Nature medicine. 2021. T. 27. № 5. C. 806.

44. Cermak T. h gp. Efficient design and assembly of custom TALEN and other TAL effector-based constructs for DNA targeting // Nucleic Acids Research. 2011. T. 39. № 12. C. e82.

45. Chang N. h gp. Genome editing with RNA-guided Cas9 nuclease in Zebrafish embryos // Cell Research 2013 23:4. 2013. T. 23. № 4. C. 465-472.

46. Chapman J. R., Taylor M. R. G., Boulton S. J. Playing the End Game: DNA Double-Strand Break Repair Pathway Choice // Molecular Cell. 2012. T. 47. № 4. C. 497-510.

47. Char J. E. h gp. A Little CFTR Goes a Long Way: CFTR-Dependent Sweat Secretion from G551D and R117H-5T Cystic Fibrosis Subjects Taking Ivacaftor // PLOS ONE. 2014. T. 9. № 2. C. e88564.

48. Charlesworth C. T. h gp. Identification of preexisting adaptive immunity to Cas9 proteins in humans // Nature Medicine. 2019. T. 25. № 2. C. 249-254.

49. Charpentier M. h gp. CtIP fusion to Cas9 enhances transgene integration by homology-dependent repair // Nature Communications. 2018. T. 9. № 1. C. 1133.

50. Chen X. h gp. Manta: rapid detection of structural variants and indels for germline and cancer sequencing applications // Bioinformatics (Oxford, England). 2016. T. 32. № 8. C. 1220-1222.

51. Cheng Q. h gp. Selective ORgan Targeting (SORT) nanoparticles for tissue specific mRNA delivery and CRISPR/Cas gene editing // Nature nanotechnology. 2020. T. 15. № 4. C. 313.

52. Chew W. L. h gp. A multifunctional AAV-CRISPR-Cas9 and its host response // Nature Methods. 2016. T. 13. № 10. C. 868-874.

53. Choi J. Y. h gp. Aberrant CFTR-dependent HCO3- transport in mutations associated with cystic fibrosis // Nature. 2001. T. 410. № 6824. C. 94-97.

54. Cholon D. M., Esther C. R., Gentzsch M. Efficacy of lumacaftor-ivacaftor for the treatment of cystic fibrosis patients homozygous for the F508del-CFTR mutation // Expert Review of Precision Medicine and Drug Development. 2016. T. 1. № 3. C. 235243.

55. Clancy J. P. h gp. Results of a phase IIa study of VX-809, an investigational CFTR corrector compound, in subjects with cystic fibrosis homozygous for the F508del-CFTR mutation // Thorax. 2012. T. 67. № 1. C. 12-18.

56. Colombo C. Liver disease in cystic fibrosis // Current Opinion in Pulmonary Medicine. 2007. T. 13. № 6. C. 529-536.

57. Cong L. h gp. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems // Science. 2013. T. 339. № 6121. C. 819-823.

58. Cooney A. L. h gp. Widespread airway distribution and short-term phenotypic correction of cystic fibrosis pigs following aerosol delivery of piggyBac/adenovirus // Nucleic Acids Research. 2018. T. 46. № 18. C. 9591-9600.

59. Cooney A. L. h gp. A novel AAV-mediated gene delivery system corrects CFTR function in pigs // American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 2019. T. 61. № 6. C. 747-754.

60. Cormet-Boyaka E. h gp. Rescuing cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CHR)-processing mutants by transcomplementation // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2004. T. 101. № 21. C. 8221-8226.

61. Corradi V., Vergani P., Tieleman D. P. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR):closedandopenstate channelmodels // Journal of Biological Chemistry. 2015. T. 290. № 38. C. 22891-22906.

62. Crane A. M. h gp. Targeted correction and restored function of the CFTR gene in cystic fibrosis induced pluripotent stem cells // Stem Cell Reports. 2015. T. 4. № 4. C. 569-577.

63. Crystal R. G. h gp. Administration of an adenovirus containing the human CFTR cDNA to the respiratory tract of individuals with cystic fibrosis // Nature Genetics. 1994. T. 8. № 1. C. 42-51.

64. Cyranoski D. CRISPR gene-editing tested in a person for the first time // Nature. 2016. T. 539. № 7630. C. 479.

65. Daer R. M. h gp. The Impact of Chromatin Dynamics on Cas9-Mediated Genome Editing in Human Cells // ACS synthetic biology. 2016. T. 6. № 3. C. 428.

66. Dagenais R. V. E., Su V. C. H., Quon B. S. Real-World Safety of CFTR Modulators in the Treatment of Cystic Fibrosis: A Systematic Review // Journal of clinical medicine. 2020. T. 10. № 1. C. 1-56.

67. Davies J. C. h gp. GLPG1837, a CFTR potentiator, in p.Gly551Asp (G551D)-CF patients: An open-label, single-arm, phase 2a study (SAPHIRA1) // Journal of Cystic Fibrosis. 2019. T. 18. № 5. C. 693-699.

68. De A. h gp. Sendai virus persistence questions the transient naive reprogramming method for iPSC generation // bioRxiv. 2024. C. 2024.03.07.583804.

69. Deeks E. D. Lumacaftor/Ivacaftor: A Review in Cystic Fibrosis // Drugs. 2016. T. 76. № 12. C. 1191-1201.

70. Demchenko A. h gp. Airway basal cells from human-induced pluripotent stem cells: a new frontier in cystic fibrosis research // Frontiers in cell and developmental biology. 2024. T. 12. C. 1336392.

71. Derichs N. Targeting a genetic defect: Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator modulators in cystic fibrosis // European Respiratory Review. 2013. T. 22. № 127. C. 58-65.

72. Doench J. G. h gp. Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation // Nature Biotechnology 2014 32:12. 2014. T. 32. № 12. C. 1262-1267.

73. Dong J. Y. h gp. Systematic analysis of repeated gene delivery into animal lungs with a recombinant adenovirus vector // Human Gene Therapy. 1996. T. 7. № 3. C. 319-331.

74. Dorin J. R. h gp. A demonstration using mouse models that successful gene therapy for cystic fibrosis requires only partial gene correction // Gene Therapy. 1996. T. 3. № 9. C. 797-801.

75. Drexler H. G., Uphoff C. C. Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention // Cytotechnology. 2002. T. 39. № 2. C. 75-90.

76. Duchesneau P. h gp. Partial Restoration of CFTR Function in cftr-Null Mice following Targeted Cell Replacement Therapy // Molecular Therapy. 2017. T. 25. № 3. C. 654-665.

77. Duncan G. A. h gp. An Adeno-Associated Viral Vector Capable of Penetrating the Mucus Barrier to Inhaled Gene Therapy // Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 2018. T. 9. C. 296-304.

78. Dye B. R. h gp. In vitro generation of human pluripotent stem cell derived lung organoids // eLife. 2015. T. 4. № 4. C. 1-25.

79. Eastman S. J. h gp. A concentrated and stable aerosol formulation of cationic lipid:DNA complexes giving high-level gene expression in mouse lung // Human Gene Therapy. 1997. T. 8. № 6. C. 765-773.

80. Eckford P. D. W. h gp. VX-809 and related corrector compounds exhibit secondary activity stabilizing active F508del-CFTR after its partial rescue to the cell surface // Chemistry and Biology. 2014. T. 21. № 5. C. 666-678.

81. Elborn J. S. Cystic fibrosis // The Lancet. 2016. T. 388. № 10059. C. 25192531.

82. Epinat J. C. h gp. A novel engineered meganuclease induces homologous recombination in yeast and mammalian cells // Nucleic Acids Research. 2003. T. 31. № 11. C. 2952-2962.

83. Esvelt K. M. h gp. Orthogonal Cas9 proteins for RNA-guided gene regulation and editing // Nature Methods. 2013. T. 10. № 11. C. 1116-1123.

84. Fakhiri J. h gp. Novel Chimeric Gene Therapy Vectors Based on Adeno -Associated Virus and Four Different Mammalian Bocaviruses // Molecular Therapy -Methods and Clinical Development. 2019. T. 12. C. 202-222.

85. Farboud B. h gp. Enhanced genome editing with cas9 ribonucleoprotein in diverse cells and organisms // Journal of Visualized Experiments. 2018. T. 135. C. 57350.

