Функциональный анализ некодирующих однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Устюгова Алина Сергеевна

• Устюгова Алина Сергеевна
• кандидат наук
• 2026

Оглавление диссертации кандидат наук Устюгова Алина Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования

Цели и задачи исследования

Научная новизна работы

Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Личный вклад автора

Апробация результатов и публикации

Структура и объем диссертации

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Механизмы формирования иммунологической толерантности

1.1.1. Центральная толерантность

1.1.1.1 Механизм формирования центральной толерантности Т-клетками

1.1.1.2 Механизм формирования центральной толерантности В-клетками

1.1.2. Периферическая толерантность

1.2. Генетические факторы развития аутоиммунных заболеваний

1.3. Локус ^12-21: важный регуляторный регион в развитии иммунопатологий

1.4. Методы валидации функциональных полиморфизмов в контексте нативного генома

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Биоинформатические методы

2.1.1. Выбор однонуклеотидных полиморфизмов

2.1.2. Определение связывания транскрипционных факторов на последовательности, окружающей исследуемые SNP

2.1.3. Оценка взаимодействий между генами и энхансерами

2.1.4. Выбор релевантных клеточных линий для геномного редактирования

2.1.5. Подбор sgRNA

2.2. Молекулярно-биологические методы

2.2.1. Получение репортерных конструкций

2.2.1.1. Амплификация последовательностей энхансеров

2.2.1.2. Получение альтернативных вариантов полиморфизмов

2.2.1.3. Рестрикция и последующее лигирование конструкций

2.2.2. Общая схема получение конструкций для геномного редактирования

2.2.3. Получение конструкций с последовательностями sgRNA

2.2.4. Получение конструкций с донорными последовательностями

2.2.5. Генотипирование клонов клеток

2.2.6. Анализ off-target сайтов sgRNA-1 и sgRNA-2

2.2.7. Выделение суммарной РНК из клеток

2.2.8. Синтез первой цепи кДНК

2.2.9. Количественная ПЦР в реальном времени

2.2.10. Бисульфитное секвенирование

2.3. Методы работы с прокариотическими клетками

2.3.1. Получение компетентных клеток

2.3.2. Трансформация компетентных клеток

2.3.3. Выделение и очистка плазмид

2.4. Методы работы с эукариотическими клетками

2.4.1. Культивирование клеток

2.4.2. Трансфекция клеток методом капиллярной электропорации

2.4.3. Люциферазный тест

2.4.4. Сортировка клеток и цитофлуориметрия

2.4.5. Получение клонов клеток

2.4.6. Получение клеточных лизатов и геномной ДНК из клеточных клонов

2.4.7. Активация клеток и иммунное окрашивание

2.5. Дизайн CRISPR/Cas для редактирования клеточных линий

2.5.1. Геномное редактирование методом, описанным Ikeda с соавторами

2.5.2. Геномное редактирование другими методами

2.5.2.1. Прямое редактирование в одну стадию с помощью Cas9n(D10A) и одноцепочечного ДНК-донора

2.5.2.2. Метод CORRECT

2.6. Статистическая обработка данных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Отбор некодирующих однонуклеотидных полиморфизмов для проверки их функциональности

3.1.1. Вне аутоиммунного локуса 17q12-21 были отобраны пять полиморфизмов для дальнейшего исследования

3.1.2. В локусе 17q12-21, ассоциированном с аутоиммунными заболеваниями, были отобраны еще шесть некодирующих однонуклеотидных полиморфизмов

3.1.3. Анализ мотивов связывания ТФ показал, что все отобранные полиморфизмы изменяют силу связывания ТФ, экспрессирующихся в иммунных клетках, в зависимости от аллеля

3.2 Анализ влияния отобранных полиморфизмов на активность энхансеров в

различных клеточных линиях - моделях лейкоцитов человека

3.2.1. Риск-аллель rs6832151, расположенного вне локуса 17q12-21, влияет на активность соответствующего энхансера в люциферазном тесте

3.2.2. Риск-аллели трех полиморфизмов, расположенных в локусе 17д!2-21, значимо влияют на активность соответствующих энхансеров в моделях лейкоцитов человека

3.2.3. Полиморфизм rs12946510 был выбран для последующего геномного редактирования и исследования функциональности SNP в контексте генома

3.3 Геномное редактирование с использованием системы CRISPR/Сas9 для

исследования функциональности SNP в контексте генома

3.3.1. Для геномного редактирования были выбраны В- и Т-клеточные линии МР1 и СЕМ

3.3.2. Получение сублиний, несущих альтернативные аллели полиморфизма rs12946510

3.3.3. Генотип rs12946510 влияет на экспрессию генов в локусе 17q12-21 в отредактированных клетках

3.3.4. Процедура редактирования вносит вклад в изменение экспрессии целевых генов

^12946510

3.3.5. Процедура редактирования оказала влияние на метилирование ДНК в области редактирования

3.3.6. Метилирование ДНК донора не влияет на экспрессию IKZF3

3.3.7. Риск-аллель rs12946510 влияет на активацию Т-клеток

ВЫВОДЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

Список сокращений

АЗЩЖ - аутоиммунные заболевания щитовидной железы

ВЗК - воспалительные заболевания кишечника

ГР - гомологичная рекомбинация

мТЭК - медуллярная тимусная эпителиальная клетка

НСК - негомологичное соединение концов

ИФА - иммуноферментный анализ

ПБЦ - первичный билиарный цирроз

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РА - ревматоидный артрит

РС - рассеянный склероз

ТФ - транскрипционный фактор

ФМА - форбол-12-миристат-13-ацетат

AID (Activation-Induced Cytidine Deaminase) - цитидин-дезаминаза, индуцируемая активацией

AIRE (autoimmune regulator) - аутоиммунный регулятор BCR (B-cell receptor) - В-клеточный рецептор

Bi-PE (bidirectional prime editing) - двунаправленное прайм-редактирование Cas (CRISPR associated protein) - CRISPR-ассоциированный белок

ChIP-seq (chromatin immunoprecipitation sequencing) - иммунопреципитация хроматина с секвенированием

CGI (CpG island) - CpG-островок

CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) - короткие палиндромные повторы, регулярно расположенные группами

eQTL (expression quantitative trait loci) - локусы, связанные с количественными изменениями в профиле экспрессии генов

FEZF2 (FEZ Family Zinc Finger 2) - цинковый палец FEZ семейства 2 FC (Fold change) - кратность изменения

GFP (green fluorescent protein) - зеленый фруоресцентный белок GSDMA (Gasdermin A) - гасдермин А GSDMB (Gasdermin В) - гасдермин В

GWAS (Genome-Wide Association Study) - полногеномный поиск ассоциаций HLA (human leukocyte antigen) - человеческий лейкоцитарный антиген

HMR (hypermethylation region) - гипометилированный участок

HPRT1 (hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1) - гипоксантин фосфорибозил трансфераза

IKZF3 (IKAROS Family Zinc Finger 3) - белок 3 семейства IKAROS, содержащий домен "цинковый палец"

IL - интерлейкин

LD (linkage disequilibrium) - неравновесное сцепление

MHC (major histocompatibility complex) - главный комплекс гистосовместимости

Off-target сайт - участок в геноме, который не является целевым для редактирования, но может быть по ошибке разрезан или модифицирован нуклеазой

ORMDL3 (ORMDL Sphingolipid Biosynthesis Regulator 3) - ORMDL регулятор биосинтеза сфинголипидов

PICS (Probabilistic Identification of Causal SNPs) - вероятностная идентификация каузативных SNP

sgRNA (single guide RNA) - направляющая РНК

SNP (single nucleotide polymorphism) - однонуклеотидный полиморфизм TNF (tumor necrosis factor) - фактор некроза опухоли TCR (T-cell receptor) - Т-клеточный рецептор

TGFp (transforming growth factor beta) - трансформирующий фактор роста-бета Th - Т-хелперная клетка Treg - регуляторная Т-клетка

TSS (transcription start site) - сайт начала транскрипции

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональный анализ некодирующих однонуклеотидных полиморфизмов, ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями человека»

Введение

Актуальность и степень разработанности темы исследования

С появлением таких методов молекулярной биологии, как биологические микрочипы высокой плотности и технологии высокопроизводительного секвенирования, существенно изменились подходы к исследованиям в генетике человека. Теперь возможен массовый анализ генетических вариаций, включая однонуклеотидные полиморфизмы (SNP, от англ. Single nucleotide polymorphism). В области биоинформатики основное внимание традиционно уделялось исследованию эффектов однонуклеотидных замен в кодирующих последовательностях [Ramensky, Bork, Sunyaev, 2002], однако всё больший интерес вызывает изучение SNP в некодирующих областях ДНК, особенно в регуляторных участках генома, которые могут изменять аффинность сайтов связывания транскрипционных факторов (ТФ). Популяционные генетические исследования позволяют выявлять статистические связи между SNP и заболеваниями, но не всегда позволяют определить причинно-следственные связи на молекулярном уровне. Чтобы лучше понять механизмы развития аутоиммунных заболеваний, важно идентифицировать гены-мишени, определяющие механизмы активации лимфоцитов, а также макрофагов, дендритных клеток и других эффекторных клеток врожденного иммунитета в зависимости от различных аллелей SNP.

