Повышение эффективности праймированного редактирования варианта F508del в гене CFTR тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Володина Ольга Владимировна

• Володина Ольга Владимировна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Володина Ольга Владимировна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертационного исследования

Степень разработанности темы

Цель исследования

Задачи, решаемые в ходе исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы диссертационного исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности результатов

Апробация результатов исследования

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Личный вклад автора в проведение исследования

Публикации

Структура и объем диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Генная терапия

1.2 Муковисцидоз

1.2.1 Клиническая картина муковисцидоза

1.2.2 Генетика муковисцидоза

1.2.3 Лекарственные препараты для лечения муковисцидоза

1.3 Геномное редактирование

1.3.1 Платформы для геномного редактирования

1.3.2 Репарация ДЦР

1.4 Праймированное редактирование

1.4.1 Причины снижения эффективности PE

1.4.2 Виды праймированного редактирования

1.4.3 Использование нуклеаз FEN1 и EXO1 для повышения эффективности праймированного редактирования

1.4.4 Выбор pegRNA для праймированного редактирования

1.4.5 Проблемы доставки системы PE

1.5 Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Материалы исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Выделение ДНК из клеток и определение концентрации

2.2.2 Полимеразная цепная реакция

2.2.3 Электрофорез нуклеиновых кислот

2.2.4 Работа с прокариотическими клетками

2.2.4.1 Трансформация компетентных клеток

2.2.4.2 Наращивание плазмидной ДНК

2.2.4.3 Выделение плазмидной ДНК

2.2.5 Создание коллекции плазмидных конструкций, кодирующих epegRNA55

2.2.6 Создание коллекции плазмидных конструкций, кодирующих модификации PEmax

2.2.7 Работа с эукариотическими клетками

2.2.7.1 Получение базальных клеток дыхательных путей из чИПСК и их ведение

2.2.7.2 Доставка генетических конструкций в чиБК методом электропорации

2.2.7.3 Доставка генетических конструкций в чиБК методом липофекции

2.2.7.4 Световая и флуоресцентная микроскопия

2.2.7.5 Доставка генетических конструкций в HEK293T методом липофекции

2.2.7.6 Облучение клеток HEK293T

2.2.7.7 Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток HEK293T

2.2.8 Подготовка образцов перед глубоким таргетным секвенированием

2.2.9 Подготовка образцов перед глубоким таргетным секвенированием для оценки нецелевых эффектов

2.2.10 Глубокое таргетное секвенирование

2.2.11 Анализ данных и статистическая обработка

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Создание коллекции плазмид, кодирующих последовательности epegRNA

3.1.1 Дизайн конструкций epegRNA для праймированного редактирования варианта F508del в гене CFTR

3.1.2 Создание коллекции плазмид, кодирующих различные epegRNA

3.2 Написание алгоритма для обработки данных на языке программирования Python

3.3 Оценка специфического и неспецифического воздействия различных epegRNA в сочетании с системами редактирования PEmax или PE2-NG

3.3.1 Оценка специфического воздействия различных epegRNA в сочетании с PEmax или PE2-NG

3.3.1.1 Проведение экспериментов с использованием 24 плазмид, кодирующих epegRNA

3.3.1.2 Проведение дополнительных экспериментов с наиболее эффективными epegRNA

3.3.2 Оценка неспецифического воздействия различных epegRNA в сочетании с PEmax или PE2-NG

3.3.2.1 Оценка неспецифического действия различных epegRNA в сочетании с PEmax или PE2-NG в локусе редактирования

3.3.2.2 Оценка нецелевых эффектов, внесенных наиболее эффективной epegRNA20 в сочетании с PE2-NG

3.4 Создание коллекции плазмид, кодирующих модификации PEmax

3.4.1 Дизайн модификаций PEmax с использованием нуклеаз EXO1 и FEN1

3.4.2 Создание коллекции плазмид, кодирующих различные модификации

PEmax

3.5 Оценка специфического и неспецифического воздействия модификаций PEmax

3.5.1 Оценка специфического воздействия различных модификаций PEmax

3.5.1.1 Проведение экспериментов с использованием плазмид, кодирующих 12 различных модификаций PEmax

3.5.1.2 Проведение дополнительных экспериментов с наиболее эффективными модификациями системы PEmax

3.5.2 Оценка неспецифического воздействия различных модификаций PEmax

3.5.2.1 Оценка неспецифического действия различных модификаций PEmax в локусе редактирования

3.5.2.2 Оценка нецелевых эффектов внесенных системой 4-FEN

3.5.2.3 Оценка фокусов yH2AX

3.5.2.4 Итоговая оценка неспецифического воздействия различных модификаций PEmax

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Список статей, опубликованных в журналах, рекомендованных ВАК при

Минобрнауки России

Список публикаций в других изданиях

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение А Последовательности нуклеаз EXO1, HEX-N2 и FEN1

Приложение Б Праймеры для амплификации перекрывающихся участков для клонирования плазмидных конструкций методом Гибсона

Приложение В Праймеры для проверки колоний после клонирования методом

Гибсона. Х - 4-аминокислотный или 16-аминокислотный линкер

Приложение Г Праймеры для оценки нецелевых эффектов

Приложение Д Алгоритм на языке программирования Python

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ААВ - аденоассоциированный вирус ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ДЦР - двухцепочечный разрыв МВ - муковисцидоз ПНК - пептидонуклеиновая кислота ПЦР - полимеразная цепная реакция РНК - рибонуклеиновая кислота

чиБК - индуцированные базальные клетки легкого человека

чиПСК - индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека

BE - base editor - редактор оснований

CRISPR - clustered regularly interspaced short palindromic repeats - сгруппированные

регулярно чередующиеся короткие палиндромные повторы

crRNA - CRISPR RNA

EXO1 - человеческая экзонуклеаза

FEN1 - flap endonuclease

HDR - homology-directed repair - направленная гомологичная репарация

HR - homologous recombination - гомологичная рекомбинация

MMEJ - microhomology-mediated end joining - микрогомологичное соединение

концов

MMR - mismatch repair system - система репарации неспаренных оснований NGS - next-generation sequencing - высокопроизводительное секвенирование NHEJ - non-homologous end joining - негомологичное соединение концов PAM - protospacer adjacent motif - мотив, прилежащий к протоспейсеру PBS - primer binding site - сайт связывания праймера

PCNA - Proliferating cell nuclear antigen - ядерный антиген пролиферирующих клеток

PE - праймированное редактирование

pegRNA - prime editing guide RNA - направляющая РНК для праймированного редактирования

RFC - replication factor C - фактор репликации C RT - reverse transcriptase - обратная транскриптаза

RTT - reverse transcriptase template - матрица для обратной транскрипции SEM - standard error of the mean - стандартная ошибка среднего sgRNA - single guide RNA - единая направляющая РНК

TALEN - Transcription activator-like effector nucleases - эффекторная нуклеаза, подобная активатору транскрипции

tracrRNA - trans-activating CRISPR RNA - транс-активирующая crRNA ZFN - zinc finger nuclease - нуклеаза «цинковые пальцы»

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Повышение эффективности праймированного редактирования варианта F508del в гене CFTR»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы диссертационного исследования

Праймированное редактирование (prime editing, PE) - наиболее безопасный метод коррекции патогенных вариантов, потенциально имеющий преимущества для лечения заболеваний человека [Zhao и др., 2023]. При праймированном редактировании используется никаза Cas9, связанная с обратной транскриптазой, при этом для внесения желаемого изменения в геном не требуется донорная молекула [Chen, Liu, 2023]. В качестве направляющей РНК используется улучшенная молекула для праймированного редактирования - epegRNA - более сложная, чем направляющая РНК, она содержит последовательность протоспейсера для распознавания целевой последовательности, матрицу для обратной транскриптазы с правильной последовательностью фрагмента гена и сайт связывания праймера для активации обратной транскриптазы, а также содержит защитную шпильку tevopreQi на З'-конце [Nelson и др., 2022].

Несмотря на преимущества PE, эффективность редактирования во многих случаях остаётся низкой, что в значительной степени связано с нуклеотидным составом таргетных участков ДНК [Yu и др., 2023; Zhao и др., 2023]. Показано, что АТ-богатые локусы хуже поддаются коррекции [Javaid, Choi, 2021], что особенно актуально для патогенного варианта F508del в гене CFTR. Этот вариант вызывает нарушение работы хлорного канала CFTR, что приводит к муковисцидозу -аутосомно-рецессивному заболеванию с высокой летальностью, преимущественно связанной с тяжелым поражением легких [Dickinson, Collaco, 2021; McKone и др., 2021]. Хотя существует патогенетическая терапия, разработка этиотропных подходов остаётся актуальной, так как существующие препараты требуют пожизненного применения, имеют высокую стоимость и выраженные побочные эффекты [Муковисцидоз не выходит на торги, 2024; Important Safety Information | TRIKAFTA® (elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor and ivacaftor), 2025].

Для повышения эффективности праймированного редактирования варианта F508del в рамках создания этиотропной терапии могут быть использованы два основных подхода: оптимизация epegRNA и модификация самого редактора.

Установлено, что длина и нуклеотидный состав вариабельных областей epegRNA напрямую влияют на эффективность редактирования [Chen и др., 2021; Chen, Liu, 2023], однако подобрать оптимальную последовательность исключительно методами in silico невозможно, что требует экспериментального тестирования спектра молекул epegRNA. При этом важно учитывать ограничения PAM, распознаваемого используемым редактором. Более эффективные системы, такие как PEmax [Chen и др., 2021], распознают PAM NGG, что часто ограничивает возможность создания epegRNA с высоким GC-содержанием. Напротив, менее эффективные, но более гибкие системы, например, PE2-NG, распознают PAM NGN [Kweon и др., 2021], что расширяет диапазон доступных участков для проектирования epegRNA. Таким образом, важно определить, что более критично для успешного редактирования: высокая эффективность редактора или гибкость в выборе epegRNA с оптимальным GC-составом.

Другим направлением повышения эффективности праймированного редактирования является модификация самого редактора за счёт включения в его состав одной из нуклеаз - FEN1, EXO1 или ее каталитически активный домен HEX-N2. Эти ферменты способны удалять неизменённую 5'-цепь ДНК, не содержащую вносимое изменение [Keijzers, Liu, Rasmussen, 2016; FEN1 flap structure-specific endonuclease 1 [Homo sapiens (human)] - Gene - NCBI, 2025]. Это обеспечивает доступ участка ДНК для новосинтезированной 3'-цепи с исправленным патогенным вариантом и повышает вероятность её отжига с матричной ДНК, тем самым увеличивая общую эффективность редактирования.