86. Farrow N. h gp. Epithelial disruption: A new paradigm enabling human airway stem cell transplantation // Stem Cell Research and Therapy. 2018. T. 9. № 1. C. 153.

87. Fernández E. F. h gp. Biopolymer-based nanoparticles for cystic fibrosis lung gene therapy studies // Materials. 2018. T. 11. № 1. C. 122.

88. Fernández Fernández E. h gp. Optimization of CFTR-mRNA transfection in human nasal epithelial cells // Translational Medicine Communications. 2016. T. 1. № 1. C. 5.

89. Firth A. L. h gp. Functional Gene Correction for Cystic Fibrosis in Lung Epithelial Cells Generated from Patient iPSCs // Cell Reports. 2015. T. 12. № 9. C. 13851390.

90. Fleischer A. h gp. iPSC-Derived Intestinal Organoids from Cystic Fibrosis Patients Acquire CFTR Activity upon TALEN-Mediated Repair of the p.F508del Mutation // Molecular Therapy - Methods and Clinical Development. 2020. T. 17. C. 858-870.

91. Flotte T. h gp. A phase I study of an adeno-associated Virus-CFTR gene vector in adult CF patients with mild lung disease // Human Gene Therapy. 1996. T. 7. № 9. C. 1145-1159.

92. Flotte T. R. h gp. Phase I trial of intranasal and endobronchial administration of a recombinant adeno-associated virus serotype 2 (raav2)-cftr vector in adult cystic fibrosis patients: A two-part clinical study // Human Gene Therapy. 2003. T. 14. № 11. C. 1079-1088.

93. Flotte T. R. h gp. Correlation between DNA transfer and cystic fibrosis airway epithelial cell correction after recombinant adeno-associated virus serotype 2 gene therapy // Human Gene Therapy. 2005. T. 16. № 8. C. 921-928.

94. Flume P. A. h gp. Ivacaftor in subjects with cystic fibrosis who are homozygous for the F508del-CFTR mutation // Chest. 2012. T. 142. № 3. C. 718-724.

95. Friedman K. J. h gp. Correction of aberrant splicing of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene by antisense oligonucleotides // Journal of Biological Chemistry. 1999. T. 247. № 51. C. 36193-36199.

96. Fu Y. h gp. Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs // Nature Biotechnology. 2014. T. 32. № 3. C. 279-284.

97. Fusaki N. h gp. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome // Proceedings of the Japan Academy. Series B, Physical and biological sciences. 2009. T. 85. № 8. C. 348-362.

98. Gees M. h gp. Identification and characterization of novel CFTR potentiators // Frontiers in Pharmacology. 2018. T. 9. C. 1221.

99. Geurts M. H. h gp. CRISPR-Based Adenine Editors Correct Nonsense Mutations in a Cystic Fibrosis Organoid Biobank // Cell Stem Cell. 2020. T. 26. № 4. C. 503-510.e7.

100. Geurts M. H. h gp. Evaluating CRISPR-based Prime Editing for cancer modeling and CFTR repair in intestinal organoids // bioRxiv. 2020. C. 2020.10.05.325837.

101. Ghosh M. h gp. Regulation of trachebronchial tissue-specific stem cell pool size // Stem Cells. 2013. T. 31. № 12. C. 2767-2778.

102. Gill D. R., Hyde S. C. Delivery of genes into the CF airway // Thorax. 2014. T. 69. № 10. C. 962-964.

103. Ginn S. L. h gp. Gene therapy clinical trials worldwide to 2017: An update // Journal of Gene Medicine. 2018. T. 20. № 5. C. e3015.

104. Giuliano K. A. h gp. Use of a High-Throughput Phenotypic Screening Strategy to Identify Amplifiers, a Novel Pharmacological Class of Small Molecules That Exhibit Functional Synergy with Potentiators and Correctors // SLAS Discovery. 2018. T. 23. № 2. C. 111-121.

105. Goldman M. J. h gp. Lentiviral vectors for gene therapy of cystic fibrosis // Human Gene Therapy. 1997. T. 8. № 18. C. 2261-2268.

106. Goodman B. E., Percy W. H. CFTR in cystic fibrosis and cholera: From membrane transport to clinical practice // American Journal of Physiology - Advances in Physiology Education. 2005. T. 29. № 2. C. 75-82.

107. Goor F. Van h gp. Rescue of AF508-CFTR trafficking and gating in human cystic fibrosis airway primary cultures by small molecules // American Journal of Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology. 2006. T. 290. № 6. C. L1117-30.

108. Goor F. Van h gp. Rescue of CF airway epithelial cell function in vitro by a CFTR potentiator, VX-770 // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2009. T. 106. № 44. C. 18825-18830.

109. Goor F. Van h gp. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809 // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2011. T. 108. № 46. C. 1884318848.

110. Goor F. Van, Hadida S., Grootenhuis P. Pharmacological Rescue of Mutant CFTR Function for the Treatment of Cystic Fibrosis Springer, Berlin, Heidelberg, 2008. T. 3. C. 91-120.

111. Graham C., Hart S. CRISPR/Cas9 gene editing therapies for cystic fibrosis // Expert Opinion on Biological Therapy. 2021. T. 21. № 6. C. 767-780.

112. Griesenbach U., Alton E. W. F. W. Moving forward: Cystic fibrosis gene therapy // Human Molecular Genetics. 2013. T. 22. № R1. C. R52-8.

113. Griesenbach U., Pytel K. M., Alton E. W. F. W. Cystic Fibrosis Gene Therapy in the UK and Elsewhere // Human Gene Therapy. 2015. T. 26. № 5. C. 266275.

114. Griesenbach U., W.F.W. Alton E. Progress in Gene and Cell Therapy for Cystic Fibrosis Lung Disease // Current Pharmaceutical Design. 2012. T. 18. № 5. C. 642-662.

115. Grubb B. R. h gp. Inefficient gene transfer by adenovirus vector to cystic fibrosis airway epithelia of mice and humans // Nature. 1994. T. 371. № 6500. C. 802806.

116. Guan S. h gp. Self-assembled peptide-poloxamine nanoparticles enable in vitro and in vivo genome restoration for cystic fibrosis // Nature Nanotechnology. 2019. T. 14. № 3. C. 287-297.

117. Guan S., Rosenecker J. Nanotechnologies in delivery of mRNA therapeutics using nonviral vector-based delivery systems // Gene Therapy. 2017. T. 24. № 3. C. 133143.

118. Guo C. h gp. Off-target effects in CRISPR/Cas9 gene editing // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2023. T. 11. C. 1143157.

119. Guo N. N. h gp. Early prediction of the differentiation potential during the formation of human iPSC-derived embryoid bodies // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2019. T. 516. № 3. C. 673-679.

120. Gutschner T. h gp. Post-translational Regulation of Cas9 during G1 Enhances Homology-Directed Repair // Cell Reports. 2016. T. 14. № 6. C. 1555-1566.

121. Haardt M. h gp. C-terminal truncations destabilize the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator without impairing its biogenesis. A novel class of mutation // Journal of Biological Chemistry. 1999. T. 274. № 31. C. 21873-21877.

122. Hajj R. h gp. Basal Cells of the Human Adult Airway Surface Epithelium Retain Transit-Amplifying Cell Properties // Stem cells. 2007. T. 25. № 1. C. 139-148.

123. Hammerle M. M., Aleksandrov A. A., Riordan J. R. Disease-associated Mutations in the Extracytoplasmic Loops of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator Do Not Impede Biosynthetic Processing but Impair Chloride Channel Stability // Journal of Biological Chemistry. 2001. T. 276. № 18. C. 1484814854.

124. Haque A. K. M. A. h gp. Chemically modified hCFTR mRNAs recuperate lung function in a mouse model of cystic fibrosis // Scientific Reports. 2018. T. 8. № 1. C. 16766.

125. Haridhasapavalan K. K. h gp. An insight into non-integrative gene delivery approaches to generate transgene-free induced pluripotent stem cells // Gene. 2019. T. 686. C. 146-159.