Углубление знаний о молекулярных и клеточных процессах, влияющих на риск аутоиммунных реакций, критически важно для улучшения терапии этих заболеваний, поскольку многие из них трудно поддаются лечению и приводят к значительному снижению качества жизни и ранней смертности больных. Новые данные и ресурсы позволяют точнее предсказывать функциональные SNP и клетки, в которых эти SNP проявляют свои эффекты. Например, благодаря эпигенетическим данным, опубликованным для 111 различных первичных тканей и органов, стало возможным определение расположения энхансеров в конкретных субпопуляциях иммунных клеток и выбор SNP для дальнейшего анализа [Roadmap Epigenomics Consortium и др., 2015]. Также развиваются математические алгоритмы для выделения наиболее вероятных каузативных полиморфизмов, непосредственно связанных с развитием заболевания, среди группы

сцепленных SNP [Farh и др., 2015; Taylor и др., 2021]. Предпринимаются масштабные инициативы по поиску новых терапевтических мишеней, в том числе на основе данных полногеномного поиска ассоциаций (genome-wide association studies, GWAS). Например, Национальный Институт Здоровья США (National Institutes of Health, NIH) запустил программу «Illuminating the Druggable Genome», направленную на выявление новых белковых мишеней для терапевтического воздействия

(https://ncats.nih.gov/research/research-activities/idg). Созданы ресурсы, такие как Target Central Resource Database и Pharos, которые позволяют исследователям анализировать информацию о белках с неизвестными функциями в контексте известных фармакологических мишеней [Kelleher и др., 2024]. Еще один крупный проект, OpenTargets, специализируется на анализе мишеней для конкретных заболеваний, включая онкологические, иммунологические и нейродегенеративные заболевания. В настоящее время консорциум включает как научные, так и коммерческие организации, такие как GSK, EMBL-EBI, Sanofi, Pfizer, Genentech и другие. В 2018 года к ним присоединился проект Immunobase (https://www.immunobase.org/). Платформа OpenTargets интегрирует разнообразные типы данных, включая генетические ассоциации, соматические мутации, существующие и разрабатываемые лекарства, сигнальные пути, экспрессию РНК, анализ текстов, а также модели на животных, сосредотачиваясь на заболеваниях и потенциальных терапевтических мишенях. В то же время консорциум проводит высокопроизводительные экспериментальные исследования, направленные на изучение связей между мишенями и заболеваниями. Для этого используются различные передовые технологии, такие как генетическое редактирование, индуцированные плюрипотентные стволовые клетки, геномика одиночных клеток, культивирование тканей и органоидов, крупномасштабные геномные и эпигеномные исследования, GWAS, секвенирование нового поколения, биоинформатика и высокопроизводительные вычисления [Buniello и др., 2024].

Независимо от этого, отдельные научные группы, а также консорциум GTEx (https://www.gtexportal.org) предпринимают усилия по идентификации генов-мишеней каузативных SNP с помощью анализа транскриптомов (expression quantitative trait loci, eQTL-анализ). Однако эффективность такого подхода во многом зависит от размера выборки. На данный момент проведено лишь несколько исследований, обладающих достаточной мощностью, с числом доноров от 500 до 5000, или на узких популяциях клеток

[Bryois и др., 2014; Fairfax и др., 2014; Lloyd-Jones и др., 2017; Schmiedel и др., 2022; Zeller и др., 2010]. Систематический анализ и сопоставление работ по анализу eQTL в клетках крови и лимфобластоидных клеточных линиях позволили сделать вывод, что исследования, выполненные на меньших выборках и/или смешанных клеточных популяциях (например, в мононуклеарах периферической крови), выявляют лишь очень малую долю генов-мишеней [He и др., 2018; Min и др., 2011; Tambets и др., 2024]. Исследования также показывают, что мишени регуляторных SNP могут находиться на значительном расстоянии от них, до нескольких миллионов пар оснований, или даже на другой хромосоме [Balasubramanian и др., 2024; Zhang и др., 2013], и что они могут быть высоко специфичны для определенного типа клеток или их функционального состояния (например, в зависимости от способа и продолжительности активации) [Nathan и др., 2022; Ota и др., 2021; Yazar и др., 2022]. В результате, несмотря на высокую стоимость, омиксные подходы для выявления eQTL до сих пор остаются ограниченными, так как не позволяют охватить все возможные типы клеток и их функциональные состояния в рамках больших выборок [Kang, Gao, 2020; Lu и др., 2024; Nathan и др., 2022].

В данной работе изучались перспективы применения альтернативного подхода к поиску генов-мишеней, экспрессия которых регулируется функциональными SNP. Одним из перспективных инструментов в этом направлении является технология геномного редактирования CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR-associated protein 9), которая позволяет вносить точные изменения в геном клеток. Этот метод уже демонстрирует значительное влияние на развитие различных биологических дисциплин. Внесение однонуклеотидных замен в геном остается сложной задачей, поскольку эффективность гомологичной рекомбинации (ГР) после разрезания ДНК нуклеазой Cas9 достаточно низкая и сильно зависит от типа клеток и их состояния. Однако за последнее время произошел значительный прогресс в понимании взаимодействия Cas9 с ДНК и последующих процессов репарации. Были разработаны стратегии для оптимизации направляющих РНК и донорных ДНК, что позволило повысить долю успешных клонов [Choudhery, Arif, Mahmood, 2024; Ikeda и др., 2018; Tao и др., 2022]. Кроме того, были разработаны альтернативные подходы редактирования без индуцирования двухцепочечного разрыва, в том числе редакторы оснований и прайм-редактирование. Редакторы оснований позволяют напрямую преобразовывать одну

нуклеотидную пару в другую (например, C^T или A^-G) без разрезания ДНК, что существенно снижает частоту нежелательных мутаций и повышает точность редактирования [Lee и др., 2020]. Прайм-редактирование использует Cas9-никтазу в сочетании с обратной транскриптазой и специализированной направляющей РНК для прайм-редактирования (pegRNA), позволяя вносить широкий спектр точечных замен, вставок и делеций с высокой специфичностью [Anzalone и др., 2019]. Также был разработан усовершенствованный подход, двунаправленное прайм-редактирование (bidirectional prime editing, Bi-PE), который позволяет одновременно вносить редактирования с обеих сторон от целевого сайта [Tao и др., 2022].

В рамках данной работы были отобраны потенциальные функциональные полиморфизмы, связанные с аутоиммунными заболеваниями, такими как рассеянный склероз, воспалительные заболевания кишечника, диабет 1 типа, ревматоидный артрит и др., проведена их валидация методом репортерного анализа, а затем созданы клеточные сублинии, несущие альтернативные аллели SNP. Путем сравнения экспрессии вероятных генов-мишеней в этих сублиниях были подтверждены соответствующие гены-мишени SNP с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени и оценено влияние генотипа SNP на способность лимфоцитов к активации.

Цели и задачи исследования

Целью работы являлось среди ранее охарактеризованных некодирующих однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), ассоциированных с рядом аутоиммунных заболеваний, выявить полиморфизмы с наиболее высокой вероятностью каузативности и определить гены-мишени для SNP, показавшего наибольшую функциональность в репортерном анализе, с использованием метода геномного редактирования CRISPR/Cas.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи по изучению функциональности полиморфизмов, расположенных в межгенных участках и ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями:

1. С использованием биоинформатических ресурсов и математического алгоритма точного картирования вероятностной идентификации каузативных SNP (Probabilistic Identification of Causal SNPs, PICS) отобрать потенциально каузативные некодирующие SNP, расположенные в активных энхансерах первичных лейкоцитов и ассоциированные с аутоиммунными патологиями.

2. Выбрать полиморфизм для последующего геномного редактирования путем исследования влияния риск-аллелей отобранных полиморфизмов на активность содержащих их энхансеров в клеточных линиях лимфоцитарного происхождения, в которых SNP находится в активном энхансере согласно биоинформатическим данным.

3. С помощью системы CRISPR/Cas провести геномное редактирование клеток, в которых замена аллеля SNP приводит к значимому изменению активности соответствующего энхансера, и получить сублинии, содержащие альтернативные аллели SNP.

4. Оценить влияние различных вариантов полиморфизма на уровень экспрессии поверхностных маркеров активации лимфоцитов при стимуляции сублиний, а также на уровень экспрессии генов, для которых полиморфизм является eQTL в иммунных клетках.

Научная новизна работы

Сочетание биоинформатического анализа данных GWAS с использованием алгоритма PICS позволило из большого массива данных выделить 11 полиморфизмов с высокой вероятностью каузативности и впервые исследовать их на функциональность в моделях лимфоцитов человека.