Для обеспечения специфичности и безопасности предполагается соединение FEN1 или EXO1 с праймированным редактором с помощью белковых линкеров, что позволит контролировать пространственное положение ферментов и ограничить их активность рамками редактируемого локуса. При этом важно учитывать, что поведение таких гибридных конструкций также невозможно точно

предсказать in silico, поэтому требуется разработка и экспериментальное тестирование нескольких вариантов систем с различной пространственной организацией и длиной линкера.

Таким образом, ключевой задачей исследования является комплексная оценка различных подходов повышения эффективности праймированного редактирования варианта F508del в гене CFTR, включая использование более эффективных поколений редактора, выбор систем редактирования с более гибким PAM, обеспечивающих разнообразие epegRNA, а также внедрение новых модификаций редактора с нуклеазами и систематическая оценка их эффективности.

Степень разработанности темы

Молекулярная система для праймированного редактирования, основанная на слиянии обратной транскриптазы и никазы Cas9, была предложена D. Liu и соавт. [Chen, Liu, 2023] и стала важной альтернативой классической системе CRISPR/Cas9. Праймированные редакторы показывают высокую эффективность коррекции ДНК, а также низкий уровень нежелательных изменений, таких как вставки, делеции и замены по сравнению со стандартной системой CRISPR/Cas9 [Chen, Liu, 2023]. Это позволяет рассматривать технологию для разработки генной терапии наследственных заболеваний.

Редакторы первого поколения демонстрировали низкую эффективность коррекции, поэтому были разработаны модификации, направленные на её повышение. Редактор второго поколения (PE2) уже показывал значительное повышение эффективности по сравнению с редактором первого поколения - от 1,5 до 4,2 раз. Были предложены различные подходы к улучшению праймированного редактирования, включая модификации, вызывающие дополнительный разрыв в молекуле ДНК [Chen и др., 2021; Chen, Liu, 2023; Doman и др., 2023], и системы с подавлением репарации неспаренных оснований [Chen и др., 2021]. Эти улучшения позволяли повысить эффективность коррекции ДНК в 7,7 раз по сравнению с

редактором второго поколения. Все описанные варианты редактирования применяли и для коррекции варианта F508del с эффективностью до 58%, однако их использование сопровождалось увеличением частоты вставок и делеций, что снижало потенциальную безопасность метода для дальнейшего использования в терапевтических целях [Sousa и др., 2025]. Более того, в указанных работах epegRNA разрабатывали исключительно для нуклеазы с PAM NGG, а возможности использования систем редактирования, распознающих альтернативные PAM-последовательности, не исследовали.

Кроме того, несмотря на широкое развитие технологий праймированного редактирования, до настоящего времени не были созданы модификации с использованием нуклеаз FEN1, EXO1 и HEX-N2, которые потенциально могли бы повысить эффективность редактирования за счёт удаления 5'-конца в процессе репарации. Ранее влияние этих нуклеаз изучалось лишь косвенно - через их сверхэкспрессию или подавление экспрессии [Chen и др., 2021; Xu и др., 2023]. В единственном исследовании FEN1 была объединена с системой PE2 при помощи линкера, однако авторы не тестировали различные варианты линкерных последовательностей, а полученная слитная конструкция показала низкую эффективность и не использовалась в дальнейших исследованиях [Xu и др., 2023]. Добавление человеческой EXO1 или её активного домена HEX-N2 к праймированному редактору до сих пор не исследовалось. Также в существующих работах, направленных на изучение FEN1 и EXO1, не рассматривалась их роль в коррекции патогенных вариантов.

Таким образом, представленные подходы для повышения эффективности праймированного редактирования варианта F508del в гене CFTR не применялись ранее в России и в мире.

Цель исследования

Изучить влияние различных модификаций праймированного редактирования на эффективность коррекции патогенного варианта F508del в гене CFTR при муковисцидозе.

Задачи, решаемые в ходе исследования

1. Разработать дизайн вариантов epegRNA для праймированного редактирования F508del в гене CFTR и сформировать коллекцию плазмидных конструкций для дальнейших исследований.

2. Разработать алгоритм на языке Python для автоматизированной обработки данных NGS с использованием утилиты CRISPResso2.

3. Оценить специфическую и неспецифическую активность созданных epegRNA в сочетании с системами редактирования PEmax и PE2-NG при коррекции варианта F508del в гене CFTR в базальных клетках лёгкого пациентов с муковисцидозом.

4. Создать коллекцию плазмидных конструкций, кодирующих никазу Cas9 и обратную транскриптазу, слитные с экзонуклеазами FEN1 или EXO1.

5. Оценить специфическую и неспецифическую активность созданных модификаций праймированного редактирования при коррекции варианта F508del в гене CFTR в базальных клетках лёгкого пациентов с муковисцидозом.

Научная новизна

Впервые были созданы плазмидные конструкции, кодирующие epegRNA, в сочетании с праймированным редактором PEmax или PE2-NG для коррекции F508del в гене CFTR. Впервые в мире был разработан дизайн модификаций системы редактирования PEmax с добавлением нуклеаз EXO1 или FEN1, соединённых 4- либо 16-аминокислотным линкером. Собранные конструкции

были протестированы в базальных клетках легкого пациентов с муковисцидозом. Показано, что GC-состав epegRNA влияет на эффективность коррекции F508del в гене CFTR, а модификация 4-FEN приводит к повышению эффективности праймированного редактирования в 2 раза.

Впервые был написан алгоритм для обработки данных, полученных после глубокого таргетного секвенирования с использованием программного обеспечения CRISPResso2, позволяющий существенно ускорить анализ данных.

Впервые в мире показано, что модификация праймированного редактирования с добавлением нуклеазы FEN1 не приводит к индуцированной генотоксичности, что свидетельствует о ее безопасности в отношении риска опухолевой трансформации.

Теоретическая и практическая значимость

Разработанные в рамках данной работы epegRNA могут быть использованы для создания генной терапии муковисцидоза, поскольку достигнутая частота коррекции, пересчитанная с учётом эффективности трансфекции, превышает 10%, что, вероятно, является пороговым значением восстановленных аллелей, необходимых для достижения клинического эффекта, согласно литературным данным.

Составленный алгоритм анализа данных предназначен для автоматизированной обработки файлов формата fastq, полученных в результате глубокого таргетного секвенирования отредактированных образцов, и формирования сводной таблицы с ключевыми результатами по завершении работы программы. Использование этого алгоритма позволяет существенно ускорить анализ результатов и снизить количество ошибок, возникающий при ручном анализе.

Одна из созданных модификаций системы РЕтах продемонстрировала двукратное увеличение эффективности коррекции варианта F508del по сравнению

со стандартной системой РЕтах, что указывает на её перспективность для дальнейших исследований с использованием праймированного редактирования.

Методология и методы диссертационного исследования

Методологической и теоретической основой диссертационной работы являлись отечественные и зарубежные исследования в области геномного редактирования с помощью праймированного редактора. В диссертационной работе использованы следующие молекулярно-генетические методы: синтез epegRNA и их клонирование в плазмидную конструкцию методом рестрикции и лигирования; клонирование методом Гибсона генов FEN1 и EXO1 для получения плазмидных конструкций, содержащих редактор PEmax и последовательности, кодирующие нуклеазы; ведение бактериальных культур для наращивания плазмид и выделение плазмидной ДНК; липофекция клеточных линий базальных клеток легкого полученными препаратами плазмидной ДНК; выделение геномной ДНК; полимеразная цепная реакция; детекция результатов полимеразной цепной реакции с помощью гель-электрофореза; рестрикционный анализ; методы статистической обработки полученных результатов; глубокое таргетное секвенирование, выполняемое методами высокопроизводительного секвенирования; написание алгоритма для обработки данных на языке Python; анализ данных, полученных после глубокого таргетного секвенирования.

Положения, выносимые на защиту

1. Для эффективной коррекции АТ-богатых участков с помощью праймированного редактирования требуется подбор in silico и тестирование in vitro широкого спектра epegRNA, различающихся по вариабельным участкам, при этом рациональный подбор направляющих РНК является ключевым фактором для успешной коррекции таких локусов.

2. Разработанный алгоритм на языке Python для автоматизированной обработки данных NGS с использованием CRISPResso2 обеспечивает стандартизированное и воспроизводимое получение сводных таблиц с ключевыми результатами анализа, а также значительно сокращает время обработки данных.

3. На основе экспериментальных данных была определена молекула epegRNA с оптимальным составом, которая показала высокую эффективность коррекции F508del в гене CFTR (23,5% после нормирования на эффективность трансфекции), что позволяет использовать ее для дальнейшей разработки терапии муковисцидоза.

4. На основе экспериментальных данных показано, что модификация PEmax путём добавления FEN1 к C-концу обратной транскриптазы через короткий аминокислотный линкер способствует повышению эффективности коррекции варианта F508del в 2,13 раза без увеличения частоты нежелательных эффектов.

Степень достоверности результатов

Высокая степень достоверности результатов достигнута, благодаря использованию большого количества биологических и технических повторов в экспериментах с последующим анализом полученных результатов при использовании современных методов статистической оценки. Теоретическое обоснование работы основано на анализе многочисленных источников отечественной и зарубежной литературы. В работе применялись современные методы исследования и оборудование, а полученные результаты работы согласуются с результатами других исследований. Поставленные в работе цели и задачи полностью выполнены и отражены в выводах.

Апробация результатов исследования

Материалы диссертационной работы доложены на 8 международных и всероссийских конференциях: Конгресс CRISPR-2023 (2023, Новосибирск,

Россия); Конкурс молодых ученых ФГБНУ «МГНЦ» (2023, Москва, Россия); Мультимедийная конференция «Генная терапия: настоящее и будущее» (2023, Москва, Россия); Конкурс молодых ученых ФГБНУ «МГНЦ» (2024, Москва, Россия); Конференция «Генная терапия» (2025, Москва, Россия); European Human Genetics Conference (2025, Milan, Italy); European Cystic Fibrosis Conference (2025, Milan, Italy); CRISPR-2025 (2025, Ереван, Армения).

Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета 24.1.168.01 при Федеральном государственном бюджетном научном учреждении «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова» (ФГБНУ «МГНЦ»).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует паспорту специальности 1.5.7. Генетика (биологические науки), и охватывает следующие направления исследования: 14. Генетические основы биотехнологии. Генетическая и клеточная инженерия; 19. Генетика человека. Медицинская генетика. Наследственные болезни.

Личный вклад автора в проведение исследования

В диссертации представлены результаты исследований, выполненных автором лично или при его активном участии в период с 2022 по 2025 годы. Личный вклад автора в настоящую работу состоит в анализе литературы, проведение экспериментальной работы, обработке и анализе полученных результатов, и их оформлении и представлении в виде научных докладов и публикаций.

Публикации

Материалы диссертационной работы представлены в 7 печатных работах, в том числе в 3 статьях (все в Web of Science и/или Scopus, К1 - 3), опубликованных

в журналах, рекомендованных ВАК при Минобрнауки России для соискателей ученой степени кандидата биологических наук. В опубликованных научных работах полностью отражены основные результаты диссертации, положения и выводы.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 137 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 25 рисунков. Работа имеет следующую структуру: список сокращений и условных обозначений, введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список научных трудов по теме диссертации, список цитируемой литературы, приложения. Библиографический указатель включает 123 наименований, из них 2 отечественных и 121 зарубежных источника.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Генная терапия

Генная терапия человека направлена на изменение или регуляцию экспрессии генов либо на модификацию биологических свойств клеток с терапевтической целью. Она может осуществляться различными способами: замещением мутантного гена здоровой копией, инактивацией дефектного гена или введением нового или модифицированного гена для лечения заболевания. [FDA, 2020].

Для разработки генной терапии пользуются широким спектром методов молекулярной биологии и генной инженерии для получения нужных продуктов (рекомбинантных ДНК и векторов, модифицированных клеток), которые доставляются в организм реципиента в виде инъекций, аэрозолей или с помощью клеточной трансплантации [Xiao-Jie и др., 2015].

На данный момент в генной терапии широко используется подход, при котором рекомбинантные вирусные векторы применяются для доставки кодирующей последовательности целевого гена [Ghosh и др., 2020]. После интеграции этой последовательности в геном клетки начинается экспрессия функционального белка, который заменяет дефектный белок и восстанавливает нормальную функцию клетки. Такая доставка осуществляется преимущественно ретровирусными и лентивирусными векторами, которые почти случайным образом интегрируются в геном, либо аденоассоциированными вирусами - они находятся в ядре в виде внехромосомной копии ДНК [Nowakowski и др., 2013]. Лентивирусная генная терапия наиболее эффективна и обеспечивает долгосрочную работу гена, но основным ее недостатком является случайная интеграция в геном хозяина. Различные клинические исследования доказали, что при соблюдении предосторожностей и с учетом контроля количества вирусных копий лентивирусная терапия может быть безопасна для человека [Naldini, 2015; Rainov, Ren, 2003; Shirley и др., 2020].

Терапия аденоассоциированными вирусами включает в себя доставку эписомы ДНК в ядро, она считается более безопасной, чем лентивирусная терапия, но эписомальные копии ДНК аденоассоциированного вектора теряются при делении клеток, с чем связана более низкая эффективность этого метода доставки. Также у многих людей есть иммунитет к капсидным белкам аденоассоциированного вектора, а после однократного применения такой терапии у пациентов неизменно возникает приобретенный иммунитет, что исключает возможность повторного лечения [Ronzitti, Gross, Mingozzi, 2020].

Таким образом, можно сказать, что существующие методы генной терапии недостаточно точны и эффективны, поэтому сейчас активно разрабатываются стратегии, позволяющие изменять ДНК без интеграции вирусного вектора в клетку. Вирусные векторы в данном случае используются только для доставки конструкций, позволяющих редактировать геном клетки. Точное редактирование генома позволяет изменять ДНК клеток в определенных локусах для создания целевых геномных изменений. В качестве систем для разработки генной терапии ученые все чаще используют современные программируемые нуклеазы (нуклеазы цинковых пальцев, TALEN, CRISPR/Cas9) [Hu и др., 2024; Sugita и др., 2022; Tebas и др., 2025], которые работают по методу «cut - and - paste», то есть дефект удаляется, и вставляется нужная последовательность. Распознание сайта-мишени происходит с помощью специфичных для последовательности ДНК связывающих белков или с помощью короткого участка РНК. Затем в локус с патогенным вариантом вводится двухцепочечный или одноцепочечный разрыв, который репарируется с помощью механизмов клеточной репарации [Xiao-Jie и др., 2015]. Используя различные инструменты, можно добиваться разных целей - создавать точковые замены, инактивировать ген, интегрировать дополнительную копию гена в безопасный локус генома [Sadelain, Papapetrou, Bushman, 2011].

На данный момент разрабатывается генная терапия различных моногенных заболеваний с использованием платформ для геномного редактирования [Gillmore и др., 2021; Hu и др., 2024; Huang, Li, Li, 2022; Editas Medicine Announces Clinical Data Demonstrating Proof of Concept of EDIT-101 from Phase 1/2 BRILLIANCE Trial

| Editas Medicine, 2025]. В частности, в этой работе исследуется повышение эффективности праймированного редактирования для коррекции варианта F508del в гене CFTR в клетках пациентов с муковисцидозом.

1.2 Муковисцидоз

Муковисцидоз - наследственное аутосомно-рецессивное заболевание, при котором поражаются железы внешней секреции. Муковисцидоз протекает с тяжелым поражением легких, что в 90% случаев является причиной смерти пациентов. Патогенные варианты в гене регулятора трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR) приводит к изменению белка CFTR, который регулирует транспорт хлоридов, натрия и бикарбонатов через эпителиальные мембраны [Dickinson, Collaco, 2021; Reis, Damaceno, 1998]. Во всем мире зарегистрировано около 100 000 случаев муковисцидоза. Чаще всего заболевание встречается у людей североевропейского происхождения - 1 случай на 3000-6000 новорожденных [Scotet, L'Hostis, Ferec, 2020], реже всего у американцев азиатского происхождения - 1:30000 новорожденных [Hamosh и др., 1998, с. 1]. При этом частота заболеваемости в среднем в Российской Федерации составляет 1:10250 [Kiseleva и др., 2020]. Медианная продолжительность жизни пациентов в Европе составляет 51,7 лет [McKone и др., 2021], в России - 25 лет [Амелина, Черняк, Черняев, 2001].

1.2.1 Клиническая картина муковисцидоза

CFTR представляет собой белок, включающий пять функциональных доменов. К ним относятся два трансмембранных домена (TMD1 и TMD2), формирующих пору для прохождения ионов хлора; два нуклеотид-связывающих домена (NBD1 и NBD2), отвечающих за связывание и гидролиз АТФ и содержащих участки для фосфорилирования; а также уникальный регуляторный домен (R-домен), активация которого посредством цАМФ-зависимой протеинкиназы А

приводит к открытию канала. [Riordan и др., 1989; Sheppard, Welsh, 1999]. Он участвует в транспорте ионов хлора через мембраны клеток желез, повышая проницаемость для воды и обеспечивая гидратацию слизи на поверхности дыхательных путей [Boucher, 2007]. Это снижает её вязкость, а благодаря подщелачиванию бикарбонатом облегчает связывание и отделение слизи [Shah и др., 2016]. При патогенных вариантах гена CFTR слизь приобретает повышенную вязкость и закупоривает дыхательные пути, что обусловливает развитие тяжелых легочных инфекций. Для муковисцидоза характерна нейтрофильная инфильтрация, сопровождающаяся высвобождением эластазы, которая ингибирует антипротеазы легких. В результате происходит активация протеаз, приводящая к повреждению легочной ткани [Griese и др., 2008]. Кроме того, при дегрануляции нейтрофилы высвобождают большое количество нуклеиновых кислот и белков матрикса цитозоля, что приводит к повышению вязкости слизи.

При муковисцидозе также поражаются органы желудочно-кишечного тракта. Слизистые пробки закупоривают канальцы поджелудочной железы и проток желчного пузыря, препятствуя поступлению ферментов и желчи в двенадцатиперстную кишку. Это приводит к нарушениям всасывания питательных веществ и ухудшению пищеварения. Кроме того, может возникнуть синдром дистальной кишечной непроходимости, характерный для пациентов с недостаточностью поджелудочной железы. Это характеризуется илеоцекальной непроходимостью инспирированного кишечного содержимого [Griese и др., 2008; Houwen и др., 2010; Khoshoo, Udall, 1994].

Также из-за потери соли с потом у пациентов с муковисцидозом наблюдается дисбаланс минералов в крови, что приводит к обезвоживанию, аритмии, слабости, тепловым ударам [Rafeeq, Murad, 2017].

1.2.2 Генетика муковисцидоза

Ген CFTR находится на длинном плече 7 хромосомы. Было идентифицировано более 1900 генетических вариантов, из которых F508del

(делеция трех оснований, кодирующих фенилаланин в 508-м положении) является наиболее распространенной [Orenstein, Winnie, Altman, 2002]. При этом патогенном варианте нарушаются посттрансляционные модификации CFTR, что приводит к нарушению фолдинга белка и его разрушению в эндоплазматическом ретикулуме. Также есть патогенные варианты, вызывающие проблемы с экспрессией белка, белковой регуляцией, белковой проводимостью, уменьшением количества функционального CFTR, но они менее распространены.

Всего выделяют 6 классов патогенных вариантов (рисунок 1), приводящих к нарушению работы белка CFTR. Патогенные варианты класса I обусловлены дефектом продукции белка, что приводит к полному отсутствию CFTR. При патогенный вариантах класса II нарушается процессинг белков, что приводит к нарушению фолдинга, при этом дефектный белок элиминируется эндоплазматическим ретикулумом. Этот класс включает F508del, наиболее распространенный вариант, на долю которого приходится 51,55% всех пациентов с муковисцидозом в России (по данным регистра больных муковисцидозом в России за 2021 год). Патогенные варианты класса III приводят к нарушениям регуляции белка, его активность снижается. G551D является наиболее распространенным патогенным вариантом класса III. Патогенные варианты класса IV приводят к нарушению проводимости белка, меняется частота ионного потока. Наиболее распространенным вариантом данного класса является R117H. Патогенные варианты класса V приводят к уменьшению количества функционального белка CFTR. Патогенные варианты класса VI вызывают усиленный обмен белков [Abeliovich и др., 1992; Antunovic, Lukac, Vujovic, 2013; Lukacs, Durie, 2003]. Наиболее тяжело заболевание протекает у пациентов с патогенными вариантами классов I—III.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Володина Ольга Владимировна, 2025 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Амелина Е. Л., Черняк А. В., Черняев А. Л. Муковисцидоз: определение продолжительности жизни // Пульмонология. 2001. Т. 0. № 3. С. 61-64.