126. Harvey B.-G. h gp. Variability of Human Systemic Humoral Immune Responses to Adenovirus Gene Transfer Vectors Administered to Different Organs // Journal of Virology. 1999. T. 73. № 8. C. 6729-6742.

127. Hawkins F. J. h gp. Derivation of Airway Basal Stem Cells from Human Pluripotent Stem Cells // Cell stem cell. 2021. T. 28. № 1. C. 79-95.e8.

128. Hegab A. E. h gp. Isolation and In Vitro Characterization of Basal and Submucosal Gland Duct Stem/Progenitor Cells from Human Proximal Airways // STEM CELLS Translational Medicine. 2012. T. 1. № 10. C. 719-724.

129. Hendel A. h gp. Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells // Nature Biotechnology. 2015. T. 33. № 9. C. 985-989.

130. Highsmith W. E. h gp. A Novel Mutation in the Cystic Fibrosis Gene in Patients with Pulmonary Disease but Normal Sweat Chloride Concentrations // New England Journal of Medicine. 1994. T. 331. № 15. C. 974-980.

131. Highsmith W. E. h gp. Identification of a splice site mutation (2789 + 5 G>A) associated with small amounts of normal CFTR mRNA and mild cystic fibrosis // Human Mutation. 1997. T. 9. № 4. C. 332-338.

132. Hockemeyer D., Jaenisch R. Induced pluripotent stem cells meet genome editing // Cell Stem Cell. 2016. T. 18. № 5. C. 573-586.

133. Hoegger M. J. h gp. Impaired mucus detachment disrupts mucociliary transport in a piglet model of cystic fibrosis // Science. 2014. T. 345. № 6198. C. 818822.

134. Hollywood J. A. h gp. Analysis of gene repair tracts from Cas9/gRNA double-stranded breaks in the human CFTR gene // Scientific Reports. 2016. T. 6. C. 32230.

135. Howden S. E. h gp. A Cas9 Variant for Efficient Generation of Indel-Free Knockin or Gene-Corrected Human Pluripotent Stem Cells // Stem Cell Reports. 2016. T. 7. № 3. C. 508-517.

136. Hsu P. D., Zhang F. Dissecting neural function using targeted genome engineering technologies // ACS Chemical Neuroscience. 2012. T. 3. № 8. C. 603-610.

137. Hull J. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator dysfunction and its treatment. // Journal of the Royal Society of Medicine. 2012. T. 105 Suppl 2. № Suppl 2.

138. Hwang G. H. h gp. CRISPR-sub: Analysis of DNA substitution mutations caused by CRISPR-Cas9 in human cells // Computational and structural biotechnology journal. 2020. T. 18. C. 1686-1694.

139. Hyde S. C. h gp. CpG-free plasmids confer reduced inflammation and sustained pulmonary gene expression // Nature Biotechnology. 2008. T. 26. №2 5. C. 549551.

140. Igreja S. h gp. Correction of a cystic fibrosis splicing mutation by antisense oligonucleotides // Human Mutation. 2015. T. 37. № 2. C. 209-215.

141. Inagaki K. h gp. Frequency and Spectrum of Genomic Integration of Recombinant Adeno-Associated Virus Serotype 8 Vector in Neonatal Mouse Liver // Journal of Virology. 2008. T. 82. № 19. C. 9513-9524.

142. Ishiguro H. h gp. CFTR Functions as a bicarbonate channel in pancreatic duct cells // Journal of General Physiology. 2009. T. 133. № 3. C. 315-326.

143. Jiang W. h gp. RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems // Nature Biotechnology. 2013. T. 31. № 3. C. 233-239.

144. Jiang Y. h gp. Multigene editing in the Escherichia coli genome via the CRISPR-Cas9 system // Applied and Environmental Microbiology. 2015. T. 81. № 7. C. 2506-2514.

145. Jinek M. h gp. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity // Science. 2012. T. 337. № 6096. C. 816-821.

146. Johnson L. G. h gp. Efficiency of gene transfer for restoration of normal airway epithelial function in cystic fibrosis // Nature Genetics. 1992. T. 2. № 1. C. 2125.

147. Khoury O. h gp. Immunomodulatory cell therapy to target cystic fibrosis inflammation // American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 2018. T. 58. № 1. C. 12-20.

148. Kim D. h gp. Genome-wide target specificities of CRISPR-Cas9 nucleases revealed by multiplex Digenome-seq // Genome Research. 2016. T. 26. №2 3. C. 406-415.

149. Kim S. h gp. Highly efficient RNA-guided genome editing in human cells via delivery of purified Cas9 ribonucleoproteins // Genome Research. 2014. T. 24. № 6. C. 1012-1019.

150. Kim Y. G., Cha J., Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: Zinc finger fusions to Fok I cleavage domain // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1996. T. 93. № 3. C. 1156-1160.

151. King N. E. h gp. Correction of Airway Stem Cells: Genome Editing Approaches for the Treatment of Cystic Fibrosis // Human Gene Therapy. 2020. T. 31. № 17-18. C. 956.

152. Kleinstiver B. P. h gp. High-fidelity CRISPR-Cas9 nucleases with no detectable genome-wide off-target effects // Nature. 2016. T. 529. № 7587. C. 490-495.

153. Knowles M. R. h gp. A Controlled Study of Adenoviral-Vector-Mediated Gene Transfer in the Nasal Epithelium of Patients with Cystic Fibrosis // New England Journal of Medicine. 1995. T. 333. № 13. C. 823-831.

154. Kobayashi N. h gp. Differential effects of Sendai virus infection on mediator synthesis by mesangial cells from two mouse strains // Kidney International. 2003. T. 64. № 5. C. 1675-1684.

155. Kondrateva E. h gp. An overview of currently available molecular Cas-tools for precise genome modification // Gene. 2021. T. 769. C. 145225.

156. Koonin E. V., Makarova K. S., Zhang F. Diversity, classification and evolution of CRISPR-Cas systems // Current Opinion in Microbiology. 2017. T. 37. C. 67-78.

157. Kopeikin Z. h gp. Combined effects of VX-770 and VX-809 on several functional abnormalities of F508del-CFTR channels // Journal of Cystic Fibrosis. 2014. T. 13. № 5. C. 508-514.

158. Kosicki M., Tomberg K., Bradley A. Repair of double-strand breaks induced by CRISPR-Cas9 leads to large deletions and complex rearrangements // Nature Biotechnology. 2018. T. 36. C. 765-771.

159. Krishnamurthy S. h gp. Functional correction of CFTR mutations in human airway epithelial cells using adenine base editors // Nucleic Acids Research. 2021. T. 49. № 18. C. 10558.

160. Kunzelmann K. h gp. An immortalized cystic fibrosis tracheal epithelial cell line homozygous for the delta F508 CFTR mutation. // American journal of respiratory cell and molecular biology. 1993. T. 8. № 5. C. 522-529.

161. Lee C. M. h gp. Correction of the Af508 mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene by zinc-finger nuclease homology-directed repair // BioResearch Open Access. 2012. T. 1. № 3. C. 99-103.

162. Lee S. H., Kim S., Hur J. K. CRISPR and target-specific DNA endonucleases for efficient DNA knock-in in eukaryotic genomes // Molecules and Cells. 2018. T. 41. № 11. C. 943-952.

163. Li H, Durbin R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 2009. T. 25. № 14. C. 1754-60.

164. Li H. h gp. Design and specificity of long ssDNA donors for CRISPR-based knock-in // bioRxiv. 2017. C. 178905.

165. Li K. h gp. Optimization of genome engineering approaches with the CRISPR/Cas9 system // PLoS ONE. 2014. T.9. № 8. C. e105779.

166. Liang S. Q. h gp. AAV5 delivery of CRISPR-Cas9 supports effective genome editing in mouse lung airway // Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2022. T. 30. № 1. C. 238-243.

167. Liang X. h gp. Rapid and highly efficient mammalian cell engineering via Cas9 protein transfection // Journal of Biotechnology. 2015. T. 208. C. 44-53.

168. Lin S. h gp. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery // eLife. 2014. T. 3. C. e04766.

169. Loi R. h gp. Limited restoration of cystic fibrosis lung epithelium in vivo with adult bone marrow-derived cells // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2006. T. 173. № 2. C. 171-179.