Новаторским аспектом работы является комплексный анализ функционирования выявленных полиморфизмов, включающий оценку их влияния на активность энхансеров, экспрессию генов и фенотипические характеристики клеток. Так, впервые была показана функциональность пяти SNP, rs12946510, rs12709365, rs4795397, rs8067378 и rs6832151, которые значимо влияли на активность соответствующих энхансеров в различных моделях иммунных клеток. Для валидации генов-мишеней полиморфизма rs12946510 был применен подход с использованием системы геномного редактирования CRISPR/Cas. Впервые было продемонстрировано, что замена протективного аллеля на риск-аллель rs12946510 в Т-клеточной линии CEM приводит к значительным изменениям в экспрессии генов IKZF3 и ORMDL3, играющих важную роль в дифференцировке и функционировании Т-клеток. Впервые было показано, что клетки CEM с риск-аллелем rs12946510(T) демонстрируют сниженный уровень активации в ответ на неспецифические стимулы по сравнению с клетками, несущими протективный аллель.

Эти результаты подчеркивают важность изучения функциональных эффектов SNP в контексте целого генома и физиологических процессов. Кроме того, работа выявила потенциальные ограничения метода геномного редактирования, связанные с влиянием процедуры клонирования на экспрессию генов, что имеет важное методологическое значение для применения CRISPR/Cas редактирования генома клеток человека в различных исследованиях.

Теоретическая и практическая значимость работы

Изучение потенциально каузативных некодирующих SNP, расположенных в активных энхансерах первичных лейкоцитов, позволяет глубже изучить генетические факторы, лежащие в основе аутоиммунных патологий. Это, в свою очередь, может привести к разработке новых диагностических и прогностических маркеров, а также к выявлению потенциальных терапевтических мишеней. Использование геномного редактирования для определения генов-мишеней SNP позволяет более точно и достоверно оценить влияние конкретных генетических вариантов на экспрессию генов и функциональное состояние клеток иммунной системы.

Практическая значимость работы заключается демонстрации перспектив использования предложенного подхода для функциональной оценки регуляторных SNP, ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями. Полученные результаты указывают на потенциальную возможность применения таких данных в будущем для повышения точности генетических тестов оценки риска, однако в настоящее время этот подход требует дальнейшего совершенствования. Выявление функциональных SNP и их влияния на экспрессию генов-мишеней помогает углубить понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе аутоиммунных процессов, что может способствовать разработке новых персонализированных диагностических или терапевтических стратегий в долгосрочной перспективе.

Методология и методы исследования

Для идентификации каузативных SNP, ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями, был применен комплексный подход, основанный на анализе данных GWAS с использованием чипа с высоким покрытием - Immunochip. Этот чип обеспечивает детальное покрытие аутоиммунных локусов и генов, связанных с функционированием иммунной системы, что повышает точность предсказания каузативных SNP.

Отбор потенциально функциональных SNP осуществлялся с помощью алгоритма PICS. Дальнейшая фильтрация кандидатных полиморфизмов проводилась на основе эпигенетических данных проекта ENCODE 2 для различных типов первичных клеток человека. Это позволило выявить SNP, локализованные в энхансерах, характерных для

клеток иммунной системы, участвующих в патогенезе соответствующего заболевания. Кроме того, были определены предполагаемые границы соответствующих энхансеров с учетом данных о чувствительности к ДНКазе I и кластеризации факторов транскрипции на

ДНК.

В результате применения многоступенчатого отбора были выделены 11 полиморфизмов, удовлетворяющих следующим критериям:

1. Ассоциация с аутоиммунным заболеванием, выявленная в GWAS с использованием Immunochip.

2. Высокое отношение рисков.

3. Вероятность PICS не менее 0.1.

4. Локализация в области пика H3K27Ac и чувствительности к ДНКазе I в релевантных первичных клетках.

5. Влияние аллельного варианта на предсказанный сайт связывания релевантных транскрипционных факторов.

Для функционального анализа отобранных регуляторных SNP была разработана система репортерных конструкций. Энхансерные последовательности, содержащие исследуемые SNP, были клонированы в плазмиду pGL3-Basic после гена люциферазы под контролем минимального промотора из плазмиды pGL4.24, поскольку объектом изучения были регуляторные SNP с неподтвержденными генами-мишенями. Аллельные варианты изучаемых SNP в составе репортерных конструкций были получены методом ПЦР-мутагенеза.

Функциональная активность полученных конструкций оценивалась путем их электропорации в различные лейкоцитарные клеточные линии (CEM, Jurkat, MT-2, MP1, Reh, Raji, U-937 и другие). Влияние SNP на активность соответствующего энхансера определялось по уровню люциферазной активности. Это позволило выявить SNP, оказывающие значимое влияние на активность энхансера, а также определить типы клеток, в которых это влияние наиболее выражено. Проводилось генотипирование соответствующих клеточных линий по интересующему полиморфизму.

Далее проводилась работа по внесению альтернативных вариантов подтвержденного функционального SNP в геном клеточных линий с помощью системы CRISPR/Cas9. Для этого были использованы плазмиды pSpCas9(BB)-2A-GFP (pX458) и

pSpCas9n(BB)-2A-GFP (pX461), сконструированные в лаборатории Feng Zhang (Addgene #48138, #48140). Данные плазмиды содержат каркас для экспрессии направляющей РНК (sgRNA) под U6 промотором, а также объединенной мРНК, с которой экспрессируется кодон-оптимизированный Cas9 (полностью функциональный или с мутацией, инактивирующей RuvC нуклеазный домен, соответственно) с сигналом ядерной локализации и последовательностью Козак, а также зеленый флуоресцентный белок (green fluorescent protein, GFP), отделенный от него вирусным саморасщепляющимся линкером T2A. Подбор sgRNA и предсказание off-target сайтов (не целевых участков редактирования) осуществлялось с помощью ресурса Cas-OFFinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder). Для повышения эффективности внесения однонуклеотидных замен применялись следующие методические приемы:

• Использование sgRNA, обеспечивающих разрезание ДНК на расстоянии не более 10 нуклеотидов от SNP.

• Подбор оптимальных условий электропорации исследуемых клеточных линий.

• Подбор наиболее эффективного метода редактирования: прямое редактирование в одну стадию с помощью никазы Cas9n (D10A) и одноцепочечного ДНК-донора; CORRECT (редактировании в два этапа с внесением, а затем удалением мутаций, препятствующих повторному разрезанию ДНК) [Paquet и др., 2016]; редактирование в два этапа с положительной и отрицательной селекцией по флуоресцентному маркеру, с использованием плазмидных доноров [Ikeda и др., 2018].

Жизнеспособные клетки были отобраны с помощью клеточного сортера по уровню флуоресценции и клонированы. Клоны были отобраны по наличию искомой замены с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с вариант-специфическими праймерами. Клоны были объединены в пулы для последующего анализа. Потенциальные гены, экспрессия которых зависит от аллельного варианта изучаемого полиморфизма, валидированы с помощью ПЦР в реальном времени на нескольких клонах и пулах клеток каждой сублинии, результаты были сопоставлены с существующими данными по eQTL и данными о пространственном взаимодействии участков генома. Отличия в уровнях

активации отредактированных клеток с разными генотипами были изучены с помощью цитофлуориметрии, иммуноферментного анализа (ИФА) и ПЦР в реальном времени.

Основные положения, выносимые на защиту

1. С использованием данных GWAS, которые были получены с помощью Immunochip и проанализированы Farh с соавторами с помощью математического алгоритма точного картирования PICS, а также данных модификации хроматина ENCODE было выбрано 11 полиморфизмов с высокой вероятностью каузативности, лежащих в активных энхансерах первичных лейкоцитов человека и ассоциированных с некоторыми аутоиммунными заболеваниями: rs12946510, rs12709365, rs4795397, rs8067378, rs13380815, rs2313430, rs6832151, rs4772201, rs61972489, rs2163226 и rs2387397.

2. Изменение протективного аллеля на риск-аллель для пяти полиморфизмов вызывает значительное влияние на активность соответствующих энхансеров в зависимости от типа клеток:

a. В модели зрелых В-лимфоцитов (MP1) замена аллеля rs12946510 и rs4795397 приводит к снижению активности соответствующих энхансеров;

b. Замена аллеля rs12946510 в В-клеточной линии Nalm6 вызывает повышение активности соответствующего энхансера;

c. В активированных моноцитах (клеточная линия U-937) риск-аллель rs12946510 увеличивает активность энхансера, тогда как замена rs12709365 приводит к снижению активности соответствующего энхансера;

d. В модели Т-хелперных (Th) клеток СЕМ замена протективного аллеля на риск-аллель rs12946510 снижает, а rs6832151 повышает, активность соответствующих энхансеров;

e. В клеточной линии МТ-2, модели регуляторных Т-клеток, замена аллеля rs8067378 на риск-аллель приводит к повышению активности энхансера, в котором локализуется данный SNP.

3. Редактированные клетки СЕМ, несущие риск-аллель полиморфизма rs12946510(T), имеют более низкую экспрессию генов IKZF3, кодирующего транскрипционный фактор Ailos, участвующий в выборе CD4/CD8 дифференцировки Т-клеток в тимусе, и продукции IL10 CD4+ Т-клетками, а также ORMDL3, продукт которого стимулирует дифференцировку Т-клеток в Th2, по сравнению с клетками, содержащими протективный аллель rs12946510(C), а также сниженный уровень активации в ответ на неспецифические стимулы.