2. Закиян С. М. и др. Редактирование генов и геномов. Новосибирск: , 2018. Вып. Издательство СО РАН. 369 с.

3. Abeliovich D. и др. Screening for five mutations detects 97% of cystic fibrosis (CF) chromosomes and predicts a carrier frequency of 1:29 in the Jewish Ashkenazi population // Am J Hum Genet. 1992. Т. 51. № 5. С. 951-956.

4. Ahi Y. S., Bangari D. S., Mittal S. K. Adenoviral vector immunity: its implications and circumvention strategies // Curr Gene Ther. 2011. Т. 11. № 4. С. 307-320.

5. Antunovic S. S., Lukac M., Vujovic D. Longitudinal cystic fibrosis care // Clin Pharmacol Ther. 2013. Т. 93. № 1. С. 86-97.

6. Anzalone A. V. и др. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA // Nature. 2019. Т. 576. № 7785. С. 149-157.

7. Aranko A. S., Wlodawer A., Iwai H. Nature's recipe for splitting inteins // Protein Eng Des Sel. 2014. Т. 27. № 8. С. 263-271.

8. Averina O. A. и др. Comparative Analysis of Genome Editors Efficiency on a Model of Mice Zygotes Microinjection // Int J Mol Sci. 2021. Т. 22. № 19. С. 10221.

9. Bae S., Park J., Kim J.-S. Cas-OFFinder: a fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases // Bioinformatics. 2014. Т. 30. № 10. С. 1473-1475.

10. Bassai L., Shigunov P., Soares L. CORRECTION OF THE MUTATION CAUSE OF CYSTIC FIBROSIS (F508DEL) IN PULMONARY EPITHELIUS LINE CELLS BY CRISPR/CAS9 // Cytotherapy. 2021. Т. 23. № 4, Supplement. С. 8.

11. Becker J. R. и др. Flap endonuclease overexpression drives genome instability and DNA damage hypersensitivity in a PCNA-dependent manner // Nucleic Acids Res. 2018. Т. 46. № 11. С. 5634-5650.

12. Becker S., Boch J. TALE and TALEN genome editing technologies // Gene and Genome Editing. 2021. Т. 2. С. 100007.

13. Berfelde J. h gp. FEN1 Inhibition as a Potential Novel Targeted Therapy against Breast Cancer and the Prognostic Relevance of FEN1 // Int J Mol Sci. 2024. T. 25. № 4. C. 2110.

14. Boel A. h gp. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments // Dis Model Mech. 2018. T. 11. № 10. C. dmm035352.

15. Boucher R. C. Cystic fibrosis: a disease of vulnerability to airway surface dehydration // Trends Mol Med. 2007. T. 13. № 6. C. 231-240.

16. Bulcaen M. h gp. Prime editing functionally corrects cystic fibrosis-causing CFTR mutations in human organoids and airway epithelial cells // Cell Rep Med. 2024. T. 5. № 5. C. 101544.

17. Chemello F. h gp. Precise correction of Duchenne muscular dystrophy exon deletion mutations by base and prime editing // Sci Adv. 2021. T. 7. № 18. C. eabg4910.

18. Chen P. J. h gp. Enhanced prime editing systems by manipulating cellular determinants of editing outcomes // Cell. 2021. T. 184. № 22. C. 5635- 5652.e29.

19. Chen P. J., Liu D. R. Prime editing for precise and highly versatile genome manipulation // Nat Rev Genet. 2023. T. 24. № 3. C. 161-177.

20. Chen Y. h gp. Development of Highly Efficient Dual-AAV Split Adenosine Base Editor for In Vivo Gene Therapy // Small Methods. 2020. T. 4. № 9. C. 2000309.

21. Clement K. h gp. CRISPResso2 provides accurate and rapid genome editing sequence analysis // Nat Biotechnol. 2019. T. 37. № 3. C. 224-226.

22. Condren M. E., Bradshaw M. D. Ivacaftor: A Novel Gene-Based Therapeutic Approach for Cystic Fibrosis // J Pediatr Pharmacol Ther. 2013. T. 18. № 1. C. 8-13.

23. Dai Y. h gp. Cellular and humoral immune responses to adenoviral vectors containing factor IX gene: tolerization of factor IX and vector antigens allows for long-term expression. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1995. T. 92. № 5. C. 1401-1405.

24. Dai Y. h gp. EXO1 overexpression is associated with poor prognosis of hepatocellular carcinoma patients // Cell Cycle. 2018. T. 17. № 19-20. C. 2386-2397.

25. Dalby B. h gp. Advanced transfection with Lipofectamine 2000 reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications // Methods. 2004. T. 33. № 2. C. 95103.

26. Daya S., Berns K. I. Gene Therapy Using Adeno-Associated Virus Vectors // Clin Microbiol Rev. 2008. T. 21. № 4. C. 583-593.

27. Demchenko A. h gp. Airway basal cells from human-induced pluripotent stem cells: a new frontier in cystic fibrosis research // Front Cell Dev Biol. 2024. T. 12. C. 1336392.

28. Dickinson K. M., Collaco J. M. Cystic Fibrosis // Pediatr Rev. 2021. T. 42. № 2. C. 55-67.

29. Doman J. L. h gp. Phage-assisted evolution and protein engineering yield compact, efficient prime editors // Cell. 2023. T. 186. № 18. C. 3983- 4002.e26.

30. Elborn J. S. h gp. Efficacy and safety of lumacaftor/ivacaftor combination therapy in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR by pulmonary function subgroup: a pooled analysis // Lancet Respir Med. 2016. T. 4. № 8. C. 617-626.

31. Felgner P. L. h gp. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1987. T. 84. № 21. C. 7413-7417.

32. Fu Y.-W. h gp. Dynamics and competition of CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins and AAV donor-mediated NHEJ, MMEJ and HDR editing // Nucleic Acids Res. 2021. T. 49. № 2. C. 969-985.

33. Ghosh S. h gp. Viral Vector Systems for Gene Therapy: A Comprehensive Literature Review of Progress and Biosafety Challenges // Appl Biosaf. 2020. T. 25. № 1. C. 7-18.

34. Gillmore J. D. h gp. CRISPR-Cas9 In Vivo Gene Editing for Transthyretin Amyloidosis // N Engl J Med. 2021. T. 385. № 6. C. 493-502.

35. Graham C., Hart S. CRISPR/Cas9 gene editing therapies for cystic fibrosis // Expert Opin Biol Ther. 2021. T. 21. № 6. C. 767-780.

36. Griese M. h gp. Inhibition of airway proteases in cystic fibrosis lung disease // Eur Respir J. 2008. T. 32. № 3. C. 783-795.

37. Gupta A. h gp. Next generation triplex-forming PNAs for site-specific genome editing of the F508del CFTR mutation // J Cyst Fibros. 2025. T. 24. № 1. C. 142-148.

38. Hamosh A. h gp. Comparison of the clinical manifestations of cystic fibrosis in black and white patients // J Pediatr. 1998. T. 132. № 2. C. 255-259.

39. Houwen R. H. h gp. Defining DIOS and constipation in cystic fibrosis with a multicentre study on the incidence, characteristics, and treatment of DIOS // J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2010. T. 50. № 1. C. 38-42.

40. Hu J. h gp. ^-Thalassemia gene editing therapy: Advancements and difficulties // Medicine (Baltimore). 2024. T. 103. № 18. C. e38036.

41. Huang C., Li Q., Li J. Site-specific genome editing in treatment of inherited diseases: possibility, progress, and perspectives // Medical Review. 2022. T. 2. № 5. C. 471-500.

42. Hwang G.-H. h gp. PE-Designer and PE-Analyzer: web-based design and analysis tools for CRISPR prime editing // Nucleic Acids Res. 2021. T. 49. № W1. C. W499-W504.

43. Javaid N., Choi S. CRISPR/Cas System and Factors Affecting Its Precision and Efficiency // Front Cell Dev Biol. 2021. T. 9. C. 761709.

44. Jiao Y. h gp. Random-PE: an efficient integration of random sequences into mammalian genome by prime editing // Mol Biomed. 2021. T. 2. № 1. C. 36.

45. Jinek M. h gp. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity // Science. 2012. T. 337. № 6096. C. 816-821.

46. Johnson L. G. h gp. Efficiency of gene transfer for restoration of normal airway epithelial function in cystic fibrosis // Nat Genet. 1992. T. 2. № 1. C. 21-25.

47. Kantor A., McClements M. E., MacLaren R. E. CRISPR-Cas9 DNA Base-Editing and Prime-Editing // Int J Mol Sci. 2020. T. 21. № 17. C. 6240.

48. Keijzers G., Bohr V. A., Rasmussen L. J. Human exonuclease 1 (EXO1) activity characterization and its function on flap structures // Biosci Rep. 2015. T. 35. № 3. C. e00206.

49. Keijzers G., Liu D., Rasmussen L. J. Exonuclease 1 and its versatile roles in DNA repair // Crit Rev Biochem Mol Biol. 2016. T. 51. № 6. C. 440-451.

50. Khoshoo V., Udall J. N. Meconium ileus equivalent in children and adults // Am J Gastroenterol. 1994. T. 89. № 2. C. 153-157.

51. Kim D. Y. h gp. Unbiased investigation of specificities of prime editing systems in human cells // Nucleic Acids Res. 2020. T. 48. № 18. C. 10576-10589.

52. Kiseleva A. h gp. Cystic Fibrosis Polymorphic Variants in a Russian Population // Pharmgenomics Pers Med. 2020. T. 13. C. 679-686.

53. Kondrateva E. h gp. Generation of induced pluripotent stem cell line (RCMGi001-A) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with p.F508del mutation // Stem Cell Res. 2020. T. 48. C. 101933.

54. Kondrateva E. h gp. Derivation of iPSC line (RCMGi002-A) from dermal fibroblasts of a cystic fibrosis female patient with homozygous F508del mutation // Stem Cell Res. 2021. T. 53. C. 102251.