170. Lopes R., Prasad M. K. Beyond the promise: evaluating and mitigating offtarget effects in CRISPR gene editing for safer therapeutics // Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2023. T. 11. C. 1339189.

171. Lopes-Pacheco M. CFTR Modulators: The Changing Face of Cystic Fibrosis in the Era of Precision Medicine // Frontiers in Pharmacology. 2020. T. 10. C. 1662.

172. Lu Y. h gp. Safety and feasibility of CRISPR-edited T cells in patients with refractory non-small-cell lung cancer // Nature medicine. 2020. T. 26. № 5. C. 732-740.

173. Luciani A. h gp. Defective CFTR induces aggresome formation and lung inflammation in cystic fibrosis through ROS-mediated autophagy inhibition // Nature Cell Biology. 2010. T. 12. № 9. C. 863-875.

174. Lukacs G. L. h gp. Conformational maturation of CFTR but not its mutant counterpart (AF508) occurs in the endoplasmic reticulum and requires ATP // EMBO Journal. 1994. T. 13. № 24. C. 6076-6086.

175. Maeder M. L. h gp. Rapid «Open-Source» Engineering of Customized Zinc-Finger Nucleases for Highly Efficient Gene Modification // Molecular Cell. 2008. T. 31. № 2. C. 294-301.

176. Maguire C. A. h gp. Microvesicle-associated AAV vector as a novel gene delivery system // Molecular Therapy. 2012. T. 20. № 5. C. 960-971.

177. Maherali N., Hochedlinger K. Guidelines and techniques for the generation of induced pluripotent stem cells // Cell stem cell. 2008. T. 3. № 6. C. 595-605.

178. Mali P. h gp. RNA-guided human genome engineering via Cas9 // Science. 2013. T. 339. № 6121. C. 823-826.

179. Mann C. M. h gp. The Gene Sculpt Suite: a set of tools for genome editing // Nucleic Acids Research. 2019. T. 47. № W1. C. W175-W182.

180. Mao Z. h gp. Comparison of nonhomologous end joining and homologous recombination in human cells // DNA Repair. 2008. T. 7. № 10. C. 1765-1771.

181. Maule G. h gp. Allele specific repair of splicing mutations in cystic fibrosis through AsCas12a genome editing // Nature Communications. 2019. T. 10. № 1. C. 3556.

182. Maule G., Arosio D., Cereseto A. Gene therapy for cystic fibrosis: Progress and challenges of genome editing // International Journal of Molecular Sciences. 2020. T. 21. № 11. C. 1-13.

183. McCauley K. B. h gp. Efficient Derivation of Functional Human Airway Epithelium from Pluripotent Stem Cells via Temporal Regulation of Wnt Signaling // Cell Stem Cell. 2017. T. 20. № 6. C. 844-857.e6.

184. McLachlan G. h gp. Pre-clinical evaluation of three non-viral gene transfer agents for cystic fibrosis after aerosol delivery to the ovine lung // Gene Therapy. 2011. T. 18. № 10. C. 996-1005.

185. McNeer N. A. h gp. Nanoparticles that deliver triplex-forming peptide nucleic acid molecules correct F508del CFTR in airway epithelium // Nature Communications. 2015. T. 6. C. 6952.

186. Medvedev S.P. h gp. Derivation of induced pluripotent stem cells from fetal human skin fibroblasts // Acta Naturae. 2010. T. 2. № 2. C. 102-106.

187. Mention K., Santos L., Harrison P. T. Gene and base editing as a therapeutic option for cystic fibrosis-learning from other diseases // Genes. 2019. T. 10. № 5. C. 387.

188. Merkert S. h gp. Generation of a gene-corrected isogenic control iPSC line from cystic fibrosis patient-specific iPSCs homozygous for p.Phe508del mutation mediated by TALENs and ssODN // Stem Cell Research. 2017. T. 23. C. 95-97.

189. Mijnders M., Kleizen B., Braakman I. Correcting CFTR folding defects by small-molecule correctors to cure cystic fibrosis // Current Opinion in Pharmacology.

2017. T. 34. C. 83-90.

190. Milla C. E. h gp. Lumacaftor/Ivacaftor in patients aged 6-11 years with cystic fibrosis and homozygous for F508del-CFTR // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2017. T. 195. № 7. C. 912-920.

191. Milone M. C., O'Doherty U. Clinical use of lentiviral vectors // Leukemia.

2018. T. 32. № 7. C. 1529-1541.

192. Molinier-Frenkel V. h gp. Immune Response to Recombinant Adenovirus in Humans: Capsid Components from Viral Input Are Targets for Vector-Specific Cytotoxic T Lymphocytes // Journal of Virology. 2000. T. 74. № 16. C. 7678-7682.

193. Montoro D. T. h gp. A revised airway epithelial hierarchy includes CFTR-expressing ionocytes // Nature. 2018. T. 560. № 7718. C. 319-324.

194. Moss R. B. h gp. Repeated Adeno-Associated Virus Serotype 2 AerosolMediated Cystic Fibrosis Transmembrane Regulator Gene Transfer to the Lungs of Patients with Cystic Fibrosis: A Multicenter, Double-Blind, Placebo-Controlled Trial // Chest. 2004. T. 125. № 2. C. 509-521.

195. Moss R. B. h gp. Repeated aerosolized AAV-CFTR for treatment of cystic fibrosis: A randomized placebo-controlled phase 2B trial // Human Gene Therapy. 2007. T. 18. № 8. C. 726-732.

196. Murovec J., Pirc Z., Yang B. New variants of CRISPR RNA-guided genome editing enzymes // Plant Biotechnology Journal. 2017. T. 15. № 8. C. 917-926.

197. Murphy S. V., Atala A. Cell therapy for cystic fibrosis // Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 2015. T. 9. № 3. C. 210-223.

198. Myint M. h gp. In vivo evaluation of adeno-associated virus gene transfer in airways of mice with acute or chronic respiratory infection // Human Gene Therapy. 2014. T. 25. № 11. C. 966-976.

199. Nam S. J. h gp. Hyposecretion, not hyperabsorption, is the basic defect of cystic fibrosis airway glands // Journal of Biological Chemistry. 2006. T. 281. № 11. C. 7392-7398.

200. Nazareth D., Walshaw M. Coming of age in cystic fibrosis - transition from paediatric to adult care // Clinical medicine (London, England). 2013. T. 13. № 5. C. 482486.

201. Oglesby I. K. h gp. Regulation of Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator by MicroRNA-145, -223, and -494 Is Altered in AF508 Cystic Fibrosis Airway Epithelium // The Journal of Immunology. 2013. T. 190. № 7. C. 33543362.

202. Okuda K. h gp. Secretory cells dominate airway CFTR expression and function in human airway superficial epithelia // American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 2021. T. 203. № 10. C. 1275-1289.

203. Oren Y. S. h gp. Antisense oligonucleotide splicing modulation as a novel Cystic Fibrosis therapeutic approach for the W1282X nonsense mutation // Journal of cystic fibrosis : official journal of the European Cystic Fibrosis Society. 2022. T. 21. № 4. C. 630-636.

204. Oyaghire S. N. h gp. Poly(Lactic-co-Glycolic Acid) Nanoparticle Delivery of Peptide Nucleic Acids In Vivo // Methods in Molecular Biology. 2020. T. 2105. C. 261-281.

205. Palfi S. h gp. Long-term safety and tolerability of ProSavin, a lentiviral vector-based gene therapy for Parkinson's disease: A dose escalation, open-label, phase 1/2 trial // The Lancet. 2014. T. 383. № 9923. C. 1138-1146.

206. Palmer D. J., Turner D. L., Ng P. A Single "All-in-One" Helper-Dependent Adenovirus to Deliver Donor DNA and CRISPR/Cas9 for Efficient Homology-Directed Repair // Molecular Therapy. Methods & Clinical Development. 2020. T. 17. C. 441.

207. Pannunzio N. R., Watanabe G., Lieber M. R. Nonhomologous DNA end-joining for repair of DNA double-strand breaks // Journal of Biological Chemistry. 2018. T. 293. № 27. C. 10512-10523.