Личный вклад автора

Основные результаты исследования были полученные автором самостоятельно или с его участием. Автор вносил личный вклад в планирование и проведение экспериментов, обработку и анализ полученных данных, в подготовку и написание научных публикаций, отражающих ключевые результаты исследования (в том числе статьи в Genes (2019), Молекулярная биология (2020), BBA Molecular Basis of Disease (2023)). В статье, опубликованной в International Journal of Molecular Sciences, автор внёс методический вклад в разработку общей структуры исследования, проведения экспериментов на начальных этапах, а также в научном редактировании текста работы. Имена соавторов указаны в тексте работы и соответствующих публикациях.

Апробация результатов и публикации

Результаты диссертационной работы были представлены и обсуждены на международных и отечественных конференциях: 44th FEBS Congress, Краков, Польша, 611 июля 2019; 43th FEBS Congress, Прага, Чехия, 7-12 июля 2018; Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2018», МГУ имени М.В. Ломоносова, Москва, Россия, 10-11 апреля 2018.

По теме диссертации опубликовано 4 статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в базах данных Web of Science, Scopus и рекомендованных для защиты в диссертационном совете ИМБ РАН по специальности 1.5.3 - Молекулярная биология, а также 4 тезиса.

Статьи в рецензируемых научных изданиях, индексируемых в Web of Science:

1. Ustiugova A.S., Korneev K.V., Kuprash D.V., Afanasyeva M.A. Functional SNPs in the human autoimmunity-associated locus 17q12-21 // Genes. 2019. Т. 10. № 2. С. 77. Импакт-фактор (WoS) - 2.8.

2. Устюгова А.С., Афанасьева М.А. Некодирующий полиморфизм rs6832151 -перспективный кандидат для геномного редактирования с целью поиска новых механизмов развития аутоиммунных заболеваний // Молекулярная биология. 2020. Т. 45. № 5. С. 826-836. Импакт-фактор (WoS) - 1.2.

3. Ustiugova A.S., Dvorianinova E.M., Melnikova N.V., Dmitriev A.A., Kuprash D.V., Afanasyeva M.A. CRISPR/Cas9 genome editing demonstrates functionality of the autoimmunity-associated SNP rs12946510 // Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 2023. Т. 1869. № 2. С. 166599. Импакт-фактор (WoS) - 4.2.

4. Uvarova A.N., Zheremyan E.A., Ustiugova A.S., Murashko M.M., Bogomolova E.A., Demin D.E., Stasevich E.M., Kuprash D.V., Korneev K.K. Autoimmunity-Associated SNP rs3024505 Disrupts STAT3 Binding in B Cells, Leading to IL10 Dysregulation // Int. J. Mol. Sci. 2024. T. 25. № 18. C. 10196. Импакт-фактор (WoS) - 4.9.

Тезисы конференций:

1. Устюгова А.С., Купраш Д.В. Поиск функциональных некодирующих полиморфизмов в локусе 17q12-21 человека, ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями // Материалы Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2018». 2018. Секция "Молекулярная биология". С. 20.

2. Ustiugova A.S., Afanasyeva M.A., Korneev K.V., Kuprash D.V. Identification of functional non-coding SNPs in the autoimmunity-associated human locus 17q12-21 to be edited by CRISPR/Cas system in order to find new therapy targets // FEBS OPEN BIO. 2018. T. 8. № S1. С. 261-262. Импакт-фактор (WoS) - 2.3.

3. Ustiugova A., Afanasyeva M. A novel approach to discovering new molecular mechanisms in autoimmunity // FEBS OPEN BIO. 2019. Т. 9. С. 399. Импакт-фактор (WoS) - 2.3.

4. Ustiugova A.S., Afanasyeva M.A., Kuprash D.V. Genome editing confirms functionality of autoimmunity-associated intergenic polymorphism rs12946510 in a T-helper cell line // 6th European Congress of Immunology (ECI). 2021. Eur J Immunol. 2021. Т. 51. №S1, С. 1-448. Импакт-фактор (WoS) - 3.7.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, заключения и списка литературы, который включает 201 источник. Работа изложена на 157 страницах, содержит 40 рисунков и 18 таблиц.

ГЛАВА 1. Обзор литературы

Функциональные некодирующие однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) стали важными элементами в изучении аутоиммунных заболеваний благодаря их значительной роли в регуляции экспрессии генов. Большинство значимых SNP, выявленных в GWAS, находятся именно в некодирующих регионах, что подчеркивает их роль в транскрипционной регуляции, а не в прямом изменении функции белков [Visser, Palstra, Kayser, 2015]. Понимание функциональных характеристик некодирующих SNP имеет решающее значение для раскрытия сложного генетического влияния на различные патологии. SNP вовлечены в различные заболевания и фенотипические характеристики, влияя на биологические процессы и способствуя развитию многофакторных заболеваний за счет нарушения нормальных паттернов экспрессии генов [Chen и др., 2010; Zhang, Lupski, 2015].

Несмотря на их значимость, регуляторные участки генома менее изучены по сравнению с кодирующими регионами, что затрудняет идентификацию функциональных регуляторных SNP [Bryzgalov и др., 2013]. Некодирующие SNP могут влиять на регуляцию генов через такие механизмы, как изменение связывания ТФ, альтернативный сплайсинг РНК, метилирование ДНК, привлечение микроРНК [Pai, Pritchard, Gilad, 2015] и нарушение трансляции [Filatova и др., 2021]. Современные достижения в области геномных и эпигеномных подходов включают функциональную аннотацию регуляторных элементов для приоритизации SNP, связанных с риском заболеваний, в некодирующих регионах для дальнейших исследований [Kumar и др., 2013]. Функциональная геномика прогрессирует в направлении раскрытия элементов, играющих ключевую роль в цис-регуляции экспрессии генов и влияние некодирующих вариантов на фенотипическую изменчивость [IGVF Consortium, 2024].

В контексте аутоиммунных заболеваний исследования GWAS выявили множество генетических вариантов, связанных с риском развития патологий, большинство из которых расположены за пределами кодирующих генов, что создает трудности для изучения их механизмов [Lin, Cheng, 2017]. Такие некодирующие SNP часто обнаруживаются в регуляторных регионах иммунных клеток, особенно CD4+ T-клеток, и связь таких регионов с промоторами генов в релевантных клеточных контекстах помогает идентифицировать гены, непосредственно связанные с заболеваниями [Burren и др., 2017]. Обогащение SNP в локусах количественных признаков экспрессии (eQTL) указывает на то, что большая часть вариантов риска изменяют экспрессию генов [Chun и др., 2017].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Устюгова Алина Сергеевна, 2026 год

Список литературы

1. Akcakaya P. u gp. In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations // Nature. 2018. T. 561. № 7723. C. 416-419.

2. Anzalone A. V. u gp. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA // Nature. 2019. T. 576. № 7785. C. 149-157.

3. Athar A. u gp. ArrayExpress update - from bulk to single-cell expression data // Nucleic Acids Res. 2019. T. 47. № D1. C. D711-D715.

4. Aude-Garcia C. u gp. Dual roles for MEF2A and MEF2D during human macrophage terminal differentiation and c-Jun expression // Biochem. J. 2010. T. 430. № 2. C. 237-244.

5. Ayres J. S., Schneider D. S. Tolerance of infections // Annu. Rev. Immunol. 2012. T. 30. № 1. C. 271-294.

6. Baglaenko Y. u gp. Defining the function of disease variants with CRISPR editing and multimodal single cell sequencing // bioRxiv. 2024. C. 2024.03.28.587175.

7. Balasubramanian D. u gp. Enhancer-promoter interactions can form independently of genomic distance and be functional across TAD boundaries // Nucleic Acids Res. 2024. T. 52. № 4. C. 1702-1719.

8. Bardhan K., Anagnostou T., Boussiotis V. A. The PD1:PD-L1/2 pathway from discovery to clinical implementation // Front. Immunol. 2016. T. 7. C. 550.

9. Bauer D. E. u gp. An erythroid enhancer of BCL11A subject to genetic variation determines fetal hemoglobin level // Science. 2013. T. 342. № 6155. C. 253-257.

10. Bell S. E., Goodnow C. C. A selective defect in IgM antigen receptor synthesis and transport causes loss of cell surface IgM expression on tolerant B lymphocytes // EMBO J. 1994. T. 13. № 4. C. 816-826.

11. Bencomo-Alvarez A. E. u gp. Proteasome 26S subunit, non-ATPases 1 (PSMD1) and 3 (PSMD3), play an oncogenic role in chronic myeloid leukemia by stabilizing nuclear factor-kappa B // Oncogene. 2021. T. 40. № 15. C. 2697-2710.

12. Bluestone J. A. u gp. T cells in the control of organ-specific autoimmunity // J. Clin. Invest. 2015. T. 125. № 6. C. 2250-2260.

13. Bluestone J. A., Bour-Jordan H. Current and future immunomodulation strategies to restore tolerance in autoimmune diseases // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2012. T. 4. № 11. C. a007542-a007542.

14. Bolger A. M., Lohse M., Usadel B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data // Bioinformatics. 2014. T. 30. № 15. C. 2114-2120.

15. Boussiotis V. A., Chatterjee P., Li L. Biochemical signaling of PD-1 on T cells and its functional implications // Cancer J. 2014. T. 20. № 4. C. 265-271.