55. Kumar P., Nagarajan A., Uchil P. D. Electroporation // Cold Spring Harb Protoc. 2019. T. 2019. № 7.

56. Kunkel T. A., Erie D. A. DNA mismatch repair // Annu Rev Biochem. 2005. T. 74. C.681-710.

57. Kweon J. h gp. Engineered prime editors with PAM flexibility // Mol Ther. 2021. T. 29. № 6. C. 2001-2007.

58. Limera C. h gp. New Biotechnological Tools for the Genetic Improvement of Major Woody Fruit Species // Front Plant Sci. 2017. T. 8. C. 1418.

59. Lino C. A. h gp. Delivering CRISPR: a review of the challenges and approaches // Drug Deliv. 2018. T. 25. № 1. C. 1234-1257.

60. Liu C. h gp. Delivery strategies of the CRISPR-Cas9 gene-editing system for therapeutic applications // J Control Release. 2017. T. 266. C. 17-26.

61. Loewen N., Poeschla E. M. Lentiviral vectors // Adv Biochem Eng Biotechnol. 2005. T. 99. C. 169-191.

62. Lopes-Pacheco M. CFTR Modulators: Shedding Light on Precision Medicine for Cystic Fibrosis // Front Pharmacol. 2016. T. 7. C. 275.

63. Lukacs G. L., Durie P. R. Pharmacologic approaches to correcting the basic defect in cystic fibrosis // N Engl J Med. 2003. T. 349. № 15. C. 1401-1404.

64. McKone E. F. h gp. Survival estimates in European cystic fibrosis patients and the impact of socioeconomic factors: a retrospective registry cohort study // Eur Respir J. 2021. T. 58. № 3. C. 2002288.

65. Michnick S. W. h gp. Universal strategies in research and drug discovery based on protein-fragment complementation assays // Nat Rev Drug Discov. 2007. T. 6. № 7. C. 569-582.

66. Naldini L. h gp. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector // Science. 1996. T. 272. № 5259. C. 263-267.

67. Naldini L. Gene therapy returns to centre stage // Nature. 2015. T. 526. № 7573. C. 351-360.

68. Nelson J. W. h gp. Engineered pegRNAs improve prime editing efficiency // Nat Biotechnol. 2022. T. 40. № 3. C. 402-410.

69. Nowakowski A. h gp. Genetic engineering of stem cells for enhanced therapy // Acta Neurobiol Exp (Wars). 2013. T. 73. № 1. C. 1-18.

70. Orenstein D. M., Winnie G. B., Altman H. Cystic fibrosis: a 2002 update // J Pediatr. 2002. T. 140. № 2. C. 156-164.

71. Panchuk I. h gp. Generation of two induced pluripotent stem cell lines (RCMGi005-A/B) from human skin fibroblasts of a cystic fibrosis patient with homozygous F508del mutation in CFTR gene // Stem Cell Res. 2022. T. 64. C. 102896.

72. Park S. Y. h gp. Recombinant Adeno-Associated Virus Vector Mediated Gene Editing in Proliferating and Polarized Cultures of Human Airway Epithelial Cells // Hum Gene Ther. 2025. T. 36. № 15-16. C. 1067-1082.

73. Park S.-J. h gp. Targeted mutagenesis in mouse cells and embryos using an enhanced prime editor // Genome Biol. 2021. T. 22. C. 170.

74. Pitsikas P., Lee D., Rainbow A. J. Reduced host cell reactivation of oxidative DNA damage in human cells deficient in the mismatch repair gene hMSH2 // Mutagenesis. 2007. T. 22. № 3. C. 235-243.

75. Ponnienselvan K. h gp. Reducing the inherent auto-inhibitory interaction within the pegRNA enhances prime editing efficiency // Nucleic Acids Res. 2023. T. 51. № 13. C. 6966-6980.

76. Rafeeq M. M., Murad H. A. S. Cystic fibrosis: current therapeutic targets and future approaches // J Transl Med. 2017. T. 15. C. 84.

77. Rainov N. G., Ren H. Clinical trials with retrovirus mediated gene therapy--what have we learned? // J Neurooncol. 2003. T. 65. № 3. C. 227-236.

78. Rak M., Gora-Sochacka A., Madeja Z. Lipofection-Based Delivery of DNA Vaccines // Methods Mol Biol. 2021. T. 2183. C. 391-404.

79. Reis F. J., Damaceno N. [Cystic fibrosis] // J Pediatr (Rio J). 1998. T. 74 Suppl 1. C. S76-94.

80. Research C. for B. E. and. What is Gene Therapy? // FDA. 2020.

81. Ribeiro S. h gp. Plasmid DNA size does affect nonviral gene delivery efficiency in stem cells // Cell Reprogram. 2012. T. 14. № 2. C. 130-137.

82. Riordan J. R. h gp. Identification of the cystic fibrosis gene: cloning and characterization of complementary DNA // Science. 1989. T. 245. № 4922. C. 10661073.

83. Ronzitti G., Gross D.-A., Mingozzi F. Human Immune Responses to Adeno-Associated Virus (AAV) Vectors // Front Immunol. 2020. T. 11. C. 670.

84. Sadelain M., Papapetrou E. P., Bushman F. D. Safe harbours for the integration of new DNA in the human genome // Nat Rev Cancer. 2011. T. 12. № 1. C. 51-58.

85. Salk J. J., Schmitt M. W., Loeb L. A. Enhancing the accuracy of next-generation sequencing for detecting rare and subclonal mutations // Nat Rev Genet. 2018. T. 19. № 5. C. 269-285.

86. Schene I. F. h gp. Prime editing for functional repair in patient-derived disease models // Nat Commun. 2020. T. 11. № 1. C. 5352.

87. Scotet V., L'Hostis C., Ferec C. The Changing Epidemiology of Cystic Fibrosis: Incidence, Survival and Impact of the CFTR Gene Discovery // Genes (Basel). 2020. T. 11. № 6. C. 589.

88. Seol J.-H., Shim E. Y., Lee S. E. Microhomology-mediated end joining: Good, bad and ugly // Mutat Res. 2018. T. 809. C. 81-87.

89. Sertic S. h gp. Human exonuclease 1 connects nucleotide excision repair (NER) processing with checkpoint activation in response to UV irradiation // Proc Natl Acad Sci U S A. 2011. T. 108. № 33. C. 13647-13652.

90. Shah V. S. h gp. Airway acidification initiates host defense abnormalities in cystic fibrosis mice // Science. 2016. T. 351. № 6272. C. 503-507.

91. Sheppard D. N., Welsh M. J. Structure and function of the CFTR chloride channel // Physiol Rev. 1999. T. 79. № 1 Suppl. C. S23-45.

92. Shirley J. L. h gp. Immune Responses to Viral Gene Therapy Vectors // Mol Ther. 2020. T. 28. № 3. C. 709-722.

93. Smirnikhina S. A. h gp. P.F508del editing in cells from cystic fibrosis patients // PLoS One. 2020. T. 15. № 11. C. e0242094.

94. Song M. h gp. Generation of a more efficient prime editor 2 by addition of the Rad51 DNA-binding domain // Nat Commun. 2021. T. 12. № 1. C. 5617.

95. Sousa A. A. h gp. Systematic optimization of prime editing for the efficient functional correction of CFTR F508del in human airway epithelial cells // Nat Biomed Eng. 2025. T. 9. № 1. C. 7-21.

96. Sugita M. h gp. Allogeneic TCRaP deficient CAR T-cells targeting CD 123 in acute myeloid leukemia // Nat Commun. 2022. T. 13. C. 2227.

97. Tebas P. h gp. CCR5-edited CD4+ T cells augment HIV-specific immunity to enable post-rebound control of HIV replication // J Clin Invest. T. 131. № 7. C. e144486.

98. Torchilin V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers // Nat Rev Drug Discov. 2005. T. 4. № 2. C. 145-160.

99. Van Goor F. h gp. Correction of the F508del-CFTR protein processing defect in vitro by the investigational drug VX-809 // Proc Natl Acad Sci U S A. 2011. T. 108. № 46. C. 18843-18848.

100. Veit G. h gp. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination // JCI Insight. 2020. T. 5. № 18. C.e139983, 139983.

101. Velimirovic M. h gp. Peptide fusion improves prime editing efficiency // Nat Commun. 2022. T. 13. C. 3512.

102. Villegas Kcam M. C., Tsong A. J., Chappell J. Rational engineering of a modular bacterial CRISPR-Cas activation platform with expanded target range // Nucleic Acids Res. 2021. T. 49. № 8. C. 4793-4802.

103. Volodina O. h gp. Prime Editing Modification with FEN1 Improves F508del Variant Editing in the CFTR Gene in Airway Basal Cells // International Journal of Molecular Sciences. 2025. T. 26. C. 7943.

104. Volodina O. V. h gp. Evolution of Prime Editing Systems: Move Forward to the Treatment of Hereditary Diseases // Curr Gene Ther. 2024. T. 25. № 1. C. 46-61.

105. Voytas D. F., Gao C. Precision genome engineering and agriculture: opportunities and regulatory challenges // PLoS Biol. 2014. T. 12. № 6. C. e1001877.

106. Wang D. h gp. Prime Editing in Mammals: The Next Generation of Precision Genome Editing // CRISPR J. 2022. T. 5. № 6. C. 746-768.

107. Wang M. h gp. Efficient delivery of genome-editing proteins using bioreducible lipid nanoparticles // Proc Natl Acad Sci U S A. 2016. T. 113. № 11. C. 2868-2873.

108. Westberg I. h gp. Cytosine base editors optimized for genome editing in potato protoplasts // Front Genome Ed. 2023. T. 5. C. 1247702.

109. Wu M. h gp. Inhibition of the FEN1-PBX1 axis elicits cellular senescence in breast cancer via the increased intracellular reactive oxygen species levels // J Transl Med. 2025. T. 23. C. 248.

110. Xiao-Jie L. h gp. CRISPR-Cas9: a new and promising player in gene therapy // J Med Genet. 2015. T. 52. № 5. C. 289-296.

111. Xie W. h gp. Androgen receptor knockdown enhances prostate cancer chemosensitivity by down-regulating FEN1 through the ERK/ELK1 signalling pathway // Cancer Med. 2023. T. 12. № 14. C. 15317-15336.

112. Xu Z. h gp. Explore the dominant factor in prime editing via a view of DNA processing // Synth Syst Biotechnol. 2023. T. 8. № 3. C. 371-377.