208. Paquet D. h gp. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9 // Nature. 2016. T. 533. № 7601. C. 125129.

209. Pattanayak V. h gp. Revealing off-target cleavage specificities of zinc-finger nucleases by in vitro selection // Nature Methods. 2011. T. 8. № 9. C. 765-772.

210. Pedemonte N. h gp. Small-molecule correctors of defective AF508-CFTR cellular processing identified by high-throughput screening // Journal of Clinical Investigation. 2005. T. 115. № 9. C. 2564-2571.

211. Penaud-Budloo M. h gp. Adeno-Associated Virus Vector Genomes Persist as Episomal Chromatin in Primate Muscle // Journal of Virology. 2008. T. 82. № 16. C. 7875-7885.

212. Perez E. E. h gp. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases // Nature Biotechnology. 2008. T. 26. № 7. C. 808-816.

213. Peters-Hall J. R. h gp. Long-term culture and cloning of primary human bronchial basal cells that maintain multipotent differentiation capacity and CFTR channel function // American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology.

2018. T. 315. № 2. C. L313-L327.

214. Petris G. h gp. Hit and go CAS9 delivered through a lentiviral based self-limiting circuit // Nature Communications. 2017. T. 8. C. 15334.

215. Pezzulo A. A. h gp. Reduced airway surface pH impairs bacterial killing in the porcine cystic fibrosis lung // Nature. 2012. T. 487. № 7405. C. 109-113.

216. Phuan P. W. h gp. Synergy-based small-molecule screen using a human lung epithelial cell line yields Af508-CFTR correctors that augment VX-809 maximal efficacy // Molecular Pharmacology. 2014. T. 86. № 1. C. 42-51.

217. Plasschaert L. W. h gp. A single-cell atlas of the airway epithelium reveals the CFTR-rich pulmonary ionocyte // Nature. 2018. T. 560. № 7718. C. 377-381.

218. Protasevich I. h gp. Thermal unfolding studies show the disease causing F508del mutation in CFTR thermodynamically destabilizes nucleotide-binding domain 1 // Protein Science. 2010. T. 19. № 10. C. 1917-1931.

219. Prytherch Z. h gp. Tissue-Specific Stem Cell Differentiation in an in vitro Airway Model // Macromolecular Bioscience. 2011. T. 11. № 11. C. 1467-1477.

220. Ramalingam S. h gp. Generation and genetic engineering of human induced pluripotent stem cells using designed zinc finger nucleases // Stem Cells and Development. 2013. T. 22. № 4. C. 595-610.

221. Ran F. A. h gp. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system // Nature Protocols. 2013. T. 8. № 11. C. 2281-2308.

222. Ran F. A. h gp. XDouble nicking by RNA-guided CRISPR cas9 for enhanced genome editing specificity // Cell. 2013. T. 154. № 6. C. 1380-9.

223. Ran F. A. h gp. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9 // Nature. 2015. T. 520. № 7546. C. 186-191.

224. Rees H. A., Yeh W. H., Liu D. R. Development of hRad51-Cas9 nickase fusions that mediate HDR without double-stranded breaks // Nature Communications.

2019. T. 10. C. 2212.

225. Ren H. Y. h gp. VX-809 corrects folding defects in cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein through action on membrane-spanning domain 1 // Molecular Biology of the Cell. 2013. T. 24. № 19. C. 3016-3024.

226. Renaud J. B. h gp. Improved Genome Editing Efficiency and Flexibility Using Modified Oligonucleotides with TALEN and CRISPR-Cas9 Nucleases // Cell Reports. 2016. T. 14. № 9. C. 2263-2272.

227. Richard-Fiardo P. h gp. Evaluation of tetrafunctional block copolymers as synthetic vectors for lung gene transfer // Biomaterials. 2015. T. 45. C. 10-17.

228. Richardson C. D. h gp. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA // Nature Biotechnology. 2016. T. 34. № 3. C. 339-344.

229. Richardson C., Jasin M. Frequent chromosomal translocations induced by DNA double-strand breaks // Nature. 2000. T. 405. № 6787. C. 697-700.

230. Robinson E. h gp. Lipid Nanoparticle-Delivered Chemically Modified mRNA Restores Chloride Secretion in Cystic Fibrosis // Molecular Therapy. 2018. T. 26. № 8. C. 2034-2046.

231. Rogan M. P., Stoltz D. A., Hornick D. B. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator intracellular processing, trafficking, and opportunities for mutation-specific treatment // Chest. 2011. T. 139. № 6. C. 1480-1490.

232. Rogers F. A. h gp. Site-directed recombination via bifunctional PNA-DNA conjugates // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2002. T. 99. № 26. C. 16695-16700.

233. Rouet P., Smih F., Jasin M. Expression of a site-specific endonuclease stimulates homologous recombination in mammalian cells // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994. T. 91. № 13. C. 6064-6068.

234. Rawlins E.L., Hogan B.L. Ciliated epithelial cell lifespan in the mouse trachea and lung // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2008. T. 295. № 1. C. L231-4.

235. Rowe S. M. h gp. Lumacaftor/ivacaftor treatment of patients with cystic fibrosis heterozygous for F508del-CFTR // Annals of the American Thoracic Society. 2017. T. 14. № 2. C. 213-219.

236. Rowe S. M. h gp. Tezacaftor-Ivacaftor in Residual-Function Heterozygotes with Cystic Fibrosis // New England Journal of Medicine. 2017. T. 377. № 21. C. 20242035.

237. Ruan J. h gp. Efficient Gene Editing at Major CFTR Mutation Loci // Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2019. T. 16. C. 73-81.

238. Ruiz F. E. h gp. A clinical inflammatory syndrome attributable to aerosolized lipid-DNA administration in cystic fibrosis // Human Gene Therapy. 2001. T. 12. № 7. C. 751-761.

239. Sakuma T. h gp. MMEJ-Assisted gene knock-in using TALENs and CRISPR-Cas9 with the PITCh systems // Nature Protocols. 2016. T. 11. № 1. C. 118133.

240. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1977. T. 74. № 12. C. 5463-5467.

241. Sanz D. J. h gp. Cas9/gRNA targeted excision of cystic fibrosis-causing deep-intronic splicing mutations restores normal splicing of CFTR mRNA // PLoS ONE. 2017. T. 12. № 9. C. e0184009.

242. Schaefer K. A. h gp. Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo // Nature methods. 2017. T. 14. № 6. C. 547.

243. Schneider E. h gp. Can Cystic Fibrosis Patients Finally Catch a Breath With Lumacaftor/Ivacaftor? // Clinical Pharmacology & Therapeutics. 2017. T. 101. № 1. C. 130-141.

244. Schuster B. S. h gp. Overcoming the cystic fibrosis sputum barrier to leading adeno-associated virus gene therapy vectors // Molecular Therapy. 2014. T. 22. № 8. C. 1484-1493.

245. Schwank G. h gp. Functional repair of CFTR by CRISPR/Cas9 in intestinal stem cell organoids of cystic fibrosis patients // Cell Stem Cell. 2013. T. 13. № 6. C. 653658.

246. Schwerdt M. h gp. Staphylococcus aureus in the airways of cystic fibrosis patients - A retrospective long-term study // International Journal of Medical Microbiology. 2018. T. 308. № 6. C. 631-639.

247. Sermet-Gaudelus I. h gp. Antisense oligonucleotide eluforsen improves CFTR function in F508del cystic fibrosis // Journal of Cystic Fibrosis. 2019. T. 18. № 4. C. 536-542.

248. Shen M. W. h gp. Predictable and precise template-free CRISPR editing of pathogenic variants // Nature. 2018. T. 563. № 7733. C. 646-651.

249. Sheppard D. N. h gp. Mutations in CFTR associated with mild-disease-form CI- channels with altered pore properties // Nature. 1993. T. 362. № 6416. C. 160-164.

250. Sheridan S. D., Surampudi V., Rao R. R. Analysis of Embryoid Bodies Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells as a Means to Assess Pluripotency // Stem Cells International. 2012. T. 2012. C. 738910.

251. Shibata A. Regulation of repair pathway choice at two-ended DNA doublestrand breaks // Mutation Research - Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 2017. T. 803-805. C. 51-55.