16. Braun A. h gp. Genome-wide meta-analysis of myasthenia gravis uncovers new loci and provides insights into polygenic prediction // Nat. Commun. 2024. T. 15. № 1. C. 9839.

17. Browne P. h gp. Atlas of Multiple Sclerosis 2013: A growing global problem with widespread inequity // Neurology. 2014. T. 83. № 11. C. 1022-1024.

18. Bryois J. h gp. Cis and trans effects of human genomic variants on gene expression // PLoS Genet. 2014. T. 10. № 7. C. e1004461.

19. Bryzgalov L. O. h gp. Detection of regulatory SNPs in human genome using ChlP-seq ENCODE data // PLoS One. 2013. T. 8. № 10. C. e78833.

20. Buchbinder E. I., Desai A. CTLA-4 and PD-1 pathways: Similarities, differences, and implications of their inhibition // Am. J. Clin. Oncol. 2016. T. 39. № 1. C. 98-106.

21. Buniello A. h gp. Open Targets Platform: facilitating therapeutic hypotheses building in drug discovery // Nucleic Acids Res. 2024. T. 53. № D1. C. D1467-D1475.

22. Burren O. S. h gp. Chromosome contacts in activated T cells identify autoimmune disease candidate genes // Genome Biol. 2017. T. 18. № 1. C. 165.

23. Cancellieri S. h gp. CRISPRitz: rapid, high-throughput and variant-aware in silico off-target site identification for CRISPR genome editing // Bioinformatics. 2020. T. 36. № 7. C. 20012008.

24. Cardamone G. h gp. The characterization of GSDMB splicing and backsplicing profiles identifies novel isoforms and a circular RNA that are dysregulated in multiple sclerosis // Int. J. Mol. Sci. 2017. T. 18. № 3. C. 576.

25. Ceccarelli F., Agmon-Levin N., Perricone C. Genetic factors of autoimmune diseases // J. Immunol. Res. 2016. T. 2016. C. 3476023.

26. Chandra J. h gp. Batf3 selectively determines acquisition of CD8+ dendritic cell phenotype and function // Immunol. Cell Biol. 2017. T. 95. № 2. C. 215-223.

27. Chen R. h gp. Non-synonymous and synonymous coding SNPs show similar likelihood and effect size of human disease association // PLoS One. 2010. T. 5. № 10. C. e13574.

28. Chen X.-F. h gp. Multiomics dissection of molecular regulatory mechanisms underlying autoimmune-associated noncoding SNPs // JCI Insight. 2020. T. 5. № 17.

29. Chi X., Li Y., Qiu X. V(D)J recombination, somatic hypermutation and class switch recombination of immunoglobulins: mechanism and regulation // Immunology. 2020. T. 160. № 3. C. 233-247.

30. Choudhery M. S., Arif T., Mahmood R. Bidirectional prime editing: Combining precision with versatility for genome editing // Cell. Reprogram. 2024.

31. Chu X. u gp. A genome-wide association study identifies two new risk loci for Graves' disease // Nat. Genet. 2011. T. 43. № 9. C. 897-901.

32. Chuai G. u gp. DeepCRISPR: optimized CRISPR guide RNA design by deep learning // Genome Biol. 2018. T. 19. № 1. C. 80.

33. Chun S. u gp. Limited statistical evidence for shared genetic effects of eQTLs and autoimmune-disease-associated loci in three major immune-cell types // Nat. Genet. 2017. T. 49. № 4. C. 600-605.

34. Cooper J. D. u gp. Seven newly identified loci for autoimmune thyroid disease // Hum. Mol. Genet. 2012. T. 21. № 23. C. 5202-5208.

35. Costenbader K. H. u gp. Genes, epigenetic regulation and environmental factors: which is the most relevant in developing autoimmune diseases? // Autoimmun. Rev. 2012. T. 11. № 8. C. 604-609.

36. Debnath I. u gp. Defining a transcriptional fingerprint of murine splenic B-cell development // Genes Immun. 2008. T. 9. № 8. C. 706-720.

37. Debnath I. u gp. Bone marrow-induced Meff2c deficiency delays B-cell development and alters the expression of key B-cell regulatory proteins // Int. Immunol. 2013. T. 25. № 2. C. 99115.

38. Dengler H. S. u gp. Distinct functions for the transcription factor Foxo1 at various stages of B cell differentiation // Nat. Immunol. 2008. T. 9. № 12. C. 1388-1398.

39. Di Noia J. M., Neuberger M. S. Molecular mechanisms of antibody somatic hypermutation // Annu. Rev. Biochem. 2007. T. 76. № 1. C. 1-22.

40. Ding J. u gp. Pore-forming activity and structural autoinhibition of the gasdermin family // Nature. 2016. T. 535. № 7610. C. 111-116.

41. ENCODE Project Consortium u gp. Author Correction: Expanded encyclopaedias of DNA elements in the human and mouse genomes // Nature. 2022. T. 605. № 7909. C. E3.

42. Fairfax B. P. u gp. Innate immune activity conditions the effect of regulatory variants upon monocyte gene expression // Science. 2014. T. 343. № 6175. C. 1246949.

43. Fairley S. u gp. The International Genome Sample Resource (IGSR) collection of open human genomic variation resources // Nucleic Acids Res. 2020. T. 48. № D1. C. D941-D947.

44. Farh K. K.-H. u gp. Genetic and epigenetic fine mapping of causal autoimmune disease variants // Nature. 2015. T. 518. № 7539. C. 337-343.

45. Filatova A. Y. h gp. Upstream ORF frameshift variants in the PAX6 5'UTR cause congenital aniridia // Hum. Mutat. 2021. T. 42. № 8. C. 1053-1065.

46. Fine E. J. h gp. An online bioinformatics tool predicts zinc finger and TALE nuclease offtarget cleavage // Nucleic Acids Res. 2014. T. 42. № 6. C. e42.

47. Fishilevich S. h gp. GeneHancer: genome-wide integration of enhancers and target genes in GeneCards // Database . 2017. T. 2017.

48. Foley G. E. h gp. Continuous culture of human lymphoblasts from peripheral blood of a child with acute leukemia // Cancer. 1965. T. 18. № 4. C. 522-529.

49. Forrester J. V. h gp. Immune privilege or privileged immunity? // Mucosal Immunol. 2008. T. 1. № 5. C. 372-381.

50. Franks S. E., Cambier J. C. Putting on the brakes: Regulatory kinases and phosphatases maintaining B cell anergy // Front. Immunol. 2018. T. 9. C. 665.

51. Freedman A. S. h gp. Adhesion of human B cells to germinal centers in vitro involves VLA-4 and INCAM-110 // Science. 1990. T. 249. № 4972. C. 1030-1033.

52. Fujio K., Okamura T., Yamamoto K. The Family of IL-10-secreting CD4+ T cells // Adv. Immunol. 2010. T. 105. C. 99-130.

53. Gallagher M. D., Chen-Plotkin A. S. The post-GWAS era: From association to function // Am. J. Hum. Genet. 2018. T. 102. № 5. C. 717-730.

54. Gekas C. h gp. Mef2C is a lineage-restricted target of Scl/Tal1 and regulates megakaryopoiesis and B-cell homeostasis // Blood. 2009. T. 113. № 15. C. 3461-3471.

55. Giraud M., Peterson P. The autoimmune regulator (AIRE) gene, the master activator of self-antigen expression in the thymus // Thymus Transcriptome and Cell Biology. Cham: Springer International Publishing, 2019. C. 169-189.

56. Goodnow C. C. h gp. Cellular and genetic mechanisms of self tolerance and autoimmunity // Nature. 2005. T. 435. № 7042. C. 590-597.

57. Goris A. h gp. Genetics of multiple sclerosis: lessons from polygenicity // Lancet Neurol. 2022. T. 21. № 9. C. 830-842.

58. Grau J., Boch J., Posch S. TALENoffer: genome-wide TALEN off-target prediction // Bioinformatics. 2013. T. 29. № 22. C. 2931-2932.

59. GTEx Consortium. The Genotype-Tissue Expression (GTEx) project // Nat. Genet. 2013. T. 45. № 6. C. 580-585.

60. GTEx Consortium h gp. Genetic effects on gene expression across human tissues // Nature. 2017. T. 550. № 7675. C. 204-213.

61. Gupta N. u gp. Regulation of immune responses to protein therapeutics by transplacental induction of T cell tolerance // Sci. Transl. Med. 2015. T. 7. № 275. C. 275ra21.

62. Hall J. M. u gp. Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome 17q21 // Science. 1990. T. 250. № 4988. C. 1684-1689.

63. Hamano R. u gp. Characterization of MT-2 cells as a human regulatory T cell-like cell line // Cell. Mol. Immunol. 2015. T. 12. № 6. C. 780-782.

64. Han D. u gp. Comparative analysis of models in predicting the effects of SNPs on TF-DNA binding using large-scale in vitro and in vivo data // Brief. Bioinform. 2024. T. 25. № 2. C. bbae110.

65. Han J., Huang J. DNA double-strand break repair pathway choice: the fork in the road // Genome Instab. Dis. 2020. T. 1. № 1. C. 10-19.