113. Yanik M. h gp. Development of a Reporter System to Explore MMEJ in the Context of Replacing Large Genomic Fragments // Mol Ther Nucleic Acids. 2018. T. 11. C. 407415.

114. Yeadon J. PROS AND CONS OF ZNFS, TALENS, AND CRISPR/CAS [Электронный ресурс]. URL: https://wwwjax.org/news-and-insights/jax-blog/2014/march/pros-and-cons-of-znfs-talens-and-crispr-cas.

115. Yin H. и др. Therapeutic genome editing by combined viral and non-viral delivery of CRISPR system components in vivo // Nat Biotechnol. 2016. Т. 34. № 3. С. 328-333.

116. Yu G. и др. Prediction of efficiencies for diverse prime editing systems in multiple cell types // Cell. 2023. Т. 186. № 10. С. 2256- 2272.e23.

117. Zhao Z. и др. Prime editing: advances and therapeutic applications // Trends Biotechnol. 2023. Т. 41. № 8. С. 1000-1012.

118. Zhi S. и др. Dual-AAV delivering split prime editor system for in vivo genome editing // Mol Ther. 2022. Т. 30. № 1. С. 283-294.

119. Show Your Molecular TALEN(T) [Электронный ресурс]. URL: https://bitesizebio.com/43965/show-your-molecular-talent/ (дата обращения: 06.02.2025).

120. Муковисцидоз не выходит на торги [Электронный ресурс]. URL: https://www.kommersant.ru/doc/7329420 (дата обращения: 04.08.2025).

121. FEN1 flap structure-specific endonuclease 1 [Homo sapiens (human)] - Gene -NCBI [Электронный ресурс]. URL: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2237 (дата обращения: 03.07.2025).

122. Editas Medicine Announces Clinical Data Demonstrating Proof of Concept of EDIT-101 from Phase 1/2 BRILLIANCE Trial | Editas Medicine [Электронный ресурс]. URL: https://ir.editasmedicine.com/news-releases/news-release-details/editas-medicine-announces-clinical-data-demonstrating-proof (дата обращения: 25.08.2023).

123. Important Safety Information | TRIKAFTA® (elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor and ivacaftor) [Электронный ресурс]. URL: https://www.trikafta.com/important-safety-information (дата обращения: 04.08.2025).

123

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение А Последовательности нуклеаз ЕХ01, НЕХ-Ш и FEN1

Нуклеаза Последовательность

ЕХ01а GGGATACAGGGATTGCTACAATTTATCAAAGAAGCTT

CAGAACCCATCCATGTGAGGAAGTATAAAGGGCAGGT

AGTAGCTGTGGATACATATTGCTGGCTTCACAAAGGA

GCTATTGCTTGTGCTGAAAAACTAGCCAAAGGTGAAC

CTACTGATAGGTATGTAGGATTTTGTATGAAATTTGTA

AATATGTTACTATCTCACGGGATCAAGCCTATTCTCGT

ATTTGATGGATGTACTTTACCTTCTAAAAAGGAAGTAG

AGAGATCTAGAAGAGAAAGACGACAAGCCAATCTTCT

TAAGGGAAAGCAACTTCTTCGTGAGGGGAAAGTCTCG

GAAGCTCGAGAGTGTTTCACCCGGTCTATCAATATCAC

ACATGCCATGGCCCACAAAGTAATTAAAGCTGCCCGG

TCTCAGGGGGTAGATTGCCTCGTGGCTCCCTATGAAGC

TGATGCGCAGTTGGCCTATCTTAACAAAGCGGGAATT

GTGCAAGCCATAATTACAGAGGACTCGGATCTCCTAG

CTTTTGGCTGTAAAAAGGTAATTTTAAAGATGGACCA

GTTTGGAAATGGACTTGAAATTGATCAAGCTCGGCTA

GGAATGTGCAGACAGCTTGGGGATGTATTCACGGAAG

AGAAGTTTCGTTACATGTGTATTCTTTCAGGTTGTGAC

TACCTGTCATCACTGCGTGGGATTGGATTAGCAAAGG

CATGCAAAGTCCTAAGACTAGCCAATAATCCAGATAT

AGTAAAGGTTATCAAGAAAATTGGACATTATCTCAAG

ATGAATATCACGGTACCAGAGGATTACATCAACGGGT

TTATTCGGGCCAACAATACCTTCCTCTATCAGCTAGTT

TTTGATCCCATCAAAAGGAAACTTATTCCTCTGAACGC

CTATGAAGATGATGTTGATCCTGAAACACTAAGCTAC

124

Нуклеаза Последовательность

GCTGGGCAATATGTTGATGATTCCATAGCTCTTCAAAT

AGCACTTGGAAATAAAGATATAAATACTTTTGAACAG

ATCGATGACTACAATCCAGACACTGCTATGCCTGCCC

ATTCAAGAAGTCGTAGTTGGGATGACAAAACATGTCA

AAAGTCAGCTAATGTTAGCAGCATTTGGCATAGGAAT

TACTCTCCCAGACCAGAGTCGGGTACTGTTTCAGATGC

CCCACAATTGAAGGAAAATCCAAGTACTGTGGGAGTG

GAACGAGTGATTAGTACTAAAGGGTTAAATCTCCCAA

GGAAATCATCCATTGTGAAAAGACCAAGAAGTGCAGA

GCTGTCAGAAGATGACCTGTTGAGTCAGTATTCTCTTT

CATTTACGAAGAAGACCAAGAAAAATAGCTCTGAAGG

CAATAAATCATTGAGCTTTTCTGAAGTGTTTGTGCCTG

ACCTGGTAAATGGACCTACTAACAAAAAGAGTGTAAG

CACTCCACCTAGGACGAGAAATAAATTTGCAACATTT

TTACAAAGGAAAAATGAAGAAAGTGGTGCAGTTGTGG

TTCCAGGGACCAGAAGCAGGTTTTTTTGCAGTTCAGAT

TCTACTGACTGTGTATCAAACAAAGTGAGCATCCAGC

CTCTGGATGAAACTGCTGTCACAGATAAAGAGAACAA

TCTGCATGAATCAGAGTATGGAGACCAAGAAGGCAAG

AGACTGGTTGACACAGATGTAGCACGTAATTCAAGTG

ATGACATTCCGAATAATCATATTCCAGGTGATCATATT

CCAGACAAGGCAACAGTGTTTACAGATGAAGAGTCCT

ACTCTTTTAAGAGCAGCAAATTTACAAGGACCATTTCA

CCACCCACTTTGGGAACACTAAGAAGTTGTTTTAGTTG

GTCTGGAGGTCTTGGAGATTTTTCAAGAACGCCGAGC

CCCTCTCCAAGCACAGCATTGCAGCAGTTCCGAAGAA

AGAGCGATTCCCCCACCTCTTTGCCTGAGAATAATATG

TCTGATGTGTCGCAGTTAAAGAGCGAGGAGTCCAGTG

ACGATGAGTCTCATCCCTTACGAGAAGGGGCATGTTC

Нуклеаза Последовательность

TTCACAGTCCCAGGAAAGTGGAGAATTCTCACTGCAG AGTTCAAATGCATCAAAGCTTTCTCAGTGCTCTAGTAA GGACTCTGATTCAGAGGAATCTGATTGCAATATTAAG TTACTTGACAGTCAAAGTGACCAGACCTCCAAGCTAT GTTTATCTCATTTCTCAAAAAAAGACACACCTCTAAGG AACAAGGTTCCTGGGCTATATAAGTCCAGTTCTGCAG ACTCTCTTTCTACAACCAAGATCAAACCTCTAGGACCT GCCAGAGCCAGTGGGCTGAGCAAGAAGCCGGCAAGC ATCCAGAAGAGAAAGCATCATAATGCCGAGAACAAG CCGGGGTTACAGATCAAACTCAATGAGCTCTGGAAAA ACTTTGGATTTAAAAAATTC

HEX-N2 GGGATACAGGGATTGCTACAATTTATCAAAGAAGCTT CAGAACCCATCCATGTGAGGAAGTATAAAGGGCAGGT AGTAGCTGTGGATACATATTGCTGGCTTCACAAAGGA GCTATTGCTTGTGCTGAAAAACTAGCCAAAGGTGAAC CTACTGATAGGTATGTAGGATTTTGTATGAAATTTGTA AATATGTTACTATCTCACGGGATCAAGCCTATTCTCGT ATTTGATGGATGTACTTTACCTTCTAAAAAGGAAGTAG AGAGATCTAGAAGAGAAAGACGACAAGCCAATCTTCT TAAGGGAAAGCAACTTCTTCGTGAGGGGAAAGTCTCG GAAGCTCGAGAGTGTTTCACCCGGTCTATCAATATCAC ACATGCCATGGCCCACAAAGTAATTAAAGCTGCCCGG TCTCAGGGGGTAGATTGCCTCGTGGCTCCCTATGAAGC TGATGCGCAGTTGGCCTATCTTAACAAAGCGGGAATT GTGCAAGCCATAATTACAGAGGACTCGGATCTCCTAG CTTTTGGCTGTAAAAAGGTAATTTTAAAGATGGACCA GTTTGGAAATGGACTTGAAATTGATCAAGCTCGGCTA GGAATGTGCAGACAGCTTGGGGATGTATTCACGGAAG AGAAGTTTCGTTACATGTGTATTCTTTCAGGTTGTGAC

Нуклеаза Последовательность

TACCTGTCATCACTGCGTGGGATTGGATTAGCAAAGG CATGCAAAGTCCTAAGACTAGCCAATAATCCAGATAT AGTAAAGGTTATCAAGAAAATTGGACATTATCTCAAG ATGAATATCACGGTACCAGAGGATTACATCAACGGGT TTATTCGGGCCAACAATACCTTCCTCTATCAGCTAGTT TTTGATCCCATCAAAAGGAAACTTATTCCTCTGAACGC CTATGAAGATGATGTTGATCCTGAAACACTAAGCTAC GCTGGGCAATATGTTGATGATTCCATAGCTCTTCAAAT AGCACTTGGAAATAAAGATATAAATACTTTTGAACAG ATCGATGACTACAATCCAGACACTGCTATGCCTGCCC ATTCAAGAAGTCGTAGTTGGGATGACAAAACATGTCA AAAGTCAGCTAATGTTAGCAGCATTTGGCATAGGAAT TACTCTCCCAGACCAGAGTCGGGTACTGTTTCAGATGC CCCACAATTGAAGGAAAATCCAAGT