252. Silvis M. R. h gp. A mutation in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator generates a novel internalization sequence and enhances endocytic rates // Journal of Biological Chemistry. 2003. T. 278. № 13. C. 11554-11560.

253. Singh K. h gp. Comprehensive analysis of off-target and on-target effects resulting from liver-directed CRISPR-Cas9-mediated gene targeting with AAV vectors // Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 2024. T. 32. № 4. C. 101365.

254. Sinn P. L. h gp. Lentivirus Vector Can Be Readministered to Nasal Epithelia without Blocking Immune Responses // Journal of Virology. 2008. T. 82. № 21. C. 10684-10692.

255. Sinn P. L. h gp. Lentiviral vector gene transfer to porcine airways // Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2012. T. 1. № 11. C. e56.

256. Sinn P. L. h gp. Novel GP64 envelope variants for improved delivery to human airway epithelial cells // Gene Therapy. 2017. T. 24. № 10. C. 674-679.

257. Slaymaker I. M. h gp. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity // Science. 2016. T. 351. № 6268. C. 84-88.

258. Song B. h gp. Analysis of NHEJ-Based DNA Repair after CRISPR-Mediated DNA Cleavage // International journal of molecular sciences. 2021. T. 22. № 12. C. 6397.

259. Song F., Stieger K. Optimizing the DNA Donor Template for Homology-Directed Repair of Double-Strand Breaks // Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2017. T. 7. C. 53-60.

260. Song Y. h gp. Functional cystic fibrosis transmembrane conductance regulator expression in cystic fibrosis airway epithelial cells by AAV6.2-mediated segmental trans-splicing // Human gene therapy. 2009. T. 20. № 3. C. 267-81.

261. Srivastava A., Lusby E. W., Berns K. I. Nucleotide sequence and organization of the adeno-associated virus 2 genome. // Journal of Virology. 1983. T. 45. № 2. C. 555-564.

262. Stoltz D. A. h gp. Cystic fibrosis pigs develop lung disease and exhibit defective bacterial eradication at birth // Science Translational Medicine. 2010. T. 2. № 29. C. 29ra31.

263. Stoltz D. A. h gp. Intestinal CFTR expression alleviates meconium ileus in cystic fibrosis pigs // Journal of Clinical Investigation. 2013. T. 123. № 6. C. 2685-2693.

264. Sultan S. h gp. A peptide nucleic acid (PNA) masking the miR-145-5p binding site of the 3'UTR of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) mRNA enhances CFTR expression in Calu-3 cells // Molecules. 2020. T. 25. № 7. C. 1677.

265. Suzuki K. h gp. In vivo genome editing via CRISPR/Cas9 mediated homology-independent targeted integration // Nature. 2016. T. 540. № 7631. C. 144-149.

266. Suzuki S. h gp. TALENs facilitate single-step seamless SDF correction of F508del CFTR in airway epithelial submucosal gland cell-derived CF-iPSCs // Molecular Therapy - Nucleic Acids. 2016. T. 5. № 1. C. e273.

267. Suzuki S. h gp. Highly Efficient Gene Editing of Cystic Fibrosis Patient -Derived Airway Basal Cells Results in Functional CFTR Correction // Molecular Therapy. 2020. T. 28. № 7. C. 1684-1695.

268. Takahashi K. h gp. Induction of Pluripotent Stem Cells from Adult Human Fibroblasts by Defined Factors // Cell. 2007. T. 131. № 5. C. 861-872.

269. Taylor-Cousar J. L. h gp. Clinical development of triple-combination CFTR modulators for cystic fibrosis patients with one or two F508del alleles // ERJ Open Research. 2019. T. 5. № 2. C. 00082-02019.

270. Tebas P. h gp. Gene Editing of CCR5 in Autologous CD4 T Cells of Persons Infected with HIV // New England Journal of Medicine. 2014. T. 370. № 10. C. 901-910.

271. Thyme S. B. h gp. Internal guide RNA interactions interfere with Cas9-mediated cleavage // Nature Communications. 2016. T. 7. C. 11750.

272. Tornabene P., Trapani I. Can Adeno-Associated Viral Vectors Deliver Effectively Large Genes? // Human gene therapy. 2020. T. 31. № 1-2. C. 47-56.

273. Urnov F. D. h gp. Genome editing with engineered zinc finger nucleases // Nature Reviews Genetics. 2010. T. 11. № 9. C. 636-646.

274. Vaidyanathan S. h gp. High-Efficiency, Selection-free Gene Repair in Airway Stem Cells from Cystic Fibrosis Patients Rescues CFTR Function in Differentiated Epithelia // Cell Stem Cell. 2020. T. 26. № 2. C. 161-171.e4.

275. Vaidyanathan S. h gp. Targeted replacement of full-length CFTR in human airway stem cells by CRISPR-Cas9 for pan-mutation correction in the endogenous locus // Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 2022. T. 30. № 1. C. 223-237.

276. Vakulskas C. A. h gp. A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells // Nature Medicine. 2018. T. 24. № 8. C. 1216-1224.

277. Vannucci L. h gp. Viral vectors: a look back and ahead on gene transfer technology // The new microbiologica. 2013. T. 36. № 1. C. 1-22.

278. Vaz I. M. h gp. Chromosomal aberrations after induced pluripotent stem cells reprogramming // Genetics and Molecular Biology. 2021. T. 44. № 3. C. e20200147.

279. Vazquez-Armendariz A. I., Tata P. R. Recent advances in lung organoid development and applications in disease modeling // The Journal of Clinical Investigation. 2023. T. 133. № 22. C. e170500.

280. Villella V. R. h gp. Disease-relevant proteostasis regulation of cystic fibrosis transmembrane conductance regulator // Cell Death and Differentiation. 2013. T. 20. № 8. C. 1101-1115.

281. Wagner J. A. h gp. A phase I/II study of tgAAV-CF for the treatment of chronic sinusitis in patients with cystic fibrosis // Human Gene Therapy. 1998. T. 9. № 6. C. 889-909.

282. Wagner J. A. h gp. Safety and biological efficacy of an adeno-Associated virus vector-Cystic fibrosis transmembrane regulator (aav-Cftr) in the cystic fibrosis maxillary sinus // Laryngoscope. 1999. T. 109. № 2. C. 266-274.

283. Wagner J. A. h gp. A Phase II, double-blind, randomized, placebo-controlled clinical trial of tgAAVCF using maxillary sinus delivery in patients with cystic fibrosis with antrostomies // Human Gene Therapy. 2002. T. 13. № 11. C. 1349-1359.

284. Wainwright C. h gp. Long-Term Safety and Efficacy of Elexacaftor/Tezacaftor/Ivacaftor in Children Aged >6 Years with Cystic Fibrosis and at Least One F508del Allele: A Phase 3, Open-Label Clinical Trial // American journal of respiratory and critical care medicine. 2023. T. 208. № 1. C. 68-78.

285. Wang D. h gp. Adenovirus-Mediated Somatic Genome Editing of Pten by CRISPR/Cas9 in Mouse Liver in Spite of Cas9-Specific Immune Responses // Human Gene Therapy. 2015. T. 26. № 7. C. 432-442.

286. Wang H., Russa M. La, Qi L. S. CRISPR/Cas9 in Genome Editing and beyond // Annual Review of Biochemistry. 2016. T. 85. C. 227-264.

287. Wang Z. h gp. Human Bocavirus 1 Is a Novel Helper for Adeno-associated Virus Replication // Journal of Virology. 2017. T. 91. № 18. C. e00710-17.

288. Ward P., Walsh C. E. Current and future prospects for hemophilia gene therapy // Expert Review of Hematology. 2016. T. 9. № 7. C. 649-659.

289. Wecht S., Rojas M. Mesenchymal stem cells in the treatment of chronic lung disease // Respirology. 2016. T. 21. № 8. C. 1366-1375.

290. Wei T. h gp. Lung SORT LNPs enable precise homology-directed repair mediated CRISPR/Cas genome correction in cystic fibrosis models // Nature Communications. 2023. T. 14. № 1. C. 7322.

291. White M. K., Khalili K. CRISPR/Cas9 and cancer targets: Future possibilities and present challenges // Oncotarget. 2016. T. 7. № 11. C. 12305-12317.