66. He B. u gp. Global view of enhancer-promoter interactome in human cells // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2014. T. 111. № 21. C. E2191-9.

67. He P. u gp. Identification of expression quantitative trait loci (eQTLs) in human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and shared with liver and brain // J. Cell. Biochem. 2018. T. 119. № 2. C. 1659-1669.

68. Heizmann B., Kastner P., Chan S. The Ikaros family in lymphocyte development // Curr. Opin. Immunol. 2018. T. 51. C. 14-23.

69. Hlavac K. u gp. FoxO1 signaling in B cell malignancies and its therapeutic targeting // FEBS Lett. 2024.

70. IGVF Consortium. Deciphering the impact of genomic variation on function // Nature. 2024. T. 633. № 8028. C. 47-57.

71. Ikeda A. u gp. High-fidelity endonuclease variant HypaCas9 facilitates accurate allele-specific gene modification in mouse zygotes // Commun. Biol. 2019. T. 2. № 1. C. 371.

72. Ikeda K. u gp. Efficient scarless genome editing in human pluripotent stem cells // Nat. Methods. 2018. T. 15. № 12. C. 1045-1047.

73. Inoue F., Ahituv N. Decoding enhancers using massively parallel reporter assays // Genomics. 2015. T. 106. № 3. C. 159-164.

74. International Multiple Sclerosis Genetics Consortium (IMSGC) u gp. Analysis of immune-related loci identifies 48 new susceptibility variants for multiple sclerosis // Nat. Genet. 2013. T. 45. № 11. C. 1353-1360.

75. International Multiple Sclerosis Genetics Consortium, MultipleMS Consortium. Locus for severity implicates CNS resilience in progression of multiple sclerosis // Nature. 2023. T. 619. № 7969. C. 323-331.

76. Irion U., Krauss J., Nusslein-Volhard C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system // Development. 2014. T. 141. № 24. C. 4827-4830.

77. Isobe J. h gp. Commensal-bacteria-derived butyrate promotes the T-cell-independent IgA response in the colon // Int. Immunol. 2020. T. 32. № 4. C. 243-258.

78. John L. B., Ward A. C. The Ikaros gene family: transcriptional regulators of hematopoiesis and immunity // Mol. Immunol. 2011. T. 48. № 9-10. C. 1272-1278.

79. Kang M., Gao J. Integration of multi-omics data for expression quantitative trait loci (eQTL) analysis and eQTL epistasis // Methods Mol. Biol. 2020. T. 2082. C. 157-171.

80. Karpova M. B. h gp. Raji revisited: cytogenetics of the original Burkitt's lymphoma cell line // Leukemia. 2005. T. 19. № 1. C. 159-161.

81. Katoh K., Standley D. M. MAFFT multiple sequence alignment software version 7: improvements in performance and usability // Mol. Biol. Evol. 2013. T. 30. № 4. C. 772-780.

82. Ke J. h gp. Genetic predisposition to colon and rectal adenocarcinoma is mediated by a super-enhancer polymorphism coactivating CD9 and PLEKHG6 // Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 2020. T. 29. № 4. C. 850-859.

83. Kelleher K. J. h gp. Pharos and TCRD : Informatics tools for illuminating dark targets // Methods and Principles in Medicinal Chemistry. 2024. C. 231-267.

84. Khan A. h gp. JASPAR 2018: update of the open-access database of transcription factor binding profiles and its web framework // Nucleic Acids Res. 2018. T. 46. № D1. C. D1284.

85. Khan U., Ghazanfar H. T lymphocytes and autoimmunity // Int. Rev. Cell Mol. Biol. 2018. T. 341. C. 125-168.

86. Khunsriraksakul C. h gp. Construction and application of polygenic risk scores in autoimmune diseases // Front. Immunol. 2022. T. 13. C. 889296.

87. Kim Y.-I., Lee E.-J., Chang S.-Y. Intestinal resident CX3CR1+ cells support gut immune system by helping production of IgA from B cells // J. Immunol. 2016. T. 196. № 1_Supplement. C. 136.9-136.9.

88. Klein G. h gp. Continuous lymphoid cell lines with characteristics of B cells (bone-marrow-derived), lacking the Epstein-Barr virus genome and derived from three human lymphomas // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1974. T. 71. № 8. C. 3283-3286.

89. Kochi Y. Genetics of autoimmune diseases: perspectives from genome-wide association studies // Int. Immunol. 2016. T. 28. № 4. C. 155-161.

90. Komaki S. h gp. iMETHYL: an integrative database of human DNA methylation, gene expression, and genomic variation // Hum. Genome Var. 2018. T. 5. № 1. C. 18008.

91. Kong N. R. u gp. MEF2C and EBF1 co-regulate B cell-specific transcription // PLoS Genet. 2016. T. 12. № 2. C. e1005845.

92. Korneev K. V. u gp. Minor C allele of the SNP rs7873784 associated with rheumatoid arthritis and type-2 diabetes mellitus binds PU.1 and enhances TLR4 expression // Biochim. Biophys. Acta Mol. Basis Dis. 2020. T. 1866. № 3. C. 165626.

93. Kotelnikova E. u gp. MAPK pathway and B cells overactivation in multiple sclerosis revealed by phosphoproteomics and genomic analysis // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2019. T. 116. № 19. C. 9671-9676.

94. Kreiner E. u gp. Shared genetic variants suggest common pathways in allergy and autoimmune diseases // J. Allergy Clin. Immunol. 2017. T. 140. № 3. C. 771-781.

95. Krueger F., Andrews S. R. Bismark: a flexible aligner and methylation caller for Bisulfite-Seq applications // Bioinformatics. 2011. T. 27. № 11. C. 1571-1572.

96. Kumar V. u gp. Human disease-associated genetic variation impacts large intergenic non-coding RNA expression // PLoS Genet. 2013. T. 9. № 1. C. e1003201.

97. Kuraoka M. u gp. BCR and endosomal TLR signals synergize to increase AID expression and establish central B cell tolerance // Cell Rep. 2017. T. 18. № 7. C. 1627-1635.

98. LaPierre N. u gp. Identifying causal variants by fine mapping across multiple studies // PLoS Genet. 2021. T. 17. № 9. C. e1009733.

99. Lee S. u gp. Single C-to-T substitution using engineered APOBEC3G-nCas9 base editors with minimum genome- and transcriptome-wide off-target effects // Sci. Adv. 2020. T. 6. № 29. C.eaba1773.

100. Li L. u gp. Polymorphisms of IKZF3 gene and autoimmune thyroid diseases: Associated with Graves' disease but not with Hashimoto's thyroiditis // Cell. Physiol. Biochem. 2018. T. 45. № 5. C.1787-1796.

101. Li L., Hu S., Chen X. Non-viral delivery systems for CRISPR/Cas9-based genome editing: Challenges and opportunities // Biomaterials. 2018. T. 171. C. 207-218.

102. Li X. u gp. Precise CRISPR-Cas9 gene repair in autologous memory T cells to treat familial hemophagocytic lymphohistiocytosis // Sci. Immunol. 2024. T. 9. № 92. C. eadi0042.

103. Li X., Heyer W.-D. Homologous recombination in DNA repair and DNA damage tolerance // Cell Res. 2008. T. 18. № 1. C. 99-113.

104. Liang F. u gp. Modulation of autoimmune and autoinflammatory diseases by gasdermins // Front. Immunol. 2022. T. 13. C. 841729.

105. Liang H. u gp. Structural variants in linkage disequilibrium with GWAS-significant SNPs // Heliyon. 2024. T. 10. № 11. C. e32053.

106. Lin J.-D., Cheng C.-W. Causal variants in autoimmune disease: a commentary on a recent published fine-mapping algorithm analysis in genome-wide association studies study // Ann. Transl. Med. 2017. T. 5. № 6. C. 151.

107. Lin Y. h gp. CRISPR/Cas9 systems have off-target activity with insertions or deletions between target DNA and guide RNA sequences // Nucleic Acids Res. 2014. T. 42. № 11. C. 7473-7485.

108. Liu E. G. h gp. Antigen-presenting cells in food tolerance and allergy // Front. Immunol. 2020. T. 11. C. 616020.

109. Liu J. Z. h gp. Association analyses identify 38 susceptibility loci for inflammatory bowel disease and highlight shared genetic risk across populations // Nat. Genet. 2015. T. 47. № 9. C. 979-986.

110. Liu X. h gp. Systematic pan-cancer analysis identifies gasdermin B as an immunological and prognostic biomarker for kidney renal clear cell carcinoma // Front. Oncol. 2023. T. 13. C. 1164214.

111. Lloyd-Jones L. R. h gp. The genetic architecture of gene expression in peripheral blood // Am. J. Hum. Genet. 2017. T. 100. № 2. C. 228-237.

112. Lu Y. h gp. Integrative cross-omics and cross-context analysis elucidates molecular links underlying genetic effects on complex traits // Nat. Commun. 2024. T. 15. № 1. C. 2383.

113. Luthers C. R., Dunn T. M., Snow A. L. ORMDL3 and asthma: Linking sphingolipid regulation to altered T cell function // Front. Immunol. 2020. T. 11. C. 597945.