FEN1 GGAATTCAAGGCCTGGCCAAACTAATTGCTGATGTGG CCCCCAGTGCCATCCGGGAGAATGACATCAAGAGCTA CTTTGGCCGTAAGGTGGCCATTGATGCCTCTATGAGCA TTTATCAGTTCCTGATTGCTGTTCGCCAGGGTGGGGAT GTGCTGCAGAATGAGGAGGGTGAGACCACCAGCCACC TGATGGGCATGTTCTACCGCACCATTCGCATGATGGA GAACGGCATCAAGCCCGTGTATGTCTTTGATGGCAAG CCGCCACAGCTCAAGTCAGGCGAGCTGGCCAAACGCA GTGAGCGGCGGGCTGAGGCAGAGAAGCAGCTGCAGC AGGCTCAGGCTGCTGGGGCCGAGCAGGAGGTGGAAA AATTCACTAAGCGGCTGGTGAAGGTCACTAAGCAGCA CAATGATGAGTGCAAACATCTGCTGAGCCTCATGGGC ATCCCTTATCTTGATGCACCCAGTGAGGCAGAGGCCA GCTGTGCTGCCCTGGTGAAGGCTGGCAAAGTCTATGC TGCGGCTACCGAGGACATGGACTGCCTCACCTTCGGC

Нуклеаза Последовательность

AGCCCTGTGCTAATGCGACACCTGACTGCCAGTGAAG CCAAAAAGCTGCCAATCCAGGAATTCCACCTGAGCCG GATTCTGCAGGAGCTGGGCCTGAACCAGGAACAGTTT GTGGATCTGTGCATCCTGCTAGGCAGTGACTACTGTGA GAGTATCCGGGGTATTGGGCCCAAGCGGGCTGTGGAC CTCATCCAGAAGCACAAGAGCATCGAGGAGATCGTGC GGCGACTTGACCCCAACAAGTACCCTGTGCCAGAAAA TTGGCTCCACAAGGAGGCTCACCAGCTCTTCTTGGAAC CTGAGGTGCTGGACCCAGAGTCTGTGGAGCTGAAGTG GAGCGAGCCAAATGAAGAAGAGCTGATCAAGTTCATG TGTGGTGAAAAGCAGTTCTCTGAGGAGCGAATCCGCA GTGGGGTCAAGAGGCTGAGTAAGAGCCGCCAAGGCA GCACCCAGGGCCGCCTGGATGATTTCTTCAAGGTGAC CGGCTCACTCTCTTCAGCTAAGCGCAAGGAGCCAGAA CCCAAGGGATCCACTAAGAAGAAGGCAAAGACTGGG GCAGCAGGGAAGTTTAAAAGGGGAAAA

Приложение Б Праймеры для амплификации перекрывающихся участков для клонирования плазмидных конструкций методом Гибсона

Название Направление Последовательность, 5'>3'

4-FEN insert Прямой TTGAATTCCAGAACCACCAGAAG GGGAGGAGTTTTCAATCA

Обратный TTTTGAGCCGCCAGATTTTCCCCT TTTAAACTTCCCTGC

4-FEN backbone 1 Прямой GCAGGGAAGTTTAAAAGGGGAA AATCTGGCGGCTCAAAAAGAAC

Обратный TTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCC GACGCCATCCTGCTGAG

Название Направление Последовательность, 5'>3'

4-FEN backbone 2 Прямой CTCAGCAGGATGGCGTCGGACAG GTTCTTGGCGGCCAGAA

Обратный TTGAATTCCAGAACCACCAGAAG GGGAGGAGTTTTCAATCA

FEN-4 insert Прямой GTCACCAAAGAAGAAGCGGAAA GTCGGAATTCAAGGCCTGGCC

Обратный CCAGGCCGATGCTGTACTTCTTG TCAGAACCACCAGATTTTCCCCT TTTAAACTTCCCTGC

FEN-4 backbone 1 Прямой GAAACCTGGGATATAGGGCATC

Обратный GACTTTCCGCTTCTTCTTTGG

FEN-4 backbone 2 Прямой GACAAGAAGTACAGCATCGGC

Обратный TGCTTCTGACAGATCTGGGC

16-FEN insert Прямой TCAGGATCAGAAACTCCAGGTAC TTCTGAATCTGCTACTCCTGAATC TGGAATTCAAGGCCTGGCCAAA

Обратный TTTTGAGCCGCCAGATTTTCCCCT TTTAAACTTCCCTGC

16-FEN backbone 1 Прямой GCAGGGAAGTTTAAAAGGGGAA AATCTGGCGGCTCAAAAAGAAC

Обратный TTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCC GACGCCATCCTGCTGAG

16-FEN backbone 2 Прямой CTCAGCAGGATGGCGTCGGACAG GTTCTTGGCGGCCAGAA

Обратный ACCTGGAGTTTCTGATCCTGAAG GGGAGGAGTTTTCAAT

FEN-16 insert Прямой GTCACCAAAGAAGAAGCGGAAA GTCGGAATTCAAGGCCTGGCC

Название Направление Последовательность, 5'>3'

Обратный CAGATTCAGAAGTACCTGGAGTT TCTGATCCTGATTTTCCCCTTTTA AACTTCCCTGCT

FEN-16 backbone 1 Прямой GAAACCTGGGATATAGGGCATC

Обратный GACTTTCCGCTTCTTCTTTGG

FEN-16 backbone 2 Прямой GGTACTTCTGAATCTGCTACTCCT GAATCTGACAAGAAGTACAGCAT CGGC

Обратный TGCTTCTGACAGATCTGGGC

4-EXO insert Прямой ACTCCTCCCCTTCTGGTGGTTCTG GGATACAGGGATTGCTACA

Обратный GGTTCTTTTTGAGCCGCCAGAGA ATTTTTTAAATCCAAA

4-EXO backbone 1 Прямой TTTGGATTTAAAAAATTCTCTGG CGGCTCAAAAAGAACC

Обратный TTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCC GACGCCATCCTGCTGAG

4-EXO backbone 2 Прямой CTCAGCAGGATGGCGTCGGACAG GTTCTTGGCGGCCAGAA

Обратный TGTAGCAATCCCTGTATCCCAGA ACCACCAGAAGGGGAGGAGT

EXO-4 insert Прямой GTCACCAAAGAAGAAGCGGAAA GTCGGGATACAGGGATTGCTACA AT

Обратный AGGCCGATGCTGTACTTCTTGTC AGAACCACCAGAGAATTTTTTAA ATCC

EXO-4 backbone 1 Прямой GAAACCTGGGATATAGGGCATC

Название Направление Последовательность, 5'>3'

Обратный GACTTTCCGCTTCTTCTTTGG

EXO-4 backbone 2 Прямой TGCTTCTGACAGATCTGGGC

Обратный TGCTTCTGACAGATCTGGGC

16-EXO insert Прямой 1 ATTGAAAACTCCTCCCCTTCAGG ATCAGAAACTCCAGGTACTTCTG AATCTGCTAC

Прямой 2 CAGGTACTTCTGAATCTGCTACT CCTGAATCTGGGATACAGGGATT GCTACAAT

Обратный GGTTCTTTTTGAGCCGCCAGAGA ATTTTTTAAATCCAAA

16-EXO backbone 1 Прямой TTTGGATTTAAAAAATTCTCTGG CGGCTCAAAAAGAACC

Обратный TTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCC GACGCCATCCTGCTGAG

16-EXO backbone 2 Прямой CTCAGCAGGATGGCGTCGGACAG GTTCTTGGCGGCCAGAA

Обратный ACCTGGAGTTTCTGATCCTGAAG GGGAGGAGTTTTCAAT

EXO-16 insert Прямой GTCACCAAAGAAGAAGCGGAAA GTCGGGATACAGGGATTGCTACA AT

Обратный GGTACTTCTGAATCTGCTACTCCT GAATCTGACAAGAAGTACAGCAT CGGC

EXO-16 backbone 1 Прямой GAAACCTGGGATATAGGGCATC

Обратный GACTTTCCGCTTCTTCTTTGG

EXO-16 backbone 2 Прямой GACAAGAAGTACAGCATCGGC

Название Направление Последовательность, 5'>3'

Обратный TGCTTCTGACAGATCTGGGC

4-HEX insert Прямой ACTCCTCCCCTTCTGGTGGTTCTG GGATACAGGGATTGCTACA

Обратный ACTTGGATTTTCCTTCAATTGTGG

4-HEX backbone 1 Прямой ATTGAAGGAAAATCCAAGTTCTG GCGGCTCAAAAAGAACCGCCGA

Обратный TTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCC GACGCCATCCTGCTGAG

4-HEX backbone 2 Прямой CTCAGCAGGATGGCGTCGGACAG GTTCTTGGCGGCCAGAA

Обратный TGTAGCAATCCCTGTATCCCAGA ACCACCAGAAGGGGAGGAGT

HEX-4 insert Прямой GTCACCAAAGAAGAAGCGGAAA GTCGGGATACAGGGATTGCTACA AT

Обратный GCTGTACTTCTTGTCACTACCGCC GGAACTTGGATTTTCCTTCAAT

HEX-4 backbone 1 Прямой GAAACCTGGGATATAGGGCATC

Обратный GACTTTCCGCTTCTTCTTTGG

HEX-4 backbone 2 Прямой GACAAGAAGTACAGCATCGGC

Обратный TGCTTCTGACAGATCTGGGC

16-HEX insert Прямой 1 ATTGAAAACTCCTCCCCTTCAGG ATCAGAAACTCCAGGTACTTCTG AATCTGCTAC

Прямой 2 CAGGTACTTCTGAATCTGCTACT CCTGAATCTGGGATACAGGGATT GCTACAAT

Обратный ACTTGGATTTTCCTTCAATTGTGG

Название Направление Последовательность, 5'>3'

16-HEX backbone 1 Прямой ATTGAAGGAAAATCCAAGTTCTG GCGGCTCAAAAAGAACCGCCGA

Обратный TTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCC GACGCCATCCTGCTGAG