292. Wong A. P. h gp. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein // Nature Biotechnology. 2012. T. 30. № 9. C. 876-882.

293. Wood A. J. h gp. Targeted genome editing across species using ZFNs and TALENs // Science. 2011. T. 333. № 6040. C. 307.

294. Wu X., Kriz A.J., Sharp P.A. Target specificity of the CRISPR-Cas9 system // Quant Biol. 2014. T. 2. № 2. C. 59-70.

295. Xia E. h gp. TALEN-mediated gene targeting for cystic fibrosis-gene therapy // Genes. 2019. T. 10. № 1. C. 39.

296. Yang H. h gp. One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/cas-mediated genome engineering // Cell. 2013. T. 154. № 6. C. 1370.

297. Yang H., Ma T. F508del-cystic fibrosis transmembrane regulator correctors for treatment of cystic fibrosis: A patent review // Expert Opinion on Therapeutic Patents. 2015. T. 25. № 9. C. 991-1002.

298. Yang H., Wang H., Jaenisch R. Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering // Nature Protocols. 2014. T. 9. № 8. C. 1956-1968.

299. Yang L. A practical guide for structural variation detection in human genome // Current protocols in human genetics. 2020. T. 107. № 1. C. e103.

300. Yao X. h gp. CRISPR/Cas9 - Mediated Precise Targeted Integration In Vivo Using a Double Cut Donor with Short Homology Arms // EBioMedicine. 2017. T. 20. C. 19-26.

301. Zabner J. h gp. Adenovirus-mediated gene transfer transiently corrects the chloride transport defect in nasal epithelia of patients with cystic fibrosis // Cell. 1993. T. 75. № 2. C. 207-216.

302. Zainal Abidin N. и др. Ataluren in cystic fibrosis: development, clinical studies and where are we now? // Expert Opinion on Pharmacotherapy. 2017. Т. 18. № 13. C. 1363-1371.

303. Zanuttigh E. и др. Generation of two human iPSC lines, HMGUi004-A and FINCBi004-A, from fibroblasts of MPAN patients carrying pathogenic recessive mutations in the gene C19orf12 // Stem cell research. 2023. Т. 72. С. 103197.

304. Zarrilli F. и др. Peptide nucleic acids as miRNA target protectors for the treatment of cystic fibrosis // Molecules. 2017. Т. 22. № 7. С. 1144.

305. Zawistoski M. и др. 32 Properties of a novel F508del-CFTR corrector FDL169 // Journal of Cystic Fibrosis. 2016. Т. 15. C. S59-S60.

306. Zhang L. и др. CFTR delivery to 25% of surface epithelial cells restores normal rates of mucus transport to human cystic fibrosis airway epithelium // PLoS Biology. 2009. Т. 7. № 7. С. e1000155.

307. Zhao Y. и др. Improving the Efficiency of CRISPR Ribonucleoprotein-Mediated Precise Gene Editing by Small Molecules in Porcine Fibroblasts // Animals : an open access journal from MDPI. 2024. Т. 14. № 5. С. 719.

308. Zielenski J., Tsui L. C. Cystic fibrosis: Genotypic and phenotypic variations // Annual Review of Genetics. 1995. Т. 29. C. 777-807.

309. Zuckerman J. B. и др. A phase I study of adenovirus-mediated transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene to a lung segment of individuals with cystic fibrosis // Human Gene Therapy. 1999. Т. 10. № 18. C. 29732985.

310. Annual Data Report 2020 Cystic Fibrosis Foundation Patient Registry. URL: https://www.cff.org/sites/default/files/2021-10/2019-Patient-Registry-Annual-Data-Report.pdf

311. Approved Cellular and Gene Therapy Products [Электронный ресурс]. -URL: https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/cellular-gene-therapy-products/approved-cellular-and-gene-therapy-products (дата обращения: 08.07.2025).

312. Cystic Fibrosis Foundation | CF Foundation [Электронный ресурс]. URL: https://www.cff.org/ (дата обращения: 04.03.2021).

ПРИЛОЖЕНИЕ

Стандартная операционная процедура «Протокол получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека»

Составлено: Кондратьева Е.В., научный сотрудник лаборатории редактирования генома; Слесаренко Я.С., научный сотрудник лаборатории редактирования генома

Содержание и назначение: Определяет порядок получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и их характеристику для подтверждения плюрипотентных свойств

Пересмотр через: 1 год

I.ТЕРМИНЫ И ОБОЗНАЧЕНИЯ

Стандартная операционная процедура (далее СОП) - документально оформленный набор инструкций или пошаговых действий, которые надо осуществить, чтобы выполнить ту или иную работу.

Биоматериал - биологический материал (клетки, ДНК) ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота.

База данных - база, в которой регистрируются клеточная линия и данные донора.

II. ЦЕЛЬ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Настоящая стандартная операционная процедура (далее СОП) «Протокол получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека» разработана в качестве стандарта для получения и характеризации линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из соматических клеток доноров, для дальнейшего использования полученных клеток с разнообразными целями и депонирования их в ЦКП «Биобанк».

Цель разработки СОП состоит в:

- определении порядка получения линий индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) из соматических клеток;

- определении количества применяемых реактивов и расходного материала, необходимых для получения и характеризации линий ИПСК;

- унификация протокола получения ИПСК человека.

Разработанная СОП рекомендована для научных сотрудников лабораторий, работающих клеточными культурами и линиями.

III. НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ

1. СанПиН 2.1.3.2630-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к организациям, осуществляющим медицинскую деятельность». Утверждены постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 18 мая 2010 г № 58.

2. СанПиН 2.1.7.2790-10 «Санитарно-эпидемиологические требования к обращению с медицинскими отходами».

3. Р 3.5.1904-04 «Использование ультрафиолетового бактерицидного излучения для обеззараживания воздуха в помещениях».

4. Приказ Минздрава СССР N 770 от 10 июня 1985 г О введении в действие отраслевого стандарта ОСТ 42-21-2-85 «Стерилизация и дезинфекция изделий медицинского назначения. Методы, средства и режимы».

5. ГОСТ Р 53079.4-2008. «Технологии медицинские лабораторные. Обеспечение качества клинических лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа». Введен в действие с 1.01.2010 года.

6. ГОСТ Р 8.691 Государственная система обеспечения единства измерений. Стандартные образцы материалов (веществ). Содержание паспортов и этикеток.

7. Европейский стандарт Е^1500 «Обработка рук» - общая методика обработки рук, начиная с первого (бытовой, механический) уровень - и вплоть до третьего, хирургического уровня.

8. КО 15189:2012 «Лаборатории медицинские. Требования к качеству и компетентности»

9. Методические рекомендации «Организация преаналитического этапа при централизации лабораторных исследований», принятые на XVI форуме «Национальные дни лабораторной медицины России - 2012», Кишкун А.А., Гильманов А.Ж. и соавт.

10. Приложение к Приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г. № 708н

11. ГОСТ Р 53434-2009. Принципы надлежащей лабораторной практики. М.: Стандартинформ. 2010. 12 с.

IV. ТРЕБОВАНИЯ К ПРОЦЕДУРЕ

Репрограммирование фибробластов человека (ФЧ) с получением индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) является в настоящее время одним из основных методов клеточной биологии и медицины. Опубликовано множество протоколов, которые различаются по способу доставки трансгенов в клетки, условиям культивирования клеток в процессе репрограммирования, а также эффективности. Далее полученные таким образом ИПСК человека можно дифференцировать, например, в кроветворные стволовые клетки, кардиомиоциты, стволовые клетки нервной ткани или печени, с помощью различных факторов. На данный момент эта технология используется в основном для моделирования заболеваний, анализа экспрессии генов при различных заболеваниях, а также для оценки влияния на клетки различных веществ, в том числе лекарств и токсинов. Полученные в таких исследованиях данные дают материал для поиска новых подходов к ранней диагностике и терапии заболеваний. Кроме того, весьма перспективным направлением считается разработка лечения с помощью ИПСК благодаря возможности получения неограниченного количества разных типов клеток и выращивания здоровых клеток и тканей из собственных клеток человека, в том числе с участием геномного редактирования.