114. Mansson R. h gp. Positive intergenic feedback circuitry, involving EBF1 and FOXO1, orchestrates B-cell fate // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012. T. 109. № 51. C. 21028-21033.

115. Martin M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads // EMBnet J. 2011. T. 17. № 1. C. 10.

116. Matsuo Y., Drexler H. G. Establishment and characterization of human B cell precursor-leukemia cell lines // Leuk. Res. 1998. T. 22. № 7. C. 567-579.

117. Meng X. h gp. Immunological mechanisms of tolerance: Central, peripheral and the role of T and B cells // Asia Pac. Allergy. 2023. T. 13. № 4. C. 175-186.

118. Miller M. h gp. ORMDL3 is an inducible lung epithelial gene regulating metalloproteases, chemokines, OAS, and ATF6 // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012. T. 109. № 41. C. 1664816653.

119. Miller M. h gp. Does reduced zona pellucida binding protein 2 (ZPBP2) expression on chromosome 17q21 protect against asthma? // J. Allergy Clin. Immunol. 2018. T. 142. № 2. C. 706- 709.e4.

120. Min J. L. u gp. The use of genome-wide eQTL associations in lymphoblastoid cell lines to identify novel genetic pathways involved in complex traits // PLoS One. 2011. T. 6. № 7. C. e22070.

121. Mitkin N. A. u gp. The A allele of the single-nucleotide polymorphism rs630923 creates a binding site for MEF2C resulting in reduced CXCR5 promoter activity in B-cell lymphoblastic cell lines // Front. Immunol. 2016. T. 7. C. 515.

122. Mitkin N. A. u gp. [Relative Efficiency of Transcription Factor Binding to Allelic Variants of Regulatory Regions of Human Genes in Immunoprecipitation and Real-Time PCR] // Mol. Biol. (Mosk.). 2019. T. 53. № 3. C. 393-401.

123. Moreno-Moral A. u gp. Changes in macrophage transcriptome associate with systemic sclerosis and mediate GSDMA contribution to disease risk // Ann. Rheum. Dis. 2018. T. 77. № 4. C. 596-601.

124. Mortha A. u gp. Microbiota-dependent crosstalk between macrophages and ILC3 promotes intestinal homeostasis // Science. 2014. T. 343. № 6178. C. 1249288.

125. Murphy K., Weaver C. Janeway's Immunobiology. London, England: Garland Science, 2016. Bbm. 9.

126. Nathan A. u gp. Single-cell eQTL models reveal dynamic T cell state dependence of disease loci // Nature. 2022. T. 606. № 7912. C. 120-128.

127. Nguyen H. u gp. Non-genetically encoded epitopes are relevant targets in autoimmune diabetes // Biomedicines. 2021. T. 9. № 2. C. 202.

128. Nica A. C., Dermitzakis E. T. Expression quantitative trait loci: present and future // Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 2013. T. 368. № 1620. C. 20120362.

129. Niu R. u gp. R-CRISPR: A deep learning network to predict off-target activities with mismatch, insertion and deletion in CRISPR-Cas9 system // Genes (Basel). 2021. T. 12. № 12. C. 1878.

130. Okeke E. B., Uzonna J. E. The pivotal role of regulatory T cells in the regulation of innate immune cells // Front. Immunol. 2019. T. 10. C. 680.

131. Ota M. u gp. Dynamic landscape of immune cell-specific gene regulation in immunemediated diseases // Cell. 2021. T. 184. № 11. C. 3006- 3021.e17.

132. Pai A. A., Pritchard J. K., Gilad Y. The genetic and mechanistic basis for variation in gene regulation // PLoS Genet. 2015. T. 11. № 1. C. e1004857.

133. Paquet D. u gp. Efficient introduction of specific homozygous and heterozygous mutations using CRISPR/Cas9 // Nature. 2016. T. 533. № 7601. C. 125-129.

134. Park C.-Y. u gp. Modeling and correction of structural variations in patient-derived iPSCs

using CRISPR/Cas9 // Nat. Protoc. 2016. T. 11. № 11. C. 2154-2169.

135. Parkes J. E. h gp. Systematic protein-protein interaction and pathway analyses in the idiopathic inflammatory myopathies // Arthritis Res. Ther. 2016. T. 18. № 1. C. 156.

136. Pelanda R., Torres R. M. Central B-cell tolerance: where selection begins // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2012. T. 4. № 4. C. a007146.

137. Pistillo M. P. h gp. Human lymphoblastoid cell lines secreting antibodies with restricted HLA specificity // Immunogenetics. 1987. T. 25. № 3. C. 145-151.

138. Pogulis R. J., Vallejo A. N., Pease L. R. In vitro recombination and mutagenesis by overlap extension PCR // Methods Mol. Biol. 1996. T. 57. C. 167-176.

139. Ramensky V., Bork P., Sunyaev S. Human non-synonymous SNPs: server and survey // Nucleic Acids Res. 2002. T. 30. № 17. C. 3894-3900.

140. Ramos-Nino M. E., Ramdass P. V. A. K. GSDMB gene polymorphisms and their association with asthma susceptibility: A systematic review and meta-analysis of case-control studies // JoR. 2024. T. 4. № 4. C. 198-209.

141. Renaudineau Y. h gp. Epigenetic alterations and autoimmune disease // J. Dev. Orig. Health Dis. 2011. T. 2. № 5. C. 258-264.

142. Ridley M. L. h gp. IKZF3/Aiolos is associated with but not sufficient for the expression of IL-10 by CD4+ T cells // J. Immunol. 2020. T. 204. № 11. C. 2940-2948.

143. Roadmap Epigenomics Consortium h gp. Integrative analysis of 111 reference human epigenomes // Nature. 2015. T. 518. № 7539. C. 317-330.

144. Rosier F. h gp. Genetic predisposition to the mortality in septic shock patients: From GWAS to the identification of a regulatory variant modulating the activity of a CISH enhancer // Int. J. Mol. Sci. 2021. T. 22. № 11. C. 5852.

145. Sakaguchi S. h gp. Regulatory T cells and immune tolerance // Cell. 2008. T. 133. № 5. C. 775-787.

146. Sanyal A. h gp. The long-range interaction landscape of gene promoters // Nature. 2012. T. 489. № 7414. C. 109-113.

147. Schmiedel B. J. h gp. 17q21 asthma-risk variants switch CTCF binding and regulate IL-2 production by T cells // Nat. Commun. 2016. T. 7. C. 13426.

148. Schmiedel B. J. h gp. Impact of genetic polymorphisms on human immune cell gene expression // Cell. 2018. T. 175. № 6. C. 1701- 1715.e16.

149. Schmiedel B. J. h gp. Single-cell eQTL analysis of activated T cell subsets reveals activation and cell type-dependent effects of disease-risk variants // Sci. Immunol. 2022. T. 7. №

68. C. eabm2508.

150. Schneider U., Schwenk H. U., Bornkamm G. Characterization of EBV-genome negative "null" and "T" cell lines derived from children with acute lymphoblastic leukemia and leukemic transformed non-Hodgkin lymphoma // Int. J. Cancer. 1977. T. 19. № 5. C. 621-626.

151. Schwartz R. H. T cell anergy // Annu. Rev. Immunol. 2003. T. 21. № 1. C. 305-334.

152. Sijts A., Zaiss D., Kloetzel P. M. The role of the ubiquitin-proteasome pathway in MHC class I antigen processing: implications for vaccine design // Curr. Mol. Med. 2001. T. 1. № 6. C. 665-676.

153. Soldner F. u gp. Parkinson-associated risk variant in distal enhancer of a-synuclein modulates target gene expression // Nature. 2016. T. 533. № 7601. C. 95-99.

154. Song Q. u gp. A reference methylome database and analysis pipeline to facilitate integrative and comparative epigenomics // PLoS One. 2013. T. 8. № 12. C. e81148.

155. Soyer O. U. u gp. Mechanisms of peripheral tolerance to allergens // Allergy. 2013. T. 68. № 2. C. 161-170.

156. Sprouse M. L. u gp. High self-reactivity drives T-bet and potentiates Treg function in tissue-specific autoimmunity // JCI Insight. 2018. T. 3. № 2.

157. Stankey C. T. u gp. A disease-associated gene desert directs macrophage inflammation through ETS2 // Nature. 2024. T. 630. № 8016. C. 447-456.

158. Stefanovic M. u gp. Expression levels of GSDMB and ORMDL3 are associated with relapsing-remitting multiple sclerosis and IKZF3 rs12946510 variant // Heliyon. 2024. T. 10. № 3. C. e25033.

159. Stehling-Sun S. u gp. Regulation of lymphoid versus myeloid fate "choice" by the transcription factor Mef2c // Nat. Immunol. 2009. T. 10. C. 289-296.

160. Strasser A., Jost P. J., Nagata S. The many roles of FAS receptor signaling in the immune system // Immunity. 2009. T. 30. № 2. C. 180-192.

161. Strober B. J. u gp. Fine-mapping causal tissues and genes at disease-associated loci // medRxiv. 2024.

162. Sundstrom C., Nilsson K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937) // Int. J. Cancer. 1976. T. 17. № 5. C. 565-577.