16-HEX backbone 2 Прямой CTCAGCAGGATGGCGTCGGACAG GTTCTTGGCGGCCAGAA

Обратный ACCTGGAGTTTCTGATCCTGAAG GGGAGGAGTTTTCAAT

HEX-16 insert Прямой GTCACCAAAGAAGAAGCGGAAA GTCGGGATACAGGGATTGCTACA AT

Обратный AGATTCAGGAGTAGCAGATTCAG AAGTACCTGGAGTTTCTGATCCT GAACTTGGATTTTCCTTCAATTGT GG

HEX-16 backbone 1 Прямой GAAACCTGGGATATAGGGCATC

Обратный GACTTTCCGCTTCTTCTTTGG

HEX-16 backbone 2 Прямой GGTACTTCTGAATCTGCTACTCCT GAATCTGACAAGAAGTACAGCAT CGGC

Обратный TGCTTCTGACAGATCTGGGC

Приложение В Праймеры для проверки колоний после клонирования методом Гибсона. Х - 4-аминокислотный или 16-аминокислотный линкер

Название Направление Последовательность, 5'>3'

X-FEN texting Прямой ACACTCCGCCGAGGCAAG

Обратный GCCGTTCTCCATCATGCGAAT

FEN-X testing Прямой AGGCGTGTACGGTGGGAG

Обратный GCCGTTCTCCATCATGCGAAT

X-EXO testing Прямой ACACTCCGCCGAGGCAAG

Обратный ATAGGCTTGATCCCGTGAGA

EXO-X testing Прямой AGGCGTGTACGGTGGGAG

Обратный ATAGGCTTGATCCCGTGAGA

X-HEX testing Прямой ACACTCCGCCGAGGCAAG

Обратный ATAGGCTTGATCCCGTGAGA

HEX-X testing Прямой AGGCGTGTACGGTGGGAG

Обратный ATAGGCTTGATCCCGTGAGA

Backbone testing 1 Прямой GAGTGGAGGGACCCTGAGAT

Обратный TGGGATGAACAGCCTGCAAA

Backbone testing 2 Прямой CCGAGGATGCCAAACTGCAGCT

Обратный GCCGTTGTCGAAGGTCCG

Приложение Г Праймеры для оценки нецелевых эффектов

Ген Прямой праймер, 5'>3' Обратный праймер, 5'>3'

IL1RAP CTCGCAATGAGGTTTGG TGG TCATTGACTAGAACACACATCA GAG

TOX2 AGTCCTATCCTCAATGC GTGT TGAGTACTTTTCTTCCTACAGG TCA

GYPE GAAAGAGGCCAAAATC ATGTTTATTTAAT CAACTCTTACTGGCTTAGATGT CA

WNK2 CGCTAGAAACAAATGA AACAGAAG GGGCTGCACACATACTAACTG

ARID4A TTTAAATGGCCTTCCCT AAGACT TCAACTGTGATAACTATAGAAG TCCCT

Ген Прямой праймер, 5'>3' Обратный праймер, 5'>3'

BTLA ATATCCCTTGTTAAGTC ACTATAGGT ATGTATAGAGAAAGGGGTTGC TCAAATG

CDK6 AAGGCCAATCATACCA TCCCTC CCCCAGAACTCATCTGGCATA

ALK TTTGCCACAAAGCAGA GGTCA TCCAAGCAATCAAACCAGCC

DCC CTATCCTCATCAGCACG CTTCA TACCTTCCATGGCTGCTCAAT

TOX2 TTTGCGTAAGCTCACAC CCT AGGAACCCACAGAGAGCTGA

EPHA3 TCTAACTGAAGTGTCTG GCTTG GCCACAGAATATTCATAGCATC ATC

L1LRB1 GAATAACAAGTTATTCC AAATGAAG AAATGCATGCCTGCTCTTTCT

Приложение Д Алгоритм на языке программирования Python

Import pandas as pd

import numpy as np

import multiprocessing as mp

import subprocess

import os

from os import listdir import zipfile import re, shutil

first file list = [name for name in os.listdir() if name.endswith('.gz')] for i in first file list:

result = re.search(r'(\d{2,3}).*?(R\d)', i) if result:

num, r = result.groups()

os.rename(i, f'LRG-{num} {r}.fastq.gz') with open ("table exp PE.txt") as rfile: content = rfile.readlines()

dict_exp = {i.split("\t")[0]:i.split("\t")[1].stripO for i in content} pegRNA_dict= {1:"ACCATTAAAGAAAATATCAT", 2:"ACCATTAAAGAAAATATCAT", 3:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

4:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

5:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

6:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

7:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

8:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

9:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

10:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

11:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

12:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

13:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

14:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

15:"ACCATTAAAGAAAATATCAT",

16:"ATTATGCCTGGCACCATTAA",

17:"CCATTAAAGAAAATATCATT",

18:"CCATTAAAGAAAATATCATT",

19:"CCATTAAAGAAAATATCATT",

2 0:"TTCATCATAGGAAACACCAA",

21:"TTCATCATAGGAAACACCAA",

22:"TTCATCATAGGAAACACCAA",

23:"TTCATCATAGGAAACACCAA",

24:"TTCATCATAGGAAACACCAA"} #словарь с номерами pegRNA и их последовательностями

file list = [name for name in listdir() if name.endswith('.gz')] #список файлов из директории с разрешением fastq

keys crispr = ['-a',

"AAGCACAGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCATTAAAGAAAA

TATCATTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGA",

'--output folder',"./report", i _

e',"AAGCACAGTGGAAGAATTTCATTCTGTTCTCAGTTTTCCTGGATTATGCCTGGCACCATTAAAG AAAATATCATCTTTGGTGTTTCCTATGATGAATATAGATACAGA", '--default min aln score',"60", '-q',"0", '-s',"0",

'--plot window size',"20",

'--min_bp_quality_or_N',"0",

'—exclude_bp_from_left',"15",

'--exclude bp from right',"15",

'--conversion nuc from',"C",

'--conversion nuc to',"T", i__

prime editing pegRNA extension quantification window size',"5", '-w',"6",

'-wc',"-3",'--write cleaned report', '-place report in output folder'] #список с постоянн^1ми параметрами

list r = [] # список с переменными for i in file list:

common part = i.split(' ')[0] if common part not in list r:

list r.append(common part) #создание списка двух файлов для одного условия (т.к. на одно условие приходятся два файла R1 и R2)

df current = pd.DataFrame() for common part in list r:

filenames = ['-r1',f'{common part} R1.fastq.gz','-r2', f'lcommon part} R2.fastq.gz'] ^изменение названия файлов через f-строку, переменная - common part - общая для каждого условия

exp num = common part.split('-')[-1] #номер, которым будет называться

файл

peg num = int(dict exp[exp num]) #номер pegRNA для каждого условия сопоставить с номером pegRNA из словаря dict exp

pegRNA = pegRNA dict[peg num] #последовательность pegRNA, соответствующая номеру из словаря

name = common part.split('-')[-1]

command = 'CRISPResso' + ' ' + ' '.join(filenames) +' '+ ' '.join(keys crispr)+f' -n {name} -g {pegRNA}'

subprocess.run(command, shell=True)

#Разархивирование файла, учитывая номер образца:

with

zipfile.ZipFile(f'report/CRISPResso on {name}/Alleles frequency table.zip', 'r') as zip ref:

zip ref.extract('Alleles frequency table.txt', 'outcome')

os.rename('outcome/Alleles frequency table.txt', f'outcome/{name} Alleles frequency table.txt')

df alleles = pd.read csv(f'outcome/{name} Alleles frequency table.txt', sep='\t')

# Фильтрация строк: reference name = reference и read status = modified

filtered df = df alleles[(df alleles['Reference Name'] == 'Reference') & (df_alleles['Read_Status'] == 'MODIFIED')]

filtered_HDR_df = df_alleles[(df_alleles['Reference_Name'] == 'HDR')]

filtered HDR perfect df = df alleles[(df alleles['Reference Name'] == 'HDR') & (df_alleles['Read_Status'] == 'UNMODIFIED')]

filtered HDR imperfect df = df alleles[(df alleles['Reference Name'] == 'HDR') & (df_alleles['Read_Status'] == 'MODIFIED')]

# Расчет всех модификаций

all modifications count = sum(filtered df['#Reads'])

# Фильтрация строк с n deleted != 0

deleted_df = filtered_df[filtered_df['n_deleted'] != 0]

# Расчет строк с n deleted != 0 deleted count = sum(deleted df['#Reads'])

# Фильтрация строк с n deleted = 0 и n inserted != 0 inserted df = filtered df[(filtered df['n deleted'] == 0) &

(filtered_df['n_inserted'] != 0)]

inserted count = sum(inserted df['#Reads']) #Расчет всех прочтений с мутациями

mut_df = filtered_df[(filtered_df['n_deleted'] == 0) & (filtered df['n inserted'] == 0)]

mut count = sum(mut df['#Reads'])

#Расчет процента инсерций и делеций indelpercent =

((deleted count+inserted count)/(deleted count+inserted count+mut count))*100 nhej percent = (sum(filtered df['#Reads'])/sum(df alleles['#Reads']))*100 indel_percent_fin = ((deleted count+inserted count)/sum(df alleles['#Reads']))*100

#Расчет процента SNP

percent mut = nhej percent-indel percent fin

#Расчет процента коррекции мутации HDR percent =

(sum(filtered_HDR_df['#Reads'])/sum(df_alleles['#Reads']))*100 HDR_perfect =

(sum(filtered_HDR_perfect_df['#Reads'])/sum(df_alleles['#Reads']))*100 HDR imperfect =

(sum(filtered_HDR_imperfect_df['#Reads'])/sum(df_alleles['#Reads']))*100 # Создание новой таблицы с результатами

dict final prep = {'No': [common part.split('-')[-1]], 'Percent of correction': [HDR percent], 'Perfect correction': [HDR perfect], 'Imperfect correction': [HDR imperfect], 'Percent of undesired changes': [nhej percent], 'Percent of insertions and deletions': [indel percent fin], 'Percent of mutations': [percent mut], 'Reads': [sum(df_alleles['#Reads'])]} df temp = pd.DataFrame(dict final prep) df current = pd.concat([df current, df temp])

df current = df current.sort values(by = 'No', ascending = True #сортировка значений в таблице, чтобы они шли от меньшего к большему

columns to modify = [col for col in df current.columns if col not in ['No']]

df current[columns to modify] = df current[columns to modify].map(lambda x: f"{x:.2f}".replace('.', ',')) # изменение отображения цифр в таблице, чтобы вместо точки была запятая, а после запятой сохранялись только два знака

file path = os.path.join('outcome', 'table report.csv') try:

df table report = pd.read csv(file path)