Данная СОП описывает получение ИПСК человека из фибробластов и моноцитов крови с использованием двух взаимозаменяемых методик: с помощью вируса Сендай и с помощью невирусного РНК-вектора. Обе эти методики обеспечивают репрограммирование дифференцированных клеток благодаря экспрессии в них факторов репрограммирования: ОСТ4, KLF4, SOX2 и с-МГС в обоих случаях, с добавлением фактора GLIS1 в случае невирусного РНК-вектора. Кроме того, невирусный РНК-вектор также содержит ген устойчивости к антибиотику пуромицину, что облегчает этап селекции успешно трансфицированных факторами клеток.

В соответствии с общепризнанными нормативами при получении и дальнейшей работе с ИПСК необходимо получение характеристики этих ИПСК по определенным параметрам. В связи с этим данная СОП также содержит описание методик, позволяющих получить такую характеристику. Как правило, характеристика должна включать подтверждение экспрессии маркеров плюрипотентности, функциональное подтверждение плюрипотентного статуса клеток (т.е. способность ИПСК дифференцироваться в клетки, принадлежащие трем зародышевым

листкам), подтверждение отсутствия хромосомных перестроек (например, методом кариотипирования), подтверждение происхождения линии ИПСК (например, методом STR-анализа), а также стандартный для работ с эукариотическими линиями анализ на отсутствие контаминации микоплазменной инфекцией.

Все работы, проводимые в условиях лаборатории, должны вестись в соответствии с правилами пожарной безопасности и охраны труда. Процедуры, требующие стерильности, проводят в ламинарных боксах классом безопасности не ниже II. При работе обеспечиваются условия, предотвращающие заражение персонала инфекционными агентами из первичного биоматериала. Все оборудование проходит процедуру калибровки сотрудниками лаборатории с периодичностью и с использованием методов, как это указано производителем. Все расходные материалы и реактивы должны иметь соответствующие сертификаты качества и храниться соответственно спецификации. Контроль выполнения пунктов протокола возлагается на Руководителя работ. Ответственность за выполнение данной процедуры несут все сотрудники, участвующие в исследовании.

Получение информированного добровольного согласия пациента на использование полученных у него образцов биологического материала в научных исследованиях.

В соответствии с нормами этического права, признанными международным сообществом и регламентированными приказами Министерства здравоохранения Российской Федерации, перед получением от пациентов образцов биологического материала для проведения научных исследований необходимо получить его информированное добровольное согласие на медицинское вмешательство и последующее использование этих образцов в научных целях. В беседе с пациентом ему разъясняют, что полученному от него образцу будет присвоен кодовый номер, а паспортные и анамнестические сведения, равно как и данные его обследования, будут не доступны для персональной идентификации.

В соответствии с нормами, одобренными региональным отделением Этического комитета субъекта Российской Федерации и института, пациент подтверждает свое согласие на использование для научных исследований полученных у него образцов биологического материала при заполнении документа «Информированное добровольное согласие».

V. ТЕХНИКА БЕЗОПАСНОСТИ И ОХРАНА ТРУДА

Соблюдение правил техники безопасности и санитарного противоэпидемического режима на рабочем месте является неукоснительным требованием для выполнения всем персоналом, допущенным к работе в лаборатории. Ответственность за организацию безопасных условий труда в подразделении возлагается в соответствии с приказом по учреждению на руководителя соответствующего подразделения или специально назначенное ответственное лицо.

Правила техники безопасности по каждому виду работ разрабатывает заведующий подразделением совместно с ответственным сотрудником, прошедшим специальную подготовку по указанным вопросам. Инструкции по технике безопасности по каждому виду лабораторных работ после согласования с комиссией местного профсоюзного комитета утверждает руководитель учреждения. Копии всех необходимых инструкций выдаются в каждое структурное подразделение института.

Комплект инструкций по технике безопасности подвергают регулярному пересмотру: в плановом порядке (1 раз в 5 лет); внепланово в связи с возникновением внештатной ситуации; в связи с внедрением в практику новых методов диагностического исследования или приобретением нового вида лабораторного оборудования.

Каждый сотрудник получает первичный инструктаж по технике безопасности при приеме на работу или возвращении к данному виду деятельности после длительного перерыва, о чем делают запись по установленной форме в «Журнале проведения инструктажа по технике безопасности». Повторный плановый инструктаж проводят ежегодно, а внеплановый - при возникновении аварийных ситуаций или по распоряжению администрации учреждения.

О прохождении инструктажа и допуске к самостоятельной работе в соответствующем подразделении института делают отметку под роспись сотрудника в «Журнале проведения инструктажа по технике безопасности». По согласованию с администрацией учреждения проверку знаний по технике безопасности у работников лаборатории контролируют путем собеседования, принятия зачета или экзамена, анкетирования, инспектирования в процессе работы.

VI. ОТВЕТСТВЕННОСТЬ ПЕРСОНАЛА

Сотрудники лаборатории несут ответственность за выполнение ими правил техники безопасности, соблюдение санитарного противоэпидемического и противопожарного режимов на рабочем месте. При работе с образцами пациента, обращаться с ними следует как с потенциально содержащими патологические биологические агенты, независимо от результатов предшествовавших лабораторных исследований. Сотрудникам лаборатории запрещено без разрешения администрации учреждения выносить за пределы рабочей зоны образцы

биологических материалов, контрольных материалов и рабочую документацию подразделения. Сотрудники, осуществляющие забор биологического материала, несут персональную ответственность за сохранность биологических образцов, полноту, правильность и своевременность проведения комплекса исследований, ведение записей в журналах лаборатории, своевременное заполнение протоколов с результатами исследований.

VII. ПРОЦЕДУРА ПОЛУЧЕНИЯ И ХАРАКТЕРИЗАЦИИ ИПСК

1. Перечень необходимого оборудования и расходных материалов

1.1. Общее лабораторное оборудование

Приведены возможные варианты производителей и марок оборудования. Для большей части оборудования ниже не указан производитель, так как можно использовать приборы разных производителей:

- С02-инкубатор (условия культивирования: 5% CO2 и 37°С);

- автоматический счетчик клеток, например Countess II (Thermo Fisher Scientific);

- аквадистиллятор электрический;

- весы аналитические;

- водяная баня (37°С);

- инвертированный микроскоп;

- конфокальный микроскоп;

- криохранилище с жидким азотом;

- ламинарный шкаф II класса защиты;

- набор автоматических пипеток, макс. объем 10, 20, 100, 200, 1000 мкл;

- пипеточный дозатор 0,5-100 мл;

- планшетный ридер, например EnSpire Multimode Plate Reader (PerkinElmer);

- холодильники с температурой -80°С, -20°С и +4°С;

- центрифуга с адаптером для пробирок 10 и 50 мл;

- центрифуга-вортекс для пробирок 0,5 и 1,5 мл;

- штатив для замораживания криопробирок CoolCell LX (Corning, BCS-405G).

1.2. Общие расходные материалы и реактивы

В данном разделе перечислены общие расходные материалы и реактивы, которые будут необходимы для получения ИПСК независимо от типа исходных клеток и методики репрограммирования. Приведены возможные варианты производителей материалов и реактивов. Указанные ниже реагенты можно заменять на аналогичные от других производителей, поэтому для части расходных материалов производитель не указан:

- 2-меркаптоэтанол 55 мМ;

- Версена раствор;

- витронектин рекомбинантный (VTN-N) (Thermo Fisher Scientific, кат. № A14700);

- ДМСО (диметилсульфоксид);

- добавка GlutaMAX (Thermo Fisher Scientific, кат. № 35050038);

- колхицин (ПанЭко);

- криопробирки, 2 мл;

- лабораторные стулья или кресла (с поверхностями, подлежащими обработке дезинфицирующими средствами);

- лабораторный рабочий стол;

- наконечники стерильные пластиковые, 10, 200 и 1000 мкл;

- нокаутный заменитель сыворотки (KSR) (Thermo Fisher Scientific, кат. № 10828-028);

- пипетки стерильные серологические, 2, 5, 10 и 25 мл;

- планшет 12-луночный для работы с адгезивными культурами клеток;

- планшет 6-луночный для работы с адгезивными культурами клеток;

- пластиковые контейнеры для сбора и дезинфицирующей обработки расходных материалов, перчаток;