163. Szymanski K. u gp. The replication of the association of the rs6832151 within chromosomal band 4p14 with Graves' disease in a Polish Caucasian population // Tissue Antigens. 2012. T. 79. № 5. C. 380-383.

164. Takaba H. u gp. Fezf2 orchestrates a thymic program of self-antigen expression for immune

tolerance // Cell. 2015. T. 163. № 4. C. 975-987.

165. Tambets R. h gp. Extensive co-regulation of neighboring genes complicates the use of eQTLs in target gene prioritization // HGG Adv. 2024. T. 5. № 4. C. 100348.

166. Tang Z. h gp. CTCF-mediated human 3D genome architecture reveals chromatin topology for transcription // Cell. 2015. T. 163. № 7. C. 1611-1627.

167. Tao R. h gp. Bi-PE: bi-directional priming improves CRISPR/Cas9 prime editing in mammalian cells // Nucleic Acids Res. 2022. T. 50. № 11. C. 6423-6434.

168. Tay T. h gp. Degradation of IKZF1 prevents epigenetic progression of T cell exhaustion in an antigen-specific assay // Cell Rep. Med. 2024. T. 5. № 11. C. 101804.

169. Taylor K. E. h gp. PICS2: next-generation fine mapping via probabilistic identification of causal SNPs // Bioinformatics. 2021. T. 37. № 18. C. 3004-3007.

170. Tsai S. Q. h gp. GUIDE-seq enables genome-wide profiling of off-target cleavage by CRISPR-Cas nucleases // Nat. Biotechnol. 2015. T. 33. № 2. C. 187-197.

171. Tytgat H. L. P. h gp. Bowel biofilms: Tipping points between a healthy and compromised gut? // Trends Microbiol. 2019. T. 27. № 1. C. 17-25.

172. Uvarova A. N. h gp. Methods for functional characterization of genetic polymorphisms of non-coding regulatory regions of the human genome // Biochemistry (Mosc.). 2024. T. 89. № 6. C. 1002-1013.

173. Verlaan D. J. h gp. Allele-specific chromatin remodeling in the ZPBP2/GSDMB/ORMDL3 locus associated with the risk of asthma and autoimmune disease // Am. J. Hum. Genet. 2009. T. 85. № 3. C. 377-393.

174. Visser M., Palstra R.-J., Kayser M. Allele-specific transcriptional regulation of IRF4 in melanocytes is mediated by chromatin looping of the intronic rs12203592 enhancer to the IRF4 promoter // Hum. Mol. Genet. 2015. T. 24. № 9. C. 2649-2661.

175. Vorontsov I. h gp. PERFECTOS-APE - predicting regulatory functional effect of SNPs by approximate P-value estimation // Bioinformatics. 2015. C. 102-108.

176. Vorontsov I. E. h gp. HOCOMOCO in 2024: a rebuild of the curated collection of binding models for human and mouse transcription factors // Nucleic Acids Res. 2024. T. 52. № D1. C. D154-D163.

177. Wallace C. h gp. Dissection of a complex disease susceptibility region using a Bayesian stochastic search approach to fine mapping // PLoS Genet. 2015. T. 11. № 6. C. e1005272.

178. Wang D. C., Wang X. Off-target genome editing: A new discipline of gene science and a new class of medicine // Cell Biol. Toxicol. 2019. T. 35. № 3. C. 179-183.

179. Wang G. h gp. A simple new approach to variable selection in regression, with application to genetic fine mapping // J. R. Stat. Soc. Series B Stat. Methodol. 2020. T. 82. № 5. C. 12731300.

180. Wang J. H. h gp. Aiolos regulates B cell activation and maturation to effector state // Immunity. 1998. T. 9. № 4. C. 543-553.

181. Wang L., Wang F.-S., Gershwin M. E. Human autoimmune diseases: a comprehensive update // J. Intern. Med. 2015. T. 278. № 4. C. 369-395.

182. Wienert B. h gp. CRISPR off-target detection with DISCOVER-seq // Nat. Protoc. 2020. T. 15. № 5. C. 1775-1799.

183. Wohlfert E. A. h gp. GATA3 controls Foxp3+ regulatory T cell fate during inflammation in mice // J. Clin. Invest. 2011. T. 121. № 11. C. 4503-4515.

184. Wyvekens N., Tsai S. Q., Joung J. K. Genome editing in human cells using CRISPR/Cas nucleases // Curr. Protoc. Mol. Biol. 2015. T. 112. № 1. C. 31.3.1-31.3.18.

185. Xie J. h gp. Efficient base editing for multiple genes and loci in pigs using base editors // Nat. Commun. 2019. T. 10. № 1. C. 2852.

186. Xu C. L. h gp. Viral delivery systems for CRISPR // Viruses. 2019. T. 11. № 1. C. 28.

187. Xu C. L. h gp. CRISPR off-target analysis platforms // Methods Mol. Biol. 2023. T. 2560. C. 279-285.

188. Yang J., Jiang J. Gasdermins: a dual role in pyroptosis and tumor immunity // Front. Immunol. 2024. T. 15. C. 1322468.

189. Yazar S. h gp. Single-cell eQTL mapping identifies cell type-specific genetic control of autoimmune disease // Science. 2022. T. 376. № 6589. C. eabf3041.

190. Yin H. h gp. Partial DNA-guided Cas9 enables genome editing with reduced off-target activity // Nat. Chem. Biol. 2018. T. 14. № 3. C. 311-316.

191. Yin W., Xiang P., Li Q. Investigations of the effect of DNA size in transient transfection assay using dual luciferase system // Anal. Biochem. 2005. T. 346. № 2. C. 289-294.

192. Yoshimi K. h gp. Allele-specific genome editing and correction of disease-associated phenotypes in rats using the CRISPR-Cas platform // Nat. Commun. 2014. T. 5. № 1. C. 4240.

193. Yu X. h gp. Shared genetic architecture between autoimmune disorders and B-cell acute lymphoblastic leukemia: insights from large-scale genome-wide cross-trait analysis // BMC Med. 2024. T. 22. № 1. C. 161.

194. Zeller T. h gp. Genetics and beyond--the transcriptome of human monocytes and disease susceptibility // PLoS One. 2010. T. 5. № 5. C. e10693.

195. Zhang F., Lupski J. R. Non-coding genetic variants in human disease // Hum. Mol. Genet. 2015. T. 24. № R1. C. R102-10.

196. Zhang H., Zhang S. CRISPR/Cas9-mediated precise SNP editing in human iPSC lines // Bio Protoc. 2021. T. 11. № 12. C. e4051.

197. Zhang P., Lu Q. Genetic and epigenetic influences on the loss of tolerance in autoimmunity // Cell. Mol. Immunol. 2018. T. 15. № 6. C. 575-585.

198. Zhang W. u gp. Inferring polymorphism-induced regulatory gene networks active in human lymphocyte cell lines by weighted linear mixed model analysis of multiple RNA-Seq datasets // PLoS One. 2013. T. 8. № 10. C. e78868.

199. Zhou S. u gp. Highly efficient generation of sheep with a defined FecBB mutation via adenine base editing // Genet. Sel. Evol. 2020. T. 52. № 1. C. 35.

200. Ziegler S. F., Ramsdell F., Alderson M. R. The activation antigen CD69 // Stem Cells. 1994. T. 12. № 5. C. 456-465.

201. Zumer K. u gp. Unmodified histone H3K4 and DNA-dependent protein kinase recruit autoimmune regulator to target genes // Mol. Cell. Biol. 2012. T. 32. № 8. C. 1354-1362.

Благодарности

Выражаю глубокую признательность своему научному руководителю Дмитрию Владимировичу Купрашу за профессиональное руководство, ценные рекомендации, помощь в планировании экспериментов, постоянную поддержку на всех этапах работы, а также терпение и доброжелательность.

Отдельно хочу поблагодарить Марину Алексеевну Афанасьеву за чуткое и внимательное руководство, помощь в получении экспериментальных данных и освоении новых методов.

Особую благодарность выражаю сотрудникам лаборатории Алексея Дмитриева, в особенности Наталье Мельниковой и Екатерине Дворяниновой, за существенную помощь в проведении и анализе данных бисульфитного секвенирования.

Глубокую благодарность хочу выразить Элине Жеремян, Кириллу Корнееву, Аксинье Уваровой и Екатерине Стасевич за их неоценимую помощь в работе и эмоциональную поддержку.

Я выражаю признательность профессорско-преподавательскому составу кафедры иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова за предоставленные ценные теоретические и практические знания. Отдельно благодарю Сергея Артуровича Недоспасова, Анну Павловну Топтыгину и Лазаревич Наталию Леонидовну за привитый интерес к иммунологии и великолепные лекции.

Я признательна бывшим и настоящим сотрудникам лаборатории передачи внутриклеточных сигналов в норме и патологии Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (Антону Шварцу, Екатерине Свиряевой, Денису Дёмину, Никите Митькину, Матвею Мурашко и Алисе Горбачевой), а также студентам и аспирантам кафедры иммунологии биологического факультета МГУ за помощь в работе и создание дружественной рабочей атмосферы.

Благодарю своих родных и близких за поддержку на всех этапах, заботу и терпение.